CN109550055A - 一种还原响应释放原药的紫衫烷类两亲性聚合物药物前体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种还原响应释放原药的紫衫烷类两亲性聚合物药物前体及其制备方法和应用，其具有如式Ⅰ所示的分子结构式：其中，R＝‑CH₂CH₃、‑CH₂CH₂CH₃、‑CH₂CH₂CH₂CH₃或‑CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃；R₁＝‑OC(CH₃)₃或‑C₆H₅；R₂＝‑H、‑CH₃或‑COCH₃；R₃＝‑H或‑CH₃；X为NH或O；n为5～1000；m为1或2。本发明提供的药物前体能够实现靶向给药，既保留了纳米载药系统的优势，同时又发挥了二硫键在肿瘤部位特异性降解的特点。与常规的2,2′‑二硫代二乙酸、3,3′‑二硫代二丙酸等连接臂相比，无需通过进一步水解就可以得到原药分子形式的抗癌药物。

Description

一种还原响应释放原药的紫衫烷类两亲性聚合物药物前体及 其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种聚合物药物前体及其制备方法和应用，尤其涉及一种可应用于肿瘤治疗的能够自组装成胶束的紫衫烷类两亲性聚合物药物前体及其制备方法和应用。

背景技术

化疗是一种基本的肿瘤治疗方法，其主要是利用抗癌药物杀死肿瘤细胞而达到治疗肿瘤的目的。目前临床上使用的小分子化疗药物杀伤肿瘤的效果好，但是由于其能够自由穿过正常组织和肿瘤组织的血管壁，在正常组织和肿瘤组织中的分布一致，因而选择性差，对正常细胞和组织有严重的毒副作用，导致肿瘤化疗效果差。肿瘤组织对大分子药物的通透性较大(EPR效应)，因此可以将小分子抗肿瘤药物和高分子聚合物载体通过共价键连接制备大分子前药，从而达到增加药物在肿瘤组织中靶向蓄积的目的。

紫杉烷类药物是从红豆杉中得到的一类具有良好抗肿瘤活性的化合物，作用机制是加强微管蛋白聚合作用和抑制微管解聚作用，导致形成稳定的非功能性微管束，因而破坏肿瘤细胞的有丝分裂。临床应用的紫杉烷类抗肿瘤药物在水中溶解性都很低，例如目前临床上使用的紫杉烷类药物注射剂，多含有聚氧乙烯蓖麻油、吐温80和乙醇等溶剂，易产生溶血和过敏反应。将紫杉烷类药物制备成水溶性大分子前药可改善其体内的吸收和分布，对于增加其抗肿瘤效果和减小副作用具有重要意义。

在水溶性高分子聚合物中，聚乙二醇得到了广泛关注。聚乙二醇是一种生物相容性优异的高分子材料，已经被美国FDA批准为可体内注射的药用高分子聚合物之一。疏水性药物经聚乙二醇修饰之后，水溶性和体内稳定性均得以提高，并能显著降低肾脏清除率，大大延长血液循环时间，还能通过EPR效应增强肿瘤处的积聚，这些均对提高肿瘤治疗效果、降低毒副作用具有至关重要的作用。

近年来，纳米给药系统以其优良的特性受到了广泛的关注，纳米给药系统具有以下特征:较大程度提高药物的水溶性、通过提高渗透性和保留效应(EPR)来实现对肿瘤的被动靶向、延长体内循环时间、提高药物利用率以及降低毒副作用等。日本的FumiakiKoizumi等人首先合成了聚乙二醇-聚天冬氨酸衍生物嵌段聚合物，然后将紫杉醇通过物理包埋作用包埋在疏水内核中形成胶束，但该药物制备方法繁琐，药物结构也不清楚。另一方面，普通的纳米制剂并不能识别肿瘤部位与正常部位，也不能区分细胞内及细胞外的环境，因此如何让纳米制剂在体内选择性的释放出原药仍然是一大难题。

