CN108926718A - 一种还原响应释放原药的两亲性聚合物药物前体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种还原响应释放原药的两亲性聚合物药物前体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种还原响应释放原药的两亲性聚合物药物前体及其制备方法和应用，其具有如式Ⅰ所示的分子结构式：其中，X为NH或O；ROH为疏水性抗肿瘤药物；n为5～1000；m为1或2。本发明提供的药物前体能够实现靶向给药，既保留了纳米载药系统的优势，同时又发挥了二硫键在肿瘤部位特异性降解的特点。与常规的2,2′‑二硫代二乙酸、3,3′‑二硫代二丙酸等连接臂相比，无需通过进一步水解就可以得到原药分子形式的抗癌药物。

Description

一种还原响应释放原药的两亲性聚合物药物前体及其制备方 法和应用
技术领域
本发明涉及一种聚合物药物前体及其制备方法和应用，尤其涉及一种可应用于肿瘤治疗的聚乙二醇化两亲性聚合物药物前体及其制备方法和应用。
背景技术
化疗是一种基本的肿瘤治疗方法，其主要是利用抗癌药物杀死肿瘤细胞而达到治疗肿瘤的目的。临床上常用的抗癌药物主要包括喜树碱类、紫杉烷类、长春碱和蒽醌类等，但这些抗癌药物理化性质较差(例如难溶于水，选择性差等)，对正常细胞和组织有严重的毒副作用，导致肿瘤化疗效果差，因此临床应用受到限制。
通过化学修饰在药物的分子结构中引入亲水性基团，制备得到水溶性的前药，可以有效的解决疏水性药物的水溶性问题。在水溶性高分子聚合物中，聚乙二醇得到了广泛关注。聚乙二醇是一种生物相容性优异的高分子材料，已经被美国FDA批准为可体内注射的药用高分子聚合物之一。疏水性药物经聚乙二醇修饰之后，水溶性和体内稳定性均得以提高，并能显著降低肾脏清除率，大大延长血液循环时间，还能通过EPR效应增强肿瘤处的积聚，这些均对提高肿瘤治疗效果、降低毒副作用具有至关重要的作用。
近年来，纳米给药系统以其优良特性受到了广泛的关注，纳米给药系统具有以下特征:较大程度提高药物的水溶性、通过提高渗透性和保留效应 (EPR)来实现对肿瘤的被动靶向、延长体内循环时间、提高药物利用率以及降低毒副作用等。然而，普通的纳米制剂并不能识别肿瘤部位与正常部位，也不能区分细胞内及细胞外的环境，因此如何让纳米制剂在体内选择性的释放出原药仍然是一大难题。
研究发现，细胞内的谷胱甘肽浓度(0.5～10mM/L)是细胞外谷胱甘肽浓度(2～20μM/L)的200倍以上，二硫键在一定量的谷胱甘肽(GSH) 或二硫苏糖醇(DTT)等还原剂存在下被还原生成巯基，但是在人体的正常体温、pH和氧化等环境下非常稳定，即细胞外的谷胱甘肽浓度不足以还原二硫键，另外，肿瘤组织细胞比正常组织细胞缺氧，更具有还原性环境。因此，可以将亲水性的聚合物和疏水性的药物通过二硫键链接，并在溶剂中自组装成纳米胶束，通过细胞内吞作用进入靶细胞后被GSH还原，即二硫键断裂生成巯基，从而快速有效地释放药物，并扩散到细胞核等结构，从而杀死癌细胞。目前最常用的二硫键连接臂主要为2,2′-二硫代二乙酸、3,3′-二硫代二丙酸等，例如以3,3′-二硫代二丙酸作为连接臂的药物前体，在GSH、 DTT等还原条件下，二硫键迅速发生断裂，但是释放的药物通常会带着“尾巴”，而非原药分子形式。
发明内容
本发明针对现有抗肿瘤药物水溶性以及靶向释放原药方面存在的不足，提供一种还原响应释放原药的两亲性聚合物药物前体及其制备方法和应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种还原响应释放原药的两亲性聚合物药物前体，具有如式Ⅰ所示的结构式：
