BR112012021991A2 - policlicerol hiperramificado uso de um poliglicerol hipermanificado, método de adiministração de uma força biologicamente ativa a um tecido biológico, composição farmacêutica e método de síntese de um poliglicerol hiperrramificado. - Google Patents

policlicerol hiperramificado uso de um poliglicerol hipermanificado, método de adiministração de uma força biologicamente ativa a um tecido biológico, composição farmacêutica e método de síntese de um poliglicerol hiperrramificado. Download PDF

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Donald Brooks
Kumar Kainthan Rajesh
K. Jackson John
Martin Gleave
Alan So
Clement Mugabe
Lu Ye
Dechi Guan
Richard Liggins
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Abstract

  POLIGLICEROIS HIPERRAMIFICADOS DERIVATIZADOS São aqui fornecidos poligliceróis hiperramificados derivatizados ("dHPGs"). O dHPG compreende um núcleo contendo um poliglicerol hiperramificado derivatizado com cadeias de alquila C1-C20 e uma parte externa que compreende pelo menos um substituinte hidrofílico ligado a grupos hidroxila do núcleo, sendo que o poliglicerol hiperramificado compreende de cerca de 1 a hidrofílico. Os dHPGs são para uso como agentes para a administração de um fármaco ou outra porção biologicamente ativa ao trato urinário, trata digestivo, vias aéreas, cavidade vaginal e colo do útero e na cavidade peritoneal para o tratamento de indicações tais como câncer, que podem ser úteis no tratamento de, ou fabricação de um medicamento, na preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de câncer, como um pré-tratamento ou cotratamento para melhorar a absorção de fármaco em um tecido. Adicionalmente, são fornecidos métodos de preparação de dHPGs.

Description

o 1 *
POLIGLICERÓIS HIPERRAMIFICADOS DERIVATIZADOS
REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório Norte-Americano No. de Série 61/309.304 intitulado "BIOADHESIVE DERIVATIZED HYPERBRANCHED POLYGLYCEROLS", depositado no dia 1º de março de 2010, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO * Esta invenção refere-se à terapêutica, seus usos e métodos para a administração de fármacos ou outras porções o biologicamente ativas aos tecidos biológicos. Em i particular, a invenção refere-se aos polímeros baseados em ” poligliceróis hiperramificados derivatizados (dHPGs) e aos métodos para o tratamento de câncer, infecções e * 15 inflamações ou doenças autoimunes.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Câncer de bexiga é a segunda malignidade genitourinária mais comum. No momento do diagnóstico inicial, cerca de 70% dos casos não são músculo-invasivos. As opções atuais de tratamento para a doença superficial incluem tratamento de câncer de bexiga topicamente via oe instilação intravesicular de um agente quimioterapêutico dentro da bexiga com um cateter. No entanto, essas opções de tratamento possuem eficácia limitada. Apesar da quimioterapia e/ou imunoterapia intravesical, até 80% dos pacientes com câncer de bexiga que não é músculo-invasivo desenvolvem tumores recorrentes, dos quais de 20 a 30% se desenvolvem em tumores mais agressivos potencialmente letais (Dalbagni, G. (2007) Nat. Clin. Pract. Urol. 4: 254- 260). Acredita-se que à falha no tratamento seja devido em parte ao curto tempo de interrupção dos fármacos ativos contra as células do câncer de bexiga na bexiga. Por
PN | 2 v exemplo, taxanos não são geralmente usados para instilação intravesicular devido à baixa biodisponibilidade das formulações atuais na bexiga.
Foi documentado que paclitaxel apresenta atividade antitumoral na terapia do câncer de bexiga sistêmico conforme ele penetra nos tecidos da bexiga, a uma taxa 20 vezes mais rápida do que aquela dos fármacos solúveis em água, como mitomicina (CC, permitindo a retenção prolongada de doses terapêuticas mesmo após a solução instilada ser removida.
No entanto, seu uso intravesical é dificultado pela presença de oe Cremofor"-EL na formulação comercial (Taxol"”"), uma vez que ele retém o fármaco em um ambiente aquoso e reduz a penetração do paclitaxel na parede da bexiga (Mugabe, C., et al. (2008) British J.
Urology Int. 102(7): 978-986). : 15 Embora muitos agentes ativos são hidrofóbicos Ou insolúveis em água, eles são muitas vezes necessários em ambientes à base de água ou de outro modo aquosos para o tratamento eficaz de inúmeras indicações, incluindo câncer (como "câncer de intestino, pulmão, bexiga e sistema genitourinário), infecções (como as do trato digestivo e das vias aéreas) e doenças autoimunes ou inflamatórias oe (como bexiga irritável, doença inflamatória intestinal e inflamação crônica e aguda). Tais como, sistemas múltiplos foram desenvolvidos como veículos de administração para esses agentes.
Um desses sistemas inclui o uso de micelas poliméricas.
Micelas poliméricas são anfifílicas, possuindo um núcleo hidrofóbico e uma parte externa hidrofílica, e como tais, elas podem encapsular moléculas hidrofóbicas no núcleo devido às interações hidrofóbicas.
A parte externa hidrofílica mantém o sistema solúvel em água.
No entanto, estes sistemas podem ser instáveis na bexiga devido aos efeitos de diluição ou aos fatores ambientais.
a AA a o o O A a De A a
E | 3 % Poligliceróis hiperramificados ("HPGsS") são um dos poucos polímeros hiperramificados que podem ser sintetizados de uma maneira controlada com pesos moleculares “predeterminados e limitada capacidade de polidispersão (Kainthan, R. K., et al. (2008) Biomacromolecules 9: 886-895). Moléculas hidrofóbicas podem ser encapsuladas no núcleo hidrofóbico de um HPG | (WO2006/130978).
RESUMO Esta invenção é baseada em parte na averiguação de que o os poligliceróis hiperramificados derivatizados ("dHPGs") aqui descritos podem ser utilizados como agentes para a - administração de um fármaco ou outra porção biologicamente ativa do trato urinário (por exemplo, a uretra e a bexiga), " 15 do trato digestivo (por exemplo, a boca, esôfago e cólon), das vias aéreas (por exemplo, o nariz e os pulmões), da cavidade vaginal e do colo do útero e da cavidade peritoneal para tratar indicações tais como câncer (por exemplo, cânceres de bexiga, gástrico, de esôfago, pulmão, laringe, oral, do seio nasal (sinus), vaginal ou cervical), | infecções (por exemplo, infecções do trato digestivo ou | oe vias aéreas) e doenças autoimunes ou inflamatórias (por exemplo, bexiga irritável, doença intestinal inflamatória | ou inflamação crônica ou aguda), bem como outras indicações em que a administração de um fármaco ou outra porção biologicamente ativa a um tecido ou célula é desejada. Por exemplo, os polímeros identificados neste documento podem ser úteis na terapia de instilação do câncer de bexiga que não é músculo-invasivo. Os polímeros identificados neste documento podem apresentar propriedades mucoadesivas, que podem ser úteis na terapia de instilação do câncer de bexiga que não é músculo-invasivo.
Os DHPGs aqui descritos podem ser utilizados como um v 4 * veículo para um fármaco ou outra porção biologicamente ativa e para a preparação de um medicamento terapêutico para a administração de tais fármacos ou porções aos tecidos ou células.
Em particular, os dHPGs aqui descritos podem ser utilizados como um veículo para um taxano para o tratamento de câncer de bexiga que não é músculo-invasivo.
Os dHPGs de núcleo condensado aqui descritos possuem atributos surpreendentes que são particularmente desejáveis | para a administração de um fármaco a um tecido alvo.
Em particular, como mostrado aqui, dHPGs de núcleo condensado o são menos tóxicos e possuem melhores propriedades de tolerabilidade. - De acordo com uma modalidade, é fornecido um poliglicerol hiperramificado, o poliglicerol 7 15 hiperramificado compreendendo: um núcleo que compreende um poliglicerol hiperramificado derivatizado com cadeias de alquila Ci-Co, em que a razão de cadeias de alquila C1-C2o para as unidades de glicerol é maior em um centro do núcleo em comparação com a periferia do núcleo; e uma parte externa que compreende —. pelo menos um substituinte hidrofílico ligado aos grupos hidroxila do núcleo, em que O o poliglicerol hiperramificado compreende de cerca de 1 a cerca de 200 mols de pelo menos um substituinte hidrofílico por mol do poliglicerol hiperramificado.
De acordo com outra modalidade, é fornecido um método para a administração de uma porção biologicamente ativa a um tecido biológico, o método compreendendo: administrar um poliglicerol hiperramificado carregado com a porção biologicamente ativa ao tecido biológico, em que o poliglicerol hiperramificado compreende: um núcleo que compreende um poliglicerol hiperramificado derivatizado com cadeias de alquila C1-C2x, em que a razão de cadeias alquila Ci-C»xo para as unidades de glicerol é maior em um centro do x ; * núcleo em comparação com a periferia do núcleo; e uma parte externa que compreende pelo menos um substituinte hidrofílico ligado aos grupos hidroxila do núcleo, em que o poliglicerol hiperramificado compreende de cerca de 1 a cerca de 200 mols de pelo menos um substituinte hidrofílico por mol do poliglicerol hiperramificado.
O método pode compreender ainda incorporar a porção biologicamente ativa no poliglicerol hiperramificado.
De acordo com uma outra modalidade, é fornecido um uso de um poliglicerol hiperramificado para administração de o uma porção biologicamente ativa a um tecido biológico, em que o poliglicerol hiperramificado compreende: um núcleo - que compreende poliglicerol hiperramificado derivatizado com cadeias alquila C1i-Cxw, em que a razão de cadeias ] 15 alquila Ci-Coo para unidades de glicerol é maior em um centro do núcleo em comparação com uma periferia do núcleo; e uma parte externa que compreende pelo menos um substituinte hidrofílico ligado aos grupos hidroxila do núcleo, em que o poliglicerol hiperramificado compreende de cerca de 1 a cerca de 200 mols de pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado. oe De acordo com outra modalidade, é fornecido um uso de um poliglicerol hiperramificado para preparar um medicamento para administração de uma porção biologicamente ativa a um tecido biológico, em que o poliglicerol hiperramificado compreende: um núcleo que compreende poliglicerol hiperramificado derivatizado com cadeias alquila Ci-Crxo, em que a razão de cadeias alquila C,-Coxo para unidades de glicerol é maior em um centro do núcleo em comparação com uma periferia do núcleo; e uma parte externa que compreende pelo menos um substituinte hidrofílico ligado aos grupos hidroxila do núcleo, em que oO poliglicerol hiperramificado compreende de cerca de 1 a
A A DP o a DA A > TR AA A Aa oo A A o A ; » cerca de 200 mols de pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado.
De acordo com uma modalidade adicional, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende um poliglicerol hiperramificado e uma porção biologicamente ativa, em que O poliglicerol hiperramificado compreende: um núcleo que compreende poliglicerol hiperramificado derivatizado com cadeias alquila Ci-Cx, em que a razão de cadeias alquila Ci-Coo para unidades de glicerol é maior em um centro do núcleo em comparação com uma periferia do núcleo; e uma o parte externa que compreende pelo menos um substituinte hidrofílico ligado aos grupos hidroxila do núcleo, em que o " poliglicerol hiperramificado compreende de cerca de 1 a cerca de 200 mols de pelo menos um grupo funcional por mol 7 15 do poliglicerol hiperramificado.
De acordo com uma modalidade, é fornecido —“um poliglicerol hiperramificado que compreende: um núcleo que compreende poliglicerol hiperramificado derivatizado com cadeias alquila C1-Cxw; e uma parte externa que compreende pelo menos um substituinte hidrofílico ligado aos grupos hidroxila do núcleo, em que pelo menos um substituinte oe hidrofílico compreende pelo menos um grupo funcional a partir de um ou mais dos seguintes: -NH,, =NH7', -NH;' e - NR3', em que cada R é independentemente um grupo alquila C;- Cç; ou um R é independente um grupo alquila C1-C; e dois grupos R juntos formam um grupo alquila cíclico C20o3-Cr0o4 de modo que R; forma uma amina quaternária com o nitrogênio, e em que o poliglicerol hiperramificado compreende de cerca de 1 a cerca de 200 mols de pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado.
De acordo com uma modalidade adicional, é fornecido um uso de um poliglicerol hiperramificado, o poliglicerol hiperramificado compreendendo: um núcleo que compreende
* 7 * poliglicerol hiperramificado; e uma parte externa que compreende pelo menos um substituinte hidrofílico ligado a grupos hidroxilas do núcleo, onde o pelo menos um substituinte hidrofílico compreende pelo menos um grupo funcional selecionado de um ou mais dos seguintes: -NH,, =NH/', -NH3;3' e -NR;3, em que cada R independentemente um grupo alquila C1-Ck ou um R é independente um grupo alquila C1i-C«kK E dois grupos R juntos formam um grupo alquila cíclico C3-C12, de modo que R; forma uma amina quaternária com o nitrogênio, e em que o poliglicerol hiperramificado o compreende de cerca de 1 a cerca de 200 mols de pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado . para uso como um pré-tratamento ou cotratamento para aumentar a absorção do fármaco em um tecido. Em uma ' 15 modalidade, o núcleo pode ser adicionalmente derivatizado com cadeias alquila Ci-Coo.
De acordo com outra modalidade, é fornecido um poliglicerol hiperramificado que compreende: um núcleo que compreende —"poliglicerol hiperramificado; e uma parte externa que compreende pelo menos um substituinte hidrofílico ligado aos grupos hidroxila do núcleo, em que o pelo menos um substituinte hidrofílico compreende pelo menos um grupo funcional selecionado de um ou mais dos seguintes: -NH,7, =NH,, -NH; e -NR;, em que cada R é independentemente um grupo alquila CO -C ou um R é independentemente um grupo alquila C;,-C; e dois Rs juntos formam um grupo alquila cíclico C3-Ci7 de modo que R3 forma uma amina quaternária com o nitrogênio, e em que oO poliglicerol hiperramificado compreende de cerca de 1 a cerca de 200 mols de o pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado, para uso como um pré- tratamento ou cotratamento para aumentar a absorção do fármaco em um tecido. o núcleo pode ainda ser adicionalmente derivatizado com cadeias alquila C1-C2x. Em uma modalidade, oO aumento da absorção de fármaco em um tecido pode causar a perda de células guarda-chuva do tecido. Em uma modalidade, o aumento da absorção do fármaco em um tecido pode ser sem causar a necrose e/ou inflamação do tecido.
De acordo com outra modalidade, é fornecido um poliglicerol hiperrami ficado, o poliglicerol hiperramificado compreende: um núcleo que compreende poliglicerol hiperramificado polimerizado de um epóxido de o glicerol e um epóxido de alquila Ci-Cxo Ou um éter alquil C1i-Coo glicidílico, em que todo ou substancialmente todo o . epóxido de alquila Cr Cow ou um éter alquila C1-Cro glicidílico é polimerizado antes que todo ou 7 15 substancialmente todo o epóxido de glicerol seja polimerizado; e uma parte externa que compreende pelo menos um substituinte hidrofílico covalentemente ligado aos grupos hidroxila do núcleo, em que o poliglicerol hiperramificado compreende cerca de 1 a cerca de 200 mols de pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado. De acordo com uma modalidade adicional, é oe fornecido um método de síntese de um poliglicerol hiperramificado, o método compreendendo: polimerizar um epóxido de glicerol e um epóxido de alquila C1-Cx Ou UM éter alquil Ci-Cxo glicidílico, de modo que todo ou substancialmente todo o epóxido de alquila Ci-Cxo Ou éter alquil Ci-Cwo glicidílico é polimerizado antes de todo ouou substancialmente e todo o epóxido de glicerol ser polimerizado para formar poliglicerol hiperramificado; e derivatizar grupos hidroxila do poliglicerol hiperramificado com pelo menos um substituinte hidrofílico, em que o poliglicerol hiperramificado compreende de cerca de 1 a cerca de 200 mols de pelo menos um grupo funcional
% ; por mol do poliglicerol hiperramificado. O epóxido de glicerol pode ser glicidol. O epóxido de alquila C1-C2xo pode ser 1,2-epoxioctadecano. O éter alquil C;-Cxw glicidílico pode ser éter alquil Cg-Cio glicidílico.
De acordo com outra modalidade, é fornecido um poliglicerol hiperramificado, o poliglicerol hiperramificado “compreende: um núcleo que compreende poliglicerol hiperramificado derivatizado com cadeias alquila Ci-Cxw Ee carregado com docetaxel; e uma parte externa que compreende pelo menos um substituinte o hidrofílico ligado aos grupos hidroxila do núcleo, em que o poliglicerol hiperramificado compreende de cerca de 1 a . cerca de 200 mols de o pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado.
7 15 De acordo com uma modalidade adicional, é fornecido um | uso de um poliglicerol hiperramificado para administrar docetaxel a um tecido biológico, em que o poliglicerol hiperramificado — compreende: um núcleo que compreende poliglicerol hiperramificado derivatizado com cadeias alquila Ci-Cw Ee carregado com docetaxel; e uma parte externa que compreende pelo menos um substituinte ) hidrofílico ligado aos grupos hidroxila do núcleo, em que o poliglicerol hiperramificado compreende de cerca de 1 a cerca de 200 mols de o pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado.
O poliglicerol hiperramificado pode ainda incluir uma porção biologicamente ativa. O poliglicerol hiperramificado pode ser usado como um pré-tratamento ou cotratamento para aumentar a absorção do fármaco de uma porção biologicamente ativa. A porção biologicamente ativa pode ser um ou mais fármacos hidrofóbicos. A porção biologicamente ativa pode ser selecionada de um ou mais de valrubicina, cisplatina, paclitaxel e docetaxel. A porção biologicamente ativa pode jD | 10 % ser um taxano ou um análogo do mesmo.
O taxano pode ser paclitaxel ou um analógico do mesmo.
O taxano pode ser docetaxel ou um analógico do mesmo.
A porção biologicamente ativa pode ser mitomicina ou um análogo da mesma.
Mitomicina pode incluir todos os análogos de mitomicina.
Mitomicina e seus análogos podem incluir, por exemplo, mitomicina A, mitomicina B, mitomicina C, mitomicina D, mitomicina F, mitomicina G, mitomicina H, mitomicina K e os seus análogos.
A porção biologicamente ativa pode ser mitomicina C.
A porção biologicamente ativa pode ser o mitomicina F.
A porção biologicamente ativa pode ser valrubicina.
A porção biologicamente ativa pode ser - vinblastina.
A porção biologicamente ativa pode ser cisplatina.
A porção biologicamente ativa pode ser Í 15 metotrexato.
A porção biologicamente ativa pode ser doxorrubicina ou um análogo da mesma.
A porção biologicamente ativa pode ser epirrubicina.
A porção biologicamente ativa pode ser gencitabina.
A porção biologicamente ativa pode ser everolimo.
A porção biologicamente ativa pode ser suramina.
A porção biologicamente ativa pode ser uma combinação de porções.
A oe combinação de porções pode ser metotrexato, vinblastina e doxorrubicina (M-VAC). A combinação de porções pode ser M- VAC e cisplatina.
O substituinte hidrofílico pode ser polietilenoglicol (PEG) (200 a 450 g/mL) ou metoxipolietilenoglicol (MPEG) (200 a 450 g/mL), ou combinações dos mesmos.
O pelo menos um substituinte hidrofílico pode ser MePEG ou PEG.
O pelo menos um substituinte hidrofílico pode ser MePEG.
O pelo menos um substituinte hidrofílico pode ser PEG.
O pelo menos um substituinte hidrofílico pode compreender pelo menos um grupo funcional que é -OH, -COOH, -NHS,-SH, -NH, -NH3* ou -NR3', em que cada R pode ser independente um grupo jD 11 alquila Ci-C; ou um R pode ser independentemente um grupo alquila C;,-Ck; E dois Rs juntos podem formar um grupo alquila C3-C12 cíclico, de modo que R; forma uma amina quaternária com o nitrogênio.
O pelo menos um grupo funcional pode ser -NH,, -NH;' ou -NR3, em que cada R pode ser independentemente um grupo alquila Ci-C; ou um R pode ser independentemente um grupo alquila C,-Ck e dois Rs juntos podem formar um grupo alquila cíclico C3-Cir de modo que R; forme uma amina quaternária como nitrogênio. O pelo menos um grupo funcional pode ser o -NH> ou -NH3;'. O pelo menos um grupo funcional pode ser uma amina. Alternativamente, o pelo menos um grupo funcional F pode ser -NH>. O poliglicerol hiperramificado pode compreender de E 15 cerca de 1 a cerca de 200 mols do pelo menos um substituinte hidrofílico por mol do poliglicerol hiperramificado. o poliglicerol hiperramificado pode compreender de cerca de 1 a cerca de 100 mols de o pelo menos um súbstituinte hidrofílico por mol do poliglicerol hiperramificado. O poliglicerol hiperramificado — pode compreender de cerca de 1 a cerca de 40 mols do pelo menos oe um substituinte hidrofílico por mol do poliglicerol hiperramificado. Oo poliglicerol hiperramificado pode compreender de cerca de 5 a cerca de 40 mols do pelo menos um substituinte hidrofílico por mol do poliglicerol hiperramificado. o poliglicerol hiperramificado pode compreender de cerca de 10 a cerca de 40 mols do pelo menos um substituinte hidrofílico por mol do poliglicerol hiperramificado. o poliglicerol hiperramificado pode compreender de cerca de 10 a cerca de 30 mols do pelo menos um substituinte hidrofílico por mol do poliglicerol hiperramificado. o poliglicerol hiperramificado pode compreender de cerca de 30 a cerca de 40 mols do pelo menos
| 12 um substituinte hidrofílico por mol do Ppoliglicerol hiperramificado. o poliglicerol hiperramificado pode compreender de cerca de 5 à cerca de 15 mols do pelo menos um substituinte hidrofílico por mol do Ppoliglicerol hiperramificado.
O pelo menos um substituinte hidrofílico pode se ligar a cerca de 1% até cerca de 40% dos grupos hidroxila.
O pelo menos um substituinte hidrofílico pode se ligar a cerca de 5% até cerca de 30% dos grupos hidroxila.
O pelo menos um substituinte hidrofílico pode se ligar a cerca de 20% dos grupos hidroxila. o A quantidade do substituinte hidrofílico por mol do poliglicerol hiperramificado pode ser determinada medindo o - peso molecular do poliglicerol hiperramificado e medindo a quantidade do substituinte hidrofílico presente em uma Í 15 quantidade do poliglicerol hiperramificado.
O técnico no assunto irá notar que o peso molecular do poliglicerol hiperramificado pode ser medido usando métodos diferentes, por exemplo, cromatografia de permeação em gel.
O peso molecular do poliglicerol hiperramificado pode ser medido, por exemplo, usando cromatografia de permeação em gel com detecção de espalhamento de luz laser multiângulo.
A o quantidade do substituinte hidrofílico presente em uma quantidade do poliglicerol hiperramificado pode ser medida, por exemplo, por um método de titulação.
O método de titulação pode ser um método de titulação normal.
O método de titulação pode ser um método de titulação pelo resto.
Por exemplo, onde o substituinte hidrofílico compreende pelo menos um grupo funcional que pode ser -NH,, um método de titulação normal contra um ácido, como HCl, pode ser usado para medir a quantidade do substituinte hidrofílico presente em uma quantidade do HPG.
Onde o substituinte hidrofílico compreende pelo menos um grupo funcional que pode ser -NH,, um método de titulação pelo resto usando uma
| x | 13 quantidade conhecida de um ácido, como HCl, e titulação contra uma base, como NaoH, pode ser utilizado. A quantidade do substituinte hidrofílico presente em uma quantidade do poliglicerol hiperramificado pode ser medida, por exemplo, por um método colorimétrico. A quantidade do substituinte hidrofílico presente em uma quantidade do poliglicerol hiperramificado pode ser medida, por exemplo, por um método de fluorescência. Onde o substituinte hidrofílico compreende pelo menos um grupo funcional que pode ser -NH,, um ensaio de fluorescamina pode ser usado. A o quantidade do substituinte hidrofílico presente em uma quantidade do poliglicerol hiperramificado pode ser medida - por mais de um método e um valor médio da quantidade do substituinte hidrofílico medido por mais de um método pode ' 15 ser usado para calcular o mol de substituinte hidrofílico por mol de poliglicerol hiperramificado. Onde o substituinte hidrofílico compreende pelo menos um grupo funcional que pode ser -NH,, um ensaio de fluorescamina pode ser o método preferido para determinar a quantidade do substituinte hidrofílico presente em uma quantidade do poliglicerol hiperramificado.
) O poliglicerol hiperramificado pode compreender de cerca de 1 a cerca de 200 mols do pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado. O poliglicerol hiperramificado pode compreender de cerca de 1 a cerca de 100 mols do pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado. O poliglicerol hiperramificado pode compreender de cerca de 1 a cerca de 40 mols do pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado. o poliglicerol hiperramificado pode compreender de cerca de 5 a cerca de 40 mols do pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado. o poliglicerol
| 14 hiperramificado pode compreender de cerca de 10 a cerca de 40 mols do pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado. o poliglicerol hiperramificado pode compreender de cerca de 10 a cerca de 30 mols do pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado.
O poliglicerol hiperramificado pode compreender de cerca de 30 a cerca de 40 mols do pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado. [o] poliglicerol hiperramificado pode compreender de cerca de 5 a cerca de o 15 mols do pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado. . A quantidade do grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado pode ser determinada medindo o É 15 peso molecular do poliglicerol hiperramificado e medindo a quantidade do grupo funcional presente em uma quantidade do poliglicerol hiperramificado.
A pessoa normalmente versada na técnica irá notar que o peso molecular do poliglicerol hiperramificado pode ser medido usando métodos diferentes, por exemplo, cromatografia de permeação em gel.
O peso molecular do poliglicerol hiperramificado pode ser medido, ) por exemplo, usando cromatografia de permeação em gel com detecção de espalhamento de luz laser multiângulo.
A quantidade do grupo funcional presente em uma quantidade do poliglicerol hiperramificado pode ser medida, por exemplo, por um método de titulação.
O método de titulação pode ser um método de titulação normal.
O método de titulação pode ser um método de titulação pelo resto.
Por exemplo, em que o pelo menos um grupo funcional pode ser -NH;, um método de titulação normal contra um ácido, como HCl, pode ser usado para medir a quantidade -NH, presente em uma quantidade do HPG.
