JP6550008B2 - 誘導体化超分岐ポリグリセロール類 - Google Patents
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Description
本願は、2010年3月1に出願され、本明細書中に参照により全体が組み込まれる、「生体接着性誘導体化超分岐ポリグリセロール類」と題する米国特許仮出願番号第61/309,304号の利益を主張する。
本発明は、治療学、その使用及び薬物又は他の生物学的に活性のある部分の、生物の組織への送達方法に関する。具体的には、本発明は誘導体化超分岐ポリグリセロール類(dHPG類)ベースのポリマー類並びに癌、感染症及び炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療方法に関する。
膀胱癌は、二番目に頻度が高い泌尿生殖器悪性腫瘍である。初期診断では、おおよそ70%の症例が筋層非浸潤性である。現在のところ、表在性疾患のための治療選択肢としては、化学療法剤をカテーテルで膀胱に膀胱内注入することによる、膀胱癌の局所治療が挙げられる。しかし、当該治療選択肢の効果は限られている。膀胱内での化学療法及び/又は免疫療法にもかかわらず、筋層非浸潤性膀胱癌の患者の最大80%が再発腫瘍を発症し、そのうち20%〜30%がより悪性の、致死性となり得る腫瘍に発達する(Dalbagni,G.(2007)Nat.Clin.Pract.Urol.4:254−260)。
本発明は、本明細書中に記載の誘導体化超分岐ポリグリセロール類(「dHPG類」)が、癌(例えば、膀胱癌、胃癌、食道癌、肺癌、喉頭癌、口腔癌、副鼻腔癌、膣癌又は子宮頸癌)、感染(例えば、消化管又は気道の感染)及び炎症性疾患又は自己免疫疾患(例えば、膀胱刺激症状、炎症性大腸炎、或いは慢性又は急性の炎症)並びに、薬剤又は他の生物学的に活性のある部分を組織又は細胞に送達することが望まれる他の適応疾患等の適応疾患を治療するために、薬剤又は他の生物学的に活性のある部分を尿路(例えば、尿道及び膀胱)、消化管(例えば、口、食道及び結腸)、気道(例えば、鼻及び肺)、膣腔及び頸部並びに腹膜腔に送達するための薬剤として用いられ得るという発見に一部基づく。例えば、本明細書中で特定されたポリマー類は、筋層非浸潤性膀胱癌の注入療法において有用であり得る。本明細書中で特定されたポリマー類は、筋層非浸潤性膀胱癌の注入療法において有用であり得る粘膜付着特性を示し得る。
単位に対するC1−C20アルキル鎖の比が、コアの周縁部と比較して、コアの中心部でより大きいコア;及びコアのヒドロキシル基に結合した、少なくとも1の親水性置換基を含むシェルを含み、当該超分岐ポリグリセロールが、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約1〜約200モルの、少なくとも1の官能基を含む、使用が提供される。
のRが一緒になってC3−C12環状アルキル基を形成する)の1以上から選択される少なくとも1の官能基を含むシェルを含み、当該超分岐ポリグリセロールが、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約1〜約200モルの、少なくとも1の官能基を含む、超分岐ポリグリセロールが提供される。コアはC1−C20アルキル鎖で更に誘導体化され得る。1つの実施形態においては、組織における薬物取り込みの増加は、組織のアンブレラ細胞喪失を惹起し得る。1つの実施形態においては、組織における薬物取り込みの増加は、組織の壊死及び/又は炎症の惹起を伴わない。
又はその類似体であり得る。マイトマイシンとしては、すべてのマイトマイシン類似体が挙げられ得る。マイトマイシン及びその類似体としては、例えば、マイトマイシンA、マイトマイシンB、マイトマイシンC、マイトマイシンD、マイトマイシンF、マイトマイシンG、マイトマイシンH、マイトマイシンK及びそれらの類似体が挙げられる。生物学的に活性のある部分は、マイトマイシンCであり得る。生物学的に活性のある部分は、マイトマイシンFであり得る。生物学的に活性のある部分は、バルルビシンであり得る。生物学的に活性のある部分は、ビンブラスチンであり得る。生物学的に活性のある部分は、シスプラチンであり得る。生物学的に活性のある部分は、メトトレキセートであり得る。生物学的に活性のある部分は、ドキソルビシン又はその類似体であり得る。生物学的に活性のある部分は、エピルビシンであり得る。生物学的に活性のある部分は、ゲムシタビンであり得る。生物学的に活性のある部分は、エベロリムスであり得る。生物学的に活性のある部分は、スラミンであり得る。生物学的に活性のある部分は、部分の組合せであり得る。部分の組合せは、メトトレキセート、ビンブラスチン、及びドキソルビシン(M−VAC)であり得る。部分の組合せは、M−VAC及びシスプラチンであり得る。
を測定することによって決定され得る。当業者は、超分岐ポリグリセロールの分子量は、種々の方法、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィーを用いて測定され得ることを理解するであろう。超分岐ポリグリセロールの分子量は、例えば、多角度レーザー光散乱検出によるゲル浸透クロマトグラフィーを用いて測定され得る。超分岐ポリグリセロールの量中に存在する親水性置換基の量は、例えば、滴定法によって測定され得る。滴定法は、正滴定法であり得る。滴定法は、逆滴定法であり得る。例えば、親水性置換基が、−NH2であり得る少なくとも1の官能基を含む場合、HPGの量中に存在する親水性置換基の量の測定に、HCl等の酸に対する正滴定法が用いられ得る。親水性置換基が、−NH2であり得る少なくとも1の官能基を含む場合、既知の量のHCl等の酸を用い、NaOH等の塩基に対して滴定する逆滴定法が用いられ得る。超分岐ポリグリセロールの量中に存在する親水性置換基の量は、例えば、比色法によって測定され得る。超分岐ポリグリセロールの量中に存在する親水性置換基の量は、例えば、蛍光法によって測定され得る。親水性置換基が、−NH2であり得る少なくとも1の官能基を含む場合、フルオレスカミンアッセイが用いられ得る。超分岐ポリグリセロールの量中に存在する親水性置換基の量は、1以上の方法によって測定され、1以上の方法により測定された親水性置換基の量の平均値が、超分岐ポリグリセロール1モル当たりの親水性置換基のモル数を算出するために用いられ得る。親水性置換基が、−NH2であり得る少なくとも1の官能基を含む場合、超分岐ポリグリセロールの量中に存在する親水性置換基の量を決定するためには、フルオレスカミンアッセイが好ましい方法であり得る。
−NH2であり得る場合、超分岐ポリグリセロールの量中に存在する官能基の量を決定するためには、フルオレスカミンアッセイが好ましい方法であり得る。
含む医薬組成物が提供される。更なる実施形態によれば、標的組織への薬物送達のための、本明細書中に記載の1以上のdHPG類が提供される。更なる実施形態によれば、本明細書中に記載のdHPGの調製方法が提供される。
択され得る。或いは、アルキル鎖は1以上のC8−C13又はC9−C12又はC10−C15アルキル鎖から選択され得る。或いは、アルキル鎖は1以上のC5−C15又はC5−C10又はC5−C20アルキル鎖から選択され得る。コア用に選択されるアルキル鎖又はアルキル鎖(複数)は、意図されるdHPGの使用に左右され得る。例えば、パクリタキセルのロードにとっては、C18アルキルはC8/10アルキルほどよく功を奏さなかった。
ば、消化管又は気道の感染)及び炎症性疾患又は自己免疫疾患(例えば、膀胱刺激症状、炎症性大腸炎、或いは慢性又は急性の炎症)並びに、薬剤又は他の生物学的に活性のある部分を組織又は細胞に送達することが望まれる他の適応疾患等の適応疾患を治療する。例えば、本明細書中に記載のdHPG類は、筋層非浸潤性の膀胱癌の局所治療又は標的治療に用いられ得る。いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載のポリマー類は、本明細書中に列挙される1以上の適応疾患(例えば、筋層非浸潤性の膀胱癌)の局所治療又は標的治療のための薬剤又は組成物の調製に用いられ得る。本発明のいくつかの態様により、本明細書中に記載のdHPG類及び医薬上許容される賦形剤又は担体を含む組成物が使用される。本明細書中に列挙される1以上の適応疾患(例えば、筋層非浸潤性の膀胱癌)の治療方法も提供される。当該方法は、本明細書中に記載のdHPG又は本明細書中に記載のdHPGの組成物、或いは有効量の本明細書中に記載のdHPG又は本明細書中に記載のdHPGの組成物(dHPGには生物学的に活性のある剤が組み込まれる)を、それらを必要とする被験体に投与することを含み得る。
理として用い、薬物取り込みのCavgの増加を、前処理又は共処理がないときの薬物取り込みのCavgと比較する観点から、測定し得る。当業者は、Cavgは組織の深度の、種々の範囲又は種々のポイントで測定し得ると理解するであろう。例えば、Cavgは0>3350、0>1500、200>3350又は200>1500μmの範囲の組織深度について測定し得る。1つの実施形態においては、dHPG類を前処理又は共処理として用いる、薬物取り込みのCavgは、前処理又は共処理がないときの薬物取り込みのCavgと比較して、1.3〜4.0、1.8〜2.8、1.3〜2.4、2.0〜2.6、1.5、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8又は4.0倍だけ増加し得る。いくつかの実施形態においては、薬物取り込みの増加は、dHPG類を前処理又は共処理として用い、薬物取り込みのCmaxの増加を、前処理又は共処理がないときの薬物取り込みのCmaxと比較する観点から、測定し得る。1つの実施形態においては、dHPG類を前処理又は共処理として用いる、薬物取り込みのCmaxは、前処理又は共処理がないときの薬物取り込みのCmaxと比較して、1.3〜4.0、1.8〜2.8、1.3〜2.4、2.0〜2.6、1.5、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8又は4.0倍だけ増加し得る。いくつかの実施形態においては、薬物取り込みの増加は、dHPG類を前処理又は共処理として用い、薬物取り込みのAUC(x−y)の増加を、前処理又は共処理がないときの薬物取り込みのAUC(x−y)と比較する観点から、測定し得る。当業者は、AUC(x−y)は組織の深度の、種々の範囲又は種々のポイントで測定し得ると理解するであろう。例えば、AUC(x−y)は0>無限、0>3350、0>1500、200>無限、200>3350又は200>1500μmの範囲の組織深度について測定し得る。1つの実施形態においては、dHPG類を前処理又は共処理として用いる、薬物取り込みのAUC(x−y)は、前処理又は共処理がないときの薬物取り込みのAUC(x−y)と比較して、1.3〜4.0、1.8〜2.8、1.3〜2.4、2.0〜2.6、1.5、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8又は4.0倍だけ増加し得る。当業者は、薬物取り込み増加の測定に関しては、例えば、Grabnar et al.(International Journal of Pharmaceutics 256(2003)167−173)中で報告された通り、前処理又は共処理の存在下又は非存在下で、透過性の比として算出される透過性亢進比率Rが、代替法に用いられ得ると理解するであろう。
液(経口洗い流し液、腹膜内洗浄液或いは鼻腔又は膣腔の洗浄液を含む)、点眼液、嚥下される経口液、エアロゾル、又はスプレーとして吸入するための溶液、又は粘膜表面等の、生物の組織の近接部に挿入される半固体として機能するよう作り出された、他の組成物中において投与され得る。
Williams & Wilkins,(2000)中に記載されている。
は、被験者において疾患に先立つか、又は疾患の初期段階で用いられる。
本明細書中に記載のポリマー類の調製のために検討され、好適に適合され得る、好適な合成手順が記載されている。
化学物質はすべてSigma−Aldrich Canada Ltd.(Oakville,Canada)から購入し、更なる精製はせずに用いた。溶媒はすべてFisher Scientific(Ottawa,Canada)からのHPLCグレードのものであり、更なる精製はせずに用いた。
G−C8/10−MePEG用の典型的な重合化反応手順は以下の通りである。開始剤のトリメチロイルプロパン(TMP)をアルゴン雰囲気下フラスコに加え、カリウムメチラートのメタノール溶液(20wt%)を続けて加えた。マグネティックスターバーを用いて15分間混合物を攪拌し、その後真空中で過剰なメタノールを除去した。フラスコは油浴中で95℃に保ち、シリンジポンプを用いて12時間にわたりグリシドールを滴下して加えた。モノマーの添加完了後、混合物を更に5時間攪拌した。次いでオクチル/デシルグリシジルエーテルを加え、混合物を24時間攪拌してHPG−C8/10を形成した。当該混合物に、12時間にわたってMePEG350を滴下して加え、次いで更に5時間攪拌した。MePEGのメチル基が、モノマーの一端を当該モノマーが2価にならないように(dHPG分子間を架橋することになる)保護するので、MePEGはPEGよりも好ましい。合成後に除去し得るものも含め、他の保護基も検討される。このように、HPGは、ペプチド、グリコペプチド及びタンパク質等を含む、他の化学基又は生体分子を加えることにより更に修飾され得る表面上でPEG鎖と共に調製し得る。当該手順は、種々のHPGの合成に変更し得、例えば、グリシドール添加後に1,2−エポキシデカンを混合物に加えてHPG−C18を形成し得る。
過し、透明な溶液を得、それを回転蒸発してDCMを除去した。MTBEを加えてポリマーを沈殿させた。真空の下、室温で最終生成物HPG−C8/10−NHSを乾燥した。
パクリタキセル又はドセタキセルは、dHPGと共に少量のアセトニトリル中に溶解し得、オーブン中60℃で1時間乾燥し得る。次いで窒素気流でフラッシュして微量の有機溶媒を除去し得る。結果生じるdHPG/パクリタキセル又はdHPG/ドセタキセルの
マトリクスは10mMのリン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)で水和し、2分間ボルテックスしてオーブン中60℃で1時間インキュベーションし得る。結果生じる溶液は、一般的には透明である。白色沈殿が観察される場合、溶液を遠心(18000g、10分間)し、上清を新たな容器に移し、使用するまで冷所に保持し得る。