为了解决以上难题，我们通过研究发现，细胞内的谷胱甘肽浓度(0.5～10mM/L)是细胞外谷胱甘肽浓度(2～20μM/L)的200倍以上，二硫键在一定量的谷胱甘肽(GSH)或二硫苏糖醇(DTT)等还原剂的存在下被还原生成巯基，但是在人体的正常体温、pH和氧化等环境下非常稳定，即细胞外的谷胱甘肽浓度不足以还原二硫键，另外，肿瘤组织细胞比正常组织细胞缺氧，因而更具有还原性环境。因此，可以将亲水性的聚合物和疏水性的药物通过二硫键链接，并在溶剂中自组装成纳米胶束，通过细胞内吞作用进入靶细胞后被GSH还原，即二硫键断裂生成巯基，从而快速有效地释放药物，并扩散到细胞核等结构，从而杀死癌细胞。目前最常用的二硫键连接臂主要为2,2′-二硫代二乙酸、3,3′-二硫代二丙酸等，例如以3,3′-二硫代二丙酸作为连接臂的药物前体，在GSH、DTT等还原条件下，二硫键迅速发生断裂，但是释放的药物通常会带着“尾巴”，而非原药分子形式。中国专利CN102775596所公开的聚合物药物前体在二硫键断裂释放药物的时候即属于上述的情况，要想得到原料分子形式的药物需再经过酯键水解的步骤，而在人体细胞内的弱碱性条件下，酯键的水解缓慢且不完全，直接影响药物的抗肿瘤效果。

发明内容

本发明针对现有抗肿瘤药物水溶性以及靶向释放原药方面存在的不足，提供一种还原响应释放原药且能够自组装成胶束的紫衫烷类两亲性聚合物药物前体及其制备方法和应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种还原响应释放原药的紫衫烷类两亲性聚合物药物前体，具有如式Ⅰ所示的结构式：

其中，R＝-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₂CH₃或-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃；R₁＝-OC(CH₃)₃或-C₆H₅；R₂＝-H、-CH₃或-COCH₃；R₃＝-H或-CH₃；X为NH或O；n为5～1000；m为1或2。

进一步，所述聚合物药物前体具有如式Ⅱ所示的结构式：

本发明提供的紫衫烷类两亲性聚合物药物前体释放原药分子的机理为：

本发明采用了肿瘤微环境靶向给药的思路，通过引入对还原环境敏感的自毁式二硫键连接臂，在肿瘤细胞内谷胱甘肽提供的还原条件下，聚合物药物前体的二硫键发生断裂，二硫键断裂后生成一个自由的巯基，由于受到结构稳定因素的影响，该巯基会亲核进攻邻近的酯键从而生成一个稳定的五元环或六元环结构，同时释放抗癌药物的原药分子，以卡巴他赛为例，其还原响应释放原药分子的机理如下图所示：

本发明提供的聚合物药物前体的有益效果为：

1)本发明提供的药物前体能够实现靶向给药，既保留了纳米载药系统的优势，同时又发挥了二硫键在肿瘤部位特异性降解的特点。与常规的2,2′-二硫代二乙酸、3,3′-二硫代二丙酸等连接臂相比，无需通过进一步水解就可以得到原药分子形式的抗癌药物。

2)本发明得到的两亲性聚合物药物前体，可以在溶剂中自发组装成纳米胶束。

本发明还要求保护由上述的聚合物药物前体制备而成的聚合物纳米胶束，所述聚合物纳米胶束是由如下方法制成的，将前述的聚合物药物前体和脂肪酸甘油三酯置于水中溶解得二者的混合溶液，后将溶液超声，过滤膜，向其中加入甘露醇冻干，即得聚合物纳米胶束，所得胶束的粒径为10～400nm，载药量为2～60wt％。