Onde o pelo menos um grupo funcional pode ser -NH;, um método de titulação pelo resto usando uma quantidade x 15 conhecida de um ácido, como HCl, e titulação contra uma base, como NaOH, pode ser utilizado. A quantidade do grupo funcional presente em uma quantidade do poliglicerol hiperramificado pode ser medida, por exemplo, por um método colorimétrico. A quantidade do grupo funcional presente em uma quantidade do poliglicerol hiperramificado pode ser medida, por exemplo, por um método de fluorescência. Onde o pelo menos um grupo funcional pode ser -NH;, um ensaio de fluorescamina pode ser usado. A quantidade do grupo funcional presente em uma quantidade do poliglicerol o hiperramificado pode ser medida por mais de um método e um valor médio da quantidade do grupo funcional medido por . mais de um método pode ser usado para calcular o mol de grupo funcional por mol de poliglicerol hiperramificado. ' 15 Onde o pelo menos um grupo funcional pode ser -NH>, um ensaio de fluorescamina pode ser o método preferido para determinar a quantidade do grupo funcional presente em uma quantidade do poliglicerol hiperramificado. As cadeias alquila C;-Cxy podem ser cadeias alquila Cs- Cox. AS cadeias alquila Ci-Cxo podem ser cadeias alquila Cs- Cie. As cadeias alquila Ci-Cxo podem ser cadeias alquila Cs- oe Cio. Uma porção da pelo menos um substituinte hidrofílico pode estar localizada no núcleo.
O tecido biológico pode ser uma membrana de mucosa. O tecido biológico pode ser uma célula. O tecido biológico pode ser a superfície urotelial de uma bexiga.
Os dHPGs aqui descritos podem ser descritos através de uma nomenclatura comum que identifica a estrutura hiper- ramificada básica, os atributos do núcleo e os atributos de superfície da seguinte forma: HPG-núcleo (x) -parte externa, (y1)-parte externa, (y2)...-parte externa, (yn) (1) | a 16 que designa um polímero composto de poliglicerol hiperramificado, que compreende um núcleo derivatizado um substituinte selecionado de grupos hidrofóbicos tais como grupos alquila Cg, Cio, C1i2 Ou Cig lineares ou ramificados ou contendo substituintes arila, onde a quantidade do substituinte do núcleo é x, expresso em número de mols ou como uma porcentagem.
O polímero também possui n substituintes na parte externa, como PEG ou MePEG, Ou substituintes possuindo grupos carboxila (COOH), grupos hidroxila, aminas (NR2) , N-hidroxissuccinimidas (NHS), o aminas carregadas (NR3'), tióis (SH) etc., como descrito neste documento.
Cada substituinte da parte externa pode - ser designado como estando presente em uma certa quantidade yl, y2 ou yn, e pode ser expresso em número de mols ou como : 15 uma porcentagem.
Em algumas notações, as classes gerais podem ser designadas da mesma maneira, mas sem identificar explicitamente as quantidades de cada um.
Além disso, quando o substituinte da parte externa PEG ou MePEG, ele pode ser adicionalmente definido pelo comprimento de cadeia deste componente polimérico, por exemplo, MePEG350, PEG200, etc.
Para a classe geral, no entanto, o peso molecular pode oe ser omitido.
Por exemplo, cada um de HPG-Cg/10-MePEG ou HPG-Cg/10-NH> designa o núcleo (x) como Cs/10n.
O termo "HPG-Cg/10-MePEG" ou similar, em qualquer trecho deste documento, pode ser usado de modo intercambiável com o termo "HPG-Cio-MePEG". Em algumas circunstâncias, o núcleo (x) não é identificado e pode ser considerado como sendo Cg,/10. No entanto, outras alquilas com C;-Cxo podem ser usadas.
De acordo com uma outra modalidade, é fornecido um uso de um dHPG aqui descrito para a administração de fármacos a um tecido alvo.
De acordo com uma outra modalidade, é fornecido um uso de um dHPG aqui descrito na preparação de um medicamento para
%“ 17 a administração de fármaco a um tecido alvo. De acordo com uma outra modalidade, é fornecido um uso de um dHPG aqui descrito como um pré-tratamento ou cotratamento para aumentar a absorção de fármaco em um tecido. De acordo com uma outra modalidade, é fornecido um uso de um dHPG aqui descrito para o tratamento de um câncer de bexiga que não é músculo-invasivo. De acordo com uma outra modalidade, é fornecido um uso de um dHPG aqui descrito como um pré- tratamento ou cotratamento para aumentar a absorção de fármaco em um tecido de um fármaco para o tratamento de um o câncer de bexiga que não é músculo-invasivo. De acordo com uma outra modalidade, é fornecido um uso de um dHPG aqui - descrito na preparação de um medicamento para o tratamento de um câncer de bexiga que não é músculo-invasivo. O 7 15 tratamento do câncer de bexiga que não é músculo-invasivo pode ser em um mamífero. O mamífero pode ser um ser humano. De acordo com outra modalidade, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende um dHPG, conforme estabelecido neste documento, e um excipiente farmaceuticamente aceitável. De acordo com uma modalidade adicional, é fornecido um ou mais dHPGs descritos neste documento para a oe administração de fármaco a um tecido alvo. De acordo com uma modalidade adicional, é fornecido um método para a preparação de um dHPG aqui descrito.
Os polímeros aqui descritos destinam-se a incluir todas as misturas racêmicas e todos os isômeros estruturais individuais ou variantes, em particular conforme definido pelos padrões de ramificação dentro da estrutura HPG, ou em termos de ligação física dos substituintes de superfície ao | HPG.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 mostra um cromatograma de UPLC da amostra de docetaxel (DTX).
A 18 A figura 2 mostra a área do pico dos eluentes de DTX e seu epímero (7-epi-DTX) em função do tempo para determinar a estabilidade dos dHPGs, conforme descrito neste documento, incorporando DTX.
A figura 3A mostra um único registro de íon selecionado (SIR) de DTX e do íon 7-epi-DTX (+H*) m/z 808,5 em HPG-Cg/10 incorporando DTX.
A figura 3B mostra um SIR de DTX e do íon 7-epi-DTX (+H*) m/z 808,5 no HPG-Cg/10-MePEG-NH> incorporando DTX.
A figura 4 mostra a corrente iônica total (TIC) para o HPG-Cg/10-MePEG-NH?, incorporando DTX. A figura 5 mostra um padrão de fragmentação da técnica - anterior proposto para DTX. A figura 6 mostra a área do pico dos eluentes de DTX 1 15 (e 7T-epi-DTX) em função do tempo para o HPG-Cg/10-MePEG-NH,; incorporando DTX em pH 7,4 e em pH 6,0.
A figura 7A mostra a porcentagem de proliferação das células KU7 em função da concentração de HPG-Cg/109 para uma formulação de núcleo normal (NC) e uma formulação de núcleo condensado (CC).
A figura 7B mostra a porcentagem de proliferação das o células KU7 em função da concentração de HPG-Cg/190-MePEG para uma formulação de núcleo normal (NC) e uma formulação de núcleo condensado (CC).
A figura 8 mostra a porcentagem de proliferação das células KU7 em função da concentração de polímero para determinar a biocompatibilidade dos vários dHPGs.
A figura 9 mostra o espectro de 400 MHz de próton (parte superior) e HSQC de HPG-Cg/10 em Ds-DMSO. D, Liz €& Lu representam as unidades dendrítica, linear 1-3 e linear 1- 4, respectivamente.
A figura 10 mostra os espectros a (A) 400 MHz HSQC de próton (parte superior) e HSQC de HPG-Cg/10-MePEG«s.5s E (B) OS z 19 espectros de HSQC a 400 MHz do epóxido de MePEG 350, O/DGE e do polímero HPG-Cg/10-MePEG;3 sobrepostos.
A figura 11 mostra (A) uma etanólise catalisada por base da ligação éster do PTX para gerar Bacatina III e seu éster etílico de cadeia lateral (éster N-benzoil-3- fenilisosserina etílico) e (B) cromatogramas representativos ilustrando a identificação dos degradantes de PTX por um ensaio de UPLC-MS/MS em uma formulação preparada usando HPG-Cg/10-MePEG não purificado.
A figura 12 mostra cromatogramas representativos o ilustrando o efeito de purificação do HPG-Cg/10-MePEG;; sobre a estabilidade química de PTX (tempo de retenção de 2,1 - min) medido por análise de UPLC UV. (A) cromatograma de PTX formulada em HPG impuro recém constituído em PBS (pH 7,4), 7 15 (B) uma cromatograma da mesma formulação em (A), de 48 h, e (C) um cromatograma de PTX formulado em HPG purificado, recém constituído em PBS (pH 7,4). A figura 13 mostra a liberação do PTX e DTX do HPG- Cg/10-MePEG na urina artificial a 37 ºC. (A) liberação de DTX cumulativa de HPG-Cg/1o0-MePEG (6 e 13 mols). (B) liberação de PTX cumulativa de HPG-Cg,/10-MePEG em urina o artificial (pH 4,6 e 6,5). A figura 14 mostra imagens de fluorescência confocal das células KU7, ilustrando a absorção completa de nanopartículas de HPG-Cg/10-MePEG;;-TMRCA após 1 h de exposição. (A) células KU7 não tratadas com uma mancha DAPI, permitindo a visualização dos núcleos em azul (mostrado em branco na imagem). (B) células KU7 que foram incubadas durante 1 h com nanopartículas de HPG-Cg/10-7 MePEG;3-TMRCA.
A figura 15 mostra os efeitos de citotoxicidade in vitro das formulações comerciais, Taxolº e Taxotereº* e de nanopartículas de HPG-Cg/10-MePEG carregadas com PTX e/ou z 20 DTX contra a linhagem celular KU7-luc, e ambas as linhagens celulares de carcinoma urotelial humano de baixo grau (RTA4, MGHU3) e de alto grau (UMUC3). A figura 16 mostra os efeitos do tratamento das formulações de taxano intravesicais nos xenoenxertos de câncer de bexiga ortotópico.
Controles de veículo (PBS e HPG-Cg/10-MePEG vazio), Taxolº (1 mg/ml, Bristol-Myers- Squibb), Taxotereº (0,5 mg/ml, Sanofi-Aventis) ou paclitaxel (PTX, 1 mg/ml) e docetaxel (DTX, 0,5 mag/mL) carregados em HPG-Cg/10-MePEG. o A figura 17 mostra sequências representativas de imagens de bioluminescência dos camundongos de diferentes - grupos de tratamento tomados no dia da distribuição aleatória nos dias 18 e 33. Direito, seções transversais da 7 15 bexiga representativas do mesmo camundongo nos grupos de tratamento de controle de PBS, Taxotere” e HPG-Cg/1o-MePEG carregado com DTX.
A figura 18 mostra cortes histológicos representativos das bexigas coletadas na extremidade, de camundongos recebendo vários tratamentos: A) PBS, B) Taxolº (1 ma/mL), C) HPG-Cg/10-MePEG/PTX (1 mg/ml), D) Taxotereº (0,5 mg/mL), o E) HPG-Cg/10-MePEG/DTX (0,5 mg/mL), F) HPG-Cg/,10-MePEG (sem fármaco). A figura 19 mostra o (A) espectro de próton unidimensional (traço superior) e o espectro HSQC de HPG- Cg/10-7MePEG e (B) Oo espectro de próton unidimensional (traço superior) e o espectro HSQC de HPG-Cg/10-MePEG-NH>(121, Obtido em uma força de campo magnético de 9,4 T.
A figura 20 mostra as propriedades mucoadesivas dos HPGs, conforme avaliado por um método de partícula de mucina.
A figura 21 mostra (A) a ligação de KU7-luc in vitro de HPGs marcados com rodamina e (B) a viabilidade celular
| das células KU7-luc expostas às soluções de HPG.
A figura 22 mostra a liberação de DTX cumulativa de nanopartículas de HPG-Cg/10-MePEG e HPG-Cg/10-MePEG-NH, na urina artificial em pH 6,5.
A figura 23 mostra (A) imagens de bioluminescência dos camundongos de cada grupo de tratamento, exceto do controle de PBS capturadas nos dias 2, 8 e 12 após a inoculação do tumor e (B) os efeitos do tratamento de uma única formulação de DTX intravesical em xenoenxertos de câncer de bexiga ortotópicos. Quadro direito, vista detalhada dos o ramos do tratamento, exceto para os grupos PBS e Taxotere6 (0,5 mg/mL).
- A figura 24 mostra imagens de bioluminescência de camundongos após um único tratamento intravesical com 0,2 " 15 mog/mLl de HPG-Cg/1o-MePEG carregado com DTX e HPG-Cg/190-MePEG- NHa(121) + A figura 25 mostra a citotoxicidade in vitro de formulações de DTX contra a linhagem celular KU7-luc e linhagens celulares de carcinoma urotelial humano de baixo grau (RT4, MGHU3) e de alto grau (UMUC3).
A figura 26 mostra os efeitos do tratamento das o formulações de DTX intravesicais individuais nos xenoenxertos de câncer de bexiga ortotópicos. Imagens de bioluminescência de camundongos são mostradas no quadro esquerdo.
A figura 27 mostra seções histológicas representativas das bexigas coletadas no final do estudo, de camundongos recebendo várias formulações de 0,2 mg/ml de DTX: (A) HPG- Cg/107MePEG-NH>, (B) “HPG-Cg/10-MePEG, (C) Taxotered. Nos grupos de tratamento, A, B e C, os números de 1 a 3 designam diferentes ampliações.
A figura 28 mostra a bioluminescência tumoral como uma função do tempo para HPG-Cg/10-MePEG incorporando DTX ou paclitaxel (PTX) em comparação com as formulações comerciais de DTX (Taxotere") e PTX (Taxol*').
A figura 29 mostra a retenção de DTX na bexiga 2 horas após a instilação de 50 pg de DTX em HPG-Cg/10-MePEG ou HPG- Cgno-MePEG-NH,.
A figura 30 mostra O carcinoma de bexiga ortotópico instilado com PBS; rodamina livre (TMRCA); HPG-Cg/10-MePEG marcado com rodamina (HPG-Cg/10-MePEG-TMRCA); HPG-Cg/10-MePEG- NH>? marcado com rodamina (HPG-Cg/1o-MePEG-NH;-TMRCA). (B) quantidade de fluorescência dentro os tumores de bexiga, o (C) fluorescência de rodamina observadas em tecidos tumorais em função da distância do lúmen da bexiga.
- A figura 31 mostra (A) o espectro de RMN 'He(B o espectro de RMN *C de HPG-Cg/10-MePEG-COOH em metanol-d,.
í 15 A Figura 32 mostra as unidades estruturais nos polímeros HPG. Cada unidade dendrítica, D, terminal, T e linear, Li3 ou Liu, existe como uma unidade primária, p, e secundária, s. Para polímeros não modificados, R) HPG; para polímeros modificados, R) HPG, Cg/10, MePEG ou COOH. O esquema de numeração é indicado para a unidade Dp.
A figura 33 mostra espectros de HSQC editados de o multiplicidade representativa de (A) HPG-Cg/10-0H, (B) HPG- Cg/10-COOH (alto teor de COOH) e (C) HPG-Cg,10-MePEGçs,5. Atribuições representativas são indicadas nos espectros.
A figura 34 mostra expansões das regiões dos espectros HSQC de (A) HPG-Cg,10-0H e (B) HPG-Cg/10-COOH. Atribuições representativas são fornecidas.
A figura 35 mostra os espectros FT-IR de HPG-Cg/107 MePEGs,5 (parte superior), HPG-Csg/10-MePEG«,5-COOH113 (parte central) e HPG-Ca/10-MePEGs,5-COOH36 (parte inferior).
A figura 36 mostra uma estrutura representativa do HPG-Cg/10-MePEG-COOH ligado à cisplatina.
A figura 37 mostra a ligação da cisplatina (triângulo o 23 vazio) ao HPG-Cg/10-MePEGs,s-COOH113 Ou (quadrado preenchido) HPG-Cg/10-MePEGç«,5-COOH3.e em água destilada ajustada para pH 6,0. A figura 38 mostra a liberação in vitro da cisplatina livre (diamante vazio) ou de cisplatina ligada ao (A) HPG- Cg/10-MePEG«,5-COOH113 OU (B) HPG-Cg/10-MePEGç«,5-COOH3«e EM UMA concentração de fármaco de 1 mg/mbL e concentração de polímero de 10 mg/mL.
Os meios de liberação foram PBS 1 mM nos pHs de 4,5 (quadrado preenchido), 6,0 (triângulo vazio), 7,4 (triângulo invertido) ou urina artificial o (quadrado vazio) a 37 ºC.
A figura 39 mostra a viabilidade celular das células - KU-7-luc após (A) 2 e (B) 72 h de incubação com HPG-Cg,/,10-OH (quadrado preenchido), HPG-Cg/10-MePEGs,s (triângulo vazio), 7 15 HPGCg/10-MePEGç«,5-COOH 13 (círculo preenchido) e HPG-Cg/107 MePEGs,5-COOH31ge (diamante vazio). A figura 40 mostra a viabilidade das células KU-7-luc após (A) 2 e (B) 72 h de incubação com cisplatina livre (círculo cheio), HPG-Cg/10-MePEG«,5-COOH13 carregado com cisplatina (triângulo vazio) e HPG-Cg/10-MePEGs,5-COOH348 (quadrado preenchido). oe A figura 41 mostra os perfis de profundidade do nível tecidual de DTX no tecido da bexiga suína após exposição ao DTX a 0,5 mg/mL em Tween 80 (círculo cheio), 0,5 mg/ml de DTX em HPG-Cg/10-MePEG-NH>; (37 mols de amina/mol de polímero) (quadrado vazio), 0,5 mg/ml de DTX em HPG-Cg/10-MePEG-NH, (10 mols de amina/mol de polímero) (triângulo vazio), 0,5 mg/mL de DTX no HPG-Cg/10-MePEG (triângulo invertido cheio). Os valores médios para análises repetidas de quatro formulações, comparando a penetração usando polímero HPG com o aumento do teor de amina, em comparação com Tween 80 (por exemplo, a formulação de Taxotere). Em cada análise, 5 a 6 repetições foram realizadas.
. | 24 A figura 42 mostra os perfis de profundidade do nível tecidual de DTX no tecido da bexiga suína após exposição a diferentes formulações de DTX com e sem pré-tratamento durante 1 hora. 0,5 mg/ml de DTX em Tween 80 com pré- tratamento com quitosana (círculo vazio), 0,5 mg/mL DTX em Tween 80 com pré-tratamento com HPG-Cg/10-MePEG-NH, (diamante vazio), 0,5 mg/mL de DTX em HPG-Cg/1o0-MePEG-NH, sem pré- tratamento (triângulo vazio), 0,5 mg/mL de DTX em HPG-Cg/107 MePEG-NH, com pré-tratamento com quitosana (triângulo vazio invertido) e 0,5 ma/ml de DTX em HPG-Cg/10-MePEG com pré- o tratamento com quitosana.
A figura 43 mostra AUCsS de DTX para diferentes - formulações de DTX com e sem pré-tratamento durante 1 hora. 0,5 mga/mL de DTX em Tween 80 com pré-tratamento com : 15 quitosana 0,5 mg/ml de DTIX em Tween 80 com pré-tratamento com HPG-Cg/10-MePEG-NH,, 0,5 mg/mL de DTX em HPG-Cs/10-MePEG- NH, sem pré-tratamento, 0,5 mg/mL de DTX em HPG-Cg,10-MePEG- NH, com pré-tratamento com quitosana e 0,5 mg/ml de DTX em HPG-Cg/100-MePEG com pré-tratamento com quitosana.
As linhas indicam ausência de diferença significativa (p > 0,05) entre os grupos em análise de Tukey post-hoc após um oe resultado significativo de ANOVA 1 fator, p = 0,0007. As barras de erro indicam o erro padrão da média (SEM). A figura 44 mostra os perfis de profundidade do nível tecidual de mitomicina F no tecido da bexiga suína após exposição a formulações de mitomicina com pré-tratamento durante 1 hora.
A mitomicina F com pré-tratamento com HPG- Cg/10-MePEG-NH, (10 mol de amina/mol de HPG) (quadrado vazio) e mg/ml de mitomicina F com pré-tratamento com HPG-Cg/107 MePEG-NH; (37 mol de amina/mol de HPG) (diamante cheio). A figura 45 mostra imagens SEM (microscopia eletrônica de varredura) de bexigas de porco tratadas ex vivo com veículos de distribuição de HPG:controles (tampão de
« 25 Tyrode, quitosana e HPG-Cg/10-MePEG com 0 mol de amina/mol de polímero).
A figura 46 mostra imagens SEM de bexigas de porco tratadas ex vivo com veículos de distribuição de HPG: HPG- Cg1o-MePEG-NH, 10 e 37 mol de amina/mol de polímero, solução a 0,1, 1 e 10% p/v.
A figura 47 mostra uma imagem SEM da superfície de uma bexiga de camundongo tratada com uma instilação de 2 horas de PBS. A imagem foi capturada de uma bexiga coletada imediatamente após o período de instilação de 2 horas. o A figura 48 mostra imagens SEM da superfície de uma bexiga de camundongo tratada com uma instilação de 2 horas - de solução HPG-MePEG a 10%. A imagem foi capturada de uma bexiga coletada A) imediatamente após o período de 7 15 instilação de 2 horas, B) 6 e C) 24 h após a instilação.
A figura 49 mostra imagens SEM da superfície de uma bexiga de camundongo tratada com uma instilação de 2 horas de solução de HPG-MePEG-NH; a 10% (10 mol/mol). A imagem foi capturada de uma bexiga coletada A) imediatamente após o período de instilação de 2 horas, B) 6 e C) 24 h após à instilação. A seta mostra a perda de uma célula guarda- o chuva única, expondo as camadas inferiores do epitélio.
A figura 50 mostra imagens SEM da superfície de uma bexiga de camundongo tratada com uma instilação de 2 horas de solução de HPG-MePEG-NH, a 1% (37 mol/mol). A imagem foi capturada de uma bexiga coletada A) imediatamente após o período de instilação de 2 horas, B) 6 e C) 24 h após a instilação.
A figura 51 mostra imagens SEM da superfície de uma bexiga de camundongo tratada com uma instilação de 2 horas de solução de HPG-MePEG-NH, a 10% (37 mol/mol). A imagem foi capturada de uma bexiga coletada A) imediatamente após o período de instilação de 2 horas, B) 6 e C) 24 h após a
. 26 instilação. A figura 52 mostra as contagens de célula em urina coletada de camundongos no ponto da remoção do cateter de | instilação (2 h, N= 6, para todos os grupos) e no momento | 5 da coleta da bexiga (2, 6, 24 h, n= 1-3 para os tempos de | amostragem de 6 e 24 h). A figura 53 mostra os níveis de TNFa circulantes no sangue de camundongo em 2, 6 e 24 h após a instilação de A) solução de HPG-MePEG a 10%, B) solução de HPG-MePEG-NH; a 10% (baixa), C) solução de HPG-MePEG-NH; a 1% (alta), D) | oe solução de HPG-MePEG-NH; a 10% (alta), CN) tampão PBS (controle) e em U) animais não tratados. Os resultados são - mostrados com os padrões usados para construir a curva padrão. A linha tracejada representa o sinal do padrão | " 15 menos concentrado (concentração de 0,6 pg/mL de padrão).
DESCRIÇÃO DETALHADA Os novos polímeros descritos neste documento incluem aqueles mostrados na Fórmula I, e todos os quais parecem estar relacionados com a HPG. A síntese de HPG foi anteriormente descrita, incluindo a produção de copolímeros anfifílicos e copolímeros em bloco anfifílicos, incluindo o derivatização com vários grupos funcionais e/ou a produção de copolímeros e copolímeros em bloco (como a adição de grupos alquila através de ligações éster e a adição de grupos polialquilenoglicol). As publicações descrevendo a preparação de HPG incluem: a Patente Norte-Americana No.
5.112.876; a Patente Norte-Americana No. 6.469.218; a Patente Norte-Americana No. 6.765.082; a Patente Norte- Americana No. 6.822.068; WO 2000/77070; Sunder, A. et al. (1999) Macromolecules 32:4240-46, (2000) Macromolecules 33:309-14, (2000) Macromolecules 33:1330-37, e (2000) Adv. Mater 12:235-239; Knischaka, R. et al, (2000) Macromolecules 33:315-20; Haag, R., et al. (2000)
. 27 Macromolecules 33:8158-66, e (2002) J.
Comb.
Chem. 4:112- 19; Kautz, H., et al. (2001) Macromol.
Symp. 163:67-73; Karger-Kocsis, J., et al. (2004) Polymer, 45: 1185-95; Gao, C. & Yan, D. (2004) Prog.
Polym.
Sci. 29:183-275; &e Tziveleka, L. et al., (2006) Macromol.
Biosci. 6:161-169). Sunder, A. et al., (1999) Angew.
Chem.
Int.
Ed. 38: 3552- 55, que contêm uma descrição da preparação de HPG anfifílico modificado, bem como a derivatização de tais polímeros, incluindo a derivatização com vários substituintes e grupos funcionais. oe O dHPGs aqui descritos podem incluir cadeias alquila C1-C30, Ou Outras cadeias alquila semelhantes.
No entanto, . os dHPGs aqui descritos também podem incluir cadeias alquila Ci-Cxw Ou Outras cadeias alquila semelhantes.
O ' 15 termo "alquila" é usado como é normalmente entendido por um técnico no assunto, e muitas vezes refere-se a grupos hidrocarbila alifáticos saturados monovalentes com um a 20 átomos de carbono, a menos que seja definido de outra forma.
O hidrocarboneto pode ser de cadeia linear ou ramificado e pode conter substituintes cicloalifáticos ou arila.
Cadeias alquila podem ser selecionadas de uma Ou o mais cadeias alquila Ci-Cxw.
Alternativamente, as cadeias alquila podem ser selecionadas de um ou mais de cadeias alquila C2r-Ca, C3-Cig OU C4-C1i7. Alternativamente, as cadeias alquila podem ser selecionadas de um ou mais de cadeias alquila Cs-Cis OU C68-Cis OU Ci Cia.
Alternativamente, as cadeias alquila podem ser selecionadas de um ou mais de cadeias alquila Cs8-C13 Ou C9-Ci2z OU Cio-Cis.
Alternativamente, as cadeias alquila podem ser selecionadas de um ou mais de cadeias alquila Cs-Cis Ou Cs5-Cip Ou Cs-Cxwo.
A cadeia Ou cadeias alquílicas selecionadas para oO núcleo podem depender do uso tencionando para o dHPG.
Por exemplo, uma alquila Ci não funcionou bem como uma alquila Cg/10 para carregar paclitaxel.
Os HPGs conforme descritos neste documento podem incluir HPGs derivatizados com substituintes possuindo grupos funcionais, de modo que os HPGs derivatizados ("dHPGS") sejam mucoadesivos e, mais geralmente, bioadesivos. No sentido mais amplo do termo, os dHPGs irão formar uma ligação ou interagir com um tecido biológico, que poderia ser uma célula ou um material extracelular. A ligação ou a interação pode ser de qualquer tipo, incluindo as interações de van der Waals, ligações de hidrogênio, o interações eletrostáticas, ligações iônicas ou ligações covalentes.
- O termo "mucoadesão" ou "mucoadesivo” é usado tal como é normalmente entendido por um técnico no assunto, e ' 15 comumente se refere a um fenômeno adesivo entre materiais poliméricos e o tecido biológico, que pode incluir superfícies celulares, muco nas superfícies celulares ou uma camada de muco-gel que cobre as membranas da mucosa.