其中，X为NH或O；ROH为疏水性抗肿瘤药物；n为5～1000；m 为1或2。
进一步，所述聚合物药物前体具有如式Ⅱ所示的结构式：
进一步，所述抗肿瘤药物是指喜树碱类、紫杉烷类、长春碱类药物中的任意一种。
进一步，所述喜树碱类药物是指喜树碱、伊立替康、拓扑替康、10-羟基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)中的一种，所述紫杉烷类药物是指紫杉醇、多烯紫杉醇、卡巴他赛、拉洛他赛中的一种，所述长春碱类药物是指长春碱、长春新碱、长春瑞滨中的一种。
本发明提供的聚合物药物前体释放原药分子的机理为：
本发明采用了肿瘤微环境靶向给药的思路，通过引入对还原环境敏感的自毁式二硫键连接臂，在肿瘤细胞内谷胱甘肽提供的还原条件下，聚合物药物前体的二硫键发生断裂，二硫键断裂后生成一个自由的巯基，由于受到结构稳定因素的影响，该巯基会亲核进攻邻近的酯键从而生成一个稳定的五元环或六元环结构，同时释放抗癌药物的原药分子，以7-乙基-10-羟基喜树碱即SN-38为例，其还原响应释放原药分子的机理如下所示：
本发明提供的聚合物药物前体的有益效果为：
1)本发明提供的药物前体能够实现靶向给药，既保留了纳米载药系统的优势，同时又发挥了二硫键在肿瘤部位特异性降解的特点。与常规的2,2′-二硫代二乙酸、3,3′-二硫代二丙酸等连接臂相比，无需通过进一步水解就可以得到原药分子形式的抗癌药物。
2)本发明得到的两亲性聚合物药物前体，可以在溶剂中自发组装成纳米胶束。
本发明还要求保护由上述的药物前体制备而成的聚合物纳米胶束，所述纳米胶束是通过将上述的聚乙二醇化两亲性聚合物药物前体置于水中溶解，后将溶液超声，过滤膜，向其中加入甘露醇冻干，即得，所得胶束的粒径为 10～400nm，载药量为1～50wt％。
本发明还要求保护前述的药物前体以及由本发明的药物前体制备而成的聚合物纳米胶束在抗肿瘤药物领域的应用。
进一步，所述肿瘤指的是结直肠癌、乳腺癌或者肺癌中的任意一种。
本发明还提供了上述两亲性聚合物药物前体的制备方法，包括如下步骤：
1)将含有2-3个碳原子的巯基醇或巯基胺与2,2′-二硫二吡啶反应，制备吡啶基二硫基醇或吡啶基二硫基胺；
2)使用对硝基氯甲酸苯酯与步骤1)得到的吡啶基二硫基醇或吡啶基二硫基胺进行偶联反应制备碳酸酯或氨基碳酸酯；
3)将步骤2)所得碳酸酯或氨基碳酸酯与含羟基基团的疏水性抗肿瘤药物通过酯交换反应生成偶联物；
4)将步骤3)所得的偶联物与巯基化聚乙二醇通过巯基-二硫键交换反应，制备含有二硫键的聚乙二醇聚合物药物前体；
反应路线如下：
进一步，上述制备方法中各个步骤的具体反应过程如下：
步骤1)：将含有2-3个碳原子的巯基醇或巯基胺和2,2′-二硫二吡啶按照摩尔比1:1～1:3加入溶剂中，室温反应12～48小时，反应完毕，浓缩、硅胶柱分离、浓缩、干燥得吡啶基二硫基醇或吡啶基二硫基胺；
步骤2)：在碱性条件下，将步骤1)所得的吡啶基二硫基醇或吡啶基二硫基胺溶于溶剂中，室温搅拌下将对硝基氯甲酸苯酯按摩尔比1:1～1:3缓慢滴加至溶液中，室温反应1～10小时，浓缩、硅胶柱分离、浓缩、干燥得碳酸酯或氨基碳酸酯；
步骤3)：在碱性条件下，将步骤2)所得的碳酸酯或氨基碳酸酯和含有羟基基团的疏水性抗肿瘤药物按摩尔比1:1～1:3溶于溶剂中，回流反应1～10小时，降至室温，反应液经酸洗、分液、干燥、浓缩、硅胶柱纯化、浓缩、真空干燥得二者的偶联物；
