CN109303780B - 一种还原响应型7-乙基-10-羟基喜树碱的两亲性聚合物药物前体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种还原响应型7‑乙基‑10‑羟基喜树碱的聚合物药物前体及其制备方法，其具有如下所示的分子结构：
Figure DDA0001363897560000011
其中，聚合度n为5～1000，m为1或2。本发明提供的药物前体能够实现靶向给药，既保留了纳米载药系统的优势，同时又发挥了二硫键在肿瘤部位特异性降解的特点。与常规的2,2′‑二硫代二乙酸、3,3′‑二硫代二丙酸等连接臂相比，无需通过进一步水解就可以得到原药分子形式的抗癌药物。

Description

一种还原响应型7-乙基-10-羟基喜树碱的两亲性聚合物药物 前体及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种两亲性聚合物药物前体及其制备方法，尤其涉及一种7-乙基-10-羟基喜树碱的两亲性聚合物药物前体及其制备方法。
背景技术
化疗是一种基本的肿瘤治疗方法，其主要是利用抗癌药物杀死肿瘤细胞而达到治疗肿瘤的目的。临床上常用的抗癌药物主要包括喜树碱类、紫杉烷类、长春碱和蒽醌类等，但这些抗癌药物理化性质较差(例如难溶于水，选择性差等)，对正常细胞和组织有严重的毒副作用，导致肿瘤化疗效果差，因此临床应用受到限制。
7-乙基-10-羟基喜树碱(简称SN-38)，是喜树碱类药物的重要衍生物之一。SN-38是伊立替康在体内的代谢产物，其抗肿瘤活性是伊立替康的100-1000倍，但其疏水性使得其无法直接进入临床应用。目前临床上应用的伊立替康和拓扑替康通过引入亲水性官能团改善了喜树碱类药物水溶性差的缺点，虽然在动物实验中展现出非常好的抗肿瘤活性，但是由于人体内缺乏相应的酶导致临床抗肿瘤效果不大。
通过化学修饰在药物的分子结构中引入亲水性基团，制备得到水溶性的前药，可以有效的解决疏水性药物的水溶性问题。在水溶性高分子聚合物中，聚乙二醇得到了广泛关注。聚乙二醇是一种生物相容性优异的高分子材料，已经被美国FDA批准为可体内注射的药用高分子聚合物之一。疏水性药物经聚乙二醇修饰之后，水溶性和体内稳定性均得以提高，并能显著降低肾脏清除率，大大延长血液循环时间，还能通过EPR效应增强肿瘤处的积聚，这些均对提高肿瘤治疗效果、降低毒副作用具有至关重要的作用。
近年来，纳米给药系统以其优良特性受到了广泛的关注，纳米给药系统具有以下特征:较大程度提高药物的水溶性、通过提高渗透性和保留效应(EPR)来实现对肿瘤的被动靶向、延长体内循环时间、提高药物利用率以及降低毒副作用等。然而，普通的纳米制剂并不能识别肿瘤部位与正常部位，也不能区分细胞内及细胞外的环境，因此如何让纳米制剂在体内选择性的释放出原药仍然是一大难题。
研究发现，细胞内的谷胱甘肽浓度(0.5～10mM/L)是细胞外谷胱甘肽浓度(2～20μM/L)的200倍以上，二硫键在一定量的谷胱甘肽(GSH)或二硫苏糖醇(DTT)等还原剂存在下被还原生成巯基，但是在人体的正常体温、pH和氧化等环境下非常稳定，即细胞外的谷胱甘肽浓度不足以还原二硫键，另外，肿瘤组织细胞比正常组织细胞缺氧，更具有还原性环境。因此，可以将亲水性的聚合物和疏水性的药物通过二硫键链接，并在溶剂中自组装成纳米胶束，通过细胞内吞作用进入靶细胞后被GSH还原，即二硫键断裂生成巯基，从而快速有效地释放药物，并扩散到细胞核等结构，从而杀死癌细胞。目前最常用的二硫键连接臂主要为2,2′-二硫代二乙酸、3,3′-二硫代二丙酸等，但以这些二硫键连接臂连接亲水性的聚合物与疏水性药物后，在GSH、DTT等还原条件下，二硫键迅速发生断裂，但是断裂后释放的药物上还连接有巯基和酯键这样的一个“尾巴”，而并非原料分子形式，中国专利CN102775596所公开的聚合物药物前体在二硫键断裂释放药物的时候即属于上述的情况，要想得到原料分子形式的药物需再经过酯键水解的步骤，而在人体细胞内的弱碱性条件下，酯键的水解缓慢且不完全，直接影响药物的抗肿瘤效果。