Como mucina está presente na superfície urotelial da bexiga, dHPGs contendo grupos funcionais mucoadesivos podem ser usados para oO direcionamento de administração de o fármaco à superfície da bexiga, bem como para outras membranas mucosas.
Geralmente, os dHPGS aqui descritos possuem um "núcleo", que inclui um iniciador (por exemplo, trimetilolpropano (TMP)) e poliglicerol hiperramificado. Em uma modalidade, o núcleo de poliglicerol hiperramificado pode ser derivatizado com cadeias alquila Ci-Cx. Em uma modalidade, o "núcleo" pode ser circundado em uma parte externa, em que a parte externa compreende pelo menos um substituinte hidrofílico ligado aos grupos hidroxila do núcleo, e em que o poliglicerol hiperramificado compreende de cerca de l1 a cerca de 200 mols de pelo menos um —— m———
substituinte hidrofílico por mol do poliglicerol hiperramificado. "Iniciador", como aqui utilizado, é definido como uma molécula pequena que compreende um componente alquila e mais de um, porém preferencialmente mais de dois grupos hidroxila.
No entanto, O iniciador pode ter três ou quatro ou mais grupos hidroxila.
Um exemplo de um iniciador é o trimetilolpropano (TMP). "Núcleo condensado", como usado neste documento, é definido como um núcleo em que a razão de cadeias alquila o C1i-Cro para unidades de glicerol é maior em um centro do núcleo em comparação com uma periferia do núcleo.
Por - exemplo, uma cadeia alquila Ci pode ser incorporada na estrutura, de modo que ela não seja distribuída 7 15 uniformemente em relação ao glicerol por toda a estrutura hiper-ramificada, mas antes, que ela seja distribuída de modo a ser mais concentrada no centro da estrutura do núcleo hiperramificado (por exemplo, adjacente ao iniciador) do que mais perto de sua periferia imediatamente adjacente aos substituintes da parte externa.
O grau ao qual a arquitetura do núcleo é "condensada" pode ser oe controlado pela adição de reagentes.
O termo "centro" pode ser definido como sendo o centro preciso com um ponto de volume zero.
Alternativamente, um dHPG pode ter um raio "r", onde a razão de alquila para glicerol é maior em um volume central com raio "rc", onde rc < r, do que à razão global de alquila para glicerol no dHPG como um todo.
Para um núcleo “regular” ou "normal", um epóxido de glicerol (o monômero do componente de hiper-ramificação) e um epóxido de alquila (que confere a natureza hidrofóbica ao núcleo) podem ser adicionados a uma taxa constante ao longo da reação.
Para um núcleo condensado, o epóxido de alquila é adicionado em maior proporção no estágio mais
« | 30 inicial da reação, e é reduzido até uma proporção menor (tão baixa quanto zero) em estágios posteriores da reação. Esta redução pode ocorrer continuamente Ou Ocorrer em etapas distintas, havendo um mínimo de duas etapas distintas.
A arquitetura do núcleo pode ser definida em termos da taxa de adição de componentes. Por exemplo, um polímero de núcleo condensado pode ser sintetizado em múltiplas etapas, com cada etapa possuindo uma razão definida de monômeros de núcleo, com uma sendo um epóxido de glicerol e a outra o sendo um epóxido de alquila hidrofóbico. Uma molécula de núcleo condensado pode ser feita possuindo uma razão mais - alta de epóxidos de alquila adicionados naís) etapaí(s) inicial/iniciais em comparação com a razão dos componentes ' 15 adicionados na(s) última(s) etapa(s). Alternativamente, a razão pode ser alterada durante um tempo, de modo que para um primeiro período de tempo (ou anterior) durante a reação, uma razão maior de epóxido de alquila para epóxido de glicerol é adicionada em comparação com o que é adicionado ao longo dos últimos períodos de tempo. Nesta abordagem, a razão pode ser alterada constantemente como um o gradiente ao longo de toda a reação.
Os grupos hidroxila restantes do polímero podem ser "derivatizados" com outros substituintes hidrofílicos como MePEG ou PEG para formar uma parte externa hidrofílica, incluindo substituintes com hidroxila, carboxila, amina (incluindo aminas primárias, secundárias e terciárias), NHS, éter, tiol, halo, tioéter, éster, tioéster, amida, succinimidas e outros grupos funcionais similares. Durante a formação da parte externa, pode ser possível para uma porção dos substituintes da parte externa reagir com os grupos hidroxila localizados em direção ao centro do polímero. Mesmo se tais reações ocorrerem, o núcleo mantém o seu caráter hidrofóbico.
Como aqui utilizado, o termo "anfifílico" ou "polímero anfifílico” é usado como é normalmente compreendido por um técnico no assunto, e muitas vezes refere-se à presença de uma porção tanto hidrofóbica quanto hidrofílica em uma única molécula.
Hidrofóbico refere-se a qualquer substância ou porção da mesma que é mais solúvel em um solvente não polar do que em um solvente polar.
A hidrofobicidade pode ser conferida pela inclusão de grupos apolares em uma molécula, incluindo, mas sem se limitar, aos grupos de o hidrocarboneto alifático insaturados e saturados de cadeia longa, e a tais grupos substituídos por um ou mais grupo(s) . aromático(s), cicloalifático(s) ou heterocíclico(s). Hidrofílico refere-se a qualquer substância ou porção da í 15 mesma que é mais solúvel em um solvente polar do que em um solvente não polar.
Características hidrofílicas derivam da presença de grupos polares ou carregados como grupos de carboidratos, fosfato, carboxílico, sulfato, amino, sulfidrila, nitro, hidroxila e outros similares.
A porção hidrofílica pode compreender MePEG, amina, ácido carboxílico ou NHS. oe O termo "polietilenoglicol", ou "PEG", é usado tal | como é normalmente entendido por um técnico no assunto, e | muitas vezes refere-se a tais compostos com peso molecular entre cerca de 200 a cerca de 20.000, dependendo do número de unidades de óxido de etileno na cadeia polimérica.
Pesos moleculares preferenciais são de cerca de 200 a cerca de | 400, de cerca de 200 a cerca de 1000 e de cerca de 200 a cerca de 2000, embora pesos moleculares de cerca de 2000 a | cerca de 8000 também pode ser utilizados. | O termo "óxido de (metoxipoli)etileno”, ou "MePEG", é | usado tal como é normalmente entendido por um técnico no | assunto, e muitas vezes refere-se a tais compostos com peso : ua o o o o TETE EI AI TP EDS EP EP PETI A IP TIP ET TA EDP EP A PE IA E EDP DP DP E II TR EAD ED ET EAD ED Ed " 32 molecular entre cerca de 350 a cerca de 10.000, dependendo do número de unidades de óxido de etileno na cadeia polimérica.
Pesos moleculares preferenciais são de cerca de 350 a cerca de 550, de cerca de 350 a cerca de 750 e de cerca de 350 a cerca de 2000 embora pesos moleculares de cerca de 2000 a cerca de 5000 também pode ser utilizados.
A frase "administração local ou direcionada" é usada como é normalmente compreendida por um técnico no assunto, e muitas vezes refere-se à administração de um composto diretamente a um site alvo dentro de um organismo. o Em algumas modalidades, os dHPGs conforme descritos neste documento podem ser utilizados para tratamento local - ou alvo de uma indicação do trato urinário (por exemplo, a uretra e a bexiga), o trato digestivo (por exemplo, a boca, Í 15 esôfago e cólon), as vias aéreas (por exemplo, o nariz e os pulmões), a cavidade vaginal e o colo do útero e a cavidade peritoneal para tratar as indicações tais como câncer (por exemplo, cânceres de bexiga, gástrico, de esôfago, de pulmão, da laringe, oral, do seio nasal, vaginal Ou cervical), infecção (por exemplo, infecções do trato digestivo ou das vias aéreas) e doenças inflamatórias Ou oe autoimunes (por exemplo, doença da bexiga irritável, doença intestinal inflamatória ou inflamação crônica ou aguda) bem como outras indicações em que a administração de um fármaco ou outra porção biologicamente ativa a um tecido ou célula é desejada.
Por exemplo, os dHPGs conforme descritos neste documento podem ser utilizados para tratamento local Ou direcionado do câncer de bexiga que não é músculo-invasivo.
Em algumas modalidades, os polímeros conforme descritos neste documento podem ser usados na preparação de um medicamento ou uma composição para o tratamento local ou alvo de uma ou mais das indicações listadas neste documento (por exemplo, câncer de bexiga que não é músculo-invasivo).
Alguns aspectos desta invenção fazem uso de composições compreendendo um dHPG aqui descrito e um excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável.
Métodos de tratamento de uma ou mais das indicações listadas neste documento (por exemplo, câncer de bexiga que não é músculo-invasivo) também são fornecidos.
Tais métodos podem incluir a administração de um dHPG, como descrito neste documento, ou uma composição de um dHPG, como descrito neste documento, ou uma quantidade eficaz de um dHPG, como descrito neste documento, ou uma composição de um dHPG, como descrito o neste documento para um indivíduo necessitado disso, em que o dHPG incorpora um agente biologicamente ativo. . Em algumas modalidades, os dHPGs conforme descritos neste documento podem ser usados como pré-tratamento ou 1 15 cotratamento para aumentar a absorção de fármaco em um tecido.
Em algumas modalidades, os dHPGs conforme descritos neste documento podem ser utilizados como pré-tratamento ou cotratamento para aumentar a absorção de fármaco de um fármaco para o tratamento local ou direcionado de uma indicação do trato urinário (por exemplo, a uretra e à bexiga), o trato digestivo (por exemplo, a boca, esôfago e oe cólon), as vias aéreas (por exemplo, o nariz e os pulmões), a cavidade vaginal e o colo do útero e a cavidade peritoneal para tratar as indicações tais como câncer (por exemplo, cânceres de bexiga, gástrico, de esôfago, de pulmão, da laringe, oral, do seio nasal, vaginal Ou cervical), infecção (por exemplo, infecções do trato digestivo ou das vias aéreas) e doenças inflamatórias ou autoimunes (por exemplo, doença da bexiga irritável, doença intestinal inflamatória ou inflamação crônica ou aguda) bem como outras indicações em que a administração de um fármaco ou outra porção biologicamente ativa a um tecido ou célula é desejada.
Por exemplo, os dHPGs conforme descritos neste
| documento podem ser utilizados como pré-tratamento ou cotratamento para aumentar a absorção de um fármaco para o tratamento local ou direcionado do câncer de bexiga que não é músculo-invasivo.
Em algumas modalidades, os dHPGs conforme descritos neste documento podem ser usados como pré-tratamento para aumentar a absorção de fármaco em um tecido.
Em algumas modalidades, os dHPGs conforme descritos neste documento podem ser usados como cotratamento para aumentar a absorção de fármaco em um tecido.
Em uma modalidade, o uso de dHPGs como cotratamento pode incluir o onde o fármaco ou porção biologicamente ativa não é carregado no dHPG durante o tratamento com o fármaco ou - porção biologicamente ativa.
Em uma modalidade, o uso de dHPGs como cotratamento pode incluir onde uma porção de ou Í 15 todo o fármaco ou porção biologicamente ativa é carregado no dHPG durante o tratamento com o fármaco ou porção biologicamente ativa.
Em algumas modalidades, os dHPGs conforme descritos neste documento podem ser usados como pré-tratamento ou cotratamento para aumentar a absorção de fármaco em um tecido.
Em algumas modalidades, os dHPGs conforme descritos neste documento podem ser usados como o pré-tratamento ou cotratamento para aumentar a absorção de fármaco em um tecido em comparação com a absorção de fármaco no tecido na ausência de pré-tratamento Ou cotratamento.
Em algumas modalidades, os dHPGs conforme descritos neste documento podem ser usados como pré- tratamento ou cotratamento para aumentar a absorção de fármaco em um tecido sem causar a necrose e/ou inflamação do tecido.
Em algumas modalidades, aumentar a absorção de fármaco em um tecido pode incluir causar a perda de células guarda-chuva.
Em algumas modalidades, aumentar a absorção de fármaco em um tecido pode incluir causar a perda de células guarda-chuva sem causar a necrose e/ou inflamação do tecido. Em algumas modalidades, as células guarda-chuva podem ser células guarda-chuva da superfície urotelial da bexiga. A expressão "aumentando a absorção de fármaco” é usada tal como é normalmente entendida por um técnico no assunto e, muitas vezes, refere-se à crescente concentração acúmulo de um fármaco em uma célula ou tecido.
Em algumas modalidades, o aumento da absorção do fármaco pode ser medido em termos de aumento do Cavg da absorção do fármaco com o uso de dHPGs como pré-tratamento ou cotratamento em comparação com Cavg da absorção do o fármaco na ausência de pré-tratamento ou cotratamento. O técnico no assunto perceberá que Cavg pode ser medido em . diferentes faixas ou pontos da profundidade do tecido. Por exemplo, Cavg pode ser medido para faixas de para O > 3350, Í 15 O > 1500, 200 > 3350 ou 200 > 1500 um de profundidade do tecido. Em uma modalidade, Cavg da absorção do fármaco com o uso de dHPGs como pré-tratamento ou cotratamento pode ser aumentado por um fator de 1,3 a 4,0, 1,8 a 2,8, 1,3 a 2,4, 2,0 a 2,6, 1,5, 1,8, 2, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3,0, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8 ou 4,0 vezes em comparação ao Cavg da absorção do fármaco, na ausência de pré-tratamento ou cotratamento. Em oe algumas modalidades, o aumento da absorção do fármaco pode ser medido em termos de aumento do Cmax da absorção do fármaco com o uso de dHPGs como pré-tratamento Ou cotratamento em comparação com Cmax da absorção do fármaco na ausência de pré-tratamento ou cotratamento. Em uma modalidade, Cmax da absorção do fármaco com o uso de dHPGs como pré-tratamento ou cotratamento pode ser aumentado por um fator de 1,3 a 4,0, 1,8 a 2,8, 1,3 a 2,4, 2,0 a 2,6, 1,5, 1,8, 2, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3,0, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8 Ou 4,0 vezes em comparação à Cmax da absorção do fármaco, na ausência de pré-tratamento ou cotratamento. Em algumas modalidades, o aumento da absorção do fármaco pode ser
. 36 medido em termos de aumento da AUC(x-y) da absorção do fármaco com o uso de dHPGS como pré-tratamento ou cotratamento em comparação com AUC(x-y) da absorção do fármaco na ausência de pré-tratamento ou cotratamento.
O técnico no assunto perceberá que AUC(x-y) pode ser medido em diferentes faixas ou pontos da profundidade do tecido.
Por exemplo, AUC(x-y) pode ser medido para faixas de O > infinito, O > 3350, O > 1500, 200 > infinito, 200 > 3350 ou 200 > 1500 um de profundidade do tecido.
Em uma modalidade, AUC(x-y) da absorção do fármaco com o uso de dHPGs como o pré-tratamento ou cotratamento pode ser aumentado por um fator de 1,3 a 4,0, 1,8 a 2,8, 1,3 a 2,4, 2,0 a 2,6, 1,5, . 1,8, 2, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3,0, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8 ou 4,0 vezes em comparação ao AUC (x-y) da absorção do fármaco, na ' 15 ausência de pré-tratamento ou cotratamento.
O técnico no assunto perceberá que existem métodos alternativos para medir o aumento da absorção do fármaco, por exemplo, uma razão de aumento da permeabilidade, R, calculada como um quociente das permeabilidades na presença e na ausência de pré-tratamento ou cotratamento, conforme reportado em Grabnar et al. (International Journal of Pharmaceutics 256 o (2003) 167-173) pode ser usada.
Em algumas modalidades, os dHPGs conforme descritos neste documento podem estar na forma de adição de solvente.
Os dHPGs podem estar associados com uma quantidade não estequiométrica de um solvente, água e/ou tampões, tipicamente expressada como porcentagem em peso ou porcentagem em volume.
O solvente pode ser, por exemplo e sem limitação, um solvente farmaceuticamente aceitável ou outro solvente biocompatível, incluindo etanol, DMSO, propilenoglicol, glicerol, PEG200, PEG300, Transcutol ou Solutol.
As modalidades dos dHPGs, conforme descritas neste
. 37 documento, incluem todas as possíveis alternativas de estereoquímicas, incluindo aquelas ilustradas ou descritas neste documento. Em algumas modalidades, dHPGs conforme descritos neste documento incluem isômeros como isômeros geométricos possuindo diferentes padrões de ramificação. Os DHPGs sintetizados pelos métodos divulgados neste documento são HPGs de ramificação aleatória e conterão monômeros de glicerol que são totalmente reagidos, por exemplo, ligados | nas três direções, ou parcialmente reagidos, estando ligado | o a outro monômero em uma ou duas direções. A presença de cada arquitetura de ramificação pode ser confirmada por . técnicas analíticas (por exemplo, experimentos HSQC de RMN 2D).
Í 15 As composições e dHPGsS de acordo com algumas modalidades aqui descritas podem ser administradas em qualquer uma de uma variedade de vias conhecidas. Os dHPGs poderiam ser administrados como uma solução de dosagem intravesical ou em outras composições criadas para funcionar como um enxágue (incluindo um enxágue oral, uma solução de irrigação intraperitoneal ou uma irrigação para ) cavidades nasais ou vaginais), um colírio, uma solução oral para ser engolida, um aerossol ou uma solução para inalação como um spray, ou como um semissólido a ser inserido na proximidade de um tecido biológico como uma superfície mucosa.
Entende-se que poderia ser potencialmente benéfico restringir a administração dos dHPGs descritos neste documento incorporando um fármaco ou outro agente biologicamente ativo ao tecido ou célula alvo a que a administração do fármaco é desejada. Por exemplo, é contemplado que a administração seletiva de dHPGs, como descrito neste documento, incorporando um agente
| biologicamente ativo na superfície urotelial da bexiga em um indivíduo com ou suspeito de ter câncer de bexiga que não é músculo-invasivo pode proporcionar o efeito terapêutico sem produzir efeitos colaterais significativos em outros tecidos do corpo.
Um exemplo de um método que pode ser adequado para a administração de um dHPG, como descrito neste documento, incorporando um taxano é a instilação intravesical.
A instilação intravesical é também um exemplo de um método que pode ser adequado para a administração de um dHPG, como descrito neste documento, o para uso como um pré-tratamento ou cotratamento para o aumento da absorção do fármaco em um tecido.
A instilação - intravesical é um meio de administração de fármaco por meio do que uma solução é inserida em uma vesícula, como a Í 15 bexiga.
Ao administrar à bexiga, a solução é tipicamente administrada através de um cateter inserido através da uretra para dentro da bexiga.
A solução é instilada e tipicamente retida na bexiga durante um período de tempo de cerca de l1 a cerca de 2 horas.
Um volume típico de instilação está compreendido na faixa de cerca de 10 a cerca de 50 mL.
Após o tempo de permanência, o volume de 9? solução e qualquer urina acumulada que tenha diluído a solução seria evacuado para terminar o procedimento.
O tempo de permanência representa o tempo de exposição máximo ao fármaco durante a terapia intravesical, uma vez que a maior parte do fármaco é removida durante a etapa de evacuação.
Outros exemplos de composições ou métodos para facilitar a administração ao tecido localizada seria evidente para um técnico no assunto.
Por exemplo, os dHPGs, conforme descritos neste documento, podem ser usados em composições farmacêuticas, em que o dHPG contém um taxano ou outro fármaco hidrofóbico no núcleo do dHPG junto com um segundo fármaco, que também pode ser formulado no HPG, ou O
. 39 segundo fármaco pode ser combinado em solução com o dHPG para administração. Além disso, os dHPGsS podem ser combinados com um agente de direcionamento (por exemplo, um anticorpo para o receptor do fator de crescimento epidérmico, que é superexpresso em tumores da bexiga, herceptina ou VEGF).
Composições farmacêuticas adequadas podem ser formuladas pelos meio conhecidos na técnica e seus modos de administração e a dose determinada pelo profissional versado na técnica. Para instilação intravesical, um dHPG o incorporando um agente biologicamente ativo pode ser dissolvido em um veículo de instilação como água, um . sistema de cossolvente contendo água, uma solução aquosa isotônica como solução salina normal ou dextrose em 5% em 7 15 água, ou em um sistema tamponado para controlar o pH em um nível favorável, como pH aproximadamente de 6 a 8, ou outra faixa adequada, por exemplo, pH aproximadamente de 4 a 6 ou pH acima de 8. O pH pode ser controlado em uma faixa específica para proporcionar benefícios na otimização da cinética de liberação de fármaco, estabilidade do fármaco, mucoadesão máxima, solubilidade máxima ou uma combinação oe dos mesmos. Outros veículos farmaceuticamente aceitáveis usados para administração de sistemas de distribuição de fármaco solúveis em água também são contemplados. Muitas técnicas conhecidas por um técnico no assunto são descritas em Remington: the Science & Practice of Pharmacy por Alfonso Gennaro, 20º ed., Lippencott Williams & Wilkins, (2000). Uma “quantidade eficaz” de uma composição farmacêutica, como aqui utilizado, inclui uma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade profilaticamente eficaz. Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade eficaz, nas doses e pelos períodos de
. 40 tempo necessários, para atingir o resultado terapêutico desejado, tal como a proliferação de células cancerosas diminuída, maior vida útil ou aumento da expectativa de vida.
Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um dHPG incorporando um agente biologicamente ativo pode variar de acordo com fatores como o estado de doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade do agente biologicamente ativo para extrair uma resposta desejada no indivíduo.
Os regimes de dosagem podem ser ajustados para proporcionar a resposta terapêutica ótima.
Uma quantidade terapeuticamente o eficaz é também uma em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais da formulação são compensados pelos efeitos - terapeuticamente benéficos.
Uma “quantidade profilaticamente eficaz” refere-se a uma quantidade eficaz, Í 15 nas doses e pelos períodos de tempo necessários, para atingir o resultado profilático desejado, como a prevenção ou a prevenção da progressão de uma indicação.
Tipicamente, uma dose profiláctica é usada em indivíduos antes ou em um estágio inicial da doença.
Deve-se observar que os valores de dosagem podem variar com a gravidade da condição a ser aliviada.
Para oe qualquer individuo particular, regimes de dosagem específicos podem ser ajustados ao longo do tempo, de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa administrando ou supervisionando a administração das composições.
A quantidade da composição pode variar de acordo com fatores como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo.
Os regimes de dosagem podem ser ajustados para proporcionar a resposta terapêutica ótima.
Por exemplo, uma massa única pode ser administrada ao longo do tempo, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo, ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada, conforme a 41 indicado pelas necessidades da situação terapêutica. Pode ser vantajoso formular composições na forma de unidade de dosagem por motivo de facilidade de administração e | uniformidade de dosagem.
Em algumas modalidades, dHPGs conforme descritos neste documento, podem ser utilizados, por exemplo e sem limitação, juntamente com outros métodos de tratamento. Por exemplo, dHPGs, como descritos neste documento, incorporando um agente biologicamente ativo, podem ser usados como neoadjuvante (antes), adjuvante (durante) e/ou o adjuvante (após) a terapia, em combinação com outras terapias, conhecidas por uma pessoa normalmente versada na - técnica. Em geral, dHPGsS conforme descritos neste documento í 15 podem ser utilizados para reduzir a toxicidade. A toxicidade dos dHPGs aqui descritos pode ser determinada usando técnicas padrão, por exemplo, por testes em culturas de células ou animais experimentais e determinação do índice terapêutico, isto é, a razão entre a LD5S0O (dose letal para 50% da população) e a LDIOO (dose letal para 100% da população). Em algumas circunstâncias, no entanto, oe como em condições de doença grave, pode ser necessário administrar excessos substanciais das composições. Alguns dHPGs desta invenção podem ser tóxicos em algumas concentrações. Estudos de titulação podem ser usados para determinar as concentrações tóxicas e não tóxicas. A toxicidade pode ser avaliada examinando um dHPG particular ou a especificidade da composição através das linhagens celulares. Estudos em animais também podem ser usados para fornecer uma indicação se o polímero tem quaisquer efeitos sobre outros tecidos.
Os dHPGs, como aqui descritos, podem ser administrados a um indivíduo. Como aqui utilizado, um "indivíduo" pode
N 42 ser um ser humano, um primata não humano, rato, camundongo, vaca, cavalo, porco, ovelha, cabra, cão, gato, etc.
O indivíduo pode ser suspeito de ter ou estar em risco de ter câncer ou outra doença associada com um tecido com uma superfície mucosa.
Tal indicação pode ser do trato urinário (por exemplo, a uretra e a bexiga), do trato digestivo (por exemplo, a boca, esôfago e cólon), das vias aéreas (por exemplo, o nariz e os pulmões), da cavidade vaginal e do colo do útero e da a cavidade peritoneal.
Um câncer (por exemplo, de bexiga, gástrico, de esôfago, pulmão, de o laringe, oral, do seio nasal, vaginal ou cervical), uma infecção (por exemplo, infecções do trato digestivo ou das . vias aéreas), ou doenças inflamatórias ou autoimunes (por exemplo, bexiga irritável, doença intestinal inflamatória 7 15 ou inflamação aguda ou crônica), bem como outras indicações podem ser alvos desejados dos dHPGs aqui descritos para a administração de um fármaco ou outra porção biologicamente ativa.
Métodos de diagnóstico para o câncer, infecções e doenças autoimunes ou inflamatórias são conhecidos por um técnico no assunto.
Por exemplo, os dHPGs aqui descritos podem ser usados oe para o tratamento de câncer de bexiga que não é músculo- invasivo.
Os DHPGs aqui descritos podem ser usados para a preparação de um medicamento para O tratamento de câncer de bexiga que não é músculo-invasivo.
Os dHPGs descritos neste documento podem ser usados em um método para o tratamento de câncer de bexiga que não é músculo-invasivo.
O método pode compreender administrar a um indivíduo necessitado disso uma quantidade eficaz de um dHPG descrito neste documento, incorporando um agente biologicamente ativo (por exemplo, um taxano). Por exemplo, os dHPGs aqui descritos podem ser usados como um pré-tratamento ou cotratamento para aumentar a absorção do fármaco para o tratamento de i nho - 43 câncer de bexiga que não é músculo-invasivo.
Métodos de preparação ou de síntese de dHPGs descritos serão compreendidos por um técnico no assunto com referência aos princípios de síntese química conhecidos.
Por exemplo, WO2006/130978 descreve procedimentos sintéticos adequados que podem ser considerados e adequadamente adaptados para a preparação dos polímeros descritos neste documento.