步骤4)：氮气保护下，搅拌条件下将巯基化聚乙二醇滴加到步骤3)所得偶联物的溶液中，巯基化聚乙二醇和偶联物的摩尔比为1:1～1:3，室温下反应 12～48小时，浓缩、硅胶柱纯化、浓缩、溶解、过滤、冻干，得含有二硫键的聚乙二醇抗癌药物前体。
本发明提供的两亲性聚合物药物前体的制备方法的有益效果是：原料易得、反应条件温和、产率和产物纯度高等优点，利于批量生产。
附图说明
图1为SN-38、实施例1所得聚合物药物前体以及实施例1所得聚合物药物前体在DTT条件下还原响应释药高效液相图；
图2为实施例4所得胶束的粒径分布图；
图3为实施例4所得胶束的透射电镜照片；
图4为实施例4所得胶束与SN-38对结肠癌细胞HCT116的增殖抑制活性比较；
图5为实施例4所得胶束与SN-38对结肠癌细胞HT29的增殖抑制活性比较；
图6为实施例4所得胶束与SN-38对乳腺癌MCF-7的增殖抑制活性比较；
图7为实施例4所得胶束与SN-38对肺癌A549的增殖抑制活性比较。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：
一种还原响应释放原药的两亲性聚合物药物前体，具有如下结构式：
上述两亲性聚合物药物前体的制备方法如下：
1)2-(2-吡啶基二硫基)乙醇的制备：
将2-巯基乙醇(0.87g，11.1mmol)和2,2′-二硫二吡啶(Py-SS-Py，3.63g，16.5mmol)加入100mL甲醇中，室温反应24小时。减压蒸去甲醇，过硅胶柱纯化，浓缩，真空干燥得1.6g淡黄色油状产物，收率82.8％。经检测产物的1HNMR，表明得到式a所示的2-(2-吡啶基二硫基)乙醇。
2)4-硝基苯基-2-(2-吡啶基二硫基)乙基碳酸酯的制备：
将2-(2-吡啶基二硫基)乙醇(1.6g，9.19mmol)和三乙胺(1.85g，18.3 mmol)溶于100mL二氯甲烷中，室温搅拌下将对硝基氯甲酸苯酯(2.77g， 13.8mmol)缓慢滴加至溶液中，滴毕，室温反应3小时。浓缩，硅胶柱分离、浓缩、真空干燥得白色固体产物2.21g，收率68.3％。经检测产物的1H NMR，表明得到式b所示的4-硝基苯基-2-(2-吡啶基二硫基)乙基碳酸酯； 3)2-(2-吡啶基二硫基)乙基碳酸酯与SN-38偶联物的制备：
将4-硝基苯基-2-(2-吡啶基二硫基)乙基碳酸酯(2.21g，6.28mmol) 和SN-38(3.69g，9.42mmol)溶于200mL二氯甲烷中，加入2ml三乙胺，然后升温至回流反应5小时。反应完毕，降至室温，用稀盐酸水洗有机相、分液、干燥、浓缩、经硅胶柱纯化、浓缩，真空干燥得2.8g淡黄色固体，收率为73.7％。经检测产物的1H NMR，表明得到式c所示结构的2-(2-吡啶基二硫基)乙基碳酸酯与SN-38偶联物(Py-SS(O)-SN38)。
4)聚乙二醇-二硫键(O)-SN38的制备：
将PEG2000-SH(6.0g，3.0mmol)溶于100mL DMF中，氮气保护、搅拌下，滴加Py-SS(O)-SN38(2.0g，3.3mmol)的DMF(100mL)溶液，室温下反应24小时。减压蒸去DMF，经硅胶柱纯化，浓缩，得到5.08g淡黄色固体，收率为67.9％。经检测产物的1H NMR，表明得到式d所示结构的聚乙二醇-二硫键(O)-SN38。
合成路线如下所示：