本发明还要求保护前述的药物前体以及由本发明的药物前体制备而成的聚合物纳米胶束在抗肿瘤药物领域的应用。

进一步，所述肿瘤指的是结直肠癌或者前列腺癌中的任意一种。

本发明还提供了上述两亲性聚合物药物前体的制备方法，包括如下步骤：

1)使用对硝基氯甲酸苯酯与紫衫烷类药物于碱性条件下反应制备4-硝基苯基-2′-紫衫烷碳酸酯；

2)使用含有2-3个碳原子的吡啶二硫基醇或吡啶二硫基胺与步骤1)制备的4-硝基苯基-2′-紫衫烷碳酸酯于碱性条件下反应制备吡啶二硫基紫衫烷碳酸酯；

3)将步骤2)制备的吡啶二硫基紫衫烷碳酸酯与巯基化聚乙二醇通过巯基-二硫键交换反应，制得含有二硫键的聚乙二醇化紫衫烷聚合物药物前体。

进一步，各个步骤的具体反应过程如下：

步骤1)：将紫衫烷类药物溶于有机溶剂中，0℃下将对硝基氯甲酸苯酯滴加至溶液中，后向溶液中缓慢加入4-二甲氨基吡啶，其中，对硝基氯甲酸苯酯和4-二甲氨基吡啶与紫衫烷类药物的摩尔比均为(1～3)：1，0℃下反应2～8小时，反应液经酸洗、分液、干燥、浓缩、硅胶柱纯化、浓缩、真空干燥得4-硝基苯基-2′-紫衫烷碳酸酯；

步骤2)：将含有2-3个碳原子的吡啶二硫基醇或吡啶二硫基胺与4-硝基苯基-2′-紫衫烷碳酸酯按摩尔比(1～3)：1溶于溶剂中，室温搅拌条件下缓慢加入4-二甲氨基吡啶，其中4-二甲氨基吡啶与4-硝基苯基-2′-紫衫烷碳酸酯的摩尔比为(1～3):1，回流12-36小时，反应液依次经碱洗、酸洗、分液、干燥、浓缩、硅胶柱纯化、浓缩、真空干燥得吡啶二硫基紫衫烷碳酸酯；

步骤3)：惰性气体保护下，搅拌条件下将巯基化聚乙二醇滴加到步骤2)所得的吡啶二硫基紫衫烷碳酸酯的溶液中，巯基化聚乙二醇与吡啶二硫基紫衫烷碳酸酯的摩尔比为1:(1～3)，室温下反应12-48小时，反应液经浓缩、硅胶柱纯化、浓缩、真空干燥得含有二硫键的聚乙二醇化紫衫烷聚合物药物前体。

本发明提供的紫衫烷类两亲性聚合物药物前体的制备方法的有益效果是：原料易得、反应条件温和、产率和产物纯度高等优点，利于批量生产。

附图说明

图1为实施例1所得聚合物药物前体在DTT条件下还原响应释药结果图；

图2为实施例2所得胶束的粒径分布图；

图3为实施例2所得胶束与卡巴他赛对结肠癌细胞HCT116的增殖抑制活性比较；

图4为实施例2所得胶束与卡巴他赛对前列腺癌细胞DU145的增殖抑制活性比较。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明实施例中所采用的溶液浓度单位M＝mol/L。

实施例1：

一种还原响应释放原药的卡巴他赛的两亲性聚合物药物前体，具有如下结构式：

上述卡巴他赛的两亲性聚合物药物前体的制备方法如下：

(1)4-硝基苯基-2′-卡巴他赛碳酸酯的制备：

将卡巴他赛(8.0g，9.6mmol)和4-二甲氨基吡啶DMAP(1.76g，14.4mmol)溶于500mL二氯甲烷DCM中，0℃下滴加氯甲酸对硝基苯酯(3.0g，14.4mmol)的DCM溶液(100mL)后，0℃保温反应4小时。以0.1M的HCl溶液洗有机相后，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，经硅胶柱纯化得到8.9g白色固体，收率为93％。对产物进行¹H NMR和MS测试(m/z＝1000.8)，表明得到式a所示结构的4-硝基苯基-2′-卡巴他赛碳酸酯。

(2)2-(2-吡啶基二硫基)-2′-卡巴他赛碳酸酯的制备：

将4-硝基苯基-2′-卡巴他赛碳酸酯(7.0g，7.0mmol)和2-(2-吡啶基二硫基)乙醇(2.62g，14.0mmol)溶于400mL二氯甲烷中，加入4-二甲氨基吡啶(DMAP，2.57g，21.0mmol)，回流过夜。反应液依次以1M的碳酸氢钠溶液和0.1M的稀盐酸洗，干燥后，减压蒸去溶剂，粗品经硅胶柱纯化得到6.24g白色固体，收率为85％。对产物进行¹H NMR和MS测试(m/z＝1048.8)，表明得到式b所示结构的2-(2-吡啶基二硫基)-2′-卡巴他赛碳酸酯。