Uma metodologia geral para a preparação química de um dHPG é descrita no seguinte esquema exemplificador não o limitante: oH oH O CH;OK E . e) P o ºC/Ar/Agitação m durante 1 h, remove m A, on - 15 Media Adicionar monômeros [cx durante 22-24 h 105 “C/Ar/Agitação, a o seguir reagir durante mm mais 1h PEGO e: (Te rs Cro EL e TA ida f. * Ss Fo á Da HO, MePEGA So MePEGS ã NE a ne O o. Adicionar epóxido de oe Ú od AS“ MePEG durante 22-24 Y o mm o, o o h, 105 ºC/Ar/Agitação, d x º É a seguir reagir por mais o OH RETA quo 1h nt a HarCio oH 7 Co oro 25 E: a Lo e, RA Í to 7 LA) A etapa 2, adição dos monômeros, é adicionalmente definida pela taxa de adição dos monômeros durante o período de 22 a 24 horas. Para polímeros de núcleo condensado, a taxa de adição do epóxido de alquila é mais rápida em fases iniciais do período reacional e a taxa de adição de epóxido de glicerol pode ser mais lenta nos estágios iniciais. No entanto, o ajuste da taxa de adição não é necessário, uma vez que a razão dos componentes favorece a adição do componente alquila nos estágios iniciais da reação em relação aos estágios posteriores.
Várias modalidades e métodos alternativos são descritos neste documento. Essas modalidades e exemplos são ilustrativos e não devem ser interpretados como limitantes do escopo da invenção.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: Síntese e caracterização dos HPGs o Derivatizados Todos os produtos químicos foram comprados da Sigma- - Aldrich Canada Ltd. (Oakville, Canadá) e usados sem purificação adicional. Todos os solventes eram de grau HPLC NA 15 da Fisher Scientific (Ottawa, Canadá) e foram usados sem | purificação adicional. | As polimerizações foram realizadas em um frasco de fundo redondo com três gargalos equipado com um agitador mecânico. O segundo gargalo foi ligado a uma linha Schlenk de tubo com dupla ligação, e o terceiro foi fechado com um septo de borracha, através do qual os reagentes foram o adicionados. Um processo de reação de polimerização típico para HPG-Cg/10-MePEG é o seguinte. o iniciador trimetilolpropano (TMP) é adicionado ao frasco "sob atmosfera de argônio, seguido por solução de metilato de potássio em metanol (20% em peso). A mistura é agitada usando uma barra de agitação magnética durante 15 minutos, depois do que O excesso de metanol é removido em um vácuo. O frasco é mantido em banho de óleo a 95 ºC e glicidol é adicionado gota a gota durante um período de 12 horas, utilizando uma bomba de seringa. Após o término da adição do monômero, a mistura é agitada por mais 5 horas. Éter octil/decilglicidílico é a seguir adicionado e a mistura é
. 45 agitada durante 24 horas para formar HPG-Cg/10. A esta mistura, MePEG350 é adicionado gota a gota durante um período de 12 horas e, em seguida, ela é agitada durante mais 5 horas.
MePEG é preferido em relação ao PEG porque o grupo metila do MePEG protege uma extremidade do monômero, de modo que o monômero não torna bivalente, o que poderia resultar na reticulação entre as moléculas de dHPG.
Outros grupos “protetores também são contemplados, incluindo aqueles que podem ser removidos após a síntese.
Desta forma, o HPG pode ser preparado com as cadeias de PEG na o superfície que podem ser adicionalmente modificadas pela adição de outros grupos químicos ou biomoléculas, incluindo - peptídeos, glicopeptídeos, proteínas e similares.
Este procedimento pode ser modificado para a síntese de Í 15 diferentes HPGs, por exemplo, 1,2-epoxioctadecano pode ser adicionado à mistura depois da adição do glicidol para formar HPG-Cig.
O produto é então dissolvido em metanol e neutralizado pela sua passagem três vezes através de uma coluna de troca catiônica (Amber 1 item” IRC-150). () éter octil/decilglicidílico que não reagiu é removido por ) extração com hexano.
Metanol é removido e o polímero é dialisado durante três dias contra a água usando tubulação de diálise de acetato de celulose (MWCO: 1000 g/mol, Spectrum Laboratories Inc.), com três trocas de água por dia.
O polímero seco é então obtido por liofilização e secagem por aquecimento.
Este procedimento pode ser modificado a fim de sintetizar dHPGs de núcleo condensado em que as cadeias alquila estão concentradas em direção ao centro do polímero, em vez do dHPG de núcleo normal, em que as cadeias alquila são posicionadas aleatoriamente ao longo do polímero.
O núcleo do polímero é modificado pela adição do
. 46 epóxido de glicerol e monômeros de alquila à mistura reacional em diferentes taxas e/ou em diferentes proporções.
A fim de formar um dHPG com núcleo condensado, todo o monômero alquila é adicionado antes da adição do epóxido de glicerol ser completada, de modo que a porção externa da estrutura hiper-ramificada não contenha qualquer componente alquila.
Em vez disso, o componente alquila está localizado em direção ao núcleo do HPG.
HPG-Cg/10-COOH foi sintetizado primeiro pela preparação de HPG-Cg/10, conforme descrito acima.
O esquema II mostra a ) reação para a adição de grupos funcionais de ácido carboxílico ao HPG-Cg/10! - ” Ô o ' 15 HPG em e XP 100 ml água ambiente/durante a noite Rotoevaporação — Dialisado contra água 1 Dissolver residuo Adicionar MeOH Rotoevaporação em MeOH a 70% Seca à vácuo | durante a noite o o Ao: 0 Piridina (50 mL) foi adicionada ao HPG-Cg/10 (0,5 g) e agitou-se rapidamente para dissolver o polímero.
Dimetilaminopiridina (0,2 g, 0,0016 mol) foi adicionada seguido pela lenta adição de anidrido succínico (12 g, 0,12 mol). A reação foi agitada de um dia para o outro em temperatura ambiente (aproximadamente 22 ºC). Água foi adicionada (100 mL) e a mistura foi agitada durante 30 minutos.
Os solventes foram removidos por rotaevaporação
. 47 com a adição periódica de água para permitir melhor evaporação da piridina por destilação azeotrópica.
O resíduo foi dissolvido em metanol e dialisado contra água destilada durante 16 horas usando uma membrana Spectra/Dialysis (MWCO: 3500 g/mol). O meio de diálise foi trocado quatro vezes, cada vez com uma concentração de metanol maior.
A composição final do meio de diálise foi de 70% de metanol em água destilada.
O solvente foi removido por rotaevaporação e o polímero foi seco em uma estufa a vácuo de um dia para o outro. o O esquema III mostra o primeiro esquema reacional tentado para a adição de carbonato de succinimidila para . HPG-Cg/10. Resumidamente, HPG-Cg/10 foi seco sob vácuo a 110 ºC e, a seguir, refrigerado até a temperatura ambiente.
Acetonitrila e DCM foram adicionados para dissolver o polímero.
Carbonato de N,N'-dissuccinimidila (DSC) foi em seguida adicionado ao frasco.
O frasco foi evacuado e, a seguir, purgado com argônio, e a reação prosseguiu de um dia para o outro em temperatura ambiente após a adição de | piridina.
Após a reação, a maior parte da acetonitrila foi | removida por rotaevaporação.
Éter —metil-terc-butílico oe (MTBE) foi adicionado para precipitar o polímero.
O sobrenadante foi decantado e DCM foi adicionado para dissolver o polímero.
O material foi filtrado através de um funil de Buchner de 10 a 15 um para obter uma solução límpida, que foi rotaevaporada para remover o DCM.
MTBE foi adicionado para precipitar o polímero.
O produto HPG-Cg/107 NHS final foi seco sob vácuo em temperatura ambiente. ç x g Carbonato de N,N'-dissuccinimidila (DSC) Ce ox) o o
DSC+HPG ES Remocão de ACN por rotaevaporação / vesoner ” % Mm o Precipitação. em CHCL; : Seco o À 1 DD com ITÕE ?, Yácuorremp. — NV NINO Yo Fitração tpm, HPGICarbonato É ' de succinimídila Sólido branco, solúvel em EtOH/PBS Uma segunda rota sintética foi tentada depois de demonstrar que a primeira tentativa produziu HPG-Cg/10-NHS que foi altamente reativo, na medida em que ele era instável, mesmo quando armazenado a -20 ºC, resultando na o reticulação da matriz.
O esquema IV mostra o segundo esquema reacional tentado para a produção de HPG-Cg/,10-NHS. - A síntese envolve a produção de HPG-Cg,10-COOH, conforme descrito acima como um intermediário, e a seguir reagindo ' 15 ainda mais com NHS para produzir HPG-Cg/,10-COOH-NHS. o Dra, SP Adicionar água 1:1 o HP6L OH >> ———> HPG O, e aDissolução em piidina Rotaevaporação Ao Reag. 24h/dimetilaminopirídina Dialise 24h Seco à vácuo o Dissolução em oH - DMF | Reação por 24 | O. o MWDCC Ad EL SIT, | TN Seco em vácuo Dissolver em ACN oe o (TA) Precipitado de o MTBE HPG-Cg/10 Ee anidrido succínico são dissolvidos em piridina e reagem durante 24 horas em temperatura ambiente com dimetilaminopiridina (DMAP) como catalisador.
A reação foi terminada pela adição de um volume igual de água e a piridina foi removida por rotaevaporação da solução.
A solução aquosa de HPG-Cg/10-COOH foi dialisada durante 72 h (MWCO: 3500 g/mol) para remover o solvente residual e foi liofilizada.
O HPG-Cg/wo-COOH reagiu ainda mais com N- hidroxissuccinimida (NHS) durante 24 horas em temperatura ambiente em dimetilformamida (DMF) com N,N'-
“ 49 dicicloexilcarbodiimida (DCC) como o catalisador. No final da reação, DMF foi removido por rotaevaporação. O produto foi isolado como descrito acima. Ele foi precipitado com | MTBE, filtrado em acetonitrila, rotaevaporado e precipitado com MTBE antes da secagem.
Os lotes de HPG-Cg/10-MePEG-NH> com várias densidades de amina diferentes, foram produzidos usando o procedimento abaixo, resumido no Esquema V. Várias estequiometrias de reagentes foram utilizadas para cada lote, conforme descrito na Tabela 1. oe í o NH2-NH> : & Filtráção 3 x on Refluxo em MeOH FA To st a JUÇIO — Mao . KH/THE éter 3x 7 05250 Pe de Mico =10k : " um la para 5. ow ee o À HPG-Cg/10 MePEG (4 g) foi dissolvido em 15 mL de 1,4- dioxano anidro. Hidreto de potássio (0,45 g) foi lavado com hexanos três vezes e secado sob vácuo. A solução polimérica foi combinada com o KH e agitada em temperatura ambiente o até que uma solução límpida se formou, aproximadamente 20% dos grupos OH no HPG-Cg/iw1-MePEG foram desprotonados. N- (2, 3-epoxipropil)ftalimida) (EPP) (1,184 g) foi seca por dissolução em diclorometano com agitação de um dia para oO outro em Na;SO0, ou MgSO.. A solução foi filtrada e seca sob vácuo para remover o diclorometano. O PPE seco foi dissolvido em 1,4-dioxano anidro e adicionado ao polímero com agitação de um dia para o outro a cerca de 85 a 90 “C.
O produto foi neutralizado por passagem do mesmo três vezes através de uma coluna de resina trocadora catiônica (Amberlite IRC-150) e, em seguida, precipitado três vezes do éter para remover EPP que reagiu. Por RMN, 15,5% dos grupos ftalimida foram ligados ao HPG-Cg/iw1o-MePEG.
A clivagem da função ftalimida foi conseguida por hidrazinólise (refluxo com monoidrato de hidrazina). O excesso da solução de monoidrato de hidrazina (2 ml) foi adicionada à solução do polímero em metanol e a mistura foi submetida a refluxo por 48 h.
Depois do refluxo, o metanol foi evaporado, o polímero foi dialisado contra água usando uma membrana de MWCO:10000 g/mol durante 48 h e | liofilizado. | Tabela 1 Estequiometria dos reagentes usados Para oe produzir HPG-Cg/10-MePEG-NH, o sobre o HPG-NH, $% de HPG-Cg/10-MePEG KH EPP NM substituição de NH; alvo Lo | 1,558 Os polímeros obtidos foram caracterizados por RMN, FTIR, DSC e TGA.
RMN é particularmente útil por confirmar a o estrutura ramificada e a presença de grupos de superfície adicionados à parte externa do polímero.
Para alguns grupos químicos de superfície, a análise FTIR também é útil para confirmar o consumo de grupos hidroxila e a substituição destes por outros grupos, em que à química daqueles grupos fornece um espectro IV distinto do resto da estrutura do HPG, por exemplo, a adição de ligações C=O.
Por exemplo, FTIR pode ser usado para confirmar a adição de grupos -COOH à superfície ou a adição de grupos através de uma ligação éster.
EXEMPLO 2: Encapsulamento de paclitaxel ou docetaxel nos dHPGs
Paclitaxel ou docetaxel, juntamente com um dHPG, pode ser dissolvido em uma pequena quantidade de acetonitrila e seco em estufa a 60 ºC durante uma hora, em seguida, esquichado com um fluxo de nitrogênio para eliminar traços do solvente orgânico.
A matriz de dHPG/paclitaxel ou dHPG/docetaxel resultante pode ser hidratada com solução salina tamponada com fosfato 10 mM (pH 7,4), agitada em vórtice por dois minutos e incubada em estufa a 60 “ºC durante uma hora.
A solução resultante é geralmente límpida.
Nos casos onde uma precipitação branca foi oe observada, a solução pode ser centrifugada (18.000 g durante dez minutos) e o sobrenadante pode ser transferido - para um novo recipiente e mantido em lugar fresco até o uso. ' 15 EXEMPLO 3: Estabilidade do docetaxel e paclitaxel em dHPGS A estabilidade do docetaxel ("DTX") incorporada nos dHPGs é caracterizada em termos de degradação da DTX para inativar os produtos de degradação inativo, e a sua interconversão ao seu epímero bioativo ("7-epi-DTX"). Sabe- se que a formação de epímero de paclitaxel e docetaxel o ocorre como um equilíbrio, enquanto que a degradação para inativar produtos de degradação é irreversível.
A estabilidade, conforme descrita em vários dHPGs, foi analisada usando cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC). Uma coluna de UPLC BEH Ci'; Acquity da Waters (2,1 x 50 mm, 1,7 um) foi usada para a separação dos principais picos de degradação.
O volume de injeção foi de 3 pL.
A fase móvel foi uma solução 10 mM de acetato de amônio que foi preparada por pesagem de 0,385 g do sal e dissolvendo- se o mesmo em 500 mL de água grau HPLC.
O pH foi ajustado para pH 4,0 usando ácido acético.
As soluções estoque de DTX (2 mg/ml) foram preparadas em metanol e armazenadas em um congelador a -20 ºC. Um conjunto de padrões contendo DTX foram preparados em metanol/água 50/50 em uma faixa de 0,5- 100 upug/mbL. O limite de detecção (LOD) e o limite de | quantificação (LOQ) foram ambos de 1 pg/ml. A curva de calibração de 1-100 pg/ml foi linear com Rº de 0,9998 para DTX. Uma ponderação de 1/x foi aplicada. A precisão e exatidão do método foram verificadas no LOQ (1 pg/mL) e na gama média(10 uvg/mL). Cinco injeções em replicata foram feitas em cada caso. A tabela 2 resume a exatidão e precisão obtidas para DTX nessas concentrações. o Tabela 2 Precisão e exatidão obtidos para a detecção de DTX por UPLC amostra | analito (ng/mL) (pg/mL) =, | 2 dem | 1960 | 900 | 99 | os | A degradação forçada de DTX foi realizada para gerar amostras para avaliação da especificidade do método. A degradação do DTX foi conseguida preparando uma Solução contendo 300 pL de metanol, 150 ul de hidróxido de amônio 5% e 50 ul de um promedicamento DTX estoque que se degrada o em DIX em minutos em pH alcalino. A conversão do promedicamento DTX em DTX e a degradação do DTX foram monitorados por mais de duas horas. Após 2,2 horas na bandeja (temperatura ambiente), efetivamente todo o promedicamento se degradou em DTX e outros componentes. A amostra degradada foi analisada utilizando o método descrito acima para verificar a resolução do promedicamento de DTX, DTX e degradantes relacionados.
Usando o método de UPLC acima, DTX é o eluente a 2,99 minutos e 7-epi-DTIX é o eluente a 3,15 minutos. Um cromatograma exemplificador é mostrado na Figura 1. Os picos entre 1,4 e 2,0 minutos são produtos da degradação de
DTX e 7-epi-DTX. A área do pico do DTX e 7-epi-DTX foi calculada em função do tempo e, então, utilizada para determinar a porcentagem de DTX ou epi-DTX restante no dHPG. Os resultados são mostrados na Figura 2. Como pode ser observado na Figura 2, as formulações compreendendo DTX eram estáveis quando o polímero HPG foi HPG-Cg/10 é HPG-Cg/107 MePEG, que reteve mais de 90% do DTX incorporado como DTX e 7T-epi-DTX durante um período de 72 horas em PBS tamponado até pH 7,3. A quantidade restante do fármaco se degradou nos componentes inativos e cada um desses que contribuiu o com mais de 2% das amostras totais foram identificados por experimentos de espectrometria de massa MRM. Estes | . experimentos foram realizados para identificar os fragmentos de íon associados com produtos de degradação ' 15 conhecidas do DTX.
Um único registro de íon selecionado (SIR) do DTX e do íon 7-epi-DTX (+H') m/z 808,5 no HPG-Cs,19n e em formulações HPG-Cg/10-MePEG-NH,; são comparados nas figuras 3A e 3B, respectivamente. Ambos os cromatogramas mostram a presença do degradante 7-epi, embora ele esteja presente em maior proporção na amostra HPG-MePEG-NH,. Para as figuras 3A e o 3B, os picos mais altos são DTX e os picos mais baixos são 7T-epi-DTX. Embora o cromatograma de íons total mostra um sinal global muito devido aos constituintes poliméricos (Figura 4) na formulação, massas adicionais conhecidas por corresponder aos fragmentos degradantes de DTX (Kumar et al 2007 Isolation and characterization of degradation impurities in docetaxel drug substance and its formulation, Kumar et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 12 de março de 2007 43(4): 1228-1235) foram identificados coincidindo com os maiores picos de material degradado (Figura 5). M/z de 226 e 282 foram observados em 1,5 minuto, o que pode corresponder aos fragmentos da cadeia lateral de DTX.
No entanto, m/z de 583 estava presente, o que corresponde a l0-deacetil bacatina III + K', indicando que o taxano contém tanto o núcleo quanto a cadeia lateral.
M/z de 320 e 562 também foram observados.
O pico em 2 minutos tinha m/z = 581 e 583, que pode corresponder a 10-oxo-l0-deacetilbacatina III + K, e 10- | deacetilbacatina III + K', respectivamente.
Esta posição do pico também está na região do cromatograma onde os degradantes de bacatina deverão ser observados.
A estabilidade de algumas das formulações pode ser o aumentada ainda mais ajustando o pH das formulações.
Por exemplo, uma composição que compreende HPG-Cg/10-MePEG-NH, - incorporando DTX dissolvido em meio aquoso com sais de tampão em uma razão a fim de obter um pH de 5,5 a 6,5 é 1 15 mais estável do que a mesma composição, excluindo os sais do tampão, ou uma composição com composição do sal de tampão alterada, por exemplo, um tampão PBS conferindo um pH de 7,4 (Figura 6). Sais do tampão apropriado incluem sais de tampão fosfato.
Alternativamente, o pH da composição poderia ser reduzido pela adição de um ácido, | como HCl à composição.
Além disso, a degradação do DTX é e significativamente diminuída pela alteração do pH da composição.
EXEMPLO 4: Biocompatibilidade in vitro de dHPGs
A toxicidade dos dHPGs foi medida por determinar se formulações de dHPG diferentes poderiam matar as células cancerosas KU7. Esses experimentos foram realizados usando dHPGSs que não incorporaram qualquer fármaco ou porção biologicamente ativa.
Os resultados são mostrados nas Figuras 7A e 7B.
A figura 7A mostra à porcentagem de proliferação das células KU7 em função da concentração de HPG-Cg/10 para uma formulação de núcleo regular e uma formulação de núcleo condensado.
A mudança da arquitetura do núcleo não afetou significativamente a estabilidade do HPG-Cg/10. A figura 7B mostra a viabilidade das células KU-7 em função da concentração de HPG-Cg/10-MePEG para formulações de núcleo regular e formulações de núcleo condensado.
Polímeros com um núcleo condensado mostram uma IC50 dez vezes maior quanto à viabilidade celular em comparação com um polímero de núcleo regular.
Os dHPGs com um núcleo condensado são mais bem tolerados por células do que dHPGs possuindo um núcleo regular.
Ambas as formulações continham 6,5 mol de MePEG por mol de HPG.
As formulações oe de núcleo condensado foram menos citotóxicas para as células KU-7 do que as formulações de núcleo regular.
A - tabela 3 mostra as razões de volume dos monômeros utilizados para preparar as formulações mostradas nas " 15 Figuras 7A e 7B.
Tabela 3 Razões de volume dos monômeros usados para as formulações preparadas mostradas nas Figuras 7A e 7B Formulação Etapa Volume de Volume de éter reacio- Glicidol octil/decilglicidílico nal (mML/% v/v) (mL/3 v/v) , condensado condensado condensado A figura 8 mostra que os polímeros HPG-Cg/10, Sem uma parte externa de MePEG estão entre os menos tolerados, e que sem a parte externa de MePEG, a alteração do núcleo da arquitetura regular para a de núcleo condensado não apresenta benefícios em termos de viabilidade celular melhorada. HPG-OH significa que ele é um HPG sem MePEG na superfície. No entanto, quando MePEG é adicionado, O benefício torna-se perceptível. A fórmula de HPG-Cg,10- MePEGçs,5 (com 6,5 mol MePEG por HPG) apresenta tolerabilidade comparável ao HPG-Cg/10, quando as versões de núcleo normais são comparadas, mas quando à arquitetura de núcleo condensado é usada, a tolerabilidade do HPG-Cg/,10- MePEG«.,5 melhora ao nível do núcleo regular HPG-Cg,107 MePEG13, que tem duas vezes a quantidade de MePEG na parte | oe externa. Polímeros —HPG-MePEG anteriormente divulgados | (Mugabe C. et al. 2008 BJIUI 103:978-986) também | . apresentaram quantidade de MEPEG maior, embora eles não foram quantificados, eles são estimados em >15% em mol e o. 15 estavam sendo bem tolerados.
| EXEMPLO 5: ensaio de absorção de células In vitro mostrando que dHPGs são carreados para dentro das células. A absorção de HPG-Cg/10-COOH-NHS marcado com fluoresceína e HPG-Cg/10-COOH em células KU7 foi examinada. O dHPG foi dissolvido em meio isento de FBS em 1 mg/mL. Em cada placa de uma placa de 12 poços, 250 ul de dHPG foram expostos às e células em lamelas. A placa foi lavada duas vezes com PBS, seguido por fixação durante 10 minutos com formaldeído 3,7% em PBS. Novamente a placa foi lavada duas vezes com PBS. As lamelas foram montadas usando Prolong Gold" com DAPI. Uma pilha em Z de HPG-Cg/10-COOH também foi vista para confirmar que o polímero de fato foi absorvido na célula KU-7 e não apenas permaneceu na superfície da célula. Como a fluorescência foi observada em todos os ângulos visualizados, verificou-se que os dHPGs estavam dentro da célula. Estes “resultados mostram que os dHPGs são absorvidos para dentro das células e não causam efeitos indesejáveis no interior da célula. Dados in vitro mostram que quando HPGs são expostos às células, o HPG-CPG-Cg/107 COOH-NHS e HPG-Cg/10-COOH são ambos absorvidos durante uma | hora.
No corpo, no entanto, o contato não é tão completo | quanto o cenário in vitro e a exposição prolongada para | 5 facilitar essa absorção é necessária.
EXEMPLO 6: Carregamento de taxanos nos dHPGs de núcleo condensado e núcleo regular O carregamento de fármaco máximo do HPG-Cg/10-MePEG de | núcleo condensado e regular foi investigado.
DTX e PTX foram carregados no HPG-Cg/1o0-MePEG até as concentrações de oe fármaco finais de 0,5, 1,0, 2,0 e 3,0 mg/mL.
Soluções de 100 mg/ml de polímero em THF foram preparadas e DTX ou PTX - foram adicionados.
O THF foi seco sob um fluxo de N, durante cerca de duas horas e, a seguir, ele foi seco em ' 15 estufa de capela de um dia para o outro.
As matrizes de HPG-Cg/10-MePEG/PTX e HPG-Cg/10-MePEG/DTX foram hidratadas com tampão PBS (pH 7,4). As soluções resultantes foram centrifugadas a 14000 rpm durante cerca de 15 minutos.
Os líquidos sobrenadantes foram testados por HPLC para obter as concentrações do fármaco encapsulado no HPG-Cg/10-MePEG.
Os resultados são mostrados na Tabela 4. oe Tabela 4 Carregamento teórico e efetivo de DTX e PTX no HPG-Cg/10-MePEG de núcleo condensado ("CC") e núcleo regular ("RC") Carregamen Carregamento | Carregamen- |Carregamen- |Carregamen- to alvo efetivo de | to efetivo |to efetivo |to efetivo (mg/mL) DTX em HPG- | de PTX em |de DTX em de PTX em Cg/10-MePEG HPG-Cg/107 |HPG-Cg/107 HPG-Cg/107 CC (mg/mL) MePEG CC |MePEG RC MePEG RC (mg/mL) (mg/mL) (mg/ml)
Verificou-se que Oo carregamento foi superior para oO DTX do que para o PTX. EXEMPLO 7: Síntese e caracterização de HPG-Cg/1n e HPG- Cg/10-MePEG A polimerização dos HPGs modificados de núcleo de éter octil/decilglicidílico (O/DGE, Cg/10) foi realizada em um procedimento sintético de um único frasco com base na polimerização por abertura do anel de epóxidos de acordo com os protocolos relatados (Kainthan, R.K., Mugabe, C, o 10 Burt, H.M., Brooks, D.E., 2008. Biomacromolecules 9, 886- 895).
- Todos os produtos químicos foram comprados da Sigma- Aldrich (Oakville, ON) e todos os solventes eram de grau º HPLC de Fisher Scientific (Ottawa, ON), a-epóxi,o- metoxipolietilenoglicol 350 (epóxido MePEG 350) foi sintetizado a partir da reação de MePEG 350, hidróxido de sódio e epicloridrina. Éter octil/decilglicidílico, metilato de potássio e trimetilolpropano (TMP) foram obtidos junto à Sigma-Aldrich e usados sem purificação adicional.
e 120 mg do iniciador (TMP) foram misturados com 1,5 mL de solução de metilato de potássio em metanol (25%, p/v) e adicionados a um frasco de fundo redondo com três gargalos sob atmosfera de argônio. A mistura foi agitada a 105 “ºC durante 1 h, depois do que o excesso de metanol foi removido sob vácuo, a seguir, 13 mL de glicidol e 9 ml da mistura O/DGE foram injetados usando uma bomba de seringa a uma taxa de 1,4 mL/h para O iniciador. A taxa de agitação foi fixada em 68 rpm usando um sistema de agitação suspenso digital (BDC2002). Após o término da adição do monômero, a mistura foi agitada durante mais 6 h. Os polímeros purificados foram obtidos por extração com hexano para remover o éter octil/decilglicidílico que não reagiu.