为了验证实施例1所得的两亲性聚合物药物前体在还原条件下是否释放原药分子，我们对SN-38、实施例1所得聚合物药物前体以及实施例1所得聚合物药物前体置于10mM/L的还原剂DTT溶液中后不同时间的产物均进行了HPLC测试，结果如图1所示，由图1我们可以看出，实施例1所得聚合物药物前体在DTT溶液中放置1h后，产物中已经出现了原药分子SN-38 的峰，表明已经有一部分的聚合物药物前体分解释放出了SN-38的原药，聚合物药物前体在10mM/L的DTT溶液中放置2h的HPLC出峰更加印证了这一结论，因而，本申请提供的聚合物药物前体在还原条件下可以迅速分解释放原药。
实施例2：
一种含有实施例1所得两亲性聚合物药物前体的纳米胶束，采用如下方法制成：实施例1制备的聚合物药物前体1.0g加入50mL水中溶解，超声 30秒，过0.22μm滤膜，加3％(w/v)甘露醇冻干，即得还原响应型聚合物纳米胶束。利用动态光散射(Dynamic LightScattering，DLS)测定得到纳米胶束的粒径及分布，如图2所示；并用透射电子显微镜(Transmission ElectronMicroscope，TEM)观测聚合物纳米胶束的形貌，如图3所示。
实施例3：
一种还原响应释放原药的两亲性聚合物药物前体，具有如下结构式：
上述两亲性聚合物药物前体的制备方法如下：
1)3-(2-吡啶基二硫基)丙醇的制备：
将3-巯基丙醇(0.5g，5.43mmol)和2,2′-二硫二吡啶(Py-SS-Py，2.4 g，10.8mmol)加入60mL甲醇中，室温反应24小时。室温反应24小时。减压蒸去甲醇，过硅胶柱纯化，浓缩，真空干燥得如式e所示的0.87g淡黄色油状液体产物，收率79.7％。
2)4-硝基苯基-3-(2-吡啶基二硫基)丙基碳酸酯的制备：
将3-(2-吡啶基二硫基)丙醇(0.87g，4.33mmol)和三乙胺(0.52g， 5.15mmol)溶于50mL二氯甲烷中，室温搅拌下将对硝基氯甲酸苯酯(1.03 g，5.12mmol)缓慢滴加至溶液中，滴毕，室温反应5小时。浓缩，硅胶柱分离、浓缩、真空干燥得式f所示的淡黄色油状液体1.32g，收率83.3％。
3)3-(2-吡啶基二硫基)丙基碳酸酯与卡巴他赛偶联物的制备：
将4-硝基苯基-3-(2-吡啶基二硫基)丙基碳酸酯(1.32g，3.61mmol) 和卡巴他赛(3.02g，3.61mmol)溶于100mL二氯甲烷中，加入1ml三乙胺，然后升温至回流反应5小时。反应完毕，降至室温，用稀盐酸水洗有机相、分液、干燥、浓缩、经硅胶柱纯化、浓缩，真空干燥得如式g所示的2.52 g淡黄色固体3-(2-吡啶基二硫基)丙基碳酸酯与卡巴他赛偶联物(Py-SS(O) -卡巴他赛)，收率为65.8％。
4)聚乙二醇-二硫键(O)-卡巴他赛的制备：
将PEG5000-SH(4.3g，2.15mmol)溶于100mL DMF中，氮气保护、搅拌下，滴加Py-SS(O)-卡巴他赛(2.52g，2.37mmol)的DMF(100mL) 溶液，室温下反应24小时。减压蒸去DMF，经硅胶柱纯化，浓缩，得到式 h所示的4.45g淡黄色固体，收率为70.1％。
合成路线如下：
实施例4:
一种还原响应释放原药的两亲性聚合物药物前体，具有如下结构式：
上述两亲性聚合物药物前体的制备方法如下：
1)3-(2-吡啶基二硫基)丙胺盐酸盐的制备：
将3-巯基丙胺盐酸盐(1.0g，7.87mmol)和2,2′-二硫二吡啶(Py-SS-Py， 5.2g，23.6mmol)加入30mL甲醇中，室温反应24小时。减压蒸去甲醇，过硅胶柱纯化，浓缩，真空干燥得具有如i所示结构的1.4g淡黄色固体产物，收率75.4％。
2)3-(2-吡啶基二硫基)丙氨基甲酸-4-硝基苯基酯的制备：