(3)聚乙二醇-二硫键(O)-卡巴他赛的制备：

将Et-PEG₂₀₀₀-SH(9.0g，5.5mmol)溶于100mL DMF中，氮气保护、搅拌下，滴加2-(2-吡啶基二硫基)-2′-卡巴他赛碳酸酯(5.74g，5.5mmol)的DMF(200mL)溶液，室温下反应24小时。减压蒸去DMF，经硅胶柱纯化，浓缩得到9.7g白色固体，收率为60％。对产物进行¹HNMR测试，表明得到式c所示结构的聚乙二醇-二硫键(O)-卡巴他赛。

合成路线如下所示：

实施例2：

一种含有实施例1所得两亲性聚合物药物前体的纳米胶束，采用如下方法制成：将20mg聚合物药物前体和10μL中链脂肪酸甘油三酯置于水中，然后超声1min，过滤膜，向其中加入甘露醇冻干，即得还原响应型聚合物纳米胶束冻干粉。利用动态光散射(DynamicLight Scattering，DLS)测定得到纳米胶束的粒径及分布，如图2所示。

实施例3：

一种还原响应释放原药的多西他赛的两亲性聚合物药物前体，具有如下结构式：

上述多西他赛两亲性聚合物药物前体的制备方法如下：

(1)4-硝基苯基-2′-多西他赛碳酸酯的制备：

将多西他赛(2.0g，2.5mmol)和4-二甲氨基吡啶DMAP(0.3g，2.5mmol)溶于100mL二氯甲烷中，0℃下滴加氯甲酸对硝基苯酯(0.5g，2.5mmol)的DCM溶液(50mL)后，0℃保温反应8小时。以0.1M的HCl溶液洗有机相后，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，经硅胶柱纯化得到1.10g白色固体，收率为45％。对产物进行¹H NMR和MS测试(m/z＝973.58)，表明得到式d所示结构的4-硝基苯基-2′-多西他赛碳酸酯。

(2)2-(2-吡啶基二硫基)-2’-多西他赛碳酸酯的制备：

将4-硝基苯基-2′-多西他赛碳酸酯(1.0g，1.03mmol)和2-(2-吡啶基二硫基)乙醇(0.57g，3.0mmol)溶于100mL二氯甲烷中，加入4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.24g，2.0mmol)，回流过夜。反应液依次以1M的碳酸氢钠溶液和0.1M的稀盐酸洗，干燥后，减压蒸去溶剂，粗品经硅胶柱纯化得到0.42g白色固体，收率为40％。对产物进行¹H NMR和MS测试(m/z＝1022)，表明得到式e所示结构的2-(2-吡啶基二硫基)-2′-多西他赛碳酸酯。

(3)聚乙二醇-二硫键(O)-多西他赛的制备：

将Pr-PEG5000-SH(1.0g，0.2mmol)溶于25mL DMF中，氮气保护、搅拌下，滴加2-(2-吡啶基二硫基)-2′-多西他赛碳酸酯(0.4g，0.39mmol)的DMF(25mL)溶液，室温下反应48小时。减压蒸去DMF，经硅胶柱纯化，浓缩得到0.66g白色固体，收率为56％。对产物进行¹H NMR测试，表明得到式f所示结构的聚乙二醇-二硫键(O)-多西他赛。