dHPG類に組み込まれたドセタキセル(「DTX」)の安定性を、DTXの不活性な分解産物への分解、及び生物活性を有するそのエピマー(「7−epi−DTX」)への相互変換の観点から、特性解析する。パクリタキセル及びドセタキセルのエピマー形成は、平衡として起こることが知られるが、不活性な分解産物への分解は不可逆的である。安定性は、様々なdHPG類において記載された通り、超高速液体クロマトグラフィー(UPLC)を用いて解析した。主要な分解ピークを分離するために、Waters Acquity UPLC BEH C18カラム(2.1x50mm,1.7μm)を用いた。注入体積は3μLであった。移動相は、0.385gの塩を秤量し、それを500mLのHPLCグレードの水に溶解することにより調製した10mM酢酸アンモニウム溶液であった。pHは酢酸を用いてpH4.0に調整した。DTXのストック溶液(2mg/mL)はメタノール中に調製し、−20℃の冷凍庫中に保存した。DTXを含有する標準液一式は、0.5〜100μg/mLの範囲にわたり、50/50のメタノール/水中に調製した。検出限界(LOD)及び定量限界(LOQ)は両方とも1μg/mLであった。1〜100μg/mLからの較正曲線は、DTXに関しては、R2が0.9998の直線であった。1/xの重み付けを適用した。方法の精度(accuracy)及び精度(precision)は、LOQ(1μg/mL)及び中間域(10μg/mL)で確認した。各ケースにおいて、注入を5回反復した。表2に、当該濃度のDTXについて得られた精度(accuracy)及び精度(precision)を集約する。
はpH7.3に緩衝化したPBS中、72時間にわたり、組み込んだDTXの90%超をDTX及び7−epi−DTXとして保持した。残りの量の薬物は不活性成分に分解しており、サンプル全体の2%を超えて寄与したものは各々、質量分析MRMの実験によって同定した。当該実験は、公知のDTX分解産物に関連したイオンフラグメントを同定するために行った。
al 2007 Isolation and characterization of degradation impurities in docetaxel drug substance and its formulation,Kumar et al.,Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 12 March 2007 43(4):1228−1235)が、最大の分解物ピーク(図5)に符合して同定された。DTX側鎖からのフラグメントに対応し得る226及び282のm/zが1.5分に観察された。しかし、10−デアセチルバッカチンIII+K+に対応する583のm/zが存在した。このことにより、タキサンがコア及び側鎖の両方を含有することが示される。320及び562のM/zも観察された。2分のピークは、それぞれ10−オキソ−10−デアセチルバッカチンIII+K+及び10−デアセチルバッカチンIII+K+に対応し得る、m/z=581及び583を有した。当該ピーク位置は、クロマトグラムのバッカチン分解物が観察されると期待される領域内でもある。
種々のdHPG製剤がKU7癌細胞を殺傷できるか否かを決定することにより、dHPG類の毒性を測定した。当該実験は、薬剤又は生物学的に活性のある部分を何ら組み込んでいないdHPG類を用いて行った。結果を図7A及び7B中に示す。標準コア製剤及び凝集コア製剤の両方について、HPG−C8/10濃度に応じたKU7細胞の増殖(パーセント)を図7Aに示す。HPG−C8/10の安定性は、コア構造の変化によっては有意に影響されなかった。標準コア製剤及び凝集コア製剤の両方について、KU7細胞の生存率をHPG−C8/10−MePEG濃度に応じて図7Bに示す。凝集コアを有するポリマー類は、標準コアのポリマーに比べて、細胞生存率について10倍高いIC50を示す。凝集コアを有するdHPG類は、標準コアを有するdHPG類よりも、より細胞に寛容される。両方の製剤とも、1モルのHPG当たり6.5モルのMePEGを含有した。凝集コアの製剤は、標準コアの製剤よりも、KU−7細胞に対する細胞毒性が低かった。図7A及び図7B中に示す製剤を調製するために使用したモノマー類の体積比率を表3に示す。
フルオレセインで標識されたHPG−C8/10−COOH−NHS及びHPG−C8/10−COOHのKU7細胞への取り込みを検証した。dHPGを1mg/mLでFBS−フリーの培地中に溶解した。12ウェルの各プレート中、250μLのdHPGをカバーガラス上で細胞に曝露した。PBSでプレートを2回洗浄し、続けてPBS中3.7%ホルムアルデヒドで10分固定した。再びPBSでプレートを2回洗浄した。Prolong Gold(商標)を用いてDAPIとともにカバーガラスをマウントした。
、HPG−C8/10−COOH−NHS及びHPG−C8/10−COOHの両方が1時間で取り込まれることが示される。しかし体内では、接触がin vitroでの状況ほど完全ではなく、当該取り込みを促進するためには、曝露を延長することが必要である。
凝集コアHPG−C8/10−MePEG及び標準コアHPG−C8/10−MePEGの最大薬物ローディングを調査した。薬物濃度0.5、1.0、2.0及び3.0mg/mLを目標にしてDTX及びPTXをHPG−C8/10−MePEGにロードした。THF中100mg/mLのポリマー溶液を調製し、DTX又はPTXを加えた。N2気流の下THFを約2時間乾燥し、次いでフードオーブン中で一晩乾燥した。HPG−C8/10−MePEG/PTX及びHPG−C8/10−MePEG/DTXマトリクスをPBS緩衝液(pH7.4)で水和した。結果生じる溶液を14000rpmで約15分間スピンダウンした。上清の液体をHPLCで試験し、HPG−C8/10−MePEG中に内包された薬物の濃度を入手した。結果を表4中に示す。
報告されたプロトコール(Kainthan,R.K.,Mugabe,C.,Burt,H.M.,Brooks,D.E.,2008.Biomacromolecules 9,886−895)に従い、エポキシドの開環重合を基礎とするシングルポットの合成手順でコア修飾HPG類のオクチル/デシルグリセリルエーテル(O/DGE,C8/10)重合を実施した。
EG 350エポキシド)を合成した。オクチル/デシルグリシジルエーテル、カリウムメチラート及びトリメチルプロパン(TMP)はSigma−Aldrichから入手し、更なる精製はせずに用いた。
「ワンポット」合成の最終段階として10ml又は20mlのMePEG 350エポキシドを加えた。HPGに対する、目標とする密度に応じてMePEG 350の量(つまり、目標とする6.5molのMePEGについては、1モルのHPGに対し、10mlのMePEG350)を加えた。次いで、攪拌速度を90rpmに増大させ、反応を105℃で一晩、継続して行った。ヘキサンで抽出することにより、微量の未反応オクチル/デシルグリシジルエーテルをいずれも除去した。生成物をメタノール中に溶解し、陽イオン交換カラム(Amberlite IRC−150,Rohmand Haas Co.,Philadelphia,PA)に3回通すことにより中和した。真空の下、メタノールを除去し、次いで酢酸セルロース透析管(MWCO 10,000g/mol,Spectrum Laboratories)を用いて、1日あたり3回の水交換により、ポリマー水溶液を3日間、水に対して透析し、未反応MePEGエポキシドを除去した。次いで、凍結乾燥により乾燥ポリマーを取得した。
of California,San Francisco)を用いてHSQCスペクトルを解析した。図9及び図10にHPG−C8/10ポリマー類及びHPG−C8/10−MePEGポリマー類の代表的なプロトンスペクトル及び2D HSQCスペクトルを示す。原料スペクトルを開始用参照として用い、ピークをすべてHPG類の構造成分にアサインメントした(図10B)。プロトンNMRスペクトルは報告されたもの(Kainthan,R.K.,Janzen,J.,Kizhakkedathu,J.N.,Devine,D.V.,Brooks,D.E.,2008.Biomaterials 29,1693−1704;Kainthan,R.K.,Mugabe,C.,Burt,H.M.,Brooks,D.E.,2008.Biomacromolecules 9,886−895)と同様だった。HSQC NMRのデータにより、スペクトルにおいて分岐構造は明らかであり(図9及び図10)、超分岐ポリマー類としてのHPG類の構造が確認された。各置換基の比は、HSQC実験における体積積分から算出した。MePEGのメトキシ基及びO/DGEのメチル基の積分とTMPのCH3基の積分とを比較することにより、各HPGポリマーについてO/DGE及びMePEG(mol/mol)の比を算出した。HSQCのデータにより、未反応のエポキシドモノマー類が無いこと(Fig.10)が示される。このことにより、未反応モノマー類によるポリマーのコンタミネーションが無いことが示される。
示差走査熱量測定法(DSC)及び熱重量分析(TGA)により、dHPG類の熱特性及び分解特性に対する精製過程の影響を評価した。精製dHPG類とは、例えば、未反応C8/10アルキル鎖を除去するための、ヘキサンによる抽出、続く陽イオン交換カラムを通した中和、次いで透析といった様々な精製段階を経たポリマー類を指す。
to 500oC)でTGAのランを行った。重量パーセンテージ及びTGAチャンバー
の温度をリアルタイムで記録した。TA Universal Analysis 2000ソフトウェア(Version 4.2E,TA Instruments)を用いてデータの解析を行い、開始点を見出した。AB104−Sバランスを備えたMettler Toledo DL39 Karl Fisher電量計を用いた滴定により、d
HPG類の水分量を決定した。既知の量のdHPG類を無水メタノール中に溶解し、HYDRANAL(登録商標)−Coulomat reagent(Sigma)によって滴定した。無水メタノールからのバックグラウンドの読みを差し引いて最終結果を取得した。
チンIII)を生成するであろう(図11A)。蒸留水中のdHPGポリマー類のpH測定により、未精製ポリマー類は塩基性のpHであるが、精製ポリマー類は、(陽イオン交換樹脂のAmberlite IRC−150による処理に起因して)タキサンにとってより安定的な環境である酸性pHであることが示された。タキサンは3〜5のpH域で安定性が最大であると報告されている(Dordunoo,S.K.,Burt,H.M.,1996.Int.J.Pharm.133,191−201;Tian,J.,Stella,V.J.,2010.J.Pharm.Sci.99,1288−1298)。精製ポリマー類は当該pH域内であるので(表6)、ロードしたタキサンの化学的安定性を向上させた。未精製dHPGポリマー類中にロードしたタキサンの、見かけ上のより高い薬物ローディング及びより高い物理的安定性は、ロードした薬物の大部分が、親のタキサンよりも低分子量且つ親水性の分子(バッカチンIII及びバッカチンV)に分解したという事実により説明され得る。このことにより、分解された当該分子は、より効率的にdHPG類にロードされたことが示唆される。
粒子サイズ及びゼータ電位の解析は、各解析についてDTS0012 disposable sizing cuvetteを用いたMalvern NanoZS Particle Size analyzerを用いて行った。濃度15mg/mlのポリマー溶液を1mM NaCl中に調製し、0.22μmのシリンジフィルター(PALL Acrodisc 13mm with nylon membrane)で濾過した。サンプルの取得パラメータは:角度173°の後方散乱(自動減衰);ラン回数11(10秒/ラン);分散剤は25℃の水(粘度0.8872cP及びRI 1.330);Mark−HouwinkパラメータはA=0.428及びK=7.67e−05(cm2
/s)とした。dHPG類は、屈折率がポリエチレングリコールと同様(RI=1.460及び吸収0.01)であると仮定した。最終データはすべてのランの平均を表す。
PTX又はDTX及びdHPG類を4mlバイアル中1mlアセトニトリル溶液中に溶解し、オーブン中60℃で1時間乾燥し、窒素でフラッシュして微量の有機溶媒を除去した。結果生じるdHPG/タキサンマトリクスを、50℃、1mlの10mM加温リン酸緩衝生理食塩水(PBS,pH7.4)で水和し、2分間ボルテックスした。結果生じる溶液は一般的に透明であるが、白色粒子が観察される場合は、溶液を遠心(18000g、10分間)し、上清を新たなバイアルに移した。
ータ示さず)。
Huang et al.の方法(Huang,S.N.,Phelps,M.A.,Swaan,P.W.,2003.J.Pharmacol.Exp.Ther.306,681−687)に従い、わずかな変更を伴って、HPG−C8/10−MePEG13をテトラメチルローダミン−5−カルボニルアジド(TMRCA)で共有結合的に標識した。500mgのHPG−C8/10−MePEG13を5mlの無水1,4−ジオキサン中に溶解した。適量のTMRCAを無水1,4−ジオキサン中に溶解し、最終濃度を1mg/mlとした。当該蛍光プローブのアリコート675μl(おおよそ20mol%のHPGに相当)をHPG−C8/10−MePEG13溶液に加え、窒素気流の下5時間攪拌し、油浴中で80℃に加熱した。透析液が無色になるまで溶液をDMF(MWCO
12,000〜14,000)に対して透析し、次いで蒸留水に対して24時間透析した。蛍光標識ポリマー(HPG−C8/10−MePEG13−TMRCA)を凍結乾燥し、アンバーバイアル中、−80℃で保存した。
、赤色蛍光は白色部分として示す。画像中、核を囲む赤色蛍光は暗い部分として示す。)により、細胞質中にHPG−C8/10−MePEG13−TMRCAが存在することが示される。パネルBと同一の細胞集団のz−スタックにより(z−スタックの画像は示さず)、赤色蛍光ナノ粒子は、単に細胞膜に接着しているか、又は細胞膜中に存在しているというよりもむしろ、細胞質の至る所に存在することが証明された。いくつかの点状の構造が観察され、それはHPG−C8/10−MePEG13−TMRCAナノ粒子が細胞輸送用小胞にパッケージされたことを示すのであるが、当該ナノ粒子は、細胞質中に一様に分布するように見えた。KU7細胞の核コンパートメント中に検出されたポリマー由来の蛍光は無かった。コントロールの細胞と比較すると、全時点で、HPG−C8/10−MePEG13−TMRCAナノ粒子は、KU7細胞の生存率及び有病率に影響しない。このことは、当該細胞株と当該ナノ粒子は生体適合性が非常に高いことを示す。HPG−C8/10−MePEG13−TMRCAナノ粒子は、1時間のインキュベーションによりKU7細胞に取り込まれ、1、4、8又は24時間の時点で取得した画像間で全く差異は無かった。
上記の通り、既報のプロトコール(Kainthan RK,Mugabe C,Burt HM,Brooks DE.Biomacromolecules,9(3),886−895(2008))に従ってHPG−C8/10−MePEGを調製した。1H NMR (400 MHz, D6-DMSO) δH: 0.75-0.82 (-CH3, TMP); 0.82-0.92 (O/DGE上の-CH3-アル
キル); 1.15-1.55 (-CH2-, O/DGE上のアルキル); 2.50 (溶媒, D6-DMSO); 3.15-3.80 (-CH及び-CH2-, HPGコアから); 3.23 (-OCH3- MePEGから), 3.32 (残存水); 4.8 (-OH).