将3-(2-吡啶基二硫基)丙胺盐酸盐(1.4g，5.93mmol)和三乙胺(1.2g， 11.8mmol)溶于100mL二氯甲烷中，室温搅拌下将对硝基氯甲酸苯酯 (3.57g，17.79mmol)缓慢滴加至溶液中，滴毕，室温反应3小时。浓缩，硅胶柱分离、浓缩、真空干燥得如j所示结构的白色固体产物1.5g，收率 69.3％。
3)3-(2-吡啶基二硫基)丙氨基甲酸与长春瑞滨偶联物的制备：
将3-(2-吡啶基二硫基)丙氨基甲酸-4-硝基苯基酯(1.5g，4.11mmol) 和长春瑞滨(9.6g，12.33mmol)溶于200mL二氯甲烷中，加入2ml三乙胺，然后升温至回流反应5小时。反应完毕，降至室温，用稀盐酸水洗有机相、分液、干燥、浓缩、经硅胶柱纯化、浓缩，真空干燥得如k所示结构的淡黄色固体3-(2-吡啶基二硫基)丙氨基甲酸与长春瑞滨偶联物(Py-SS(N)-长春瑞滨)2.75g，收率为79.1％。
4)聚乙二醇-二硫键(N)-长春瑞滨的制备：
将PEG1000-SH(5.4g，2.70mmol)溶于100mL DMF中，氮气保护、搅拌下，滴加Py-SS(N)-长春瑞滨(8.1g，8.1mmol)的DMF(150mL) 溶液，室温下反应24小时。减压蒸去DMF，经硅胶柱纯化，浓缩，得到如式I所示的淡黄色固体6.07g，收率为77.6％。
合成路线如下所示：
为了验证本发明所得聚合物药物前体对肿瘤细胞的增殖抑制效果，我们取实施例2所得的聚合物胶束以及SN-38进行了体外抗肿瘤细胞的效果对比实验，我们以结直肠癌HCT116、结直肠癌HT29、乳腺癌MCF-7和肺癌A549 为例分别进行了实施例2所得的聚合物胶束与SN-38对肿瘤细胞的增殖抑制效果实验，具体操作过程如下：
1)结直肠癌HCT116、结直肠癌HT29
取对数生长期的细胞，调整适当的细胞密度，接种于96孔板内，100 μl/well，培养于37℃，5％CO2的培养箱内。培养过夜后给药，分别加药作用 48h。分设空白组、给药组，每组设4个复孔。体外抗结直肠癌效果如图4 和图5所示。从图4和图5中可以看出,聚乙二醇-二硫键(O)-SN38与SN-38 具有近似的细胞毒性,聚乙二醇-二硫键(O)-SN38对结直肠癌HCT116的半数致死量IC50为0.398μM，对结直肠癌HT29的半数致死量IC50为2.155 μM,有较强的抗肿瘤活性。
2)乳腺癌MCF-7
取对数生长期的细胞，调整适当的细胞密度，接种于96孔板内，100μ l/well，培养于37℃，5％CO2的培养箱内。培养过夜后给药，分别加药作用 48h。分设空白组、给药组，每组设4个复孔。体外抗乳腺癌细胞效果如图 6所示。从图6中可以看出,聚乙二醇-二硫键(O)-SN38与SN-38具有近似的细胞毒性,聚乙二醇-二硫键(O)-SN38对乳腺癌MCF-7的半数致死量 IC50为2.071μM。
3)肺癌A549
取对数生长期的细胞，调整适当的细胞密度，接种于96孔板内，100μ l/well，培养于37℃，5％CO2的培养箱内。培养过夜后给药，分别加药作用48h。分设空白组、给药组，每组设4个复孔。体外抗肺癌细胞效果如图7 所示；从图7中可以看出,聚乙二醇-二硫键(O)-SN38与SN-38具有近似的细胞毒性,聚乙二醇-二硫键(O)-SN38对肺癌A549的半数致死量IC50 为2.428μM。
综上所述，本发明提供的两亲性聚合物药物前体不仅水溶性好，并且能够在肿瘤细胞内的还原条件下1h内释放出原药，实现了靶向释放，且经过实验证明与原药具有基本相同的抗肿瘤活性，可以于48h内发挥出其对肿瘤细胞的抑制作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种还原响应释放原药的两亲性聚合物药物前体，其特征在于，具有如式Ⅰ所示的结构式：