发明内容
本发明针对现有技术公开的二硫键连接亲水性聚合物与疏水性药物形成的聚合物药物在二硫键断裂时不能释放原药的不足，提供一种还原响应型7-乙基-10-羟基喜树碱的两亲性聚合物药物前体及其制备方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种还原响应型7-乙基-10-羟基喜树碱的两亲性聚合物药物前体，具有如下所示的分子结构式：
Figure BDA0001363897540000031
其中，聚合度n为5～1000，m为1或2。
进一步，所述聚合度的范围为400<n≦1000。
本发明提供的聚合物药物前体释放原药分子的机理为：
本发明采用了肿瘤微环境靶向给药的思路，通过引入对还原环境敏感的自毁式二硫键连接臂，在肿瘤细胞内谷胱甘肽提供的还原条件下，聚合物药物前体的二硫键发生断裂，二硫键断裂后生成一个自由的巯基，由于受到结构稳定因素的影响，该巯基会亲核进攻邻近的酯键从而生成一个稳定的五元环或六元环结构，同时释放抗癌药物的原药分子，其还原响应释放原药分子的机理如下图所示：
Figure BDA0001363897540000041
本发明提供的聚合物药物前体的有益效果为：
1)本发明提供的药物前体能够实现靶向给药，既保留了纳米载药系统的优势，同时又发挥了二硫键在肿瘤部位特异性降解的特点。与常规的2,2′-二硫代二乙酸、3,3′-二硫代二丙酸等连接臂相比，无需通过进一步水解就可以得到原药分子形式的抗癌药物。
2)本发明得到的两亲性聚合物药物前体，可以在溶剂中自发组装成纳米胶束。
本发明还要求保护由上述的聚合物药物前体制备而成的聚合物纳米胶束，所述聚合物纳米胶束是由如下方法制成的，将前述的聚合物药物前体和脂肪酸甘油三酯置于水中溶解得二者的混合溶液，后将溶液超声，过滤膜，向其中加入甘露醇冻干，即得聚合物纳米胶束，所得胶束的粒径为10～400nm，载药量为1～50wt％。
本发明还要求保护前述的药物前体以及由本发明的药物前体制备而成的聚合物纳米胶束在抗肿瘤药物领域的应用。
进一步，所述肿瘤指的是肺癌。
本发明还提供了上述聚合物药物前体的制备方法，包括如下步骤：
1)将7-乙基-10-羟基喜树碱与卤代硅烷反应，得到10位羟基得到保护的7-乙基-10-羟基喜树碱；
2)将步骤1)中所得的产物与4-(2-吡啶基二硫基)丁酸或5-(2-吡啶基二硫基)戊酸反应，得到10位羟基保护的7-乙基-10-羟基喜树碱20位酯化产物；
3)将步骤2)中所得的产物置于四丁基氟化铵的酸性环境中脱除硅烷保护基，得到7-乙基-10-羟基喜树碱的20位酯化产物；
4)将步骤3)所得的产物与巯基化聚乙二醇通过巯基-二硫键交换反应，即得7-乙基-10-羟基喜树碱的两亲性聚合物药物前体；
反应路线如下：
Figure BDA0001363897540000051
进一步，具体反应步骤如下：
步骤一：在有机胺存在下，将7-乙基-10-羟基喜树碱与卤代硅烷按摩尔比1:1～1:5溶于有机溶剂中，回流12～36小时，反应液经冷却、水洗、分液、干燥、浓缩、正己烷沉淀、过滤、真空干燥得10位羟基保护的7-乙基-10-羟基喜树碱；
步骤二：在缩合剂和有机胺存在下，将步骤一所得的10位羟基保护的7-乙基-10-羟基喜树碱和4-(2-吡啶基二硫基)丁酸或5-(2-吡啶基二硫基)戊酸按摩尔比1:1～1:3溶于二氯甲烷中，室温下反应12～36小时，反应液经水洗、分液、真空干燥得10位羟基保护的7-乙基-10-羟基喜树碱20位酯化产物；
步骤三：将步骤二所得的酯化产物和四丁基氟化铵按摩尔比1:1～1:5溶于有机溶剂中，室温反应1～5小时，反应液经萃取、水洗、干燥、硅胶柱纯化、浓缩、真空干燥得7-乙基-10-羟基喜树碱20位酯化产物；