合成路线如下所示：

实施例4：

一种还原响应释放原药的紫杉醇两亲性聚合物药物前体，具有如下结构式：

上述紫杉醇两亲性聚合物药物前体的制备方法如下：

(1)4-硝基苯基-2′-紫杉醇碳酸酯的制备：

将紫杉醇(3.0g，3.5mmol)和4-二甲氨基吡啶DMAP(1.27g，10.5mmol)溶于100mL二氯甲烷中，0℃下滴加氯甲酸对硝基苯酯(2.2g，10.5mmol)的DCM溶液(50mL)后，0℃保温反应2小时。以0.1M的HCl溶液洗有机相后，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，经硅胶柱纯化得到2.4g白色固体，收率为67％。对产物进行¹H NMR和MS测试(m/z＝1019.51)，表明得到式g所示结构的4-硝基苯基-2′-紫杉醇碳酸酯。

(2)3-(2-吡啶基二硫基)丙胺基甲酸-2′-紫杉醇酯的制备：

将4-硝基苯基-2′-紫杉醇碳酸酯(2.4g，2.4mmol)和3-(2-吡啶基二硫基)丙胺(0.48g，2.4mmol)溶于150mL二氯甲烷中，加入4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.88g，7.2mmol)，回流过夜。反应液依次以1M的碳酸氢钠溶液和0.1M的稀盐酸洗，干燥后，减压蒸去溶剂，粗品经硅胶柱纯化得到1.8g白色固体，收率为70％。对产物进行¹H NMR和MS测试(m/z＝1080.72)，表明得到式h所示结构的3-(2-吡啶基二硫基)丙胺基甲酸-2′-紫杉醇酯。

(3)聚乙二醇-二硫键(N)-紫杉醇的制备：

将n-amyl-PEG₁₀₀₀-SH(0.47g，0.47mmol)溶于50mL DMF中，氮气保护、搅拌下，滴加3-(2-吡啶基二硫基)丙胺基甲酸-2′-紫杉醇酯(1.5g，1.4mmol)的DMF(50mL)溶液，室温下反应12小时。减压蒸去DMF，经硅胶柱纯化，浓缩得到0.6g白色固体，收率为65％。对产物进行¹H NMR测试，表明得到式i所示结构的聚乙二醇-二硫键(N)-紫杉醇。

合成路线如下所示：

为了验证实施例1所得的两亲性聚合物药物前体在还原条件下是否释放原药分子，我们将实施例1所得聚合物药物前体置于10mM的还原剂DTT溶液中后不同时间的产物均进行了HPLC测试，结果如图1所示，由图1我们可以看出，实施例1所得聚合物药物前体在DTT溶液中放置10min后，产物中已经出现了原药分子卡巴他赛，表明已经有一部分的聚合物药物前体分解释放出了原药，而随着放置时间的逐渐延长，聚合物药物前体的量逐渐降低，因而本申请提供的聚合物药物前体在还原条件下可以迅速分解释放原药。

为了验证本发明所得聚合物药物前体对肿瘤细胞的增殖抑制效果，我们取实施例2所得的聚合物胶束以及卡巴他赛进行了体外抗肿瘤细胞的效果对比实验，我们以结直肠癌HCT116和前列腺癌DU145为例分别进行了实施例2所得的聚合物胶束与卡巴他赛对肿瘤细胞的增殖抑制效果实验，具体操作过程如下：

1)结直肠癌HCT116

取对数生长期的细胞，调整适当的细胞密度，接种于96孔板内，100μl/well，培养于37℃，5％CO2的培养箱内。培养过夜后给药，分别加药作用48h。分设空白组、给药组，每组设4个复孔。体外抗结直肠癌效果如图3所示。从图3中可以看出,聚乙二醇-二硫键(O)-卡巴他赛与卡巴他赛具有近似的细胞毒性,聚乙二醇-二硫键(O)-卡巴他赛对结直肠癌HCT116的半数致死量IC50为0.001μM，有较强的抗肿瘤活性。

2)前列腺癌DU145

取对数生长期的细胞，调整适当的细胞密度，接种于96孔板内，100μl/well，培养于37℃，5％CO₂的培养箱内。培养过夜后给药，分别加药作用48h。分设空白组、给药组，每组设4个复孔。体外抗乳腺癌细胞效果如图4所示。从图4中可以看出,聚乙二醇-二硫键(O)-卡巴他赛与卡巴他赛具有近似的细胞毒性,聚乙二醇-二硫键(O)-卡巴他赛对前列腺癌DU145的半数致死量IC50为0.095μM。