其中，X为NH或O；ROH为疏水性抗肿瘤药物；n为5～1000；m为1或2。
2.根据权利要求1所述的聚合物药物前体，其特征在于，具有如式Ⅱ所示的结构式：
3.根据权利要求1或2所述的聚合物药物前体，其特征在于，所述抗肿瘤药物是指喜树碱类、紫杉烷类、长春碱类药物中的任意一种。
4.根据权利要求3所述的聚合物药物前体，其特征在于，所述喜树碱类药物是指喜树碱、伊立替康、拓扑替康、10-羟基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱中的一种，所述紫杉烷类药物是指紫杉醇、多烯紫杉醇、卡巴他赛、拉洛他赛中的一种，所述长春碱类药物是指长春碱、长春新碱、长春瑞滨中的一种。
5.一种聚合物纳米胶束，其特征在于，所述聚合物纳米胶束是由如下方法制成的，将权利要求1-4中任一项所述的聚合物药物前体置于水中溶解，后将溶液超声，过滤膜，向其中加入甘露醇冻干，即得聚合物纳米胶束。
6.根据权利要求5所述的聚合物纳米胶束，其特征在于，所述聚合物纳米胶束的粒径为10～400nm，载药量为1～50wt％。
7.一种权利要求1-4中任一项所述的聚合物药物前体和权利要求5、6任一项所述的聚合物纳米胶束在抗肿瘤药物领域的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是指结直肠癌、乳腺癌或者肺癌中的任意一种。
9.一种权利要求1-4中任一项所述的聚合物药物前体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将含有2-3个碳原子的巯基醇或巯基胺与2,2′-二硫二吡啶反应，制备吡啶基二硫基醇或吡啶基二硫基胺；
2)使用对硝基氯甲酸苯酯与步骤1)得到的吡啶基二硫基醇或吡啶基二硫基胺进行偶联反应制备碳酸酯或氨基碳酸酯；
3)将步骤2)所得碳酸酯或氨基碳酸酯与含羟基基团的疏水性抗肿瘤药物通过酯交换反应生成偶联物；
4)将步骤3)所得的偶联物与巯基化聚乙二醇通过巯基-二硫键交换反应，制备含有二硫键的聚乙二醇聚合物药物前体；
反应路线如下：
10.根据权利要求9所述的聚合物药物前体的制备方法，其特征在于，各个步骤的具体反应过程如下：
步骤1)：将含有2-3个碳原子的巯基醇或巯基胺和2,2′-二硫二吡啶按照摩尔比1:1～1:3加入溶剂中，室温反应12～48小时，反应完毕，浓缩、硅胶柱分离、浓缩、干燥得吡啶基二硫基醇或吡啶基二硫基胺；
步骤2)：在碱性条件下，将步骤1)所得的吡啶基二硫基醇或吡啶基二硫基胺溶于溶剂中，室温搅拌下将对硝基氯甲酸苯酯按摩尔比1:1～1:3缓慢滴加至溶液中，室温反应1～10小时，浓缩、硅胶柱分离、浓缩、干燥得碳酸酯或氨基碳酸酯；
步骤3)：在碱性条件下，将步骤2)所得的碳酸酯或氨基碳酸酯和含有羟基基团的疏水性抗肿瘤药物按摩尔比1:1～1:3溶于溶剂中，回流反应1～10小时，降至室温，反应液经酸洗、分液、干燥、浓缩、硅胶柱纯化、浓缩、真空干燥得二者的偶联物；
步骤4)：氮气保护下，搅拌条件下将巯基化聚乙二醇滴加到步骤3)所得偶联物的溶液中，巯基化聚乙二醇和偶联物的摩尔比为1:1～1:3，室温下反应12～48小时，浓缩、硅胶柱纯化、浓缩、溶解、过滤、冻干，得含有二硫键的聚乙二醇抗癌药物前体。
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