O produto foi então dissolvido em metanol e neutralizado passando três vezes através de uma coluna trocadora catiônica (Amberlite IRC-150, Rohm and Haas Co., Filadélfia, PA). O metanol foi removido sob vácuo e uma solução aquosa do polímero foi, a seguir, dialisada durante três dias contra água usado tubulação de diálise de acetato de celulose (MWCO 10.000 g/mol, Spectrum Laboratories), com três trocas de água por dia.
RMN '*H (400 MHz, Ds-DMSO) Su: 0,75-0,82 (-CH3s, TMP); e 0,82-0,91 (-CH;-alquila em O/DGE); 1,16-1,53 (-CH;-, alquila em O/DGE); 2,46 (solvente, Dk-DMSO); 3,16-3,80 (-CH e -CH;-, - do núcleo de HPG); 4,8 (-OH). HPG-Cg/10-MePEG contendo diferentes quantidades de É 15 MePEG foi preparado e designado HPG-Cg/10-MePEGs,5s E HPG-8/107 MePEG,;; para indicar a quantidade de MePEG adicionado ao suprimento (6,5 e 13 mols de MePEG por mol de HPG, respectivamente). A síntese foi realizada de forma semelhante como a reação de HPG-Cg/10, exceto que quantidades diferentes de epóxido de MePEG 350 foram adicionadas à | mistura reacional na etapa final da síntese.
O esquema o reacional para a síntese de um recipiente de HPG-Cg/10-MePEG | derivatizado com alquila (R) está resumido no Esquema VI. da E ". e“ Ioga ! A Glicidol 105ºC 15º FE v o Éter octil/decilglicidiico — Epóxido de MePEG 350 E ENO Trimetilolpropano, oa pol sá o ' 309 7 sad ela E Lao HPG-Caro-MePEG 120 mg do iniciador (TMP) foram misturados com 1,5 mL
| 60 | .
de solução de metilato de potássio em metanol (25%, p/v) e adicionados a um frasco de fundo redondo com três gargalos sob atmosfera de argônio. A mistura foi agitada a 105 “ºC durante 1 h, depois do que o excesso de metanol foi removido sob vácuo, a seguir, 13 mL de glicidol e 9 mL da mistura O/DGE foram injetados usando uma bomba de seringa a uma vazão de 1,4 mL/h no iniciador. Depois de que toda a mistura de glicidol e O/DGE foi injetada, a reação continuou até cerca de 6 h. A seguir, 0,1 mL de hidreto de potássio (KH) foi adicionado ao frasco. A mistura foi o agitada durante 1h, depois do que 10 mL ou 20 mL de epóxido de MePEG 350 foi adicionado como uma etapa terminal na - síntese de “um recipiente” usando uma bomba de seringa em uma vazão de 1,4 mlL/h. A quantidade de MePEG 350 foi 7 15 adicionada de acordo com a densidade alvo nos HPGs (isto é, 10 mL de MePEG350 é para o alvo de 6,5 mol de MePEG por mol de HPG). A taxa de agitação foi a seguir aumentada até 90 rpm e a reação continuou a ser realizada a 105 ºC de um dia para o outro. Quaisquer traços de éter octil/decilglicidílico que não tenham —"reagido foram removidos por extração com hexano. O produto foi dissolvido o em metanol e neutralizado passando o mesmo três vezes através de uma coluna de troca catiônica (Amberlite IRC - 150, Rohm and Haas Co., Filadélfia, PA). Metanol foi removido sob vácuo e uma solução aquosa do polímero foi, a seguir, dialisada, durante três dias contra a água usando tubulação de diálise de acetato de celulose (MWCO 10.000 g/mol, Spectrum Laboratories), com três trocas de água por dia para remover os epóxidos de MePEG que não reagiram. O polímero seco foi, a seguir, obtido por liofilização. RMN 'H (400 MHz, Dk-DMSO) Su: 0,75-0,82 (-CH;y, TMP); 0,82-0,92 (-CH;-alquila em O/DGE); 1,15-1,55 (-CH>o-, alquila em O/DGE); 2,50 (solvente, Ds;-DMSO); 3,15-3,80 (-CH e -CH;, do núcleo de HPG); 3,23 (-OCH;- de MePEG), 3,32 (água residual); 4,8 (-OH).
HPG-Cg/10 (HPG sem cadeias MePEG) foi preparado por polimerização de multirramificação de abertura de anel aniônico do glicidol do trimetilolpropano (TMP) parcialmente desprotonado usando metilato de potássio. HPG- Cg/10 tem vários grupos terminais de hidroxila, o número por molécula sendo aproximadamente igual ao grau de polimerização. O núcleo do HPG-Cg,190 foi derivatizado com cadeias alquila Cg,19 para criar um núcleo hidrofóbico, para o permitir o carregamento do fármaco, por exemplo, taxanos. | As cadeias de MePEG estavam ligadas aos grupos hidroxila | - nos HPGs. Uma vez que o epóxido MePEG 350 foi adicionado à reação de polimerização após a reação dos outros " 15 componentes, uma parte externa hidrofílica é formada para aumentar a solubilidade aquosa dos HPGs. Experimentos de RMN foram realizados para caracterizar a estrutura dos polímeros de HPG. As frações de MePEG e das cadeias alquila nos HPGs foram estimadas a partir de experimentos de RMN de coerência heteronuclear simples quântica (HSQC) registrados em um espectrômetro de RMN de o 400MHz Bruker Avance utilizando solventes deuterados (Cambridge Isotope Laboratories, 99,8% de D). os deslocamentos químicos foram referenciados para o pico de solvente residual. Os espectros de HSQC foram analisados usando Sparky (T. D. Goddard e D. G. Kneller, Sparky 3, Universidade da Califórnia, São Francisco). As figuras 9 e 10 mostram espectros de próton e de HSQC 2D representativos dos polímeros HPG-Cg,19 e HPG-Cg/10-MePEG. Todos os picos foram atribuídos aos componentes estruturais dos HPGs, usando os espectros de matérias-primas como referência inicial (figura 10B). Os espectros de RMN de próton foram semelhantes àqueles relatados (Kainthan, R.K., Janzen, J.,
Kizhakkedathu, J.N., Devine, D.V., Brooks, D.E., 2008. Biomaterials 29, 1693-1704; Kainthan, R.K., Mugabe, (CC, Burt, H.M., Brooks, D.E., 2008. Biomacromolecules 9, 886- 895). Dados de RMN HSQC confirmaram a estrutura dos HPGs como polímeros hiperramificados com as arquiteturas de ramificação evidentes nos espectros (figuras 9 e 10). As frações de cada um dos substituintes foram calculadas das integrais de volume nos experimentos de HSQC. Comparando as integrais do grupo MePEG metóxi e do grupo O/DGE metila com a integral do grupo TMP CH;3, as frações de O/DGE e MePEG o (mol/mol) foram calculadas para cada polímero de HPG. Os dados de HSQC mostram a ausência dos monômeros de epóxido - que não reagiram (Figura 10), que indicam a ausência de contaminação do polímero por monômeros que não reagiram.
7 15 Os pesos moleculares e as polidispersões dos polímeros de dHPG foram determinadas por cromatografia de permeação em gel com detecção de espalhamento de luz laser multiângulo (GPC-MALLS). Os pesos moleculares foram de cerca de 80.000 g/mol (Tabela 5).
As características físico-químicas dos dHPGs estão resumidas na Tabela 5. oe Tabela 5 As características físicas do HPG-Cg,/10-O0H e HPG-Cg/10-MePEG carregados com PTX e DTX HPGs Estrutura Peso Propriedades térmicas por RMN molecular e (mol/mol capacidade de de HPG) polidispersão MePEG O/DGE M, x M.J/M, Tg Td Tg Tg 10º (ºC)? (º0)? (PTX)? (DTX)? HPG- - 4,7 ND ND —-37,5 338 - Ç Cg/10 HPG- 4,0 4,7 7,6 1,01 -45,2 341 —68,8 -—-68,3
. 63 Cg/107 MePEGç«.5 HPG- 4,6 4,7 8,3 1,22 —-55,4 344 -54,9 -58,4 Cg/107 MePEG:13 "Tg, transição vítrea, tomada no ponto médio da transição *Td, temperatura de degradação tomada na perda de peso máxima ?PTX e DTX foram carregados na capacidade de carregamento máxima de HPG-Cg/10-MePEG o Mw, peso médio do peso molecular determinado por cromatografia de permeação em gel ligado ao detector MALLS - (GPC-MALLS) Mw/Mn Capacidade de polidispersão 7 10 ND, não determinado | EXEMPLO 8: Efeito dos processos de purificação | sobre as propriedades térmicas dos dHPGsS e sobre as estabilidades física e química dos dHPGs carregados com PTX e DTX O efeito de processos de purificação sobre as propriedades térmicas e de degradação dos dHPGs foi o avaliado por calorimetria diferencial de varredura (DSC) e por análise termogravimétrica (TGA). Os DHPGs purificados são referidos como polímeros que passaram por várias etapas de purificação, por exemplo, extração com hexano para remover cadeias alquila Cg/10 que não reagiram, seguido por neutralização através de uma coluna de troca catiônica e, em seguida, diálise.
A análise térmica foi realizada utilizando DSC Q100 e TGA Q50 da TA Instruments.
As análises de DSC foram obtidas por ciclização de amostras pesadas em cadinhos de alumínio hermeticamente selados através de um ciclo de “calor-frio- calor" a 10 ºC/min na faixa de temperatura de -90 a 85 “ºC.
As análises de TGA foram realizadas em um programa de temperatura de rampa constante (20,0 ºC/min até 500 ºC) com uma vazão de gás de 40 mL/min (nitrogênio). A porcentagem em peso em tempo real e a temperatura da câmara de TGA foram registradas.
A análise dos dados foi realizada utilizando o software de análise universal 2000 TA (versão 4,.2E, TA Instruments) para encontrar os pontos de início.
A quantidade de teor de água em dHPGs foi determinada por titulação usando o coulômetro de Karl Fischer DL39 da Mettler Toledo equipado com balança AB104-S.
A quantidade o conhecida de dHPGs foi dissolvida em metanol anidro e titulada com o reagente HYDRANALG-Coulomat (Sigma). OS - resultados finais foram obtidos subtraindo-se a leitura de fundo do metanol anidro. " 15 HPG-Cg/10 & HPG-Cg/10-MePEG exibiram transições vítreas em temperaturas decrescentes de -38 a 55 ºC, conforme o | teor de MePEG aumentando de O (HPG-Cg,/10) a 4,6 mols de | MePEG/HPG (Tabela 5). Observou-se que oO processo de purificação não tem qualquer efeito sobre os valores de Tg dos dHPGs e nenhum efeito significativo foi observado sobre a estabilidade térmica. dHPGs purificados e não purificados oe foram estáveis até uma temperatura de 300 ºC, sem qualquer sinal de decomposição térmica (Tabela 6). O efeito dos processos de purificação sobre as estabilidades física e química dos HPG-Cg/10-MePEG carregados com PTX e DTX também foi avaliado.
Tanto PTX quanto DTX foram carregados em HPG-g/10-MePEG purificado ou não purificado e as estabilidades físicas foram avaliadas observando-se o início da precipitação de fármaco a partir de PBS (pH 7,4). As estabilidades químicas foram avaliadas por LC/MS/MS para determinar as quantidades de PTX e DTX e seus produtos de degradação.
Os processos de purificação afetaram as estabilidades
. 65 física e química dos dHPGsS carregados com PTX e DTX.
O carregamento de PTX e DTX máximos atingíveis foram maiores para os polímeros não purificados, e verificou-se que estas formulações são fisicamente mais estáveis do que as formulações feitas com HPGs purificados (Tabela 6). As amostras “preparadas com polímero não purificado não precipitaram durante vários dias (> 3d), com carga de taxano tão alta quanto 5% (p/p), enquanto que aquelas preparadas com polímero purificado e carga de taxano de 5% (Pp/p) precipitaram dentro de algumas horas, ou oe imediatamente após a constituição em PBS (Tabela 6). No entanto, observou-se que PTX e DTX eram quimicamente - instáveis em dHPGs não purificados e que grandes frações dos taxanos foram degradadas durante a preparação das ' 15 formulações.
Cerca de 75 a 80% de PTX foi degradado imediatamente após o carregamento em HPG-Cg/10-MePEG não purificado, independentemente se ele foi em matriz seca (a granel) ou depois de ele ser reconstituído em PBS (pH 7,4) (Tabela 6). No entanto, uma vez no tampão, a degradação de PTX não ocorreu mais, enquanto que PTX na matriz seca continuou a e se degradar durante 24 h.
A figura 11B mostra um cromatograma de uma formulação de PTX em HPG-Cg,10-MePEG impuro, com um pico correspondendo ao PTX e outros picos resultantes da formação de vários produtos de degradação.
O cromatograma foi obtido de uma formulação dissolvida em acetonitrila imediatamente após a secagem do solvente (por exemplo, no estado a granel, antes da constituição em PBS). Dois degradantes principais foram identificados por LC/MS/MS, com valores m/z de 587 e 854, respectivamente.
Com base nessas massas nos tempos de retenção relativos destes picos, as suas identidades foram consideradas como sendo bacatina III (m/z 587, Figura 11A) e 7-epi-taxol (m/z
854), respectivamente.
Outros produtos de degradação (picos
A e B, figura 11B) também foram observados nas formulações não purificadas.
Com base nos seus tempos de retenção relativos, as áreas dos picos e nos mecanismos de degradação conhecidos dos taxanos, acredita-se que o pico B (figura 11B) seja bacatina V, que é a 7-epi-bacatina III, enquanto que acredita-se que o pico A seja 10- deacetilbacatina III.
Os taxanos carregados em polímeros purificados, no entanto, apresentaram um comportamento diferente.
Verificou-se que o PTX é quimicamente estável o tanto a granel quanto em solução durante vários dias e nenhum degradantes principal foi observado durante a
. preparação das formulações (Tabela 6 e Figura 12C). Observou-se que PTX e DTX em HPGs impuros são rapidamente r 15 degradados e acredita-se que isto seja devido à presença de impurezas básicas nos polímeros não Dpurificados.
As impurezas básicas mais prováveis são oriundas do excesso de metilato de potássio e hidreto de potássio adicionado durante a síntese dos HPGs.
Tanto o metilato quanto o hidreto de potássio são bases fortes e, juntamente com a umidade residual no polímero, poderiam criar um ambiente oe favorável tanto para a epimerização na posição C7 quanto a clivagem do éster de PTX para produzir bacatina III (ou 10- deacetilbacatina III para DTX) (Figura 11A). A medição do pH dos polímeros de dHPG em água destilada mostrou que polímeros não purificados apresentavam um pH básico, enquanto que os polímeros purificados tinham um pH ácido
(devido ao tratamento com Amberlite IRC-150, uma resina trocadora catiônica), um ambiente mais estável para taxanos.
Foi reportado que a estabilidade máxima dos taxanos está na faixa de pH de 3 a 5 (Dordunoo, S.K., Burt,
H.M., 1996. Int.
J.
Pharm. 133, 191-201 ; Tian, J., Stella,
V.J., 2010. JJ.
Pharm.
Sci. 99, 1288-1298). Os polímeros purificados estavam dentro desta faixa de pH (Tabela 6), por isso a melhor estabilidade química dos taxanos carregados.
As cargas de fármaco maiores aparentes e a maior estabilidade física dos taxanos carregados nos polímeros de dHPG não purificados podem ser explicadas pelo fato de que a maioria dos fármacos carregados foram degradados até moléculas menores e mais hidrofílicas (bacatina III e bacatina V) do que os taxanos originais, sugerindo que estas moléculas degradadas foram carregadas de modo mais eficiente nos dHPGs. o Tabela 6 Efeitos da purificação de polímero sobre as propriedades do polímero e sobre a estabilidade física e - química das formulações carregadas com taxano feitas com HPG-Cg/10-MePEG;,3 purificado e não purificado F HPG-Cg/107 HPG-Cg/107 Propriedades do polímero MePEG;; não MePEG3 purificado purificado Tg -55,8 ºC -55,4 ºC Td 310 ºC 344 ºC Teor de água (% p/p) 0,326 + 0,001 2,051 + 0,001 pH (solução aquosa a 10%) 8,5 - 9 4,4 — 4,7 o Estabilidade física (tempo para a precipitação) com o DTX DTX PTX (h) PTX (h) aumento da carga de taxano (% (h) (h) p/p) * 1,0 > 72 > 72 > 12 > 72 2,0 > 72 > 72 1 > 48 3,0 > 72 > 72 o 24 5,0 > 72 > 72 o 1 Estabilidade química de PTX na formulação "a granel" ? (% 26,2 299,8 restante) (t = O) Estabilidade química de PTX Não purificado Purificado
(% restante) (t = 24 h) Na matriz "a granel" 15,6 99,4 Na formulação constituída de PBS pH 7,4 25,8 98,4 + Carregamento com PTX e DTX (% P/P) em HPG-Cg/107 MePEG;; também constituído de uma concentração aquosa equivalente (mg/mL) ? Matriz "a granel" significa o polímero HPG-Cg/10-MePEG:3 carregado com taxano preparado por evaporação de solvente antes da constituição com tampão PBS. t = O para a matriz a o granel é imediatamente após a sua etapa de preparação final, secagem para remover O solvente. º EXEMPLO 9: Efeito de derivatização de MePEG sobre as propriedades térmicas, carga superficial e tamanho de 7 partícula dos dHPGs A análise do tamanho de partículas e do potencial zeta foi realizada utilizando um analisador de tamanho de partículas Malvern NanoZS usando cubetas de dimensionamento descartáveis DTS0012 para cada análise. As soluções poliméricas em uma concentração de 15 mg/mL foram preparadas em NaCl 1 mM e foram filtradas com filtro de o seringa de 0,22 um (PALL Acrodisc 13 mm com membrana de náilon). Os parâmetros de aquisição de amostra foram: o ângulo foi de 173 º de espalhamento reverso com atenuação automática; número de execuções: 11 (10 s/execução); O dispersante foi água a 25 ºC (viscosidade de 0,8872 cP e
1.330 RI); parâmetro de Mark-Houwink A = 0,428 e K = 7,67e" º* cmº/s. Foi considerado que os dHPGs possuem um índice de refração similar ao polietileno glicol (PEG) com um RI =
1.460 e absorção de 0,01. Os dados finais representaram a média de todas as execuções. os tamanhos das partículas de dHPG foram consistentemente menores do que 10 nm de diâmetro, com o
| mo | 69 carregamento de PTX e DTX sem efeito sobre o tamanho do HPG-MePEG (dados não mostrados). HPGs carregados com fármaco formam nanopartículas extremamente pequenas de menos de 10 nm.
A presença de cadeias de MePEG na superfície dos HPGs não teve qualquer efeito significativo sobre a carga da superfície total sobre essas nanopartículas, conforme medido pelos potenciais zeta como a seguir: HPG-Cg/10=-1,29 t+ 0,97 mV; HPG-Cg/10-MePEGs.5 = -0,92 + 1,68 mV; HPG-Cg/107 MePEG;; = 0,18 + 0,16 mV.
o Efeitos sobre a temperatura de transição vítrea com o aumento da densidade de MePEG foram observados. A Tg . diminuiu de -37,5 ºC para o polímero HPG-Cg/10 até -45,2 e - 55,4 “ºC para o HPG-Cg/1o-MePEG.s Ee HPG-Cg/10-MePEG:3, 7 15 respectivamente (Tabela 5). O carregamento com PTX ou DTX ' também diminuiu a Tg (Tabela 5).
; EXEMPLO 10: Carregamento, Quantificação e Estabilidade do PTX e DTX em dHPGs e liberação de PTX e DTX dos dHPGs PTX ou DTX e dHPGs foram dissolvidos em 1 mL de solução de acetonitrila em frascos de 4 mL e secos em oe estufa a 60 ºC durante 1 h, e esguichados com nitrogênio para eliminar traços do solvente orgânico. A matriz de dHPG/taxano resultante foi hidratada com 1 mL de salina tamponada com fosfato 10 mM quente a 50 ºC (PBS, pH 7,4) e submetida ao vórtice durante 2 min. As soluções resultantes foram em geral límpidas, mas nos casos onde foram observadas partículas brancas, as soluções foram centrifugadas (18.000 x g durante 10 minutos) e os sobrenadantes foram transferidos para novos frascos.
A quantidade de PTX e DTX incorporada nos HPGs foi determinada por HPLC de fase reversa como descrito anteriormente (Jackson, J.K., Smith, J., Letchford, K.,
Babiuk, K.A., Machan, L., Signore, P., Hunter, W.L., Wang, K., Burt, H.M., 2004. Int.
J.
Pharma. 283, 97-109). 100 ul de solução de dHPG/PTX ou DTX foram dissolvidos com 900 ul de acetonitrila/água (60:40, v/v) e transferidos para frascos de HPLC (Canadian Life Science, Peterborough, ON). A análise do teor de fármaco foi realizada usando uma coluna de simetria C18 (Waters Nova-Pak, Milford, MA) com uma fase móvel contendo uma mistura de acetonitrila, água e metanol (58:37:5, v/v/v) em uma vazão de 1 mE/min.
Os volumes de injeção da amostra foram de 20 ul e a detecção o foi realizada usando a detecção por UV no comprimento de onda de 232 nm.
HPG-Cg,19h apresentou uma solubilidade em - água limitada resultando em um baixo carregamento de fármaco de taxanos (dados não mostrados). A presença de 7 15 cadeias alquila (Cg10) em dHPGs é importante para o carregamento de fármacos hidrofóbicos, no entanto, isto também reduz significativamente a solubilidade em água dos mesmos.
Para aumentar a solubilidade em água dos HPGs, cadeias de MePEG 350 foram adicionadas na fase terminal da reação durante a síntese destas moléculas.
Um aumento relativamente pequeno na quantidade de MePEG nos dHPGs oe resultou em um maior carregamento de fármacos de HPG-Cg/107 MePEG;; tanto para PTX quanto para DTX.
O carregamento de DTX nos HPGs foi maior do que para o PTX. dHPGs carregados com DTX apresentaram maior estabilidade física do que as formulações de PTX.
O carregamento máximo de DTX (5%, p/p)
foi maior do que para o PTX em HPG-Cg/10-MePEG:3 (2%, p/p). As estabilidades física e química dos dHPGs carregados com taxano foram avaliadas.
A estabilidade física foi avaliada através da observação visual da limpidez das formulações, onde a precipitação em menos de 24 horas foi considerada uma formulação fisicamente instável.
As amostras foram observadas imediatamente por meio da reidratação em PBS (t = O), ou depois de 1, 3, 6, 24, 48 e 72 h em temperatura ambiente. As estabilidades químicas do PTX e DTX foram monitoradas pelo método de HPLC, como descrito acima. os produtos de degradação foram identificados por análise de espectrometria de massa usando o espectrômetro de massa TQD da Waters. O sistema foi operado a uma temperatura de bloco da fonte iônica de “electrospray” de 150 ºC, uma temperatura de dessolvatação de 350 ºC, uma voltagem de cone de 45 KV, uma voltagem capilar de 0,70 KV, uma voltagem do extrator de 3 KV, uma o voltagen de RF de 0,1 KV, um fluxo de gás do cone de 25 L/h, um fluxo de gás de dessolvatação de 600 L/h e um fluxo . de gás de colisão de 0,2 mL/min. As moléculas sofrem ionização por electrospray no modo de íon positivo.
7 15 A liberação de PTX e de DTX dos dHPGs foi determinada por um método de diálise. 100 mg de dHPGs (HPG-Cg/10-MePEGç«,5s ou HPG-Cg/10-MePEG;3) foram pesados e misturados com 1 mg de PTX ou DTX em 1 mL de solução de acetonitrila, reforçado com 15 uci de *H-DTX ou *H-PTX (15 ul) e seco sob fluxo de nitrogênio para remover o solvente. Os fármacos radioativos (H-DTX ou H-PTX) foram obtidos junto à Moravek Biochemicals o and Radiochemicals (Brea, CA). A matriz de dHPGs/taxano foi hidratada com 2 mL de PBS e transferida para bolsas de diálise e dialisada contra 500 mL de urina artificial (pH 4,5 ou 6,5) com agitação a 100 rpm. A tubulação da membrana de diálise foi comprada de Spectrum Laboratories (Rancho Dominguez, CA). Urina artificial foi preparada de acordo com o método de Brooks et al. (Brooks, T., Keevil, C.W.,
1997. Lett. Appl. Microbiol. 24, 203-206), sem adição de peptona ou extrato de levedura. O pH da solução foi ajustado para o pH 4,5 e/ou 6,5 usando HCl 0,1 M. Em diferentes pontos de tempo, os volumes das bolsas de diálise foram medidos e uma amostra de 10 pL foi tomada
| para medição da radioatividade remanescente nas bolsas de diálise e o meio de liberação externo foi trocado com meio fresco para manter as condições do escoadouro.
A concentração de *H-DTX ou de 'H-PTX restante na bolsa de diálise em cada ponto de tempo foi determinada por contagem de cintilação beta (Beckman Coulter Canada, Mississagua, ON). A porcentagen cumulativa de fármaco liberado foi calculada subtraindo a quantidade do fármaco remanescente em cada ponto de tempo da quantidade inicial do fármaco no início do experimento.
Os dados foram expressos como o porcentagem cumulativa de fármaco liberado em função do tempo.
Os dados representam a média (SD) de três
- experimentos independentes.
O pH da urina é geralmente ácido, mas sabe-se que ele 7 15 varia ao longo de uma vasta faixa (pH 4,5 a 8), por isso o efeito do pH sobre os perfis de liberação de PTX e DTX carregado em HPG-Cg/10-MePEG foi avaliado.
Os perfis de liberação dos taxanos do HPGs foram caracterizados por uma contínua liberação controlada e pouca ou nenhuma fase de irrompimento de liberação, seguido por uma fase de liberação sustentada mais lenta.
DTX foi liberado mais o rapidamente do que PTX (liberação de fármaco de 75% vs 50% depois de 2 dias) do HPG-Cg/1o0-MePEG e quase todo o DTX foi liberado em 6 a 7 dias, em comparação com 12 a 14 dias para o PTX.
Acredita-se que isto se deve à maior hidrofilicidade do DTX, enquanto que a maior hidrofobicidade do PTX pode ter maior compatibilidade e interações com as cadeias alquila (Cs8/Ciw) do núcleo HPG, levando a um ritmo mais lento de liberação de fármaco.