分子量=83,000g/mol(1.22の多分散性)(データ示さず)。
皮癌細胞株に対する細胞傷害効果を評価した。タキソール(登録商標)はBristol−Myers−Squibb(Princeton,NJ)からのものであった。タキソテレ(登録商標)はSanofi−Aventis Canada Inc.(Laval,Quebec)から購入した。ヒト膀胱癌細胞株のRT4及びUMUC3は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから購入した。10%の熱非働化ウシ胎児血清を含有するマッコイ培地(Invitrogen,Burlington,ON)中で細胞を維持し、加湿5%CO2雰囲気中、37℃で保持した。MGHU3細胞はY.Fradet博士(L’Hotel−Dieu de Quebec,Quebec,Canada)から、ご好意により寄贈していただき、10%ウシ胎児血清及び2mM L−グルタミン(Invitrogen)を添加したMEM中で維持した。KU7はC.Dinney博士(MD Anderson Cancer Center,Houston,TX,USA)より提供していただき、5%ウシ胎児血清含有DMEM中で維持した。可視化目的のため、KU7細胞を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するレンチウイルス(Graig Logsdon博士(M.D.Anderson Cancer Center,Houston,TX,USA)による)に感染させ、当該サブクローンを以前報告(Hadaschik BA,Black PC,Sea JC et al.BJU
Int,100(6),1377−1384(2007))した通りKU7−lucと命名した。96−ウェルプレート中、体積100μlの10% FBSを添加したマッコイ培地中に5,000細胞/ウェルで細胞をプレーティングし、新たに調製したタキソール(登録商標);タキソテレ(登録商標);PTXをロードしたHPG−C8/10−MePEG;又はDTXをロードしたHPG−C8/10−MePEGの溶液を加える前に、24時間平衡化させた。細胞を薬物製剤に2時間曝露し、注入療法についての現行の臨床基準を模倣して、以前報告(Hadaschik BA,ter Borg MG,Jackson J et al.BJU Int,101(11),1347−1355(2008))した通り、CellTiter96 AQueous Non−Radioactive Cell Proliferation (MTS)assay(Promega,Madison,WI)を用いて、72時間後に細胞の生存率を決定した。各実験を3回繰り返し、すべての細胞株について、MTS値が直線の吸収帯内に収まった。
マウスの膀胱癌異種移植モデルにおいて、全部で60匹のヌードマウスでin vivoの実験を行い、膀胱内タキソール(登録商標)(1mg/ml,Bristol−Myers−Squibb);タキソテレ(登録商標)(0.5mg/ml,Sanofi−Aventis);PTX(1mg/ml)をロードしたHPG−C8/10−MePE
G;及びDTX(0.5mg/ml)をロードしたHPG−C8/10−MePEGの有効性を評価した。当該同所性マウスモデルは、Mugabe C,Hadaschik BA,Kainthan RK et al.BJU Int,103(7),978−986(2009);Hadaschik BA,Black PC,Sea JC et al.BJU Int,100(6),1377−1384(2007);Hadaschik BA,ter Borg MG,Jackson J et al.BJU
Int,101(11),1347−1355(2008)に報告されている。動物実験はカナダ動物管理協会に従って行った。11週齢の雌性ヌードマウス(Harlan,Indianapolis,IN)をイソフルランで麻酔した。潤滑化24 G Jelco血管カテーテル(Medex Medical Ltd.,Lancashire,UK)を尿道を経て膀胱へ通す前に、6−0ポリプロピレンの巾着縫合を尿道口付近の表層に施した。PBSで膀胱を1回灌注した後、2百万のKU7−luc細胞を、50μlの単一細胞懸濁液として注入し、巾着縫合を2.5時間結紮した。in vivoの腫瘍負荷を定量するために、4、11、18、25及び33日目に150mg/kgルシフェリンを腹膜内注射し、15分後に、IVIS200イメージングシステム(Xenogen/Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA)により動物を仰臥位でイメージングした。Living Image software (Xenogen)を用いてデータを取得し、解析した。腫瘍接種後5日目に、無作為に、マウスの膀胱を50μlのPBS(コントロール);HPG−C8/10−MePEG(薬物無し);タキソール(登録商標)(1mg/ml);PTX(1mg/ml)をロードしたHPG−C8/10−MePEG;タキソテレ(登録商標)(0.5mg/ml);DTX(0.5mg/ml)をロードしたHPG−C8/10−MePEGで処理した。腫瘍接種後5日目及び19日目に膀胱内治療を行った。生物発光レベルは群間で同等であった;しかし、腫瘍はマウス個体間でばらつきがあるので、統計学的解析のため、処理後の腫瘍の生物発光を、4日目の各マウスにおける初期フラックスに対して正規化した。腫瘍接種後33日目に剖検を行った。膀胱全体を取り出し、10%緩衝化ホルマリンで固定し、パラフィン中に包埋した。5μmの切片を作製し、標準法を用いてH&Eで染色した。スライドは、すべて調査し、BLISS microscope imaging workstation(Bacus Laboratories Inc.,Lombard,IL)上で走査した。KU7−luc癌細胞の膀胱内接種後、マウスはすべて膀胱腫瘍を発症した。しかし、マウス2匹が麻酔から回復せず、腫瘍接種日と同日に死亡した。タキソテレ(登録商標)群のマウス1匹が、イメージングの最終日(腫瘍接種後33日目)に死亡したことがわかった。当該マウスは以前の測定において、腫瘍が当該群中最大であった。別に、DTXをロードしたHPG−C8/10−MePEGのマウス1匹を、不可逆的な体重減少(15%体重減少)のため、屠殺した。統計解析のために、当該マウスを実験から排除した。全体的に、膀胱内のPTX及びDTX、市販のタキソール(登録商標)及びタキソテレ(登録商標)、又はHPG−C8/10−MePEGとも、マウスによって十分寛容され、深刻な毒性又は体重減少は観察されなかった。腫瘍接種後5日及び19日に膀胱内療法を行った。コントロールマウス(PBS及び空のHPG−C8/10−MePEG)と比較すると、PTX及びDTXをロードしたHPG−C8/10−MePEGにより腫瘍成長が有意に阻害された(P<0.001,二元配置分散分析、ボンフェローニ事後検定)(図16)。タキソテレ(登録商標)とは異なり、タキソール(登録商標)(1mg/ml)により、コントロール群(PBS及び空のHPG−C8/10−MePEG)と比較して、腫瘍成長が有意に低下した(P<0.01,二元配置分散分析,ボンフェローニ事後検定)。しかし、タキソール(登録商標)及びタキソテレ(登録商標)の処理群間で有意差は観察されなかった。PTX(1mg/ml)及びDTX(0.5mg/ml)の膀胱内注入投与量は、PTXを用いた以前の報告(Mugabe C,Hadaschik BA,Kainthan RK et al.BJU Int,103(7),978−986(2009))及びDTXがPTXよりも強力であることを証明するin vitroの細胞傷害性データ(Fig.15)に基づいて選んだ。実
験の最後で、PTX及びDTXをロードしたHPG−C8/10−MePEGナノ粒子両方における腫瘍成長は、PBSコントロール群と比較して、それぞれ87%及び97%阻害された。タキソテレ(登録商標)及びタキソール(登録商標)により、それぞれ43%及び65%の腫瘍成長阻害が示された。各処理群における、マウスの代表的な生物発光の画像を経時的に図17中に示す。膀胱組織の組織学的な検証により、KU7−lucの腫瘍は悪性の成長パターン及び高頻度の多病巣性を示したが、腫瘍接種から33日後には、当該処理群における腫瘍の大半が、大抵は固有層に限局し、且つ高悪性度のpT1ステージの疾患と相関したことが示される(図18)。
膀胱内のPTX製剤及びDTX製剤の薬物動態特性を評価するため、マウスにタキソール(登録商標)(1mg/ml,n=3);タキソテレ(登録商標)(0.5mg/ml,n=4);PTXをロードしたHPG−C8/10−MePEG(1mg/ml,n=4);及び/又はDTXをロードしたHPG−C8/10−MePEG(0.5mg/ml,n=4)のいずれかを注入した。膀胱内注入後0、30及び60分で尾部血液サンプルを採取した。当該時間、マウスは依然、イソフルランで麻酔していた。2時間後、CO2を用いてマウスを窒息させて殺し、心穿刺により血液を更に除去した。血液サンプルをmicro−haematocrit tubes(Fisher Scientific,Pittsburg,PA)中又はserum−separator tubes(Becton Dicknson)中で遠心し、血清を液体窒素中でさっと凍結した。各マウスの尿及び膀胱も回収し、膀胱は、凍結前に切開して内腔を露出させ、10mlPBSで5回連続で激しく洗浄した。サンプルはすべて−80℃で保存した。解析に用いたUPLC−MS/MSシステムは、Waters TQD質量分析計を用いた質量分析と共役した、統合化Waters Acquity UPLC分離システムで構成した。電子スプレーイオン源ブロックの温度150℃、脱溶媒和温度350℃、コーン電圧14V、キャピラリー電圧0.70kV、引出電圧3kV、RF電圧0.1kV、コーンガス流25l/h、脱溶媒和ガス流600l/h及び衝突ガス流0.2ml/minでシステムを作動させた。陽イオンモードにおいて、分子を電子スプレーでイオン化した。溶媒/溶媒抽出法によって、マウス血清からDTXを抽出した。96−ウェルプレートにおいて、マウス血漿及び標準液の50μlアリコートをアセトニトリル中の0.1%ギ酸150μlと混合し、室温で1分間ボルテックスした。サンプルを4℃、10分間、5,500rpmで遠心した(Allegra(商標)25 R centrifuge,Beckman−Coulter)。次いで上清100μlと蒸留水50μlとを混合し、混合して30秒間ボルテックスした。膀胱組織を計量し、ジルコニアビーズ(Biospec Products)及びミクロバイアルホルダーを備えたmini−bead beater(Biospec Products)を用いて0.1%ギ酸/メタノール中で60秒間ホモジェナイズした。サンプルを4℃で2分間、14,000rpmで遠心した(Allegra(商標)25 R centrifuge, Beckman−Coulter)。メタノール中0.1%トリフルオロ酢酸150μlをサンプルに加え、混合及び4℃で15分間、14,000rpmでボルテックスした(Allegra(商標)25 R
centrifuge,Beckman−Coulter)。サンプルの解析は、すべ
てUPLC−MS/MSを用いて行った。スパイクしたコントロールサンプルからの回収率は97%で、DTXの検出限界は10ng/mlであった。
実施例7に記載したプロトコールに従ってHPG−C8/10−MePEGを合成した。1H NMR (400 MHz, D6-DMSO) δH: 0.75-0.82 (-CH3, TMP); 0.82-0.92 (O/DGE上の-CH3-アルキル); 1.15-1.55 (-CH2-, O/DGE上のアルキル); 2.50 (溶媒, D6-DMSO); 3.15-3.80 (-CH及び-CH2-, HPGコアから); 3.23 (-OCH3- MePEGから), 3.32 (残存水); 4.8 (-OH). HPG-C8/10-MePEG-NH2(以下の手順を用いて、様々な目標量でアミン置換を行いHPG
−C8/10−MePEG−NH2を合成した。)使用した試薬の量を表8中に集約する。目標のアミン置換は、HPG1モル当たりのNH2の目標モル数を表し、HPG−C8/10−MePEG−NH2(X)(式中、xはHPG1モル当たりのNH261、12