步骤四：惰性气体保护下，搅拌条件下将巯基化聚乙二醇逐滴加入到7-乙基-10-羟基喜树碱20位酯化产物的溶液中，巯基化聚乙二醇与7-乙基-10-羟基喜树碱20位酯化产物的摩尔比为1:1～1:3，室温下反应12～36小时，浓缩、硅胶柱纯化、浓缩、真空干燥得含有二硫键的聚乙二醇抗癌药物前体。
本发明提供的两亲性聚合物药物前体的制备方法的有益效果是：原料易得、反应条件温和、产率和产物纯度高等优点，利于批量生产。
附图说明
图1为实施例1制备的7-乙基-10-羟基喜树碱的两亲性聚合物药物前体的核磁共振氢谱；
图2为实施例1所得胶束的粒径分布图；
图3为实施例2所得胶束与SN-38对肺癌H460的增殖抑制活性。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：
一种还原响应型7-乙基-10-羟基喜树碱的两亲性聚合物药物前体，具有如下所示的分子结构：
Figure BDA0001363897540000071
其中n为40～50。
上述两亲性聚合物药物前体的制备方法如下：
(1)TBDPS-7-乙基-10-羟基喜树碱的制备：
将7-乙基-10-羟基喜树碱(2.0g，5.1mmol)加入100mL二氯甲烷中，加入三乙胺(3.2mL，23mmol)和TBDPSCl(5.3mL，20.4mmol)，回流过夜。冷却至室温，依次以稀盐酸、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗有机相，分液，干燥后，减压浓缩。将浓缩液滴入大量正己烷中进行沉淀，过滤，真空干燥得3.0g黄色固体，收率为93％。对产物进行1H NMR和MS测试，表明得到式a所示结构的TBDPS-7-乙基-10-羟基喜树碱。
(2)TBDPS-PySS-7-乙基-10-羟基喜树碱的制备：
将TBDPS-7-乙基-10-羟基喜树碱(3.0g，4.8mmol),4-(2-吡啶基二硫基)丁酸(1.2g，5.2mmol)，4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.75g，6.1mmol)，N，N-二异丙基乙胺(DIEA，1.0ml，6.1mmol)溶于300mL DCM中，冰浴下加入1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI，1.2g，6.1mmol)，室温下反应24小时。反应液依次以稀盐酸、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗，分液，干燥后，减压蒸去溶剂，真空干燥得3.8g黄色固体，收率为95％。经检测产物的1H NMR，表明得到式b所示结构的4-(2-吡啶基二硫基)丁酸与TBDPS-7-乙基-10-羟基喜树碱偶联物(TBDPS-PySS-7-乙基-10-羟基喜树碱)。
(3)PySS(20)-7-乙基-10-羟基喜树碱的制备：
将TBDPS-PySS-7-乙基-10-羟基喜树碱(3.8g，4.5mmol)和TBAF(4.7g，18mmol)溶于THF和0.05mol/L HCl(体积比1：1)的混合液500mL中，室温反应1小时。反应液以二氯甲烷萃取后，以饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后，减压蒸去溶剂。经硅胶柱纯化，浓缩，真空干燥得2.3g黄色固体，收率为84％。对产物进行1H NMR和MS测试，表明得到式c所示结构的4-(2-吡啶基二硫基)丁酸与7-乙基-10-羟基喜树碱(20位)偶联物(PySS-7-乙基-10-羟基喜树碱)。
(4)聚乙二醇-二硫键-7-乙基-10-羟基喜树碱(20位)的制备：