Foi observado que aumentos na densidade do MePEG no HPGs não têm efeito sobre a liberação dos fármacos (Figura 13A). Foi observado que alterações no pH do meio de liberação (pH 4,5 a 6,5) não têm efeito sobre a liberação do fármaco das nanopartículas de HPG-Cg/10-MePEG (Figura 13B). A avaliação dos perfis de liberação de PTX e DTX das nanopartículas de HPG usando vários modelos cinéticos (incluindo o modelo de primeira ordem, de Higuchi e de Korsmeyer) indicou que tanto a cinética de primeira ordem quanto a de Higuchi proporcionam o melhor ajuste com rº = 0,98 - 0,99 (dados não mostrados). Não houve diferença estatística entre as formulações em termos de taxa de liberação de fármaco (dados “não mostrados). EXEMPLO 11: Marcação com rodamina de HPG-Cg/10-MePEG:3 e o absorção celular de HPG-Cg/10-MePEG;;3 marcado com rodamina HPG-Cg/10-MePEG:i3 foi covalentemente marcado com azida . de tetrametilrodamina-S-carbonila (TMRCA) de acordo com o método de Huang et al. com pequenas modificações (Huang, 7 15 S.N., Phelps, M.A., Warley, PW, 2003. J.
Pharmacol.
Exp.
Ther. 306, 681-687). 500 mg de HPG-Cg/10-MePEG;; foram dissolvidos em 5 mL de 1,4-dioxano anidro.
Uma quantidade apropriada de TMRCA foi dissolvida em 1,4-dioxano anidro para fornecer uma concentração final de 1 mg/ml.
Uma alíquota de 6175 uL desta sonda fluorescente, que corresponde a aproximadamente 20% em mol de HPG, foi oe adicionada à solução de HPG-Cg/10-MePEG:3; e aquecida a 80 “ºC em banho de óleo fluxo de nitrogênio com agitação durante 5h.
A solução foi dialisada contra DMF (MWCO 12.000-14.000) até o dialisado estar incolor e, em seguida, foi dialisada contra água destilada durante 24 h.
O polímero marcado fluorescente (HPG-Cg/10-MePEG:3- TMRCA) foi liofilizado e armazenado a -80 ºC em frascos âmbar.
As células KU7 foram deixadas crescer em Várias lamínulas de microscópio de 1 cm x 1 cm no fundo de uma placa de Petri de 10 cm até uma confluência de -75% ser atingida, que corresponde a um número de células de aproximadamente 7 x 10º células.
Estas lamínulas contendo células foram lavadas com PBS aquecido três vezes e, em seguida, colocadas em placas de Petri revestidas com parafilme com o lado com as células para cima. 250 pL da solução de HPG-Cg/10-MePEG:;-TMRCA (1 mg/ml dissolvido em meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM)) foram adicionados às lamínulas.
As células foram incubadas com HPG-Cg/,107 MePEG;,3-TMRCA durante 1, 4, 8 e 24 h.
Para os controles, as células —KU7 foram incubadas em DMEM sem qualquer suplementação.
As lamínulas foram a seguir lavadas quatro vezes vigorosamente com tampão PBS, o excesso de PBS marcou o suavemente e 250 ul de paraformaldeido 3,7% foram adicionados para fixar as células durante 10 min.
As - lamínulas foram lavadas por mais três vezes com PBS e submersas em água.
Após a marcação com excesso de líquido, ' 15 as células foram coradas com reagente antidesbotamento Prolong” Gold com DAPI (Molecular Probes, Invitrogen) e as lamínulas foram montadas com o lado da célula para baixo nas lâminas de vidro de microscópio.
As bordas das lamínulas foram seladas por esmalte de unha claro para evitar a secagem.
As amostras foram incubadas no escuro de um dia para o outro para garantir a coloração adequada das oe células.
As amostras foram observadas sob um microscópio confocal invertido Olympus EFV-1000 equipado com filtros DAPI (Ac. 340-380 nm; Aem, 435-485 nm; divisor dicroico, 400 nm) e rodamina (Ae, 530-560 nm; Aem, 590-650 nm; divisor dicroico, 570 nm). Contraste direto (DIC) também foi realizado para visualizar as membranas celulares e foi ativado com um laser de 405 nm.
A fim de mostrar claramente que o polímero marcado estava dentro da célula, as imagens foram analisadas por fluorescência e DIC.
A absorção celular de HPG-Cg/10-MePEG;3 marcado com rodamina (HPG-Cg/10-MePEG,3-TMRCA) foi visualizada por | microscopia confocal de células KU7. Após uma hora de a o PR A | 7s incubação, houve evidências de absorção do HPG-Cg/10-MePEG:3- TMRCA nas células KU7. Imagens representativas da absorção do HPG-Cg/10-MePEG;3-TMRCA em 1 h são mostradas na Figura 14. O quadro A mostra as células KU7 não tratadas com um corante DAPI, permitindo a visualização dos núcleos em azul (mostrado “como branco na imagem). A imagem é uma superposição de um sinal de contraste direto (que mostra o | contorno da célula) e os sinais de fluorescência, que mostram o núcleo (branco), e a ausência de qualquer outra fluorescência. O quadro (B) mostra as células KU7 que foram o incubadas durante 1 h com nanopartículas de HPG-Cg/,107 MePEG;3-TMRCA. A presença de HPG-Cg,10-MePEG;;3-TMRCA no - citoplasma é mostrada por fluorescência vermelha do polímero ao redor do núcleo (corado de azul com DAPI) 1 15 (fluorescência vermelha mostrada como uma parte branca na imagem. A fluorescência vermelha ao redor do núcleo é mostrada como uma parte escura na imagem). A pilha z da mesma população de células do quadro B (imagem da pilha z não mostrada) demonstrou que as nanopartículas fluorescentes vermelhas estão presentes em todo o citoplasma, ao invés estarem apenas aderidas a ou presentes | o na membrana celular. Essas nanopartículas pareceram estar | distribuídas uniformemente no citoplasma, embora algumas estruturas pontilhadas foram observadas, indicando que as nanopartículas de HPG-Cg/10-MePEG;,;-TMRCA foram empacotadas em pequenas vesículas para o tráfego celular. Não houve fluorescência do polímero detectado no compartimento nuclear das células KU7. As nanopartículas de HPG-Cg/107 MePEG;;-TMRCA não têm efeito sobre a viabilidade e a | prevalência das células KU7 em comparação com as células de controle em todos os pontos de tempo, indicando que essas nanopartículas foram altamente biocompatíveis com esta | linhagem celular. As nanopartículas de HPG-Cg/10-MePEG:3- |
Í | ]
TMRCA foram absorvidas pelas células KU? por 1 h de incubação e não foram observadas diferenças nas imagens obtidas nos pontos de tempo de 1, 4, 8 ou 24 h.
EXEMPLO 12: Estudos de citotoxicidade in vitro de HPG-Cg/10-MePEG HPG-Cg/10-MePEG foi preparado de acordo com os protocolos relatados por Kainthan RK, Mugabe C, Burt HM, Brooks DE.
Biomacromolecules, 9(3), 886-895 (2008) ) conforme descrito acima.
RMN 'H (400 MHz, D«-DMSO) SH: 0,75- 0,82 (-CH;y, TMP); 0,82-0,92 (-CH;-alquil em O/DGE); 1,15- o 1,55 (-CH-, alquila em O/DGE); 2,50 (solvente, D«-DMSO); 3,15-3,80 (-CH e -CH-, do núcleo de HPG); 3,23 (-OCH3;- de - MePEG), 3,32 (água residual; 4,8 (-OH). As frações de cadeias de MePEG e alquila em HPGs foram ' 15 estimadas a partir de experimentos de RMN de coerência heteronuclear simples quântica (HSQC). Os deslocamentos químicos foram referenciados para o pico de solvente residual.
Os pesos moleculares e as capacidade de polidispersão dos polímeros foram determinados por cromatografia de permeação em gel com detecção de espalhamento de luz laser multiângulo (GPC-MALLS): peso o molecular = 83.000 g/mol com uma capacidade de polidispersão de 1,22 (dados não mostrados). A análise de tamanho de partícula foi realizada utilizando um analisador de tamanho de partícula NanozS da Malvern.
HPG-Cg/190-MePEG carregado com fármaco formou nanopartículas de menos de 10 nm (7,5 + 3,4 a 7,8 + 2,7 nm, dados não mostrados). dHPGs carregados com PTX ou DTX foram preparados dissolvendo PTX (1 mg) ou DTX (0,5 mg) e HPG-Cg/,10-MePEG (100 mg) em 1 ml de solução de acetonitrila em frascos de 4 mL e secos em uma estufa a 60 ºC durante 1h e foram esquichados com fluxo de nitrogênio para eliminar traços do solvente orgânico.
Paclitaxel (PTX) em pó foi obtido junto à Polymed Therapeutics, Inc. (Houston, TX). Docetaxel (DTX) em pó foi obtido junto à Natural Pharmaceuticals Inc. (Beverly, MA). A matriz HPG-Cg/10-MePEG/taxano resultante foi hidratada com 1 mL de salina tamponada com fosfato 10 mM (PBS, pH 6) e foi agitada em vórtice durante 2 min.
AS quantidades de PTX e DTX incorporada no HPG-Cg/10-MePEG foram determinadas por HPLC de fase reversa.
PTX e DTX podem ser carregados com elevadas cargas de fármacos (carga | 10 máxima de 2 e 5% p/p, respectivamente) pelo método de
| o evaporação do solvente.
Os efeitos citotóxicos das formulações comerciais, - Taxol6 e Taxotereoê e das formulações de HPG-Cg/10-MePEG carregadas com PTX e/ou DTX contra a linhagem celular KU7- 7 15 luc, e linhagens celulares de carcinoma urotelial humano de baixo grau (RT4, MGHU3) e de alto grau (UMUC3) foram avaliados.
TaxolO foi obtido de Bristol-Myers-Squibb (Princeton, NJ). TaxotereG foi adquirido da Sanofi-Aventis Canada Inc. (Laval, Quebec). As linhagens de células cancerosas da bexiga humana RT4 e UMUC3 foram compradas da American Type Culture Collection.
As células foram mantidas oe em meio McCoy (Invitrogen, Burlington, Ontário) contendo 10% de soro bovino fetal inativado por aquecimento e mantidas a 37 ºC em uma atmosfera de CO; umidificada.
As células MGHU3 foram obtidas como um presente generoso do Dr.
Y.
Fradet (L'Hotel-Dieu de Quebec, Quebec, Canadá) e mantidas em MEM suplementado com 10% de soro bovino fetal e L-glutamina 2 mM (Invitrogen) . KU7 foi gentilmente fornecido pelo Dr.
C.
Dinney (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, EUA) e mantida em DMEM contendo 5% de soro bovino fetal.
Para fins de visualização, as células KU7 foram infectadas com um lentivírus contendo o gene da luciferase de vaga-lume, pelo Dr.
Graig Logsdon (M.D.
Naa — = 78 | . | | Anderson Cancer Center, Houston, Texas, EUA), e estes | subclones foram chamados de KU7-luc conforme relatado anteriormente (Hadaschik BA, Black PC, Sea JC et al.
BJUInt, 100(6), 1377-1384 (2007)). As células foram plaqueadas em 5.000 células/poço em placas de 96 poços em um volume de 100 ul de suplementado de meio McCoy com FBS a 10% e permitido equilibrar durante 24 h antes das soluções recém-preparadas de Taxol6; Taxotere6; HPG-Cg/10-MePEG carregado com PTX; ou HPG-Cg/10-MePEG carregado com DTX serem adicionados.
As células foram expostas às formulações o de fármaco durante 2h para simular o padrão clínico atual de terapia de instilação, e a viabilidade celular foi - determinada após 72 h usando o ensaio de proliferação de células não radioativo aquoso (MTS) CellTiter96 (Promega, ' 15 Madison, WI), conforme anteriormente relatado (Hadaschik BA, ter Borg MG, Jackson et al.
BJU Int, 101 (11), 1347- 1355 (2008)). Cada experimento foi repetido três vezes e os valores de MTS ficaram dentro de uma faixa de absorvância linear para todas as linhagens celulares.
Todas as formulações resultaram na inibição dependente de concentração da proliferação de todas as linhagens oe celulares testadas (Figura 15). As formulações DTX foram mais citotóxicas do que as formulações PTX, embora não houve diferenças significantes entre os grupos (P > 0,05 ANOVA 1 fator). A ICso do Taxotere& foi cerca de duas a cinco vezes menor do que a do TaxolO.
Verificou-se que nanopartículas de HPG-Cg/1o-MePEG carregadas com PTX e DTX são tão citotóxicas quanto as formulações comerciais de Taxol&O e Taxotereb, respectivamente (Figura 15). As nanopartículas HPG-Cg/10-MePEG de controle (sem fármaco) não apresentaram citotoxicidade em toda a faixa de concentração de 15 a 1.500 nM (dados não mostrados), enquanto que foi demonstrado que Cremophor-ELG e Tween 80 são tóxicos para
; | as células mesmo em baixas concentrações (Iwase K, Oyama Y, | Tatsuishi T et al.
Toxicol Lett, 154(1-2), 143-148 (2004); | Henni-Silhadi W, Deyme M, Boissonnade MM et al.
Pharm Res, 24(12), 2317-2326 (2007)). | 5 EXEMPLO 13: Eficácia de formulações de PTX e DTX intravesicais no modelo ortotópico do câncer de bexiga Estudos in vivo foram feitos em um total de 60 camundongos nus para avaliar a eficácia do TaxolO intravesical (1 mo/mL, Bristol-Myers-Squibb); TaxotereO (0,5 mg/mL, Sanofi-Aventis); HPG-Cg/10-MePEG carregado com o PTX (1 mg/ml); e HPG-Cg/1o-MePEG carregado com DTX (0,5 mg/ml) em um modelo de xenoenxerto de camundongo de câncer . de bexiga.
Este modelo de camundongo ortotópico foi reportado (Mugabe C, Hadaschik BA, Kainthan RK et al.
BJU : 15 Int, 103(7), 978-986 (2009); Hadaschik BA, Black PC, Sea JC et al.
BJU Int, 100(6), 1377-1384 (2007); Hadaschik BA, ter Borg MG, Jackson J et al.
BJU Int, 101(11), 1347-1355 (2008) ) . Estudos em animais foram realizados de acordo com o Canadian Council on Animal Care.
Camundongos nus do sexo feminino de onze semanas de idade (Harlan, Indianapolis, IN) foram anestesiados com isoflurano.
Uma sutura oe superficial em bolsa de polipropileno 6-0 foi colocada ao redor do canal uretral antes de um angiocateter 24 G Jelco lubrificado (Medex Medical Ltd., Lancashire, Reino Unido) passar pela uretra para dentro da bexiga.
Após uma única irrigação da bexiga com PBS, dois milhões de células KU7- luc foram instiladas como uma suspensão celular única em 50 ul e a sutura em bolsa foi amarrada durante 2,5 h.
Para quantificar a carga tumoral in vivo, os animais foram fotografados em posição supina 15 min após a injeção intraperitoneal de 150 mg/Kg de luciferina nos dias 4, 11, 18, 25 e 33 com um Sistema de Visualização IVIS200 (Xenogen/Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Os dados foram obtidos e analisados utilizando o software Living Image (Xenogen). No dia cinco após a inoculação do tumor, os camundongos foram distribuídos aleatoriamente para receber um tratamento intravesical de 50 QpL com PBS (controle); HPG-Cg/10-MePEG (sem fármaco); TaxolO (1 mg/mL); HPG-Cg/10-MePEG carregado com PTX (1 mg/mL); TaxotereO (0,5 mg/ml); e HPG-Cg/1o0-MePEG carregado com DTX (0,5 mag/mL). A terapia intravesical foi administrada no dia 5 e no dia 19 após a inoculação do tumor. Os níveis de bioluminescência foram equivalentes entre os grupos; no entanto, como o tumores variaram entre ratos individuais, para análises estatísticas, a bioluminescência do tumor após o tratamento - foi normalizada contra o fluxo inicial no dia quatro de cada camundongo. A necropsia foi realizada no dia 33 após a 1 15 inoculação do tumor. As bexigas inteiras foram removidas, fixadas em 10% de formalina tamponada e embebidas em parafina. Seções de 5 um foram preparadas e coradas com H&E usando técnicas padrão. Todas as lâminas foram revistas e verificadas em uma estação de visualização de microscópio BLISS (Bacus Laboratories Inc., Lombard, IL). Após a inoculação intravesical das células cancerosas KU'7-luc, oe todos os camundongos desenvolveram tumores de bexiga. No entanto, dois camundongos não se recuperaram da anestesia e morreram no mesmo dia da inoculação tumoral. Um camundongo na ramificação Taxotere6 foi encontrado morto no último dia da visualização (dia 33 após a inoculação do tumor), este rato tinha o maior tumor no grupo nas medições anteriores.
Outro camundongo em HPG-Cg/10-MePEG carregado com DTX foi eutanasiado devido à perda de peso irreversível (perda de peso de 15%). Para análise estatística, estes camundongos foram excluídos do estudo. Em geral, PTX e DTX intravesical, quer o Taxol6 e o Taxotere& comerciais ou as formulações —HPG-Cg/10-MePEG foram bem toleradas pelos camundongos e nenhuma toxicidade maior ou perdas de peso foram observadas.
A terapia intravesical foi administrada no dia 5 e no dia 19 após a inoculação do tumor.
Em comparação com camundongos de controle (PBS e HPG-Cg/10- MePEG vazio), HPG-Cg/10-MePEG carregados com PTX e DTX inibiram significativamente o crescimento tumoral (P < 0,001, ANOVA bicaudal, pós-testes de Bonferroni) (Figura 16). Ao contrário do Taxotere GO, Taxol O (1 mg/mL) diminuiu significativamente o crescimento tumoral (P < 0,01, ANOVA bicaudal, pós-testes de Bonferroni) em comparação com os o grupos de controle (PBS & HPG-Cg10-MePEG Vazio). No entanto, nenhuma diferença significativa foi observada - entre os ramos de tratamento com Taxotere& e Taxolo.
Doses de instilação intravesical de PTX (1 mg/ml) e DTX (0,5 | ' 15 mg/ml) foram escolhidas com base em um relatório anterior com PTX (Mugabe C, Hadaschik BA, Kainthan RK et al.
BJU | Int, 103(7), 978-986 (2009)) e os dados de citotoxicidade in vitro demonstraram que DTX é mais potente do que PTX (Figura 15). No final do estudo, Oo crescimento tumoral em nanopartículas de HPG-Cg/10-MePEG carregadas tanto com PTX quanto com DTX foi inibido por 87 e 97%, respectivamente, oe em comparação com o grupo de controle de PBS.
Taxotere6 e Taxol6 exibiram uma inibição de crescimento tumoral de 43 de 65%, respectivamente.
Imagens de bioluminescência representativa dos camundongos ao longo do tempo em cada grupo de tratamento são mostradas na Figura 17. O exame histológico dos tecidos da bexiga mostraram que os tumores KU7-luc exibiram um padrão de crescimento agressivo e frequente multifocalidade, mas após 33 dias da inoculação do tumor, à maioria dos tumores nos ramos de tratamento | estavam geralmente confinados à própria lâmina e se correlacionaram com à doença no estágio pTl de alto grau
(Figura 18).
Especula-se que a baixa faixa de tamanho nanométrico dos HPGs pode permitir a penetração entre cadeias de mucina e o contato das células guarda-chuva do urotélio, levando à endocitose intensificada dessas nanopartículas na parede da bexiga, incluindo tecidos tumorais. Também é possível que as cadeias MePEG da superfície nos HPGs podem interagir com as glicoproteínas de mucina através do entrelaçamento de cadeias, resultando no aprisionamento dessas nanopartículas nas camadas de mucina, levando ao maior tempo de residência das nanopartículas carregadas com fármaco na bexiga. A o tabela 7 mostra que nanopartículas de HPG-Cg/10-MePEG carregadas com PTX e DTX exibiram um acúmulo de tecido da - bexiga de 2 a 3 vezes maior do que as formulações comerciais de Taxol6 ou TaxotereO.
' 15 EXEMPLO 14: Farmacocinética Para avaliar as propriedades farmacocinéticas das formulações de PTX e DTX intravesicais, os camundongos foram instilados com TaxolO (1 mg/ml, n = 3); Taxotere6 (0,5 mg/ml, n = 4); e/ou HPG-Cg/10-MePEG carregado com PTX (1 mg/ml, n = 4); e/ou HPG- Cg/w1- MePEG carregado com DTX(0,5 mg/mL, n = 4). Amostras de sangue da cauda foram oe coletadas em 0, 30 e 60 min após a instilação intravesical. Durante este período, os camundongos foram ainda anestesiados com isoflurano. Após 2 h, todos os camundongos foram mortos usando asfixia por CO, e mais sangue foi removido por punção cardíaca. As amostras de sangue foram centrifugadas em tubos de microematócrito (Fisher Scientific, Pittsburg, PA) ou tubos de separação de soro (Becton Dicknson) e o soro foi congelado rapidamente em nitrogênio líquido. Urina e a bexiga de cada camundongo também foram coletados e, antes de congelar, as bexigas foram abertas por corte para expor o lúmen e elas foram vigorosamente lavadas em cinco lavagens sequenciais com 10 mL de PBS. Todas as amostras foram armazenadas a -80 ºC. O sistema de UPLC-MS/MS utilizado para a análise consistiu de um sistema de separação integrado Acquity UPLC da Waters acoplado a uma análise de espectrometria de massa usando o espectrômetro de massa TQOD da Waters. O sistema foi operado em uma temperatura de bloco de fonte iônica de electrospray de 150 ºC, uma temperatura de dessolvatação de 350 ºC, uma voltagem de cone de 14 V, uma voltagem capilar de 0,70 kV, uma voltagem do extrator de 3 KV, voltagem RF de 0,1 KV e um fluxo de gás do cone a 25 L/h, um fluxo de gás de o dessolvatação a 600 L/h e um fluxo de gás de colisão de 0,2 mL/min. As moléculas sofrem ionização por electronspray no - modo de íon positivo. DTX foi extraído do soro de camundongo pelo método de extração por solvente/solvente.
Í 15 alíquotas de 50 1yuL de plasma de camundongo e padrões foram misturadas com 150 pb de ácido fórmico 0,1% em acetonitrila em uma placa com 96 poços e agitado em vórtice durante 1 min em temperatura ambiente. As amostras foram centrifugadas a 5.500 rpm (centrífuga Allegra” 25 R, Beckman-Coulter) durante 10 min a 4 ºC. Em seguida, 100 ul do sobrenadante foram misturados com 50 unuL de água oe destilada, misturado e agitado em vórtice durante 30 s. Os tecidos da bexiga foram pesados e homogeneizados em ácido fórmico 0,1%/metanol usando pérolas de zircônia (Biospec Products) e o misturador de minipérolas equipado com um recipiente de microtubo (Biospec Products) durante 60 s. As amostras foram centrifugadas a 14,000 rpm (centrífuga Allegra” 25 R, Beckman-Coulter) durante 2 min a 4 ºC. 150 mL de ácido trifluoracético em metanol 0,1% foram adicionado para as amostras, misturadas e agitadas em vórtice a 14.000 rpm (centrífuga Allegra" 25 R, Beckman Coulter) por 15 min a 4 º C. Todas as análises de amostra foram realizadas usando UPLC-MS/MS. o limite de quantificação para DTX foi 10 ng/ml, com uma recuperação de 97% das amostras de controle reforçadas.
Várias amostras de soro tinham níveis não detectáveis ou não quantificáveis.
Em geral, os níveis no soro de PTX e de DTX foram baixos (5-20 ng/mL) após a instilação intravesical.
Não houve diferenças significativas (P > 0,05) nos níveis no soro entre os diferentes grupos e/ou nos diferentes pontos de tempo (Tabela 7). No entanto, os níveis de tecido de bexiga foram cerca de 100 a 500 vezes maiores do que os níveis no soro.
Nanopartículas de HPG- o Cg/10-MePEG carregadas com PTX e DTX exibiram um acúmulo de tecido da bexiga de 2 a 3 vezes maior do que as formulações . comerciais, embora as diferenças não foram estatisticamente significativas (P > 0,05, ANOVA 1 fator, teste de 7 15 comparações múltiplas de Bonferroni). As concentrações de fármaco finais na urina eram de cerca de 3 a 5 vezes menores do que as soluções de dosagem iniciais.
Isto foi devido à diluição da urina durante o período de 2h de instilação intravesical.
No entanto, não houve diferença significativa (P > 0,05, ANOVA 1 fator) nas concentrações de urina final de PTX e DTX entre grupos de tratamento o diferentes.
Em geral, os níveis no soro de PTX e de DTX foram baixos (5-20 ng/ml) após a instilação intravesical.
Não houve diferenças significativas (P > 0,05) nos níveis no soro entre os diferentes grupos e/ou nos diferentes pontos de tempo (Tabela 7). Tabela 7 Farmacocinética das formulações de PTX e DTX intravesicais em xenoenxertos ortotópicos Formulações de Curina” Chexiga” Csoro' (ng/mL) taxano (pg/mL) (pog/g) 1h 2h (No. de camundongos) Taxol6 (3) 303,2 + 2,93 4 8,11 5,49 101,7 0,69
Taxotereº (4) 134,3 + 1,22 + 13,97 + 16,02 79,2 0,88 4,8 | PTX/HPG-Cg/10-MePEG 188,4 + 7,38 + 16,02 19,36 + | (4) 38,6 4,16 14,10 DTX/HPG-Cg/10-MePEG 180,4 + 3,60 + 9,47 13,74 + (4) 60,5 1,07 3,0 *Concentração final na urina do camundongo após 2h de instilação intravesical medido por HPLC “Concentração de PTX ou DTX no tecido da bexiga de camundongo após a instilação intravesical de 2 h medido por o 5 LC/MS/MS *Concentração de PTX ou DTX no soro de camundongo tomado no - soro 2 h após a instilação intravesical medida por LC/MS/MS Os dados mostrados são a média + DP ' EXEMPLO 15: Síntese do HPG-Cg/10-MePEG e de HPG-Cg/10" MePEG-NH, HPG-Cg/10-MePEG foi preparado de acordo com o protocolo descrito no exemplo 7. RMN 'H (400 MHz, D«-DMSO) 3H: 0,75- 0,82 (-CH3, TMP); 0,82-0,92 (-CH3-alquila em O/DGE); 1, 15- 1,55 (-CH2-, alquila em O/DGE); 2,50 (solvente, Dç«-DMSO); 3,15-3,80 (-CH e -CH-, do núcleo de HPG); 3,23 (-OCH;- de o MEePEG), 3,32 (água residual; 4,8 (-OH). HPG-Cgs/10-MePEG-NH, com várias quantidades alvo de substituição de amina foram sintetizadas usando o procedimento abaixo.
As quantidades de reagentes utilizados estão resumidas na Tabela 8. As substituições de amina alvo representam o número alvo de mols de NH> por mol de HPG e são denotadas por HPG-Cg/107 MePEG-NH7s>,.,, onde x é 61, 121 e 161 mols de NH> por mol de HPG.