1及び161モルである)により表示する。15mlの無水1,4−ジオキサン中にHPG−C8/10−MePEGを溶解した。水素化カリウム(KH)を無水へキサンで3回リンスし、ミネラルオイルを除去して真空下乾燥した。ポリマー溶液をKHと混合し、透明な溶液が形成されるまで室温で攪拌した。一晩攪拌(Na2SO4又はMgSO4)しながらジクロロメタン中に溶解することにより、N−(2,3−エポキシプロピル)フタルイミド)(EPP)(Sigma−Aldrich)を乾燥した。溶液を濾過し、真空の下乾燥してジクロロメタンを除去した。乾燥したEPPを無水1,4−ジオキサン中に溶解し、約85〜90℃で一晩攪拌しながらポリマーに加えた。陽イオン樹脂交換カラム(Amberlite IRC−150)に3回通すことにより生成物を中和し、次いでエーテルから3回沈殿させて未反応のEPPを除去した。ヒドラジン一水和物によるヒドラジン分解により、フタルイミド官能基の開裂を達成した。ポリマーのメタノール溶液に過剰のヒドラジン一水和物溶液(2mL)を加え、混合物を72時間還流した。還流後、メタノールを蒸発させ、10,000 MWCO膜を用いて、ポリマーを水に対して48時間透析し、凍結乾燥した。1H NMR (400 MHz, D6-DMSO) δH: 0.75-0.82 (-CH3, TMP); 0.82-0.92 (O/DGE上の-CH3-アルキル); 1.15-1.55 (-CH2-, O/DGE 上のアルキル); 2.50 (溶媒, D6-DMSO); 2.60-2.80 (-CH2-NH2) 3.15-3.80 (-CH及び-CH2-, HPG コアから); 3.23 (-OCH3- MePEGから)。HPG−C8/10−MePEG−NH2製造のための、N−
(2,3−エポキシプロピル)フタルイミド)(EPP)による、HPG−C8/10−MePEGポリマー上のいくつかのヒドロキシル基(10〜20%)の表面修飾と、続くヒドラジン分解による、フタルイミド官能基の開裂用の反応スキームをスキームVII中に要約する(R,アルキル(C8/C10)鎖の混合物ベースの疎水性コアを表す。()7,MePEG 350ベースの親水性シェルを表す。)。
MePEGとHPG類上のアルキル鎖との比は、重水素化溶媒(Cambridge Isotope Laboratories,99.8%D)を用いて、Bruker Avance 400MHz NMR 質量分析計(磁場強度9.4T)に記録した異核種単一量子コヒーレンス(HSQC)NMR実験から推定した。多角度レーザー光散乱検出によるゲル浸透クロマトグラフィー(GPC−MALLS)によってポリマー類の分子量及び多分散性を決定した。
HPG−C8/10−MePEGポリマー類上で誘導体化されたアミン基のモル比を、HCl及びNaOHを用いて電気伝導度滴定により測定した。電気伝導度滴定は、YSI
model 35コンダクタンスメーター及び白金電極を備えた3403セルで、25℃で行った。シリンジポンプ(Harvard Instruments)を用いて、一定流速0.0102ml/minで希釈NaOH溶液を注入した。典型的な滴定に関しては、おおよそ10mgのHPG−C8/10−MePEG−NH2を蒸留水中に溶解し、まず0.05N HClで滴定し、続けて0.05N NaOHで逆滴定した。30秒ごとに溶液の電気伝導度を測定した。水酸化ナトリウム溶液の標準化用にフタル酸水素カリウム溶液(0.05N)を用いた。電気伝導度滴定及び分子量測定に基づいて、HPG1分子当たりのアミン基のモル数を算出した。得られた値は50〜119mol/molの範囲であり、HPG−C8/10−MePEG−NH21モル当たりのNH2の目標モル比と一致していた(表8及び10)
。
/mLフェニルアラニンストック)。60μLの0.2mg/mLフェニルアラニンストックをガラスのLC/MSバイアルに移した。90μL(90°μL)の脱イオン化H2Oを加え、ボルテックスして溶液を混合した(80ng/mLフェニルアラニン作業標準液)。
5nm並びに励起波長及び蛍光波長の両方についての5nmのバンド幅)によって解析した。
DSC及びTGAを用いてdHPG類の熱特性及び分解特性を評価した。TA Instruments DSC Q100及びTGA Q50を用いて熱解析を行った。密封したアルミニウム製パン中、秤量したサンプルを、温度範囲−90℃〜85℃にわたる、10℃/分での「加熱−冷却−加熱」の循環でサイクルにかけることによりDSCのランを取得した。分解過程において、各期の重量減少を等温状態下で観察し、主に、HPG類を500℃で、重量減少100%近くまで熱を通す「段階的等温」モードで、TGAのランを行った。HPG−C8/10−MePEGサンプル及びHPG−C8/10−MePEG−NH2サンプルの熱的なイベントを表10示す。HPG−C8/10−MePEGサンプル及びHPG−C8/10−MePEG−NH2サンプルは同様のDSC/TGAプロファイルを示した。HPG類は、−45〜−58℃のガラス転移温度を示した。アミン基の存在により、HPG類のTgが少し上昇した。主な分解的イベントは300℃を超える温度で観察されたが、このことはHPG類の良好な熱安定特性を示す。おそらくは、HPG類中のいくらかの残存溶媒又は残存水に起因して、100℃以下の温度でおおよそ3〜5%の重量喪失が生じた。想定される熱滅菌法の使用を可能とするために、医薬への適用にとっては、HPG類の良好な熱安定性は望ましい。
粒子サイズ及びゼータ電位の解析は、各解析についてDTS0012 disposable sizing cuvetteを用いたMalvern NanoZS Particle Size analyzerを用いて行った。サンプルを0.2μmのインラインシリンジフィルター(PALL Acrodisc 13mm(ナイロン膜付))で濾過した。サンプルの取得パラメータは:角度173°の後方散乱(自動減衰);ラン回数11(10秒/ラン);分散剤は25℃の水(粘度0.8872cP及びRI 1.330);Mark−HouwinkパラメータはA=0.428及びK=7.67e−
05(cm2/s)。HPG類の屈折率は、ポリエチレングリコールの屈折率(RI=1.460及び吸収0.01)と同様であると仮定した。最終データはすべてのランの平均を表す。HPG類は、<10nmの流体力学半径を有する小さなナノ粒子である。HPG類は、10nm未満の極端に小さなナノ粒子を形成する。HPG類の粒子サイズ及びゼータ電位の特徴を表10に示す。アミン基でのHPG−C8/10−MePEG表面の誘導体化によっては、粒子サイズは影響されなかったが、ゼータ電位に対しては、有意な影響を観察した。アミンが末端にくるHPGポリマー類のゼータ電位は、低pHで正に高く、塩基性条件においてはやや負の値に変化した。表面電荷における、pH滴定可能な当該変化は、アミン基のプロトン化/脱プロトン化から生じる。生理学的なpH7.4では、HPG類のいくらかのアミン基がイオン化し、従って正のゼータ電位が予想される(表10)。しかし、8を上回るpH値では実質的にすべてのアミン基が帯電しておらず、従ってpH11ではわずかに負の電荷観察される(おそらく、当該HPG類上に存在する、陰性物質のヒドロキシル基に起因した)。HPG類の薬物ローディングによっては、その粒子サイズは有意に影響されず、HPG類は溶液中で単分子ミセルとして十分に分散したままであった。DTXをロードしたHPG類のナノ粒子は物理的に安定であり、室温で1週間の保存中には薬物沈殿又は凝集を観察しなかった。
HPG類の粘膜付着特性を評価するため、Thongborisute and Takeuchiによって開発されたムチン粒子法(Thongborisute,J.;Takeuchi,H.Int.J.Pharm.2008,354,204−209)を用いた。当該方法は、サブミクロンサイズのムチンが粘着性ポリマーとムチンとの相互作用の結果として凝集することに起因する、粒子サイズ変化に基づく。サブミクロンサイズのムチンの溶液を、等体積の100mM酢酸緩衝液中HPG類(10%w/v)と混合し、ボルテックスし、37℃で30分間インキュベーションした。3000 HS Zetasizer (Malvern Instruments,San Bernardino,CA)を用いて、光散乱測定により粒子サイズ変化をモニターした。各試験はトリプリケートで実施し、陽性コントロールとしてキトサン溶液(1%w/v)を用いた。ム
チンの粒子サイズは、キトサン溶液(1%w/v)又はHPG−C8/10−MePEG−NH2(121)溶液(10%w/v)のいずれかとのインキュベーション後、有意に増大した(図20)。HPG−C8/10−MePEG(10%w/v)によっては、ムチン粒子のサイズは影響されなかった。サブミクロンサイズのムチン粒子サイズの増大は、ムチン粒子及びHPG−C8/10−MePEG−NH2ナノ粒子の凝集に起因していて、ムチンと、アミンで置換したHPG類との粘膜付着力が原因であった。広く知られている粘膜付着ポリマーのキトサンを陽性コントロールとして用いた。しかし、高分子量と水溶液における低溶解度のために、キトサンの希釈液(1%w/v)を用いた。当該希釈液ですら、共インキュベーション後に、ムチン粒子サイズの有意な変化を示した。キトサン及びHPG−C8/10−MePEG−NH2の両方の粘膜付着性は、正に帯電したアミン基と、負に帯電したムチン粒子との静電相互作用に起因するが、水素結合、疎水性効果及び鎖の絡み合い等の他の寄与もまた、影響をもたらし得ると考えられている。しかし、HPG−C8/10−MePEGの粘膜付着性の欠如からみて、HPG−C8/10−MePEG−NH2の粘膜付着特性には、主に静電引力が寄与するらしいことが示唆される。
細胞増殖
96−ウェルプレート中、10% FBSを添加した体積100μlのマッコイ培地に5,000細胞/ウェルでKU7−luc細胞をプレーティングし、新たに調製したHPG−C8/10−MePEG及び/又はHPG−C8/10−MePEG−NH2(PBS,pH7.4に溶解,0〜150μg/ml)溶液を加える前に、24時間平衡化させた。細胞をHPG溶液に2時間曝露し、以前記載(Mugabe,C.;Hadaschik,B.A.;Kainthan,R.K.;Brooks,D.E.;So,A.I.;Gleave,M.E.;Burt,H.M.BJU Int.2009,103,978−986)した通り、CellTiter96 AQueous Non−Radioactive Cell Proliferation assay(Promega,Madison,WI)を用いて、72時間後に細胞の生存率を決定した。
HPG−C8/10−MePEGポリマー類及びHPG−C8/10−MePEG−NH2(121)ポリマー類を、以前報告(Savic,R.;Luo,L.;Eisenberg,A.;Maysinger,D.Science 2003,300,615−618)した通り、テトラメチル−ローダミン−カルボニル−アジド(TMRCA)で共有結合的に標識した。テトラメチル−ローダミン−カルボニル−アジド(TMRCA)は、Invitrogen Canada Inc.(Burlington,ON)から購入した。簡単に述べると、500mgのHPG類(HPG−C8/10−MePEG又はHPG−C8/10−MePEG−NH2(121))を5mlの無水1,4−ジオキサン中に溶解した。適量のテトラメチルローダミン−5−カルボニル−アジド(TMRCA,MW 455.47)を2mlの無水1,4−ジオキサン中に溶解し、最終濃度を1mg/mlとした。当該蛍光プローブのアリコート675μl(おおよそ20mol%のHPG類に相当)をHPG類溶液に加え、窒素気流の下5時間攪拌し、油浴中で80℃に加熱した。透析液が無色になるまで、DMF(MWCO 12,000〜14,000)に対して透析し、次いで蒸留水に対して24時間透析することにより、未反応プローブを除去した。蛍光標識ポリマー類(HPG類−TMRCA)を凍結乾燥し、アンバーバイアル中、−80℃で保存した。
KU7−luc細胞を用いて、ローダミン標識HPG類の結合及び取り込みを評価した。96−ウェルプレート中、10% FBSを添加した体積100μlのマッコイ培地に
10,000細胞/ウェルで細胞をプレーティングし、24時間平衡化させた。培地を除去し、細胞をローダミン標識HPG類(HPG−C8/10−MePEG−TMRCA又はHPG−C8/10−MePEG−NH2(121)−TMRCA,1.56〜200μg/ml)と2時間インキュベーションした。インキュベーション時間に続いて細胞をPBSで3回洗浄し、200μlの0.5%Triton X−100(PBS中pH8)で溶解して細胞の蛍光結合量を蛍光分光光度計(Synergy 4.0)により、545/578の励起/蛍光で測定した。Triton X−100及びPBS(pH8)中のローダミン標識HPG類(0.781〜6.25μg/ml)から標準液を調製した。細胞に取り込まれたか、又は表面に結合したローダミン標識HPG類量を、各ウェルに加えたポリマー全量のパーセンテージとして表した。