将mPEG2000-SH(4.6g，2.3mmol)溶于200mL DMF中，氮气保护、搅拌下，滴加PySS-7-乙基-10-羟基喜树碱(1.5g，2.5mmol)的DMF(100mL)溶液，室温下反应48小时。减压蒸去DMF，经硅胶柱纯化，浓缩得到2.9g淡黄色固体，收率为55％。对产物进行1H NMR测试，表明得到式d所示结构的聚乙二醇-二硫键-7-乙基-10-羟基喜树碱(20位)，如图1。
上述合成路线如下：
Figure BDA0001363897540000081
我们将实施例1所得的聚合物药物前体制成纳米胶束，方法如下：将20mg聚合物药物前体和10μL中链脂肪酸甘油三酯置于水中，然后超声1min，过滤膜，向其中加入甘露醇冻干，即得还原响应型聚合物纳米胶束冻干粉。利用动态光散射(Dynamic LightScattering，DLS)测定得到纳米胶束的粒径及分布(图2)。
实施例2：
一种还原响应型7-乙基-10-羟基喜树碱的两亲性聚合物药物前体，具有如下所示的分子结构：
Figure BDA0001363897540000091
其中400<n<500。
上述两亲性聚合物药物前体的制备方法如下：
(1)(TMS-7-乙基-10-羟基喜树碱的制备：
将7-乙基-10-羟基喜树碱(2.0g，5.1mmol)加入100mL二氯甲烷中，加入三乙胺(3.2mL，23mmol)和(CH3)3SiCl(1.9mL，15.3mmol)，回流过夜。冷却至室温，依次以稀盐酸、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗有机相，分液，干燥后，减压浓缩。将浓缩液滴入大量正己烷中进行沉淀，过滤，真空干燥得2.19g黄色固体，收率为89％。
(2)(TMS-PySS-7-乙基-10-羟基喜树碱的制备：
将(CH3)3Si-7-乙基-10-羟基喜树碱(2.0g，4.3mmol),4-(2-吡啶基二硫基)丁酸(1.08g，4.7mmol)，4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.68g，5.5mmol)，N，N-二异丙基乙胺(DIEA，0.9ml，5.5mmol)溶于300mL DCM中，冰浴下加入1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI，1.1g，5.5mmol)，室温下反应24小时。反应液依次以稀盐酸、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗，分液，干燥后，减压蒸去溶剂，真空干燥得2.7g黄色固体，收率为93％。经检测产物的1H NMR，表明得到4-(2-吡啶基二硫基)丁酸与TMS-7-乙基-10-羟基喜树碱偶联物(TMS-PySS-7-乙基-10-羟基喜树碱)。(3)PySS(20)-7-乙基-10-羟基喜树碱的制备：
将TMS-PySS-7-乙基-10-羟基喜树碱(2.7g，4.0mmol)和TBAF(5.3g，20.0mmol)溶于THF和0.05mol/LHCl(体积比1：1)的混合液500mL中，室温反应1小时。反应液以二氯甲烷萃取后，以饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后，减压蒸去溶剂。经硅胶柱纯化，浓缩，真空干燥得2.2g黄色固体，收率为90％。对产物进行1H NMR和MS测试，表明得到4-(2-吡啶基二硫基)丁酸与7-乙基-10-羟基喜树碱(20位)偶联物(PySS-7-乙基-10-羟基喜树碱)。
(4)聚乙二醇-二硫键-7-乙基-10-羟基喜树碱(20位)的制备：
将mPEG20000-SH(5.4g，0.27mmol)溶于200mL DMF中，氮气保护、搅拌下，滴加PySS-7-乙基-10-羟基喜树碱(0.5g，0.83mmol)的DMF(100mL)溶液，室温下反应48小时。减压蒸去DMF，经硅胶柱纯化，浓缩得到2.6g淡黄色固体，收率为47％。