HPG-Cg/10 MePEG foi dissolvido em 15 mL de 1,4-dioxano anidro.
Hidreto de potássio (KH) foi rinsado com hexano anidro três vezes para remover o óleo mineral e seco sob vácuo.
A solução polimérica foi combinada com o KH e agitada em temperatura ambiente até que uma solução límpida se formou.
N-(2,3-epoxipropil)ftalimida) (EPP) (Sigma- Aldrich) foi seca por dissolução em diclorometano com agitação de um dia para o outro em Na;SO0,s ou MgSOs.. A solução foi filtrada e seca sob vácuo para remover o diclorometano.
O EPP seco foi dissolvido em 1,4-dioxano anidro e adicionado ao polímero com agitação de um dia para o outro a cerca de 85 a 90 ºC.
O produto foi neutralizado por passagem do mesmo três vezes através de uma coluna de resina trocadora catiônica (Amberlite IRC-150) e, em seguida, precipitado três vezes do éter para remover EPP o que reagiu.
A clivagem da função ftalimida foi conseguida por hidrazinólise com monoidrato de hidrazina.
O excesso da - solução de monoidrato de hidrazina (2 mL) foi adicionado à solução do polímero em metanol e a mistura foi submetida a ' 15 refluxo por 72 h.
Depois do refluxo, o metanol foi evaporado, o polímero foi dialisado contra água usando uma membrana de MWCO:10.000 durante 48 h e liofilizado.
RMN 'H (400 MHz, Ds«.-DMSO) 3H: 0,75-0,82 (-CH;, TMP); 0,82-0,92 (- CH;-alquila em O/DGE); 1,15-1,55 (-CH;-, alquila em O/DGE); 2,50 (solvente, Ds-DMSO); 2,60-2,80 (-CH>-NH;) 3,15-3,80 (- CH e -CH;-, do núcleo de HPG); 3,23 (-OCH;- de MePEG). O o esquema reacional para a modificação da superfície de alguns dos grupos hidroxila (10 a 20%) no polímero HPG- Cg/10-MePEG com N- (2, 3-epoxipropil)-ftalimida) (EPP), seguido por clivagem dos grupos funcionais de ftalimida por hidrazinólise para produzir HPG-Cg/10-MePEG-NH, é resumido no Esquema VII (R representa o núcleo hidrofóbico baseado na mistura das cadeias alquila (Cs8/Cio). () 7, representa a parte externa hidrofílica com base em MePEG 350).
o > ao ' o? / me Dow e y SF > Lu | Penne, ão S.
Try Peg, Tã YE ITS E De se SS A EE FE E A Ch | JE Lo PE Leo ; ISV MAC O DOS mA. - CC eos O PR ço A o AE AROS CANPATANEAS o S Juris fam r HPG-Cyo-MePEGEPP = $" o É dt sr Tt À 1º HPG-Cy1,-McPEG t Os po ao Pr TA MNE > te A bi Pe JA SIE IT Po a Roma - * ASA nc o i NS Ãso ar O o.
A q 4 / ê 4 ns HPG-Cy1o5-MePEG-NH, "”á à. ,
HPG-Cg/10-MePEG-NH7(121) foi selecionado para o o carregamento de fármaco e avaliação adicional em estudos com animais.
RMN e GPC As frações de MePEG e das cadeias alquila nos HPGs foram estimadas a partir de experimentos de RMN de coerência heteronuclear simples quântica (HSQC) registrados em um espectrômetro de RMN de 400MHz Bruker Avance (intensidade do campo magnético de 9,4 T) utilizando solventes deuterados (Cambridge Isotope Laboratories, 99,8% de D). Os pesos moleculares e as polidispersões dos polímeros foram determinados por cromatografia de permeação em gel com detecção de espalhamento de luz laser multiângulo (GPC-MALLS).
A figura 19A mostra um espectro de HSQC 2D representativo de HPG-Cg/10-MePEG. A modificação da superfície do HPG-Cgwo-MePEG com N-(2,3-epoxipropil)- ftalimida) foi confirmada por experimentos de HSQC 2D em que os grupos CH da ftalimida aromáticos foram identificados (deslocamentos químicos de 'H de 7,2 a 7,8 ppm e deslocamentos químicos "C de 125 a 135 ppm). O sucesso da clivagem dos grupos ftalimida por hidrazinólise para gerar grupos amina livres foi monitorado tanto por ID o de RMN quanto por experimento de HSQC 2D. A figura 19B mostra um espectro de HSPC 2D representativo de HPG-Cg/,107 - MePEG-NH>2,121,, que mostra o sucesso da clivagem do grupo protetor ftalimida para gerar grupos amina primários (2,60- 1 15 2,80 ppm e deslocamentos químicos "CC de 45 ppm, Figura 19B). Dados de RMN HSQC confirmaram a estrutura dos HPGs como polímeros hiperramificados com as arquiteturas de ramificação evidentes nos espectros (Figura 19). A fração molar de cadeias alquila C;ç, 10 e MePEG em dHPGs pode ser calculada a partir das integrais de sinal nos experimentos de HSQC. Ao comparar as integrais do grupo metóxi de MePEG o e do grupo metila do éter octil/decilglicidílico (O/DGE) com a integral do grupo CH; de TMP, as frações de MePEG e O/DGE (mol/mol) foram calculadas para cada polímero dHPG (Tabela 10).
Titulações condutométricas e ensaio de fluorescamina As frações molares dos grupos amina derivatizados nos polímeros HPG-Cg/10-MePEG foram medidas por titulação condutométrica usando HCl e NaOH. As titulações condutométricas foram feitas no medidor de condutância modelo 35 de YSI e na célula 3403 com eletrodo de platina a 25 ºC. Uma bomba de seringa (Harvard Instruments) foi usada para injetar uma solução de NaOH diluída com uma vazão constante de 0,0102 mL/min.
Para uma titulação típica, cerca de 10 mg de HPG-Cg/1o-MePEG-NH; foram dissolvidos em água destilada e titulado primeiro com HCl 0,05 N, seguido por titulação pelo resto com NaOH 0,05 N.
A condutância da solução foi medida a cada 30 s.
Solução de hidrogenoftalato de potássio (0,05 N) foi utilizada para padronizar a solução de hidróxido de sódio.
Com base na titulação condutométricas e nas medições de peso molecular, o número de mols dos grupos amina por molécula HPG foi calculado e os valores obtidos estavam na faixa de 50 a 119 mol/mol, o que eram consistentes com as razões de mol alvo de NH; por mol de HPG-Cg/10-MePEG-NH, (Tabela 8 & 10). - Tabela 8 Estequiometria dos reagentes utilizados para a síntese de HPG-Cg/1o0-MePEG-NH, í HPG-Cg/10-MePEG- NH, Massa dos reagentes (9g) Substituição de NH, alvo (mols de NH;/mol de HPG) HPG-Cg/107 KH EPP NH; alvo MePEG (mol/mol HPG) o HPG-Cg/10-MePEG- 4 0,2 0,6 61 NHz(61) HPG- Cg/10-MePEG- 4 0,45 1,184 121 NH2 (121) HPG- Cg/10-MePEG- 4 0,6 1,575 161 NH2 (161) KH, hidreto de potássio; EPP, N-(2,3-epoxipropil)- ftalimida). Propriedades de peso molecular de HPG-Cg/10" MePEG, Mw = 83.000 e Mw/Mn = 1,22 O número de mols dos grupos amina por molécula de HPG também pode ser calculado usando fluorescência e medições do peso molecular.
Por exemplo, um ensaio de fluorescamina para NH, pode ser usado (Tabela 9). Amostras de HPG-NH, foram preparadas pela medição de > 5 mg de amostras de HPG- NH; em um frasco de vidro LC/MS de 2 mL e adicionando uma quantidade adequada de H;O deionizada para fazer um estoque concentrado, e a seguir submetendo ao ultrassom a mistura até que o HPG-NH, foi dissolvido. A solução estoque foi diluída a 1 mg/mL com H;yO deionizada por mg de HPG-NH,;. O padrão de fenilalanina foi preparado pela medição de cerca de 1 mg de fenilalanina em uma placa de micropesagem de alumínio e transferindo para um frasco de vidro de 20 o mL, em seguida, adicionando 5 mL de H;O deionizada por mg de fenilalanina, e agitando com ultrassom a mistura até a . fenilalanina ser dissolvida (estoque de fenilalanina de 0,2 mg/mL). 60 uL de estoque de fenilalanina 0,2 mg/mL foram 7 15 transferidos para um frasco de LC/MS de vidro. 90 nl de HO deionizada foram adicionados e agitado em vórtice para misturar a solução (padrão de trabalho de fenilalanina de 80 ng/mL).
40 pL de estoque de HPG-NH, 1 mg/ml foram transferidos para uma placa de 96 poços, 10 ul de HO deionizada foram adicionados (ou 50 npuL, 40 uL, 30 uL, 20 pl, 10 pl ou O ul o de 80 ng/ml de padrão de trabalho de fenilalanina foi adicionado e avolumado com H,;O deionizada até 50 upL, se necessário); e a amostra foi pipetada para misturar. 12,5 unL de tampão de borato de sódio foram adicionados ao poço e pipetados para misturar. A ponta da pipeta foi rinsada com solução de fluorescamina a 0,03% duas vezes para revestir a ponta e impedir o gotejamento. 12,5 ul de solução de fluorescamina 0,03% foram adicionados ao poço da amostra. A amostra foi pipetada para misturar e, em seguida, colocada em um agitador de placa, coberta e agitada durante 1 min. 175 pb de HO deionizada foram adicionados para reagir com o excesso de fluorescamina e pipetados até a mistura, e
| 91 brevemente colocado sobre à placa de agitação.
A amostra foi analisada por um leitor de placa de fluorescência configurado em um comprimento de onda de excitação de 390 nm, um comprimento de onda de emissão de 475 nm e uma largura de banda de 5 nm para os comprimentos de onda tanto para a excitação quanto para a emissão.
Tabela 9 Mols de amina por mols de HPG medido pelo ensaio de fluorescamina ft da amostra | HPG EPP-A ou KHº ou NaHº Amina de HPG-MePEG- (9) EPP-S (mg) (mg) (mol/mol de o NH> HPG) : ' Poa [2 | e | se | 7,36 | Pos Pa se ass | 136 | Lose da ee ae | 3756 *Pureza de EPP-A (EPP do Atlântico): 78% por UPLC e 69% por RMN. o "Pureza de EPP-S (EPP da Sigma- Aldrich): 91% por UPLC e 95% por NMR.
Análise térmica DSC e TGA foram usados para avaliar as propriedades térmicas e de degradação dos dHPGs.
A análise térmica foi realizada utilizando DSC Q100 e TGA Q50 da TA Instruments.
As análises de DSC foram obtidas por ciclização de amostras pesadas em cadinhos de alumínio hermeticamente selados através de um ciclo de “calor-frio-calor" a 10 ºC/min na faixa de temperatura de -90 a 85 ºC.
As análises de TGA foram realizadas principalmente em um modo de "isoterma em etapas", onde cada fase da perda de peso no processo de degradação foi observada sob condições isotérmicas e os HPGs foram aquecidos através de quase 100% de perda de peso a 500 ºC. A tabela 10 mostra os eventos térmicos das | amostras de HPG-Cg/10-MePEG e HPG-Cg/10-MePEG-NH;. As amostras | 5 de HPG-Cg/10-MePEG e HPG-Cg/10-MePEG-NH, apresentaram perfis de DSC/TGA semelhantes. HPGs exibiram uma temperatura de transição vítrea entre -45 e -58 ºC. A presença de grupos amina produziu um pequeno aumento na Tg dos HPGs. O principal evento de degradação foi observado nas temperaturas acima de 300 ºC, que mostram boas propriedades o de estabilidade térmica dos HPGs. Aproximadamente 3 a 5% de perda de peso ocorreu nas temperaturas abaixo de 100 “ºC - provavelmente devido a alguns solventes residuais ou água em HPGs. Uma boa estabilidade térmica dos HPGs é desejável 7 15 para aplicações farmacêuticas para permitir o potencial uso dos métodos de esterilização por calor.
Dimensionamento de partículas e potencial zeta As análises do tamanho de partículas e do potencial zeta foram realizadas utilizando um analisador de tamanho de partículas Malvern NanozZS usando cubetas de dimensionamento descartáveis DTS0012 para cada análise. As o amostras foram filtradas com filtro de seringa in-line de 0,2 um (PALL Acrodisc de 13 mm com membrana de náilon). Os parâmetros de aquisição de amostra foram: ângulo em 173º de retroespalhamento com atenuação automática; número de análises: 11 (10 segundos/análise); o dispersante foi água a 25 ºC (viscosidade de 0,8872 cP e 1.330 RI); parâmetro de Mark-Houwink A = 0,428 e K = 7,67e* cm?//s. Foi considerado que os HPGs possuem um índice de refração similar ao polietileno glicol (PEG) com um RI = 1.460 e absorção de 0,01. Os dados finais representaram a média de todas as execuções. HPGsS são pequenas nanopartículas com raios hidrodinâmicos < 10 nm. HPGs formam nanopartículas i
DA 93 E" extremamente pequenas de menos de 10 nm. A tabela 10 mostra os tamanhos das partículas e as características do potencial zeta dos HPGs. A derivatização da superfície do . HPG-Cg/10-MePEG com os grupos amina não teve nenhum efeito nos seus tamanhos de partícula, entretanto, um efeito significativo no potencial zeta foi observado. O potencial zeta dos polímero de HPG terminados em amina foi altamente positivo em pH baixo e mudou para valores ligeiramente negativos em condições básicas. Esta mudança de pH titulável na carga de superfície surge da o protonação/desprotonação dos grupos amina. No pH fisiológico de 7,4 alguns dos grupos amina nos HPGs são . ionizados, e portanto, os potenciais zeta positivos eram esperados (Tabela 10). No entanto, em valores de pH maiores ' 15 do que 8, essencialmente todos os grupos amina são descarregados, de modo que a carga ligeiramente negativa observada em pH 11 foi provavelmente devido aos grupos hidroxila eletronegativos presentes nestes HPGs. [( carregamento de fármaco dos HPGs não teve nenhum efeito significativo em seus tamanhos de partículas e os HPGs permaneceram bem dispersos como micelas unimoleculares em o solução. Nanopartículas de HPGs carregadas com DTX foram fisicamente estáveis, sem precipitação de fármaco Ou agregação observados durante o armazenamento de uma semana em temperatura ambiente.
Tabela 10 Características físico-químicas dos HPGs derivatizados com cadeias alquila Csg,19 e modificadas com grupos MePEG e amina Polímeros Estrutura Titula- DSC/TGA Poten- Tama- por RMN ção cial nho (mol/mol de Zeta de HPG) partí cula
HPGs MePEG O/DGE NH2 —Tg(ºC) Td(ºC) (mV) (nm) (mol/ é ? mol) HPG-Cg/107 4,3 4,7 -= -58,9 344 -1,5 7,54 MePEG 1,0 HPG-Cg/107 3,5 2,9 50 -46 325 11 7,7 E MePEG- NH>(61) 2,9 HPG-Cg/107 8,1 6,3 104 45,5 327 11,9 9,6 + MePEG- 4,5 NH2(121)+ o HPG-Cg/107 7,9 6,3 119 46,4 320 13 8,1 + MePEG-NH>(161) 2,8 - * Esse lote foi selecionado para o carregamento de fármaco e estudos in vivo; "Tg, transição vítrea tomada no ponto , médio da transição; “Td, temperatura de degradação medida na perda máxima de peso Exemplo 16. Avaliação das propriedades mucoadesivas Para avaliar as propriedades mucoadesivas dos HPGs, foi utilizado o método de partícula de mucina desenvolvido por Thongborisute e Takeuchi (Thongborisute, J.; Takeuchi, H.
Int.
J.
Pharm. 2008, 354, 204-209). Este método baseia- o 10 se em mudanças no tamanho da partícula devido à agregação de mucina de tamanho na faixa do submícron como resultado da interação entre o polímero adesivo e mucina.
A solução de mucina de tamanho na faixa do submícron foi misturada com volumes iguais de HPGs (10% p/v) em tampão acetato de 100 mM, agitada em vórtice e incubada a 37 ºC durante 30 min.
Mudanças no tamanho de partícula foram monitoradas por medições de espalhamento de luz usando 3000 HS Zetasizer (Malvern Instruments, San Bernardino, CA). Cada teste foi realizado em triplicata e solução de quitosana (1% p/v) foi utilizada como controle positivo.
O tamanho de partícula da mucina aumentou significativamente após a incubação com soluções de quitosana (1% p/v) ou de HPG-Cg/10-MePEG-H>(121) (10% p/v) (Figura 20). HPG-Cg/10-MePEG (10% p/v) não teve efeito sobre o tamanho das partículas de mucina.
O tamanho de partícula maior da mucina de tamanho na faixa do submícron foi devido às partículas agregadas de mucina e nanopartículas de HPG-Csg/10-MePEG-NH,; e foi atribuído às forças “mucoadesivas entre mucina e os HPGs amino- substituídos.
Quitosana, um polímero mucoadesivo amplamente conhecido, foi usado como controle positivo.
No entanto, devido ao seu alto peso molecular e baixa solubilidade em o solução aquosa, uma solução diluída de quitosana foi usada (1% p/v). Até mesmo esta solução diluída apresentou - alterações significativas no tamanho de partícula da mucina após coincubação.
Acredita-se que a mucoadesividade tanto ' 15 da quitosana quanto de HPG-Cg,/10-MePEG-NH, seja devido às interações eletrostáticas entre e grupos amina positivamente carregados e partículas de mucina negativamente carregadas, mas também outras contribuições como ligações de hidrogênio, efeitos hidrofóbicos e entrelaçamento de cadeias podem ter um efeito.
No entanto, a falta de mucoadesividade de HPG-Cg/1o0-MePEG sugere que a o atração eletrostática parece ser um contribuinte principal para as propriedades mucoadesivas do HPG-Cg/10-MePEG-NH,;. Exemplo 17. Estudos de absorção e proliferação/ligação celular Proliferação celular As células Ku7-luc foram plaqueadas em 5.000 células/poço em placas com 96 poços em um volume de 100 pL de meio McCoy suplementado com FBS a 10% e permitido equilibrar durante 24 h antes que soluções recém-preparadas de HPG-Cg/10-MePEG e/ou HPG-Cg/10-MePEG-NH, (dissolvido em PBS, pH 7,4, de O a 150 pg/ml) fossem adicionadas.
As células foram expostas às soluções de HPG durante 2 he a viabilidade celular foi determinada após 72 h usando oO Ensaio de Proliferação Celular Não Radioativo Aquoso CellTiter96 (Promega, Madison, WI), conforme descrito anteriormente (Mugabe, C; Hadaschik, B.
A.; Kainthan, R.
K.; Brooks, D.
E.; So, A.
I.; Gleave, M.
E.; Burt, H.
M.
BJU Int. 2009, 103, 978-986). Marcação com Rodamina de HPGs Polímeros de HPG-Cg,1o-MePEG e HPG-Cg/,10-MePEG-NH>(121) foram covalentemente rotulados com tetrametil- rodaminacarbonilazida (TMRCA), conforme relatado o anteriormente (Savic, R.; Luo, L.; Eisenberg, A.; Maysinger, D.
Science 2003, 300, 615-618). Tetrametil- - rodaminacarbonilazida (TMRCA) foi comprada da Invitrogen Canada Inc. (Burlington, ON). Resumidamente, 500 mg de HPGs 7 15 (HPG-Cg/10-MePEG ou HPG-Cg/10-MePEG-NH>r(121)) foram dissolvidos em 5 mL de 1,4-dioxano anidro.
Uma quantidade apropriada de azida de tetrametilrodamina-5-carbonila (TMRCA, MW 455,47) foi dissolvida em 2 mL de 1,4-dioxano anidro para proporcionar uma concentração final de 1 mg/ml.
Uma alíquota de 675 ul desta sonda fluorescente, que corresponde a aproximadamente 20% em mol de HPGs, foi o adicionada à solução de HPGs e aquecida a 80 ºC em banho de óleo sob fluxo de nitrogênio com agitação durante 5h.
A sonda que não reagiu foi removida por diálise contra DMF (MWCO 12.000-14.000) até o dialisado ficar incolor e, em seguida, dialisado contra água destilada durante 24 h.
Os polímeros marcados fluorescentes (HPGs-TMRCA) foram liofilizados e armazenados a -80 ºC em frascos âmbar.
Absorção e Ligação Celular Células KU7-luc foram usadas para avaliar a ligação e a absorção de HPGs marcados com rodamina.
As células foram plaqueadas em 10.000 células/poço em placas de 96 poços no volume de 100 pl de meio McCoy suplementado com FBS a 10% e deixado equilibrar durante 24 h.
O meio foi removido e as células foram incubadas com HPGsS marcados com rodamina (HPG-Cg/10-MePEG-TMRCA ou HPG-Cg/10-MePEG-NH>(121,)-TMRCA, 1,56- 200 pg/ml) durante 2 h.
Após o período de incubação, as células foram lavadas 3 vezes com PBS e lisadas com 200 ul de Triton X-100 0,5% (pH 8 em PBS) e a quantidade de ligação de fluorescência celular foi medida por espectroscopia de fluorescência (Synergy 4.0) na excitação/emissão de 545/578. Os padrões foram preparados a partir de HPGs marcados com rodamina (0,781-6,25 pg/ml) em o Triton X-100 e PBS (pH 8). A quantidade de HPGs rotulados com rodamina absorvido nas células ou ligados à superfície - foi expressa como a porcentagem da quantidade total de polímero adicionado em cada poço.
NA 15 Análise de fluorescência confocal de absorção da
| célula
Células KU7-luc foram cultivadas em placas de Petri de 10 cm com lamínulas de 1 cm x 1 cm no fundo da placa para as células crescerem, até que uma confluência de + 75% fosse atingida, que correspondeu a um número de células de 7 x 10º células.
As lamínulas contendo células foram, a oe seguir, removidas e lavadas 3 vezes com PBS aquecido.
As lamínulas foram então colocadas com o lado das célula voltado para cima em placas de Petri revestidas com parafilme durante o ensaio de absorção.
Polímeros HPG rotulados com rodamina (250 npL de HPG-Cg/iw1o-MePEG-TMRCA ou HPG-Cg/10-MePEG-NH2(121, -TMRCA) foram adicionados às células nas lamínulas em uma concentração de 1 mag/mL.
As células foram incubadas durante 1, 4, 8 e 24 h.
Após cada ponto de tempo, as lamínulas foram lavadas quatro vezes vigorosamente em PBS.
Após a suavemente remoção da marcação do excesso de PBS, 250 ul de paraformaldeíido 3,7% na temperatura foi usado para fixar as células durante 10 minutos.
As lamínulas foram então lavadas mais 3 vezes em PBS, imersas em água, O excesso de líquido foi removido e elas foram finalmente montadas com o lado das células para baixo sobre lâminas de vidro com vidro Prolong Gold com 4" ,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Esmalte de unha claro foi usado frugalmente em torno das bordas da lamínula para interromper a secagem da amostra.
Uma incubação de um dia para o outro assegurou o endurecimento adequado da amostra, que então estava pronta para a visualização.
Estudos de microscopia foram realizados em um microscópio confocal o invertido FV-1000 Olympus.
Os comprimentos de onda de laser usados foram de 568 nm e 405 nm para a visualização da . rodamina e DAPI, respectivamente.
Contraste direto (DIC) também foi realizado para visualizar as membranas celulares : 15 e foi ativado com um laser de 405 nm da mesma forma.
A potência do laser e o ganho de alta tensão foram mantidos relativamente constantes dentro de cada grupo polimérico para permitir uma comparação consistente.
A fim de mostrar claramente que o polímero marcado estava dentro da célula, as imagens foram analisadas por fluorescência e DIC.
Estudos de absorção e proliferação/ligação celular o Em baixas concentrações, nanopartículas de HPG-Cg/107 | MePEG-NH7(121) - TMRCA foram extensivamente ligadas e internalizadas em KU7-luc, enquanto que nenhuma evidência de ligação ou absorção celular foi observada para nanopartículas de HPG-Csg/w10-MePEG-TMRCA em concentrações abaixo de 12,5 pg/ml (Figura 21A). O forte perfil de ligação deste polímero é provavelmente devido à atração eletrostática entre o polímero HPG-Cg/10-MePEG-NH7 (121) positivamente carregado e a membrana celular negativamente carregada de KU7-luc.
No entanto, conforme a concentração de HPGs aumentou, a ligação e a absorção celular de nanopartículas de HPG-Cg/i1o-MePEG-NH7r(121,-TMRCA atingiu um ponto de saturação (a 25 upg/mL), enquanto foi verificado que a ligação celular e a absorção de nanopartículas HPG- Cg/10-MePEG-TMRCA em KU7-luc é dependente da concentração com relação linear observada em concentrações entre 12,5 e 50 ug/ml, seguido pela ligação e absorção menos pronunciada em concentrações de polímero mais altas (Figura 21 A). Para avaliar se o comportamento de saturação das nanopartículas de HPG-Cg/10-MePEG-NH7(121,)-TMRCA foi devido aos seus efeitos de citotoxicidade, avaliamos o efeito do HPG sobre a proliferação de células KU7-luc.
As células foram expostas o a HPG-Cg/iwo-MePEG Vazio (sem fármaco carregado) e. a nanopartículas de HPG-Cg/10-MePEG-NH, (0 a 150 pg/mL) durante . 2hea viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTS.
Ambas as nanopartículas de HPG-Cg/10-MePEG quanto de " 15 HPG-Cg/10-MePEG-NH, exibiram efeito de proliferação semelhantes e foram biocompatíveis com a linhagem celular KU7-luc nas concentrações testadas (Figura 21B). Portanto, as diferenças na ligação e absorção celular observadas para as nanopartículas de HPG-Cg/10-MePEG-TMRCA e HPG-Cg/10-MePEG- NHo121,-TMRCA não foram provavelmente devido aos seus efeitos de citotoxicidade na linhagem celular KU7-luc. e Análise de fluorescência confocal da internalização de
HPGs marcados com rodamina
A microscopia confocal foi utilizada para monitorar se as nanopartículas foram internalizadas pelas células ou se elas foram simplesmente ligadas à membrana celular de KU7- luc.
Ambas as nanopartículas de HPG-Cg,1o0-MePEG-TMRCA quanto de HPG-Cg/10-MePEG-NH7 (121) TMRCA foram rapidamente internalizadas pelas células KU7-luc e a absorção completa foi atingida por 1 h de incubação (dados não mostrados). A presença de HPGs marcados com rodamina no citoplasma foi observada pela análise de fluorescência.
A presença de nanopartículas de HPG-Cg/10-MePEG-TMRCA e/ou HPG-Cg/10-MePEG-
NH>(121)-TMRCA por todo o citoplasma foi observada ao contrário de ser apenas aderida a ou presente na membrana celular.
Não houve fluorescência do polímero detectado no compartimento nuclear das células KU7-luc.