KU7−luc細胞を、細胞数7×104細胞に相当する〜75%のコンフルエンスに達するまで細胞増殖させ続けるために、10cmシャーレ中、シャーレの底において、1cm×1cmカバーガラス上で増殖させた。次いで、細胞を含有するカバーガラスを取り出し、加温PBSで3回洗浄した。次いで、カバーガラスを、パラフィルムで裏打ちしたシャーレ中に細胞側を上にして、取り込みアッセイの継続時間中静置した。ローダミン標識HPGポリマー類(250μlのHPG−C8/10−MePEG−TMRCA又はHPG−C8/10−MePEG−NH2(121)−TMRCA)を、1mg/mlの濃度でカバーガラス上の細胞に加えた。細胞を1、4、8及び24時間インキュベーションした。各時点の後、カバーガラスをPBS中で4回激しく洗浄した。過剰PBSを穏やかにふき取った後、250μlの3.7%のパラホルムアルデヒドを用い、細胞を室温で10分間固定した。次いで、カバーガラスをPBS中で更に3回洗浄し、水中に浸漬し、過剰な液体をふき取り、最後に細胞側を下にしてスライドガラス上に4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)を伴うProlong goldと共にマウントした。サンプルの乾燥を停止するため、透明なマニキュア液を慎重にカバーガラスのへり周辺に用いた。1晩のインキュベーションによりサンプルの適切な硬化を確実にし、次いでイメージングの準備が整った。Olympus FV−1000倒立共焦点顕微鏡で顕微鏡実験を行った。用いたレーザー波長は、ローダミン及びDAPIのイメージングについて、それぞれ568nm及び405nmであった。直接コントラスト(DIC)も行って細胞膜を可視化し、その上で405nmレーザーで励起した。一貫した比較を可能にするため、各ポリマー群内で、レーザー出力及び高電圧利得を比較的一定に保持した。標識ポリマーが細胞内側にあることを明確に示すため、画像を蛍光及びDICで解析した。
HPG−C8/10−MePEG−NH2(121)−TMRCAナノ粒子は、低濃度で大々的にKU7−luc細胞に結合し、内在化されたが、HPG−C8/10−MePEG−TMRCAナノ粒子に関しては、12.5μg/ml以下の濃度では、細胞結合又は細胞取り込みの証拠は観察されなかった(図21A)。当該ポリマーの強力な結合プロファイルは、おそらくは正に帯電したHPG−C8/10−MePEG−NH2(121)ポリマーと負に帯電したKU7−luc細胞膜との静電引力に起因する。しかし、HPG類濃度が上昇するにつれ、HPG−C8/10−MePEG−NH2(121)−TMRCAナノ粒子の細胞への結合及び細胞取り込みは(25μg/mlで)飽和点に達した。その一方、HPG−C8/10−MePEG−TMRCAナノ粒子のKU7−lucへの細胞結合及び細胞取り込みは、濃度12.5μg/ml及び50μg/mlの間で観察された直線的関係を伴って濃度依存的であり、続いてポリマー濃度がより高くなると結合及び取り込みがあまり顕著でなくなることがわかった(図21A)。飽和したHPG−C8/10−MePEG−NH2(121)−TMRCAナノ粒子の挙動が、その細胞傷害効果に起因したか否かを評価するために、発明者らは、KU7−luc細胞の増殖に対するHPGの影響を評価した。細胞を、空の(薬物をロードしていない)HPG−C8/1
0−MePEGナノ粒子及びHPG−C8/10−MePEG−NH2ナノ粒子(0〜150μg/ml)に2時間曝露し、MTSアッセイにより細胞生存率を決定した。HPG−C8/10−MePEGナノ粒子及びHPG−C8/10−MePEG−NH2ナノ粒子は、共に増殖に同様の影響を示し、試験した濃度ではKU7−luc細胞株に生体適合性があった(図21B)。従って、HPG−C8/10−MePEG−TMRCAナノ粒子及びHPG−C8/10−MePEG−NH2(121)−TMRCAナノ粒子について観察された、細胞結合及び取り込みの差異は、KU7−luc細胞株に対するそれらの細胞傷害効果には起因しないようである。
共焦点顕微鏡を用い、細胞によりナノ粒子が内在化されたのか、又は単にKU7−lucの細胞膜に結合しただけなのかどうかをモニターした。HPG−C8/10−MePEG−TMRCAナノ粒子及びHPG−C8/10−MePEG−NH2(121)−TMRCAナノ粒子は、両方とも迅速にKU7−luc細胞によって内在化され、1時間のインキュベーションで完全な取り込みが達成された(データ示さず)。蛍光解析により、細胞質中のローダミン標識HPG類の存在を観察した。HPG−C8/10−MePEG−TMRCAナノ粒子及び/又はHPG−C8/10−MePEG−NH2(121)−TMRCAナノ粒子は、細胞質の至る所に存在することが観察され、単に細胞膜に接着しているか、又は細胞膜中に存在しているのとは対照的だった。KU7−luc細胞の核コンパートメント中に検出されたポリマー類由来の蛍光は無かった。核コンパートメント中にHPGナノ粒子が無いことは、比較的大きなその分子量(<80kDa)に起因している可能性がある。全時点で、コントロールの細胞と比較すると、HPG−C8/10−MePEG−TMRCAナノ粒子及びHPG−C8/10−MePEG−NH2(121)−TMRCAナノ粒子は、KU7−luc細胞の生存率及び有病率に影響しない。全体として、ローダミン標識HPGナノ粒子は、1時間のインキュベーションによりKU7−luc細胞に取り込まれ、1、4、8又は24時間の時点で取得した画像間で全く差異は無かった。
HPG類におけるDTXのローディング及び定量
薬物及びポリマーを共通の有機溶媒中に溶解し、溶媒を除去する溶媒蒸発法により、DTXをHPG−C8/10−MePEG及びHPG−C8/10−MePEGNH2(121)にロードした。結果生じるポリマー/薬物マトリクスを、10mM PBS(pH7.4)で再構成した。結果生じる溶液は一般的に透明であったが、白色粒子が観察された場合は、溶液を遠心(18000g、10分間)し、上清を新たな容器に移した。
透析法により、HPGナノ粒子(HPG−C8/10−MePEG及びHPG−C8/10−MePEG−NH2(121))からのDTX放出を決定した。簡単に述べると、100mgのHPG−C8/10−MePEG又はHPG−C8/10−MePEG−NH2(121)を秤量して1mlアセトニトリル溶液中で1mgのDTXと混合し、15μCiの3H−DTXでスパイクし、次いで窒素気流下で乾燥して溶媒を除去した。HPG/DTXマトリクスを2mlのPBSで水和し、透析バッグに移して100rpmで震盪しながら500mlの人口尿(pH6.5)に対して透析した。0.1M HClを用いて溶液のpHを6.5に調整した。ヒト尿の生理学的pHの範囲は、広範囲にわたってばらつき得る(pH4.5〜pH8)が、中央値は6.5なので、それを選択した(Brooks,T.;Keevil,C.W.Lett.Appl.Microbiol.1997,24,203−206.)。種々の時点で、透析バッグの体積を測定し、透析バッグ中の残存放射活性の測定用にサンプル10μlを採取し、外部放出媒体全体を新鮮媒体と交換してシンクの状態を維持した。ベータシンチレーションカウンティング(Beckman Coulter Canada,Mississagua,ON)により、各時点において透析バッグ中に残存する3H−DTXの濃度を決定した。実験開始時の初期薬物量から各時点で残存する薬物の量を差し引くことにより、放出された薬物(累積)のパーセントを算出した。データは時間に応じた放出薬物(累積)のパーセンテージとして表した。HPG類からのDTX放出プロファイルでは、放出のバースト期がほぼ無いか、又は全く無い、継続的な放出制御が特徴であった(図22)。おおよそ55%の初期封入薬物が、インキュベーションの最初の24時間以内に放出された。HPG類表面上でのアミン基の存在によっては、薬物放出は影響されなかった(図22)。
同所性膀胱異種移植片を有するマウスにおいて、膀胱内の、DTXをロードしたHPG製剤の寛容度及び有効性を評価した。用いた同所性マウスモデルは、Mugabe,C.;Hadaschik,B.A.;Kainthan,R.K.;Brooks,D.E.;So,A.I.;Gleave,M.E.;Burt,H.M.BJU Int.2009,103,978−986;Hadaschik,B.A.;Black,P.C.;Sea,J.C.;Metwalli,A.R.;Fazli,L.;Dinney,C.P.;Gleave,M.E.;So,A.I.BJU Int 2007,100,1377−1384;Hadaschik,B.A.;ter Borg,M.G.;Jackson,J.;Sowery,R.D.;So,A.I.;Burt,H.M.;Gleave,M.E.BJU Int.2008,101,1347−1355に報告されている。動物実験は、すべてカナダ動物管理協会に従って行われて、動物管理プロトコールは、本発明者らの研究所(The University of British Columbia)の動物管理委員会に承認されている。当該モデルにおいては、ルシフェラーゼを発現するKU7−luc癌細胞を用いた。腫瘍接種用に、8週齢の雌性ヌードマウス(Harlan,Indianapolis,IN)をイソフルランで麻酔した。潤滑化24 G Jelco血管カテーテル(Medex Medical Ltd.,Lancashire,UK)を尿道を経て膀胱へ通す前に、巾着縫合を尿道口付近の表層に施した。100μl PBSで膀胱を1回灌注した後、2百万のKU7−luc細胞を、50μlの単一細胞懸濁液として注入し、巾着縫合を2.5時間結紮した。その間、マウスの麻酔を維持した。縫合糸を除去した後、マウスをケージ中に留置し、意識を取り戻して通常に排尿するまでモニターした。腫瘍接種後5日目に、以下の処理群:PBS(コントロール);タキソテレ(登録商標)(0.5mg/ml及び1.0mg/ml、Tween 80中DTX);HPG−C8/10−MePEG中DTX(0.5mg/ml及び1.0mg/ml);HPG−C8/10−MePEG−NH2(121)中DTX(1.0mg/ml)に従って、マウス26匹を無作為に膀胱内注入処理(50
μl及び滞留時間2時間)した。処理日にマウスを数時間モニターし、その後は日ごとにモニターした。毒性のいかなる兆候(特に、体重減少、食物及び水の摂取における変化、不活発状態、猫背の姿勢及び/又はストレスの巨視的兆候)も記録した。24時間以内に回復しなかった疼痛又は疾病の徴候を示したマウスは屠殺した。IVIS 200イメージングシステム(Xenogen Corp.,Alameda,CA)によるマウスの非侵襲的なイメージングによって、2、8、12及び19日目に腫瘍負荷をモニターした。簡単に述べると、150mg/kgのルシフェリンをマウスに腹膜内注射し、イソフルランで麻酔し、ルシフェリン注射後ちょうど15分で背臥位をイメージングした。Living Imageソフトウェア バージョン2.50(Xenogen)を用いてデータを取得し解析した。
11及び19日目に、マウスをイメージングした。膀胱内の、DTXをロードしたHPG−C8/10−MePEG−NH2(121)により、マウス腫瘍の成長は阻害されたが、DTXをロードしたHPG−C8/10−MePEGでは、同じ濃度でそうはならなかった。腫瘍再接種後11及び19日目で、4匹のうち3匹のマウスには、DTX(0.2mg/ml)をロードしたHPG−C8/10−MePEG−NH2(121)ナノ粒子による1回の膀胱内処理の後、腫瘍成長の証拠は示されなかったが、DTX(0.2mg/ml)をロードしたHPG−C8/10−MePEGナノ粒子で処理された5匹のうちの4匹のマウスには、膀胱腫瘍成長の証拠が示され、1匹のマウスには、更に腎臓腫瘍が発症していた(図24)。再度述べるが、当該製剤はマウスに十分寛容され、これらの実験の間、深刻な毒性又は体重減少は生じなかった。
KU7−luc細胞株、並びに低悪性度(RT4,MGHU3)及び抗悪性度(UMUC3)の両方のヒト尿路上皮癌細胞株に対する、市販製剤タキソテレ(登録商標)及びDTXをロードしたHPG製剤の細胞傷害性効果を評価した。
ノモラー(4〜12nM)の範囲であった。コントロールのHPG類ナノ粒子(薬物なし)では、試験した濃度範囲にわたって細胞傷害性が示されなかった(15〜1,500nM,データ示さず)。HPG類へのDTXロードによっては、その細胞傷害性は影響されなかった。
マウス同所性膀胱癌モデルにおける膀胱内DTXの有効性