实施例2所得的聚合物药物前体制成纳米胶束的方法同实施例1。
实施例3：
一种还原响应型7-乙基-10-羟基喜树碱的两亲性聚合物药物前体，具有如下所示的分子结构：
Figure BDA0001363897540000101
其中500<n<1000。
上述两亲性聚合物药物前体的制备方法如下：
(1)TBDPS-7-乙基-10-羟基喜树碱的制备：
将7-乙基-10-羟基喜树碱(2.0g，5.1mmol)加入100mL二氯甲烷中，加入三乙胺(3.2mL，23mmol)和TBDPSCl(1.3mL，5.1mmol)，回流过夜。冷却至室温，依次以稀盐酸、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗有机相，分液，干燥后，减压浓缩。将浓缩液滴入大量正己烷中进行沉淀，过滤，真空干燥得2.6g黄色固体，收率为81％。对产物进行1H NMR和MS测试，表明得到TBDPS-7-乙基-10-羟基喜树碱。
(2)TBDPS-PySS-7-乙基-10-羟基喜树碱的制备：
将TBDPS-7-乙基-10-羟基喜树碱(3.0g，4.8mmol),4-(2-吡啶基二硫基)丁酸(3.6g，15.6mmol)，4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.75g，6.1mmol)，N，N-二异丙基乙胺(DIEA，1.0ml，6.1mmol)溶于300mL DCM中，冰浴下加入1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI，1.2g，6.1mmol)，室温下反应24小时。反应液依次以稀盐酸、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗，分液，干燥后，减压蒸去溶剂，真空干燥得3.8g黄色固体，收率为95％。经检测产物的1H NMR，表明得到4-(2-吡啶基二硫基)丁酸与TBDPS-7-乙基-10-羟基喜树碱偶联物(TBDPS-PySS-7-乙基-10-羟基喜树碱)。
(3)PySS(20)-7-乙基-10-羟基喜树碱的制备：
将TBDPS-PySS-7-乙基-10-羟基喜树碱(3.8g，4.5mmol)和TBAF(1.2g，4.5mmol)溶于THF和0.05mol/L HCl(体积比1：1)的混合液500mL中，室温反应1小时。反应液以二氯甲烷萃取后，以饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后，减压蒸去溶剂。经硅胶柱纯化，浓缩，真空干燥得2.36g黄色固体，收率为86％。对产物进行1H NMR和MS测试，表明得到4-(2-吡啶基二硫基)丁酸与7-乙基-10-羟基喜树碱(20位)偶联物(PySS-7-乙基-10-羟基喜树碱)。
(4)聚乙二醇-二硫键-7-乙基-10-羟基喜树碱(20位)的制备：
将mPEG30000-SH(8.1g，0.27mmol)溶于200mL DMF中，氮气保护、搅拌下，滴加PySS-7-乙基-10-羟基喜树碱(0.5g，0.83mmol)的DMF(100mL)溶液，室温下反应48小时。减压蒸去DMF，经硅胶柱纯化，浓缩得到4.1g淡黄色固体，收率为50％。
实施例3所得的聚合物药物前体制成纳米胶束的方法同实施例1。
为了验证本发明所得聚合物药物前体对肿瘤细胞的增殖抑制效果，我们取实施例2所得的聚合物胶束以及SN-38进行了体外抗肿瘤细胞的效果对比实验，我们以肺癌H460为例进行了实施例2所得的聚合物胶束与SN-38对肿瘤细胞的增殖抑制效果实验，具体操作过程如下：