综上所述，本发明提供的两亲性聚合物药物前体不仅水溶性好，并且能够在肿瘤细胞内的还原条件下1h内释放出原药，实现了靶向释放，且经过实验证明与原药具有基本相同的抗肿瘤活性，可以于48h内发挥出其对肿瘤细胞的抑制作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种还原响应释放原药的紫衫烷类两亲性聚合物药物前体，其特征在于，具有如式Ⅰ所示的分子结构式：

其中，R＝-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₂CH₃或-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃；R₁＝-OC(CH₃)₃或-C₆H₅；R₂＝-H、-CH₃或-COCH₃；R₃＝-H或-CH₃；X为NH或O；n为5～1000；m为1或2。

2.根据权利要求1所述的聚合物药物前体，其特征在于，具有如式Ⅱ所示的结构式：

。

3.一种聚合物纳米胶束，其特征在于，所述聚合物纳米胶束是由如下方法制成的，将权利要求1-2中任一项所述的聚合物药物前体和脂肪酸甘油三酯置于水中溶解得二者的混合溶液，后将溶液超声，过滤膜，向其中加入甘 露醇冻干，即得聚合物纳米胶束。

4.根据权利要求3所述的聚合物纳米胶束，其特征在于，所述聚合物纳米胶束的粒径为10～400nm，载药量为2～60wt％。

5.一种权利要求1-2中任一项所述的聚合物药物前体和权利要求3、4中任一项所述的聚合物纳米胶束在抗肿瘤药物领域的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是指结直肠癌或者前列腺癌中的任意一种。

7.一种权利要求1-2中任一项所述的聚合物药物前体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)使用对硝基氯甲酸苯酯与紫衫烷类药物于碱性条件下反应制备4-硝基苯基-2′-紫衫烷碳酸酯；

2)使用含有2-3个碳原子的吡啶二硫基醇或吡啶二硫基胺与步骤1)制备的4-硝基苯基-2′-紫衫烷碳酸酯于碱性条件下反应制备吡啶二硫基紫衫烷碳酸酯；

3)将步骤2)制备的吡啶二硫基紫衫烷碳酸酯与巯基化聚乙二醇通过巯基-二硫键交换反应，制得含有二硫键的聚乙二醇化紫衫烷聚合物药物前体。

8.根据权利要求7所述的聚合物药物前体的制备方法，其特征在于，各个步骤的具体反应过程如下：

步骤1)：将紫衫烷类药物溶于有机溶剂中，0℃下将对硝基氯甲酸苯酯滴加至溶液中，后向溶液中缓慢加入4-二甲氨基吡啶，其中，对硝基氯甲酸苯酯和4-二甲氨基吡啶与紫衫烷类药物的摩尔比均为(1～3)：1，0℃下反应2～8小时，反应液经酸洗、分液、干燥、浓缩、硅胶柱纯化、浓缩、真空干燥得4-硝基苯基-2′-紫衫烷碳酸酯；

步骤2)：将含有2-3个碳原子的吡啶二硫基醇或吡啶二硫基胺与4-硝基苯基-2′-紫衫烷碳酸酯按摩尔比(1～3)：1溶于溶剂中，室温搅拌条件下缓 慢加入4-二甲氨基吡啶，其中4-二甲氨基吡啶与4-硝基苯基-2′-紫衫烷碳酸酯的摩尔比为(1～3):1，回流12-36小时，反应液依次经碱洗、酸洗、分液、干燥、浓缩、硅胶柱纯化、浓缩、真空干燥得吡啶二硫基紫衫烷碳酸酯；

步骤3)：惰性气体保护下，搅拌条件下将巯基化聚乙二醇滴加到步骤2)所得的吡啶二硫基紫衫烷碳酸酯的溶液中，巯基化聚乙二醇与吡啶二硫基紫衫烷碳酸酯的摩尔比为1:(1～3)，室温下反应12-48小时，反应液经浓缩、硅胶柱纯化、浓缩、真空干燥得含有二硫键的聚乙二醇化紫衫烷聚合物药物前体。