全部で42匹のヌードマウスでin vivoの実験を行い、タキソテレ(登録商標)(0.2mg/ml)並びにDTX(0.2mg/ml)をロードしたHPG−C8/10−MePEG及び/又はHPG−C8/10−MePEG−NH2による1回の膀胱内処理の有効性を評価した。用いた同所性マウスモデルは、Hadaschik BA,Black PC,Sea JC,et al.BJU Int 2007;100:1377−84;Mugabe C,Hadaschik BA,Kainthan RK,et al.BJU Int 2009;103:978−86;Hadaschik BA,ter Borg MG,Jackson J,et al.BJU Int 2008;101:1347−55;Hadaschik BA,Adomat H,Fazli L,et al.Clin Cancer Res 2008;14:1510−8;Hadaschik BA,Zhang K,So AI,et al.Cancer Res 2008;68:4506−10に報告されている。動物実験はカナダ動物管理協会に従って行った。11週齢の雌性ヌードマウス(Harlan,Indianapolis,IN)をイソフルランで麻酔した。潤滑化24 G Jelco血管カテーテル(Medex Medical Ltd.,Lancashire,UK)を尿道を経て膀胱へ通す前に、6−0ポリプロピレンの巾着縫合を尿道口付近の表層に施した。PBSで膀胱を1回灌注した後、2百万のKU7−luc細胞を、50μlの単一細胞懸濁液として注入し、巾着縫合を2.5時間結紮した。in vivoの腫瘍負荷を定量するために、4、11、18及び25日目に150mg/kgルシフェリンを腹膜内注射し、15分後に、IVIS200イメージングシステム(Xenogen/Caliper
Life Sciences,Hopkinton,MA)により動物を仰臥位でイメージングした。Living Image software(Xenogen)を用いてデータを取得し、解析した。腫瘍接種後5日目に、無作為に、マウスの膀胱を50μlのPBS(コントロール);タキソテレ(登録商標)(0.2mg/ml);DTX(0.2mg/ml)をロードしたHPG−C8/10−MePEG;及びDTX(0.2mg/ml)をロードしたHPG−C8/10−MePEG−NH2で1回処理した。生物発光レベルは群間で同等であったが、マウス個体間で腫瘍にばらつきがあるため、各マウスにおいて、統計解析のために処理後腫瘍の生物発光を4日目の初期フラックスに対して正規化した。腫瘍接種後25日目に剖検を行った。膀胱全体を取り出し、10%緩衝化ホルマリン中で固定してパラフィン中に包埋した。5μmの切片を作製し、標準法を用いてH&Eで染色した。スライドは、すべて調査し、BLISS microscope imaging workstation(Bacus Laboratories Inc.,Lombard,IL)上で走査した。
、PBSコントロール群又はタキソテレ(登録商標)群のいずれかと比較すると、統計的に有意となった(図26,P<0.01,二元配置分散分析後、事後ボンフェローニ解析)。実験の最後では、DTXをロードしたHPG−C8/10−MePEG−NH2ナノ粒子の膀胱内注入(1回)により、PBSコントロール群と比較して、腫瘍成長は88%阻害された。当該処理群においてDTXをロードしたHPG−C8/10−MePEGナノ粒子により、54%の腫瘍阻害が示された。有効性の当該増大は、DTXをロードしたHPG−C8/10−MePEG−NH2ナノ粒子で処理したマウスの膀胱及び腫瘍組織における薬物取り込み亢進に起因すると思われた。
G群についての結果は定量的である。マウスには各々、体積50μL中50μgの薬物を投与し、50mgのdHPGを用いた(1群あたりn=3)。
膀胱内DTX製剤を受けて、膀胱組織中及び血清中の取り込みを評価するために、同所性膀胱腫瘍を有するマウスを、タキソテレ(登録商標)(0.2mg/ml,n=3)又はDTX(0.2mg/ml)をロードした、HPG−C8/10−MePEG(n=4)及び/又はHPG−C8/10−MePEG−NH2(n=4)のいずれかで注入した。注入後2時間に、尿、膀胱組織及び血清中のDTX量を測定した。薬物取り込み実験は、樹立したKU7−lucの腫瘍を有する15週齢の雌性ヌードマウス(腫瘍接種後33日目)で行った。膀胱内注入後0、30及び60分で尾部血液サンプルを採取した。当該時間、マウスは依然、イソフルランで麻酔していた。2時間後、すべてのマウスをCO2を用いて窒息させて殺し、心穿刺により血液を更に除去した。血液サンプルをmicro−haematocrit tubes(Fisher Scientific,Pittsburg,PA)中又はserum−separator tubes(Becton Dicknson)中で遠心し、血清を液体窒素中でさっと凍結した。各マウスの尿及び膀胱も回収し、膀胱は、凍結前に切開して内腔を露出させ、10mlPBSで5回連続で激しく洗浄した。サンプルはすべて−80℃で保存した。解析に用いたUPLC−MS/MSシステムは、Waters TQD質量分析計を用いた質量分析と共役した、統合化Waters Acquity UPLC分離システム(Acquity BEH C18,1.7μm,2.1 X 50mmカラム)から構成した。電子スプレーイオン源ブロックの温度150℃、脱溶媒和温度350℃、コーン電圧14V、キャピラリー電圧0.70kV、引出電圧3kV、RF電圧0.1kV、コーンガス流25l/h、脱溶媒和ガス流600l/h及び衝突ガス流量0.2ml/minでシステムを作動させた。陽イオンモードにおいて、分子を電子スプレーでイオン化した。以前確立したとおり(Mugabe C,Liggins RT,Guan D,et al.Int J Pharm 2011;404:238−49)、m/z 808.5→527.2の遷移をモニターする複合反応において、DTXを定量した。溶媒/溶媒抽出法によって、マウス血清からDTXを抽出した。96−ウェルプレートにおいて、マウス血漿及び標準液の50μlアリコートをアセトニトリル中の0.1%ギ酸150μlと混合し、室温で1分間ボルテックスした。サンプルを4℃10分間、5,500rpmで遠心した(Allegra(商標)25 R centrifuge,Beckman−Coulter)。上清100μlと蒸留水50μlとを混合し、混合して30秒間ボルテックスした。膀胱組織を計量し、ジルコニアビーズ(Biospec Products)及びミクロバイアルホルダーを備えたmini−bead beater(Biospec Products)を用いて0.1%ギ酸/メタノール中で60秒間ホモジェナイズした。サンプルを4℃で2分間、14,000rpmで遠心した(Allegra(商標)25 R centrifuge,Beckman−Coulter)。メタノール中0.1%トリフルオロ酢酸150μlをサンプルに加え、混合及び4℃で15分間、14,000rpmでボルテックスした(Allegra(商標)25 R centrifuge,Beckman−Coulter)。サンプルの解析は、すべてUPLC−MS/MSを用いて行った。スパイクしたコントロールサンプルからの回収率は97%で、DTXの検出限界は10ng/mlであった。すべての場合において、ランの精度(precision)(%RSD)は15%未満の範囲内であった。
DTXをロードしたHPG−C8/10−MePEG−NH2は、タキソテレ(登録商標)又はDTXをロードしたHPG−C8/10−MePEGと比較して、膀胱組織内蓄積が有意に高くなっていた(P<0.001,一元配置分散分析,ボンフェローニの多重比較検定)。タキソテレ(登録商標)処理群とDTXをロードしたHPG−C8/10−MePEG処理群とでは、胱組織蓄積において統計的な有意差は無かった(P>0.05,一元配置分散分析)。尿中の最終濃度は初期の投与溶液よりも約5〜7倍低かった。これは、2時間の膀胱内注入の間の尿希釈に起因した。しかし、DTXの尿中最終濃度において、異なる処理群の間に有意差は無かった(P>0.05,一元配置分散分析)。各群とも、局所的又は全身的毒性は観察されなかった。
膀胱腫瘍微環境及び腫瘍組織へのローダミン標識HPG類分布を評価した。
HPG−C8/10−MePEGポリマー類及びHPG−C8/10−MePEG−NH2ポリマー類を、以前報告(Savic R,Luo L,Eisenberg A,Maysinger D.Science 2003;300:615−8;Mugabe C,Liggins RT,Guan D,et al.Int J Pharm 2011;404:238−49)した通り、テトラメチル−ローダミン−カルボニル−アジド(TMRCA)で共有結合的に標識した。同所性膀胱腫瘍(腫瘍接種後33日目)を有する15週齢の雌性ヌードマウスをイソフルランで麻酔した。6/0ポリプロピレンの巾着縫合を尿道口付近の表層に施し、膀胱を手で圧縮して空にした。ゲージ24の潤滑化Jelco血管カテーテルを尿道を経て膀胱へ通し、次いで50μlのPBS、遊離型ローダミン(TMRCA)、HPG−C8/10−MePEG−TMRCA及び/又はHPG−C8/10−MePEG−NH2−TMRCAのいずれかを注入し、巾着縫合を2
時間結紮し、その間、マウスの麻酔を維持した。2時間後、巾着縫合を除去し、膀胱を用手圧迫により空にし、150μlのPBS(pH6.0)で2回洗浄した。マウスを安楽死させ、膀胱を切除してアルミブロック上で凍結し、次いで凍結切片作製のためOCT中に包埋した。膀胱の境界から1、2及び3mmの距離で10μmの凍結切片を切った。切片を室温で乾燥し、10xの対物レンズ(0.75μm/ピクセルの解像度)を用いて、ローダミン蛍光についてイメージングした。スライドを1:1のアセトン:メタノール溶液中で10分間固定し、特注の毛管現象染色器を用いてCD31(1:50のハムスター抗CD31(抗ハムスターAlexa 647(二次)を伴う)及びHoechst 33342(核染色色素)について染色した。CD31及びHoechst 33342の蛍光イメージング後、切片をヘマトキシリンで軽くカウンター染色し、マウントして明視野でイメージングした。
Macsソフトウェアを用いて統計解析(分散のノンパラメトリック解析(クラスカル−ウォリス検定))を行った。
本発明者らの報告(Kainthan,R.K.;Brooks,D.E.Bioconjugate Chem.2008,19,2231−2238)に記載したプロトコール従い、O/DGEコアを修飾したHPG類の重合を実施した。以前報告したプロトコール(Haxton,K.J.;Burt,H.M.Dalton Trans.2008,5872−5875)に従い、カルボン酸基によるC8/10コア修飾HPG類の機能化を行った。典型的な反応については、5.0gのHPG−C8/10−OH又はHPG−C8/10−MePEG6.5を100mLのピリジン中に溶解し、溶液を窒素雰囲気下に保持し、続けて、HPG類上カルボン酸基の標的量に応じて調整したジメチルアミ
ノピリジン及び無水コハク酸を加えた。最高量のCOOH基でHPGを合成するため、利用可能なすべての遊離ヒドロキシル基を、カルボン酸塩への修飾の標的とした。従って、過剰量のジメチルアミノピリジン(0.075g,0.61mmol)及び無水コハク酸(4.5g,45mmol)を反応液に加えた。遊離ヒドロキシル基の理論モル数を算出することにより、HPG1モル当たり348モルの遊離ヒドロキシル基があり、理論的にHPG1モル当たり同数のカルボキシル基があると決定した。従って、結果生じるHPGをHPG−C8/10−MePEG6.5−COOH348と表示した。少量のジメチルアミノピリジン(0.015g,0.12mmol)と、無水コハク酸(0.9g,9mmol)を用いることにより、遊離ヒドロキシル基がすべて修飾の標的とされるわけではないHPG類を生成した。反応混合物に加えた無水コハク酸のモル数を算出することにより、HPGに加えたカルボキシレート基の理論数を決定した。従って、当該カルボン酸塩含量が低いHPGをHPGC8/10−MePEG6.5−COOH113と表示した。ジメチルアミノピリジン及び無水コハク酸を加えた後、マグネティックスターバーを用いて、溶液を室温で1晩攪拌した。脱イオン水(100mL)をフラスコに加え、混合物を30分間攪拌したままにした。共沸蒸留によってピリジンの蒸発をよりよくできるようにするために周期的に水を加え、回転蒸発によって溶媒を除去した。最終生成物をメタノール中に溶解し、酢酸セルロース透析管(MWCO 10000g/mol,Spectrum Laboratories Inc.,Rancho Domunguez,CA)を用いて、3日間、80:20のメタノール/脱イオン水混合物に対して透析した。8時間ごとに透析媒体を変え、透析媒体が水100%である最後の3段階時まで、各回でメタノール濃度を低下させた。凍結乾燥により、ポリマー類を取得した。
の未反応一級アルコール基), 69.98-73.74 (-CH2-O-, ポリマー中-CH-O), 78.93-80.14 (ポリマー中のCH), 173.84-174.16 (C(O)CH2CH2COOH), 175.92 (C(O)CH2CH2COOH).