取对数生长期的细胞，调整适当的细胞密度，接种于96孔板内，100μl/well，培养于37℃，5％CO2的培养箱内。培养过夜后给药，分别加药作用48h。分设空白组、给药组，每组设4个复孔。体外抗肺癌细胞效果如图3所示。从图3中可以看出,聚乙二醇-二硫键-7-乙基-10-羟基喜树碱(20位)聚合物胶束与SN-38具有近似的细胞毒性,聚乙二醇-二硫键-7-乙基-10-羟基喜树碱(20位)聚合物胶束对肺癌H460的半数抑制率IC50为0.734μM，有较强的抗肿瘤活性。
综上所述，本发明提供的两亲性聚合物药物前体不仅水溶性好，并且能够在水溶液中自组装成纳米胶束，且经过实验证明与原药具有基本相当的抗肿瘤活性，可以于48h内发挥出其对肿瘤细胞的抑制作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种还原响应型7-乙基-10-羟基喜树碱的两亲性聚合物药物前体，其特征在于，具有如下所示的分子结构式：
Figure FDA0003165902890000011
其中，聚合度n为5～1000，m为1或2；
所述的两亲性聚合物药物前体，可制备成聚合物纳米胶束，所述聚合物纳米胶束由如下方法制成的，将所述的聚合物药物前体和脂肪酸甘油三酯置于水中溶解得二者的混合溶液，后将溶液超声，过滤膜，向其中加入甘露醇冻干，即得聚合物纳米胶束。
2.根据权利要求1所述的两亲性聚合物药物前体，其特征在于，所述聚合度的范围为400＜n≤1000。
3.根据权利要求1所述的两亲性聚合物药物前体制得的聚合物纳米胶束，其特征在于，所述聚合物纳米胶束的粒径为10～400nm，载药量为1～50wt％。
4.一种权利要求1或2所述的两亲性聚合物药物前体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将7-乙基-10-羟基喜树碱与卤代硅烷反应，得到10位羟基得到保护的7-乙基-10-羟基喜树碱；
2)将步骤1)中所得的产物与4-(2-吡啶基二硫基)丁酸或5-(2-吡啶基二硫基)戊酸反应，得到10位羟基保护的7-乙基-10-羟基喜树碱20位酯化产物；
3)将步骤2)中所得的产物置于四丁基氟化铵的酸性环境中脱除硅烷保护基，得到7-乙基-10-羟基喜树碱的20位酯化产物；
4)将步骤3)所得的产物与巯基化聚乙二醇通过巯基-二硫键交换反应，即得7-乙基-10-羟基喜树碱的两亲性聚合物药物前体；
反应路线如下：
Figure FDA0003165902890000021
5.根据权利要求4所述的两亲性聚合物药物前体的制备方法，其特征在于，具体反应步骤如下：
步骤一：在有机胺存在下，将7-乙基-10-羟基喜树碱与卤代硅烷按摩尔比1:1～1:5溶于有机溶剂中，回流12～36小时，反应液经冷却、水洗、分液、干燥、浓缩、正己烷沉淀、过滤、真空干燥得10位羟基保护的7-乙基-10-羟基喜树碱；
步骤二：在缩合剂和有机胺存在下，将步骤一所得的10位羟基保护的7-乙基-10-羟基喜树碱和4-(2-吡啶基二硫基)丁酸或5-(2-吡啶基二硫基)戊酸按摩尔比1:1～1:3溶于二氯甲烷中，室温下反应12～36小时，反应液经水洗、分液、真空干燥得10位羟基保护的7-乙基-10-羟基喜树碱20位酯化产物；
步骤三：将步骤二所得的酯化产物和四丁基氟化铵按摩尔比1:1～1:5溶于有机溶剂中，室温反应1～5小时，反应液经萃取、水洗、干燥、硅胶柱纯化、浓缩、真空干燥得7-乙基-10-羟基喜树碱20位酯化产物；
步骤四：惰性气体保护下，搅拌条件下将巯基化聚乙二醇逐滴加入到7-乙基-10-羟基喜树碱20位酯化产物的溶液中，巯基化聚乙二醇与7-乙基-10-羟基喜树碱20位酯化产物的摩尔比为1:1～1:3，室温下反应12～36小时，浓缩、硅胶柱纯化、浓缩、真空干燥得含有二硫键的聚乙二醇抗癌药物前体。
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