精製後、HPG類は、すべてNMRにより特性解析した。400 MHz Bruker Avance II+ spectrometer(Bruker Corporation,Milton,ON)を用いてHPGポリマー類のNMRスペクトルを取得した。ポリマー類をDMSO−d6又はメタノール−d4(Cambridge Isotope Laboratories,Andover,MA)中に溶解した。一次元のプロトンスペクトル及び炭素スペクトルを取得し、二次元の、多重度編集異核種単一量子コヒーレンス(HSQC)NMR実験、異核間多結合相関(HMBC)NMR実験、及びHSQC−TOCSY(全相関分光)NMR実験も同様にした。化学シフトは残存溶媒のピークを基準にした。Sparky(T.D.Goddard and D.G.Kneller,Sparky 3,University of California,San Francisco)を用いて二次元スペクトルを解析した。HSQCのデータから、HPG類上のCOOHのモル比を、以下の通り推定した:各修飾について、メチレンのプロトン4つに対応するピークを積分し、その積分をプロトン数に関して補正した。当該値を、TMPメチル基の積分(プロトン多重度に関して補正)で除し、COOHのモル比を得た。
han,R.K.;Janzen,J.;Kizhakkedathu,J.N.;Devine,D.V.;Brooks,D.E.Biomaterials 2008,29,1693−1704;Haxton,K.J.;Burt,H.M.Dalton Trans.2008,5872−5875)。HSQC、HMBC及びHSQC−TOCSYを用い、ピーク体積の積分を用いてHPG類上の置換基、C8/10アルキル鎖、MePEG及びCOOHの比を推定した。
超分岐ポリマー類は、典型的に、以下の方程式:
脂肪族鎖のR−メチレン基にアサインされるが、もう1つのピークは明確にアサインすることができなかった。化学シフトに基づき、当該ピークは、2級ヒドロキシル基に結合した1本のアルキル鎖を伴うTユニットに対応し得るが、この考察は確認できない。HPG−MePEG6.5についても、同様の状況が観察された。MePEGのR−メチレン基からのピークはアサインできたが、未知のピークは明確にアサインできなかった。HPG−C8/10−OHと同様に、新たなピークの化学シフトは、L14様のユニットに類似している。まとめると、DB及びDPnは、シグナルの明確なアサインメントが無いために、NMRデータから算出できなかった。NMRデータにより、リニアユニット又はターミナルユニットの観察を通して遊離ヒドロキシル基を直接的に特性解析すること、並びに予想された分岐パターン及び修飾(アルキル、MePEG及びカルボキシル)が存在することを、すべて確認することが可能となる。図33でNMRスペクトル中のアサインされた様々なピークを説明し、予想された分岐パターン、MePEG、アルキル鎖及びCOOH基の存在を示す。
COOHで修飾されたすべてのHPGポリマー類について、HSQC NMRスペクトルからCOOHのモル比を推定した。当該方法による、HPGポリマー中のCOOH数は、サンプル中に存在するTMPのメチル基に対して相対的に表現されるため、絶対数ではない。各HPG分子は、TMPを1つだけ含有すると仮定するが、様々なポリマーバッチ中での、HPG1モル当たりのTMP量を、独立して定量してはいない。従って、当該数は、どのくらい多くのヒドロキシル基がCOOHで覆われているかの定性的指標としての役割を果たす。更に、HPG−C8/10−MePEG6.5−COOHポリマー類は、両方同一のHPGC8/10−MePEG6.5のバッチから合成するため、TMP含量は同一と予想し、2つのHPG−C8/10−MePEG6.5−COOHポリマー類における相対的COOH量を決定するために、NMRスペクトルを比較し得る。モル比は、HPG−C8/10−MePEG6.5−COOH113と比較して、HPG−C8/10−MePEG6.5−COOH348中では2.8倍多くのCOOH含量であることを示す。これは2つのポリマー類における目標COOH含量の比の3.1倍とよく一致する。HPG−C8/10−COOHポリマー類及び高カルボニル密度のHPGC8/10−MePEG6.5−COOH348ポリマー類については、リニアユニット又はターミナルユニットに対応するピークは観察されないが、このことは当該ポリマー中にはヒドロキシル基が存在しないことを示す(代表的なNMRスペクトルについては、図34を参照)。低密度COOHポリマー、HPG−C8/10−MePEG6.5−COOH113については、リニア基及びターミナル基のピークが、新たなピークに加えて観察されるが、このことは、カルボン酸によって、一部のみのヒドロキシル基が飽和しているこを示している(データ示さず)。
汎用ATRサンプリング装備品を伴うPerkin−Elmer FTIR分光計(Perkin−Elmer,Woodbridge,ON)を用いて、HPG類のFT−IRスペクトルを取得した。走査範囲は4000〜650cm−1で、分解能は4cm−1であった。
り、従ってそれらは、当該ポリマー類すべてにおいて見出され得る。HPG−C8/10−MePEG6.5、HPG−C8/10−MePEG6.5−COOH113及びHPG−C8/10−Me−PEG6.5−COOH348のFT−IRスペクトルを比較することにより、HPG−C8/10−MePEG−COOHにおけるOHピーク(3300〜3500cm−1)が減少し、CdOピーク(1680〜1780cm−1)が現れることが理解できるが、このことにより、OH基が消費され、COOHに変換されたことが示される。HPG−C8/10−MePEG6.5−COOH348のスペクトルにより、OHピークがほぼ除かれていることが示されたが、このことにより、OH基は大体消費されてCOOHに変換されたことが示される。一方、HPG−C8/10−MePEG6.5−COOH113についてのOHピークは、減少はするが依然明らかであり、NMRの結果と一致した。更に、後者のHPGも小さなCdOピークを示すが、このことにより、HPG−C8/10−MePEG6.5−COOH348と比較してCOOHのモル比が低いことが示される。FT−IRのデータにより、HPG類の官能基化における変化を裏付けるよい証拠が示され、また、精製手順により未反応試薬が除かれたことが確認された。
DAWN−EOS多角度レーザー光散乱(MALLS)検出器を備えたゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)(GPC−MALLS)及びOptilab RI検出器(Wyatt Technology Inc.,Santa Barbara,CA)によってHPG類の重量平均分子量(Mw)及び多分散性を決定した。流速0.8mL/minで、0.1Nの硝酸ナトリウム水溶液を移動相として用いた。詳細は以前の報告(Kainthan,R.K.;Brooks,D.E.Bioconjugate Chem.2008,19,2231−2238;Kumar,K.R.;Kizhakkedathu,J.N.;Brooks,D.E.Macromol.Chem.Phys.2004,205,567−573)中に記載している。様々なHPG類に関してのdn/dc値は、0.1N NaNO3水溶液中、HPGC8/10−MePEG6.5、HPG−C8/10−MePEG6.5−COOH348及びHPG−C8/10−MePEG6.5−COOH113について、それぞれ0.146、0.165及び0.138と決定し、ポリマー類の分子量の算出に用いた。Wyatt Technology Corp.により提供されたAstraソフトウェアを用いてデータを処理した。MwをPDIで除することにより、ポリマー類の数平均分子量を算出した。
T−50 M titrator(Mettler Toledo,Mississa
uga,ON)において、COOHを表面移植したHPG類の全濃度を定量するため、電位差/pH滴定を行った。HPG−C8/10−MePEG6.5−COOH348のサンプル及びHPG−C8/10−MePEG6.5−COOH113のサンプルを、10mLの10mM NaOH中に0.2mg/mLで溶解した。各溶液のpHを、0.1M
NaOHを加えることにより、手操作で最大おおよそ11に増大させた。次いで、0.01M HClによりサンプルを滴定した。ダイナミックレンジ10〜50μL及び注入間の時間間隔30〜60秒で注入を設定し、確実に平衡状態を確立した。pHが一旦3.0に到達すると、滴定を終了した。標準的な補外/交差法を用いて、滴定のエンドポイントを決定した。報告したCOOH滴定値は、3回の測定の平均を表す。
HPGポリマー類の溶解度特性は、既知の重量のポリマーを様々な水性緩衝液又は蒸留水に溶解することにより評価した。サンプルを穏やかにボルテックスして溶解速度を上げた。濁りの徴候について、ポリマー溶液の550nmの吸光度を、数日間定期的に測定し、ポリマーが溶液中に残存しているか否かを評価した。カルボン酸で誘導体化したHPGポリマー類のいくつかについては、溶液のpHを調整して溶解を促進した。
粒子サイズ及びゼータ電位の解析は、disposable sizing cuvetteを用いたMalvern NanoZS Particle Size analyzer(Malvern Instruments Ltd.,Malvern,U.K.)を用いて行った。濃度15mg/mlのポリマー溶液を1mM NaCl中にpH6.0で調製し、測定前に0.22μmのシリンジフィルター(Pall Life Sciences,Ann Arbor,MI)で濾過した。
0.01M NaOH中10mg/mLのポリマー類溶液を調製することにより、カルボン酸塩で修飾したHPG類へのシスプラチンの結合を評価した。薬物の最終濃度が0.5〜4mg/mLの範囲となるように、当該溶液へシスプラチンを加えた。少量の5M NaOHにより、各溶液のpHを6.0に調製した。溶液を50rpmで震盪しつつ、37℃で一晩インキュベーションした。溶液をNanosep 3K Omega centrifugal filtration devices (Pall Life Sciences,Ann Arbor,MI)に移し、5000rpmで10分間遠心した。少量の濾液(10〜40μL)を0.01M NaOHで400μLに希釈し、以前に記載のo−phenylenediamine(OPDA)colorimetric
assay (Haxton,K.J.;Burt,H.M.Dalton Trans.2008,5872−5875)により、濾液中の未結合シスプラチン濃度をアッセイした。HPGに結合したシスプラチンの濃度を、HPGに最初に加えた薬物の濃度から濾液中で見出した未結合シスプラチンの濃度を差し引くことにより決定した。
上記した通り、シスプラチンは、ポリマー及びシスプラチンの最終濃度がそれぞれ10mg/mL及び1mg/mLで、カルボン酸塩で修飾したHPG類に結合した。20μLのシスプラチン結合ポリマー溶液又は1mg/mLの遊離型シスプラチン溶液を、7000 MWCO Slide−A−Lyzer mini dialysis units(Thermo Scientific,Rockford,IL)に加え、サンプルを攪拌しつつ、pH4.5、6.0及び7.4に調整した1mM PBS又はpH7.0の合成尿4Lに対し、37℃で透析した。合成尿(Surine)はDyna−Tek Industries(Lenexa,KS)から購入した。所定の時点で、放出媒体から3つの透析ユニットを取り出し、透析ユニットを3回洗浄し、続けて新鮮な放出媒体で1mLに希釈することにより内容物全体を除去した。OPDA比色アッセイにより、透析ユニット内容物のシスプラチン濃度を決定した。透析バッグ中の実験開始時の初期薬物量から残存する薬物の量を差し引くことにより、放出された薬物のパーセント(累積)を算出した。データは時間に応じた放出薬物のパーセンテージ(累積)として表した。
明される(図38)。シスプラチン結合HPGのサンプルすべてについて、薬物は制御された態様で、遊離型薬物よりも相当に遅く放出されことがわかった。PBS中では、pHに関係なく、HPG−C8/10−MePEG6.5−COOH113に結合したシスプラチンは、PBS中でほぼ同一の速度(最初の2時間で約5%放出、1日後に40%放出、7日後に最大90%放出)で放出された。HPG−C8/10−MePEG6.5−COOH348に結合したシスプラチンにより、PBS中、pH6.0及びpH7.4で、同様の速度(2hで約3%の結合シスプラチン放出、1日で20%放出、7日超で最大70%)で、ほぼ直線的な態様で薬物が放出された。pH4.5での、HPG−C8/10−MePEG6.5−COOH348に結合したシスプラチンについての放出速度は、より高いpHカウンターパートよりも迅速で、放出プロファイルはHPG−C8/10−MePEG6.5−COOH113のものに類似した。シスプラチンの放出速度は、尿存在下では相当速く、放出は2時間で投与量の10%を少し上回り、そしてHPG−C8/10−MePEG6.5−COOH113については2日、HPG−C8/10−MePEG6.5−COOH348については3日で、薬物放出が完了した。PBS中での放出と同様に、2つのHPG類間でのシスプラチン放出の違いは、HPG−C8/10−MePEG6.5−COOH348上に存在するカルボキシレート基数が多いことに起因し得る。尿は、いくつかの成分から構成される複雑な混合物なので、HPG類からのシスプラチンの放出増加の原因がどの化合物なのかは不明であるが、当該放出速度増加は、尿による希釈に際して、薬物放出が増加するメカニズムを提供し、好都合であり得る。HPGからのシスプラチンの移動に際し、尿素、尿酸及びクレアチニン等の、尿中の窒素含有化合物が結合し、シスプラチンを不活性化し得る。シスプラチンはある程度、当該化合物と複合体を形成することが示されているが、IV投与後の尿中に存在するシスプラチンの大部分は、元々投与された形態であり、高活性のモノアクア加水分解産物であると決定された(Tang,X.;Hayes Ii,J.W.;Schroder,L.;Cacini,W.;Dorsey,J.;Elder,R.C.;Tepperman,K.Met.Based Drugs 1997,4,97−109)。当該知見を踏まえると、尿中でHPG類から放出されたシスプラチンの大部分は、薬理学的に活性のある形態だと思われる。
MTS cell proliferation assay(Promega,Madison,WI)を用いて細胞傷害性の実験を行った。当該アッセイでは、薬剤の即時の細胞溶解効果は測定されないが、長期間にわたる細胞増殖に対する、ポリマーの影響が測定される。本実験においては、KU−7−luc膀胱癌細胞がM.Tachibana博士(Keio University,Tokyo,Japan)の好意により提供された。96−ウェルプレート中、10%子ウシ血清(FBS)(Invitrogen Canada,Inc.,Burlington,ON)、1%ペニシリン−ストレプトマイシン、及び1%L−グルタミンを添加したダルベッコ改変イーグル(DMEM)培地(Invitrogen Canada,Inc.,Burlington,ON)180μLに5,000細胞/ウェルで細胞をプレーティングし、細胞傷害性アッセイ用に、5%CO2中、37℃で24時間増殖させ、おおよそ80%のコンフルエントに到達させた。次いで、細胞を0.01〜100mg/mLの範囲のHPG類単独、或いは0.01〜100μg/mLの範囲の薬物濃度で、遊離型シスプラチン又はシスプラチンをロードしたHPG類と2時間又は72時間インキュベーションした。処理後、細胞をハンクの平衡塩類溶液(HBSS)で2回洗浄し、180μLの新鮮な培養培地を各ウェルに加え、細胞を72時間増殖させた。当該細胞の増殖を、以前記載した(Mugabe,C.;Hadaschik,B.A.;Kainthan,R.K.;Brooks,D.E.;So,A.I.;Gleave,M.E.;Burt,H.M.BJU Int.2009,103,978−986)通り、CellTiter 96 aqueous non−radioactive cell proliferation assay(P
romega,Madison,WI)を用いて測定した。簡単に述べると、180μLのHBSS中3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−5−(3−カルボキシルメトニフェノール)−2−(4−スルホフェニル)−2H−テトラゾリウム10%v/v溶液と細胞とを2時間インキュベーションした。マイクロプレートリーダーを用い、620nmを基準にして490nmで吸光度を測定した。
ブタ膀胱組織への、DTX製剤からのDTXの浸透及びマイトマイシンF製剤からのマイトマイシンFの浸透を評価した。新たに切除したブタ膀胱の切片を、フランツ型拡散セル装置上にマウントし、Tween 80、HPG−C8/10−MePEG又はHPG−C8/10−MePEG−NH2中に調製した抗癌剤DTXで2時間処理した。いくつかの実験においては、ブタ膀胱組織をTween 80、HPG−C8/10−MePEG又はHPG−C8/10−MePEG−NH2中に調製したDTXで処理する前に、キトサン溶液(薬物なし)又はHPG−C8/10−MePEG−NH2溶液(薬物なし)で1時間前処理した。マイトマイシンF製剤については、新たに切除したブタ膀胱の組織切片を、フランツ型拡散セル装置上にマウントし、抗癌剤のマイトマイシンF製剤で2時
間処理した。マイトマイシンF製剤で処理する前に、ブタ膀胱組織をHPG−C8/10−MePEG−NH2溶液(薬物なし)で1時間前処理した。組織内濃度対組織内深さプロファイルを取得し、濃度曲線下面積(AUC)の算出から、薬物曝露度を取得した。
溶媒蒸発法を用い、HPG−C8/10−MePEG及びDTXをロードしたHPG−C8/10−MePEG−NH2を調製した。DTX及びHPG−C8/10−MePEG又はHPG−C8/10−MePEG−NH2をアセトニトリル中に溶解し、オーブン中60℃で1時間乾燥し、窒素でフラッシュして微量の有機溶媒を除去した。乾燥前に、ポリマー/薬物溶液を少量アリコートの3H DTXでスパイクした。結果生じるポリマー/薬物マトリクスを、60℃のタイロード緩衝液(pH7.4)で再構成し、2分間ボルテックスした。薬物の最終濃度は0.5mg/mLであり、37℃で用いた。タキソテレ(登録商標)濃縮液(1mL当たり40mgのDTX及び1040mgのTween 80を含有)をタイロード緩衝液で希釈することにより、DTXをTween 80中に
調製し、DTXの最終濃度を0.5mg/mLとした。希釈前に、少量の3H DTXを溶液に添加した。
タイロード緩衝液中でマイトマイシンF(分子量=363.4)を調製した。American Radiolabeled Chemicals Inc(St Louis,MO)Cat # ART−1689よりそれを受領した。活性は1〜10Ci/mmol、エタノール中1mCi/mLであった。50μLのエタノールストックを3mLの緩衝液中に溶解(300x希釈)することにより、溶液を調製した。
キトサン溶液を調製するために用いるキトサンは、PROTASAN(商標)UP CL 213(製品番号:4210106)であり、75〜90%のアセチル基を除去したキトサンがベースである。当該陽イオンポリマーは高度に精製され、十分に特性解析された水溶性塩化物塩である。典型的に、PROTASAN(商標)UP CL 213の分子量は150000〜400000g/mol(キトサン酢酸塩として測定)の範囲である。キトサン溶液は、それを水中に溶解することによって調製し、0.5%(w/v)の溶液濃度とした。
新たに切除したブタの膀胱から、外壁上の過剰脂肪組織を除去し、縦方向に切って左右両側へと広げ、底浅の、炭素源(95%O2/5%CO2)で泡立てた37℃タイロード緩衝液槽中、おおよそ2cmx2cmに細かく切断した。実験はすべて、屠殺後5時間以内に行った。膀胱の小片を、膀胱内腔側の壁を薬物溶液に曝露するように、フランツ型拡散セル装置上にマウントした。当該組織切片は引き伸ばされておらず、厚さはおおよそ2〜3mmであった。レセプターチャンバーに10mLの37℃タイロード緩衝液(pH7.4)を充填した。余分な組織は拡散セルの周囲周辺でトリミングした。拡散セルのドナーチャンバーに1mLの0.5mg/ml薬物溶液を充填した。組織の曝露面積は0.64cm2であった。各拡散セルを底浅の水層に設置し、37℃で2時間インキュベーションした。いくつかの実験用には、組織サンプルをDTXやマイトマイシンFをロードした製剤で処理する前に、キトサン溶液(薬物無し)又はHPG−C8/10−MePEG−NH2溶液(薬物無し)で1時間前処理した。組織サンプルをタイロード緩衝液で3回洗浄し、未結合の薬物をすべて除去した。組織サンプルをトリミングし、金属プレート上で、ドライアイスベッド上の液体窒素により急速凍結した。
Shandon Cryomatrix(商標)(Themo Scientific,Pittsburgh,PA)と共に、凍結した膀胱組織をクリオトームの対物ホルダー上にマウントした。R404A冷却システムを伴うShandon Cryotome
Electronic(Thermo Electron Corporation,Cheshire,England)上で、Shandon MB35 Premier
Low Grade Microtome Blades (Themo Scientific,Pittsburgh,PA)により、−20℃で膀胱組織を切片にした。
組織を切片にした。組織切片を、予め計量した1.5mLエッペンドルフチューブ中に入れ、凍結して−20℃で保存した。
薬物抽出のため、計量した組織切片に200μLのアセトニトリルを加えた。サンプルを、すべての組織切片が抵抗無くアセトニトリル中に浸漬するまでボルテックスし、室温で24時間放置して薬物の完全抽出を確実にした。組織切片をすべて含む抽出サンプルを、シンチレーションバイアルに移し、5mLのシンチレーション液を加えた。液体シンチレーション計測により、3H DTX又は3HマイトマイシンFのカウントを測定し、元のストック液からの較正グラフを用いて定量化した。
膀胱壁のすべての層から筋肉にかけて(例えば、尿路上皮、固有層及び筋層)における平均DTX濃度又はマイトマイシンF濃度について、組織レベルの深さプロファイルを解析した。平均組織レベルは、組織層中で見出した薬物総量を、当該層の組織総重量で除したものとして決定した。組織レベルの深さプロファイル下面積(AUC)を、直線台形公式を用いて、以下:
AUC算出のためには、補外法による、0μmでの薬物濃度(μg/g)の推定が必要であった。
て算出されたAUC値並びに組織深度の範囲180〜1560(um)及び180〜3360(um)について算出されたCavg値及びCmax値を、表15d及び15e中に示す。
上記実施例28中で観察した薬物浸透効果は、様々な処理への曝露後の膀胱組織の外見と相関した。当該実験に関して、薬物は用いず、膀胱1つ当たり1ビヒクルに1回のみ曝露した。2時間の曝露時間後、膀胱組織を採取し、緩衝液でリンスして4%パラホルムアルデヒド及び2%グルタルアルデヒドで一晩固定し、1%OsO4で後固定し、エタノールで脱水して臨界点乾燥した。膀胱全体を2つに分割し、金蒸着した。全表面をSEM(Hitachi S4700,3−5kV)で検査し、代表的な画像を記録した(1サンプル当たり最低3視野)。代表的な画像を示す(幅約130μmx高さ約100μm)。
マウス膀胱に対する種々の製剤(薬物無し)の曝露効果を評価した。8〜11週例の雌性無胸腺ヌードマウス(Harlan,Indianapolis,IN)を、4%イソフルラン及び2L/min O2を用いてディープ プレーン(deep plane)に麻酔した。膀胱を十分に圧搾し、外科手術で埋め込んだカテーテルを介して製剤を注入した。ゲージ24の潤滑化Jelco血管カテーテル(BDickenson)を尿道を経て膀胱へ通す前に、ポリプロピレンの巾着縫合を尿道口付近に施した。50μL量注入し、動物(の頭側を)をわずかに反転させて巾着縫合を結紮する一方、1回の素早い動作でカテーテルを取り出した。2時間の注入が完了するまで、マウスを(1.5〜2%イソフルラン、2L/min O2で)麻酔のままにした。巾着縫合を除去し、動物を回復させた。
PBSで組織を3回洗浄し、2%パラホルムアルデヒドで一晩固定し、次いで0.1Mカコジル酸緩衝液に移した。組織を、1%四酸化オスミウム中で1時間、室温で後固定し、次いで水を混合したエタノール中(混合物中のエタノールのパーセンテージを増大させていき、30%から始めて100%に増大させる)で脱水した。臨界点での脱水によりサンプルを乾燥し、次いで2回金−白金蒸着した(90度で1回及び45度でもう1回)。バイオイメージング施設において、サンプルをHitachi S4700走査型電子顕微鏡で検証した。各膀胱は低倍率で観察し、次いで全表面を再び、高倍率で検証した。様々な倍率で複数枚(9〜10画像)撮影した。
無傷層よりも表面細胞が小さく見え、外見があまり平面状でなかった(図51)。アンブレラ細胞喪失に対する製剤の影響は、dHPGのアミン含量及びdHPGの濃度に依存することが観察された。
密着結合、細胞剥離及び炎症細胞の浸潤における変化について、組織を評価した。組織学的解析結果を表18中に集約する。組織学的解析結果から理解できるように、dHPG製剤への曝露後、マウスの膀胱表面に炎症及び壊死の徴候を観察しなかった。
動物を安楽死させた後、膀胱を露出させ、膀胱穿刺及び25Gニードルを通した回収によりその内容物を取り出した。尿を氷上に保存(しかし、凍結させない)し、評価のために輸送した。細胞の存在に関して、尿を分析した。数滴の尿を顕微鏡スライドガラス上に静置し、細胞の存在に関して、顕微鏡により観察した。存在するあらゆる細胞を血球計スライドにより計数した。2時間の注入直後、及び膀胱採取時(2、6、24時間)にマウスから採取した尿中の細胞数を図52中に示す。
CO2吸入の終了時に、臨終の際心穿刺により血液を採取し、おおよそ500〜700μLをEDTA microtainerチューブに入れた。各チューブを数回転倒させ、血液とEDTAとを確実に一様に混合して凝集を防止した。血液サンプルは、各時点についてすべてのサンプルを回収するまで氷上に保存し、次いで、処理して血漿を生成した。サンプルを2500rpm、4℃で15分間遠心することにより血漿を生成した(rpmはBeckman GH 3.8A rotor,RCFavg 200xgに基づく)。血漿上清をピペットで吸い、ラベルしたバイアル中に入れ、−80℃で保存した。M
esoScale platform and standard assayキットを用い、TNFαレベルに関して血液を分析した。マウス血液中、様々な製剤による注入後2、6及び24時間での循環TNFαレベルを図53中に示す。あらゆるサンプルでTNFαを検出しなかった。
Claims (36)
- 超分岐ポリグリセロールであって:
C8アルキル鎖、C10アルキル鎖、又はその組合せで誘導体化された超分岐ポリグリセロールを含むコア;及び
コアのヒドロキシル基に結合した少なくとも1の親水性置換基を含むシェルであって、少なくとも1の親水性置換基が−NH2または−NH3 +を含む少なくとも1の官能基を含み、かつ少なくとも1の親水性置換基がメトキシポリエチレングリコール(MePEG)を含む、シェル
を含み、超分岐ポリグリセロールが、−NH2または−NH3 +を、超分岐ポリグリセロール1モル当たり1モル〜100モル含む、超分岐ポリグリセロール。 - MePEGが、コアのヒドロキシル基の1%〜40%に結合している、請求項1に記載の超分岐ポリグリセロール。
- コアが、C8及びC10アルキル鎖の組合せで誘導体化された超分岐ポリグリセロールを含む、請求項1または2に記載の超分岐ポリグリセロール。
- コアが、C8アルキル鎖で誘導体化された超分岐ポリグリセロールを含む、請求項1または2に記載の超分岐ポリグリセロール。
- コアが、C10アルキル鎖で誘導体化された超分岐ポリグリセロールを含む、請求項1または2に記載の超分岐ポリグリセロール。
- 生物学的に活性のある薬剤を更に含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の超分岐ポリグリセロール。
- 生物学的に活性のある薬剤が疎水性薬物である、請求項6に記載の超分岐ポリグリセロール。
- 生物学的に活性のある薬剤がタキサンである、請求項6に記載の超分岐ポリグリセロール。
- 生物学的に活性のある薬剤がパクリタキセルである、請求項6に記載の超分岐ポリグリセロール。
- 生物学的に活性のある薬剤がドセタキセルである、請求項6に記載の超分岐ポリグリセロール。
- 生物学的に活性のある薬剤がシスプラチンである、請求項6に記載の超分岐ポリグリセロール。
- 生物学的に活性のある薬剤が、生物学的に活性のある薬剤の組合せである、請求項6に記載の超分岐ポリグリセロール。
- 請求項1〜12のいずれか1項で定義された超分岐ポリグリセロール及び医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
- 生物学的に活性のある薬剤を生物の組織へ送達するための薬剤を調製するための、請求項6〜12のいずれか1項で定義された超分岐ポリグリセロールの使用。
- 生物学的に活性のある薬剤を生物の組織へ送達するための薬剤を調製するための、請求項1〜5のいずれか1項で定義された超分岐ポリグリセロール、及び生物学的に活性のある薬剤の使用。
- 生物学的に活性のある薬剤が疎水性薬物である、請求項15に記載の使用。
- 生物学的に活性のある薬剤がタキサンである、請求項15に記載の使用。
- 生物学的に活性のある薬剤がパクリタキセルである、請求項15に記載の使用。
- 生物学的に活性のある薬剤がドセタキセルである、請求項15に記載の使用。
- 生物学的に活性のある薬剤がシスプラチンである、請求項15に記載の使用。
- 生物学的に活性のある薬剤が、生物学的に活性のある薬剤の組合せである、請求項15に記載の使用。
- 生物の組織が細胞である、請求項14〜21のいずれか1項に記載の使用。
- 生物の組織が膀胱の尿路上皮表面である、請求項14〜21のいずれか1項に記載の使用。
- 被験体における癌を治療するための薬剤を調製するための、請求項6〜12いずれか1項で定義された超分岐ポリグリセロールの使用。
- 被験体における癌を治療するための薬剤を調製するための、請求項1〜5のいずれか1項で定義された超分岐ポリグリセロール及び生物学的に活性のある薬剤の使用。
- 生物学的に活性のある薬剤が疎水性薬物である、請求項25に記載の使用。
- 生物学的に活性のある薬剤がタキサンである、請求項25に記載の使用。
- 生物学的に活性のある薬剤がパクリタキセルである、請求項25に記載の使用。
- 生物学的に活性のある薬剤がドセタキセルである、請求項25に記載の使用。
- 生物学的に活性のある薬剤がシスプラチンである、請求項25に記載の使用。
- 生物学的に活性のある薬剤が、生物学的に活性のある薬剤の組合せである、請求項25に記載の使用。
- 癌を治療するための薬剤を調製するための、請求項13で定義された医薬組成物の使用。
- 癌が膀胱癌である、請求項24〜32のいずれか1項に記載の使用。
- 癌が筋層非浸潤性膀胱癌である、請求項24〜32のいずれか1項に記載の使用。
- 超分岐ポリグリセロールが膀胱内投与のためのものである、請求項24〜34のいずれか1項に記載の使用。
- 被験体がヒトである、請求項24〜35のいずれか1項に記載の使用。
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