A ausência de nanopartículas de HPG no compartimento nuclear pode ter sido devido aos seus pesos moleculares relativamente altos (< 80 KDa). As nanopartículas tanto de HPG-Cg/10-MePEG-TMRCA quanto de HPG-Cg/10-MePEG-NH>,121,)-TMRCA não têm nenhum efeito sobre a viabilidade e a prevalência das células KU7-luc em comparação com as células de controle em todos os pontos de o tempo.
As nanopartículas de HPG, marcadas com rodamina foram absorvidas pelas células KU7-luc por 1 h de incubação . e não foram observadas diferenças nas imagens obtidas nos pontos de tempo de 1, 4, 8 ou 24 h. ' 15 Exemplo 18. Carregamento e quantificação de DTX em HPGs e liberação de DTX dos HPGs Carregamento e quantificação de DTX em HPGs DTX foi carregado em HPG-Cg/iwo-MePEG e HPG-Cg107 MePEGNH>7(121,y por um método de evaporação do solvente, em que o fármaco e o polímero foram dissolvidos em um solvente orgânico comum e o solvente foi removido.
A matriz de e polímero/fármaco resultante foi reconstituída com PBS 10 mM (pH 7,4). As soluções resultantes foram em geral límpidas, mas nos casos onde foram observadas partículas brancas, as soluções foram centrifugadas (18.000 g durante 10 minutos) e os sobrenadantes foram transferidos para novos frascos.
As quantidades de DTX incorporadas nos HPGs foram determinadas por HPLC de fase reversa.
A análise do teor de fármaco foi realizada usando uma coluna de simetria C18 (Waters Nova-Pak, Milford, MA) com uma fase móvel contendo uma mistura de acetonitrila, água e metanol (58:37:5, v/v/v) em uma vazão de 1 mL/min.
Os volumes de injeção da amostra foram de 20 puL e a detecção foi realizada usando a detecção por UV no comprimento de onda de 232 nm. O tempo de análise total foi ajustado para 5 min e o tempo de retenção do DTX foi de 2,9 min. Até 5% p/p do carregamento de fármaco foi alcançado por esse método, o que corresponde a cerca de 5 a 6 moléculas de DTX por molécula de HPG. A solubilidade aquosa do DTX está na faixa de 7 uvg/mL (Du, W.; Hong, L.; Yao, T.; Yang, X.; He, Q.; Yang, B.; Hu, Y. Bioorg. Med. Chem. 2007, 15, 6323-6330; Liggins, R. T.; Hunter, W. L.; Burt, H. M. J. Pharm. Sci. 1997, 86, 1458- 1463) e a incorporação de DTX em HPGs resultou em um o aumento de aproximadamente 1.000 vezes na solubilidade em água deste fármaco.
. Liberação de DTX dos HPGs A liberação de DTX das nanopartículas de HPG (HPG- ' 15 Cg/1o-MePEG e HPG-Cg/1o0-MePEG-NHa(121)) foi determinada pelo método de diálise. Resumidamente, 100 mg de (HPG-Cg/10-MePEG ou HPG-Cg/10-NH21121) foram pesados e misturados com 1 mg de DTX em 1 mL de solução de acetonitrila, reforçado com 15 pci de *H-DTX e, em seguida, seco sob fluxo de nitrogênio para remover o solvente. A matriz de HPG/DTX foi hidratada com 2 mL de PBS e transferida para bolsas de diálise e o dialisada contra 500 ml de urina artificial (pH 6,5) com agitação a 100 rpm. O pH da solução foi ajustado para 6,5 usando HCl 0,1 M. O pH 6,5 foi escolhido porque ele é à faixa fisiológica média da urina humana, embora possa variar ao longo de uma ampla faixa (pH 4,5-8). (Brooks, T.; Keevil, C. W. Lett. Appl. Microbiol. 1997, 24, 203-206.) Em diferentes pontos de tempo, os volumes das bolsas de diálise foram medidos e uma amostra de 10 upL foi tomada para medição da radioatividade remanescente nas bolsas de diálise e todo o meio de liberação externo foi trocado com meio fresco para manter as condições do escoadouro. A concentração de *H-DTX restante na bolsa de diálise em cada ponto de tempo foi determinada por contagem de cintilação beta (Beckman Coulter Canada, Mississagua, ON). A porcentagem cumulativa de fármaco liberado foi calculada subtraindo a quantidade do fármaco remanescente em cada ponto de tempo da quantidade inicial do fármaco no início do experimento. Os dados foram expressos como porcentagem cumulativa de fármaco liberado em função do tempo. Os perfis de liberação do DTX dos HPGs foram caracterizados por uma liberação contínua controlada com pouca ou nenhuma fase de irrompimento de liberação (Figura 22). o Aproximadamente 55% do fármaco inicialmente encapsulado foi liberado nas primeiras 24 h de incubação. A presença de - grupos amina na superfície dos HPGs não teve efeito sobre a liberação do fármaco (Figura 22).
' 15 Exemplo 19 Avaliação de formulações de DTX intravesicais em um modelo de câncer de bexiga ortotópico A tolerabilidade e eficácia de formulações de HPG carregadas com DTX em camundongos com xenoenxerto de bexiga ortotópicos foram avaliadas. O modelo de camundongo ortotópico usado foi relatado (Mugabe, C; Hadaschik, B. A.; ainthan, R. K.; Brooks, D. E.; So, A. I.; Gleave, M. E.; oe Burt, H. M. BJU Int. 2009, 103, 978-986; Hadaschik, B. A.; Black, P. C; Sea, J. C; Metwalli, A. R.; Fazli, L.; Dinney, C. P.; Gleave, M. E.; So, A. I. BJU Int 2007, 100, 1377- 1384; Hadaschik, B. A.; ter Borg, M. G.; Jackson, J.; Sowery, R. D.; So, A. I.; Burt, H. M.; Gleave, M. E. BJUInt. 2008, 101, 1347-1355). Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com o Canadian Council on Animal Care e o protocolo de cuidado animal foi aprovado pelo Comitê de cuidados animais de nossa instituição (The University of British Columbia). Neste modelo, utilizaram- se células cancerosas KU7-luc expressando luciferase. Para a inoculação tumoral, camundongos nus do sexo feminino de
E oito semanas de idade (Harlan, Indianapolis, IN) foram anestesiados com isoflurano.
Uma sutura em bolsa superficial foi colocada ao redor do canal uretral antes de um angiocateter 24 G Jelco lubrificado (Medex Medical Ltd.,
Lancashire, Reino Unido) passada pela uretra para dentro da bexiga.
Após uma única irrigação da bexiga com 100 pl de
PBS, dois milhões de células KU7-luc foram instiladas como uma suspensão celular única em 50 puL e à sutura em bolsa foi amarrada durante um período de tempo de 2,5 h, durante a qual os camundongos foram mantidos anestesiados.
Após a o remoção da sutura, os camundongos foram colocados em gaiolas e monitorados até que eles recuperassem a
- consciência e evacuassem de forma normal.
Cinco dias após a Inoculação do tumor, 26 camundongos distribuídos
' 15 aleatoriamente foram tratados através de instilação intravesical (50 pL e 2 h de tempo de permanência) de acordo com os seguintes grupos de tratamento: PBS (controle); TaxotereG (0,5 e 1,0 mg/ml, DTX em Tween 80);
DTX em HPG-Cg/10-MePEG (0,5 e 1,0 mg/mL); DTX em HPG-Cg/107
MePEG-NH>r(121)y (1,0 mg/mL). Os camundongos foram monitorados durante várias horas no dia do tratamento e, depois disso,
oe diariamente.
Quaisquer sinais de toxicidade foram reportados, em particular, a perda de peso, mudança no consumo de alimentos e água, letargia, postura encurvada e/ou manifestações de estresse graves.
Qualquer camundongo apresentando sinais de dor ou doença que não se recuperaram dentro de 24 horas foi sacrificado.
A carga tumoral foi monitorada por visualização não invasiva dos camundongos nos dias 2, 8, 12 e 19 com um sistema de visualização IVIS
200 (Xenogen Corp., Alameda, CA). Resumidamente, os camundongos foram injetados intraperitonealmente com 150 mg/Kg de luciferina, anestesiados com isoflurano &Ee visualizados em posição supina exatamente 15 min após a injeção de luciferina. Os dados foram obtidos e analisados utilizando o software Living Image versão 2.50 (Xenogen). Dois dias após a inoculação tumoral, todos os camundongos desenvolveram tumores de bexiga, no entanto, 2 camundongos também desenvolveram tumores renais, tal como é demonstrado pela imagem de bioluminescência (Figura 23A). De modo geral, o DTX intravesical ou formulações de Taxotere& comerciais ou HPGs foram bem toleradas pelos camundongos. Nenhuma maior toxicidade foi observada e todos os ratos sobreviveram até o final do período de estudo. No o entanto, no dia 8 após a inoculação tumoral, alguns camundongos perderam cerca de 5% do seu peso corporal, - embora eles recuperaram na semana seguinte. A perda de peso corporal pode ter sido um resultado do tratamento | 15 intravesical e/ou de menor consumo de comida e água nos dias após o tratamento. No entanto, não houve diferença significativa (p > 0,05) na perda de peso corporal entre os diferentes grupos.
Doses de 0,5 a 1,0 mg/ml foram selecionados para estabelecer um regime de dosagem apropriado para DTX intravesical em camundongos com xenoenxertos de câncer de oe bexiga. Os camundongos tratados com uma dose única de qualquer um de Taxotere6 a 1,0 mg/mL, DTX em HPG-Cg/10-MePEG a 0,5 mg/ml, HPG-Cg/10-MePEG e/ou HPG-Cg/10-MePEG-NH7,121) à 1 mg/ml inibiram fortemente o crescimento tumoral. No dia 19 após a inoculação do tumor, todos os grupos de tratamento, exceto o do Taxotere& (0,5 mg/ml) apresentaram inibição tumoral estatisticamente significativa em comparação com o controle de PBS (p < 0,001, análise post-hoc de Bonferoni após ANOVA bicaudal). Todos os grupos de tratamento foram estatisticamente significativamente diferentes em comparação com o grupo do Taxotere& (0,5 ma/mL) (Figura 23 B, p < 0,05, análise post-hoc de Bonferoni depois de ANOVA bicaudal).
Acredita-se que as propriedades mucoadesivas dessas nanopartículas aumentam a intimidade do contato com o urotélio, levando à uma maior permeabilidade do fármaco e absorção na parede da bexiga possivelmente devido à modulação das junções apertadas ou descamação do urotélio. Devido aos seus tamanhos bastante pequenos (Rh < 10 nm), HPGs podem se difundir através das glicoproteínas de mucina e interagir diretamente com as células guarda-chuva do urotélio levando à endocitose intensificada dessas o nanopartículas na parede da bexiga ou tecidos tumorais. Um segundo estudo foi realizado para avaliar a - eficácia de uma dose mais baixa de instilação de DTX em HPGs. Para este estudo, os camundongos que não tinham ' 15 tumores de bexiga evidentes ou com baixo nível de bioluminescência conforme determinado pelo sistema de visualização IVIS 200 no dia 19 foram utilizados. No total, verificou-se que 12 camundongos eram apropriados para uma segunda reinoculação tumoral, como descrito acima. A tomada tumoral foi de cerca de 75% em comparação com 100% em | estudos anteriores e pode ser devido a uma resposta imune, oe uma vez que os camundongos foram previamente inoculados com a mesma linhagem celular; apesar do uso de camundongos imunocomprometidos atímicos, estes camundongos ainda têm um sistema imune local inerente caracterizado por macrófagos e células killer naturais. Dos 9 camundongos que desenvolveram tumores de bexiga após a reinoculação, 2 camundongos desenvolveram tumores de bexiga ainda maiores (10 a 100 vezes). No dia cinco após a reinoculação do tumor, os camundongos que desenvolveram tumores de bexiga foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos para receber uma única dose de 50 ul de HPG-Cg/10-MePEG (n = 5) ou HPG-Cg/1o-MePEG-NH>2,121) (n = 4) carregada com DTX (0,2 mg/mL) intravesical. Os camundongos foram fotografados nos dias 5, 11 e 19 após a reinoculação pós-tumoral. HPG-Cg/107 MePEG-NH>2(121y carregado com DTX intravesical inibiu oO crescimento tumoral em camundongos, enquanto que HPG-Cg/,107 MePEG carregado com DTX não conseguiu fazer isso na mesma concentração. Nos dias 11 e 19 após a reinoculação tumoral, 3 de 4 ratos não mostraram evidências de crescimento do tumor após um único tratamento intravesical com nanopartículas de HPG-Cg/10-MePEG-NH>r(121,y carregadas com DTX (0,2 mg/mL), enquanto que 4 de 5 camundongos tratados com o nanopartículas de HPG-Cg/10-MePEG carregadas com DTX (0,2 mg/mL) mostraram evidências do crescimento do tumor de . bexiga e um camundongo adicionalmente desenvolveu tumores renais (Figura 24). Mais uma vez, estas formulações foram ' 15 bem toleradas pelos camundongos sem maiores toxicidades ou a perda de peso corporal ocorreu durante esses estudos.
Exemplo 20 Estudos de citotoxicidade in vitro Os efeitos citotóxicos da formulação comercial de Taxotere8& e formulações de HPG carregadas com DTX contra a linhagem celular KU7-luc e linhagens celulares de carcinoma urotelial humanas de baixo grau (RT4, MGHU3) e de alto grau oe (UMUC3) foram avaliadas.
Taxotere O (DTX em Tween 80) foi comprado de Sanofi- Aventis Canada Inc. (Laval, Quebec). As linhagens de células cancerosas da bexiga humana RT4 e UMUC3 foram compradas da American Type Culture Collection. As células foram mantidas em meio McCoy (Invitrogen, Burlington, Ontário) contendo 10% de soro bovino fetal inativado por aquecimento e mantidas a 37 ºC em uma atmosfera de CO, umidificada. As células MGHU3 foram obtidas como um presente generoso do Dr. Y. Fradet (L'Hotel-Dieu de Quebec, Quebec, Canadá) e mantidas em MEM suplementado com 10% de soro bovino fetal e L-glutamina 2 mM (Invitrogen). KU7 foi gentilmente fornecido pelo Dr. C. Dinney (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, EUA) e mantida em DMEM contendo 5% de soro bovino fetal. Para fins de visualização, as células KU7 foram infectadas com um lentivírus contendo o gene da luciferase de vaga-lume, pelo Dr. Graig Logsdon (M.D. Anderson Cancer Center, Houston, Texas, EUA), e estes subclones foram chamados de KU7-luc conforme relatado anteriormente (Hadaschik BA, Black PC, Sea JC et al. BJU Int2007; 100: 1377-84).
As células foram plaqueadas em 5.000 células/poço em o placas com 96 poços em um volume de 100 ul de meio McCoy suplementado com FBS a 10% e deixadas equilibrar durante 24 . h antes que soluções recém-preparadas de Taxotere6 ou DTX em HPG-Cg/10-MePEG e/ou HPG-Cg/10-MePEG-NH, (dissolvido em ' 15 PBS, pH 7,4) fossem adicionadas. As células foram expostas às formulações de fármaco durante 2h para simular o padrão clínico atual para a terapia de instilação, e a viabilidade celular foi determinada após 72 h usando o ensaio de proliferação de células não radioativo aquoso (MTS) CellTiter96 (Promega, Madison, WI), conforme anteriormente relatado (Mugabe C, Hadaschik BA, Kainthan RK, et al. BJU oe Int 2009; 103: 978-86). Cada experimento foi repetido três vezes e os valores de MTS ficaram dentro de uma faixa de absorvância linear para todas as linhagens celulares.
Todas as formulações de DTX resultaram na inibição dependente de concentração da proliferação em todas as linhagens celulares testadas. A linhagem celular KU7-luc de crescimento mais rápido e mais agressiva foi a mais sensível às formulações de DTX, e HPG-Cg/10-MePEG ou HPG- Cg/10-MePEG-NH> carregado com DTX foram verificados como sendo tão citotóxicos quanto a formulação comercial de Taxotere& (Figura 25). A ICso das formulações de DTX estava na faixa nanomolar baixa (4 a 12 nM) para todas as linhagens celulares testadas.
As nanopartículas de HPGs de controle (sem fármaco) não mostraram citotoxicidade em toda a faixa de concentrações testada (15 a 1.500 nM, dados não mostrados). O carregamento de DTX em HPGs não teve efeito sobre a sua citotoxicidade.
EXEMPLO 21: Estudos in vivo Eficácia de DTX intravesical no modelo murino ortotópico do câncer de bexiga Estudos in vivo foram feitos em um total de 42 camundongos nus para avaliar a eficácia de um único o tratamento intravesical com Taxotere6 (0,2 mg/ml) e HPG- Cg/10-MePEG e/ou HPG-Cg/10-MePEG-NH, carregado com DTX (0,2 . mg/mL). O modelo de camundongo ortotópico usado foi reportado (Hadaschik BA, Black PC, Sea JC, et al.
BJU Int ' 15 2007; 100: 1377-84; Mugabe C, Hadaschik BA, Kainthan RK, et al.
BIJU Int 2009; 103: 978-86; Hadaschik BA, ter Borg MG, Jackson J, et al.
BJU Int 2008; 101: 1347-55; Hadaschik BA, Adomat H, Fazli L, et al.
Clin Cancer Res 2008; 14:1510-8; Hadaschik BA, Zhang K, So Al, et al.
Cancer Res 2008;68: 4506-10). Estudos em animais foram realizados de acordo com o Canadian Council on Animal Care.
Camundongos nus do sexo o feminino de onze semanas de idade (Harlan, Indianapolis, IN) foram anestesiados com isoflurano.
Uma sutura superficial em bolsa de polipropileno 6-0 foi colocada ao redor do canal uretral antes de um angiocateter 24 G Jelco lubrificado (Medex Medical Ltd., Lancashire, Reino Unido) passar pela uretra para dentro da bexiga.
Após uma única irrigação da bexiga com PBS, dois milhões de células KU7- luc foram instiladas como uma suspensão celular única em 50 upL e à sutura em bolsa foi amarrada durante 2,5 h.
Para quantificar a carga tumoral in vivo, os animais foram fotografados em posição supina 15 min após a injeção intraperitoneal de 150 mg/Kg de luciferina nos dias 4, 11,
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18 e 25 com um Sistema de Visualização IVIS200 (Xenogen/Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Os dados foram obtidos e analisados utilizando o software Living Image (Xenogen). No dia cinco após a inoculação tumoral, os camundongos foram distribuídos aleatoriamente para receber uma dose única de 50 ul de tratamento intravesical com PBS (controle); Taxotere6 (0,2 mg/mL); HPG-Cg/10-MePEG carregado com DTX (0,2 mg/mL); e HPG-Cg/1o-MePEG-NH, carregado com DTX (0,2 mg/mL). os níveis de bioluminescência foram equivalentes entre os grupos; no entanto, como os tumores o variaram entre camundongos individuais, para análises estatísticas, a bioluminescência do tumor após o tratamento . foi normalizada contra o fluxo inicial no dia quatro em cada camundongo.
A necropsia foi realizada no dia 25 após a ' 15 inoculação do tumor.
As bexigas inteiras foram removidas, fixadas em 10% de formalina tamponada e embebidas em parafina.
Seções de 5 pum foram preparadas e coradas com H&E usando técnicas padrão.
Todas as lâminas foram revistas e verificadas em uma estação de visualização de microscópio
BLISS (Bacus Laboratories Inc., Lombard, IL). Após a inoculação intravesical das células cancerosas o KU7T-luc, todos os camundongos desenvolveram tumores de bexiga.
No entanto, um camundongo no grupo HPG-Cg/,190-MePEG- NH; carregado com DTX morreu inesperadamente no dia quatro após o tratamento.
De modo geral, o DTX intravesical administrado como formulações de TaxotereG comerciais ou formulações de HPGs foram bem tolerados pelos camundongos.
Em comparação com os camundongos de controle, HPGs carregados com DTX inibiram o crescimento tumoral.
No entanto, HPG-Cg/10-MePEG-NH, carregado com DTX foi a fórmula mais eficaz para inibir o crescimento tumoral em xenoenxertos de câncer de bexiga ortotópicos KU7-luc e atingiu significância estatística em relação aos grupos de controle de PBS ou de Taxotere&G (Figura 26, P < 0,01, análise post-hoc de Bonferoni depois de ANOVA bicaudal). No | final do estudo, uma instilação intravesical única de nanopartículas de HPG-Cg/10-MePEG-NH, carregadas com DTX inibiu o crescimento tumoral por 88% em comparação com os grupos de controle de PBS. As nanopartículas de HPG-Cg/107 MePEG carregadas com DTX apresentaram uma inibição tumoral de 54% neste ramo do tratamento. Este aumento na eficácia provavelmente resultou da absorção do fármaco intensificada na bexiga e em tecidos tumorais dos camundongos tratados o com nanopartículas de HPG-Cg/10-MePEG-NH,; carregadas com DTX.
A formulação comercial de Taxotere&ê não conseguiu - inibir o crescimento tumoral neste modelo de xenoenxerto ortotópico. Imagens de bioluminescência representativa dos 7 15 camundongos ao longo do tempo em cada grupo de tratamento são mostradas na Figura 26. O exame histológico dos tecidos da bexiga mostrou que os tumores KU7-luc exibiram um padrão | de crescimento agressivo e com frequente multifocalidade, mas após 25 dias após a inoculação do tumor, eles estavam geralmente confinados à própria lâmina e se correlacionaram | com a doença no estágio Tl de alto grau (Figura. 27). o Embora o DTX (0,2 mg/ml) não causou qualquer alteração histológica notável no xenoenxerto KU7-luc em comparação com o tratamento com PBS, HPG-Cg/10-MePEG e/ou HPG-Cg/107 MePEG-NH,; carregado com DTX (0,2 mg/mL) inibiu o crescimento tumoral. Os tumores tratados por DTX carregado em HPG-Cg/10-MePEG-NH, diminuíram significativamente de tamanho, com tamanho celular heterogêneo, forma nuclear e | infiltração de células inflamatórias.
Também foi determinado que a técnica utilizada para carregar a porção biologicamente ativa em um dHPG é capaz de produzir uma formulação que pode ser analisada como possuindo + 20% da quantidade alvo de fármaco no sistema de administração, conforme determinado por HPLC (ver Tabela 11). Tabela 11 Concentração das formulações de DTX nas amostras analisadas após o tratamento por HPLC Formulação Concentração teórica Concentração de Docetaxel (mg/mL) efetiva de Docetaxel (mg/mL) HPG-Co/16-MePEG-NH º Loo a | - 5 Uma comparação foi feita entre as formulações incorporando paclitaxel (PTX) e aquelas incorporando DTX, ' como mostrado na Figura 28. Para ambos os fármacos, a incorporação destes em dHPG, como HPG-Cg/10-MePEG resulta em luminescência tumoral reduzida, com um dHPG incorporando DTX, sendo mais eficaz do que um dHPG incorporando paclitaxel.
Um experimento semelhante foi repetido usando dois pontos de tempo e usando animais saudáveis.
Estes dados, oe mostrados na Figura 29, demonstram que em camundongos saudáveis, mais docetaxel é retido na bexiga ao longo do tempo usando HPG-Cg/10-MePEG-NH, do que quando usando HPG- Cg/10-MePEG ou Taxotere" para administrar a mesma quantidade de fármaco.
Os resultados são semiquantitativos para o HPG- MePEG-NH, devido ao fato de exceder o limite superior dos ensaios de quantificação.
Os resultados para o grupo de Taxotere"” e HPG-Cg/i1o-MePEG são quantitativos.
Cada um dos camundongos foi dosado com 50 ug de fármaco em um volume de 50 ul e 50 mg de dHPG foram usados (n= 3 por grupo). Exemplo 22 Estudos de absorção do fármaco Para avaliar a absorção do tecido da bexiga e do soro após formulações de DTX intravesicais, os camundongos com tumores de bexiga ortotópicos foram instilados com Taxotere& (0,2 mg/ml, n = 3) ou HPG-Cg/10-MePEG carregado com DTX (0,2 mg/ml) (n = 4) e/ou HPG-Cg/10-MePEG-NH, (n = 4). As quantidades de DIX na urina, no tecido da bexiga e no soro foram medidas duas horas após a instilação.
Estudos de absorção do fármaco foram realizados em camundongos nus do sexo feminino com quinze semanas de idade com tumores KU7- luc estabelecidos (33 dias após a inoculação tumoral). Amostras de sangue da cauda foram coletadas em O, 30 e 60 o min após a instilação intravesical.
Durante este período, os camundongos foram ainda anestesiados com isoflurano. . Após 2 h, todos os camundongos foram eutanasiados usando asfixia por CO, e mais sangue foi removido por punção ' 15 cardíaca.
As amostras de sangue foram centrifugadas em tubos de microematócrito (Fisher Scientific, Pittsburg, PA) | ou tubos de separação de soro (Becton Dicknson) e o soro foi congelado rapidamente em nitrogênio líquido.
Urina e a bexiga de cada camundongo também foram coletados e, antes de congelar, as bexigas foram abertas por corte para expor o lúmen e elas foram vigorosamente lavadas em cinco o lavagens sequenciais com 10 ml de PBS.
Todas as amostras foram armazenadas a -80 ҼC.
O sistema de UPLC-MS/MS utilizado para a análise consistiu em um sistema de separação integrado Acquity UPLC da Waters (Acquity BEH C18, coluna de 1,7 um, 2,1 x 50 mm) acoplado a uma análise de espectrometria de massa usando o espectrômetro de massa TOD da Waters.
O sistema foi operado em uma temperatura de bloco de fonte iônica de electrospray de 150 ºC, uma temperatura de dessolvatação de 350 ºC, uma voltagem de cone de 14 V, uma voltagem capilar de 0,70 kV, uma voltagem do extrator de 3 KV, voltagem RF de 0,1 kV e um fluxo de gás do cone a 25 L/h, um fluxo de gás de dessolvatação a
600 L/h e um fluxo de gás de colisão de 0,2 mL/min. As moléculas sofrem ionização por electronspray no modo de íon positivo. DTX foi quantificado no monitoramento de múltiplas reações com a transição de m/z 808,5 —- 527,2, | como foi previamente estabelecido (Mugabe C, Liggins RT, | Guan D, et al. Int J Pharm XXX ; 404: 238-49). DTX foi extraído do soro de camundongo pelo método de extração por solvente/solvente. Alíquotas de 50 ul de plasma de camundongo e padrões foram misturadas com 150 pl de ácido fórmico 0,1% em acetonitrila em uma placa com 96 poços e o agitado em vórtice durante 1 min em temperatura ambiente. As amostras foram centrifugadas a 5.500 rpm (centrífuga , Allegra” 25 R, Beckman-Coulter) durante 10 min a 4 ºC. Em seguida, 100 pl do sobrenadante foram misturados com 50 ul ' 15 de água destilada, misturado e agitado em vórtice durante 30 s. Os tecidos da bexiga foram pesados e homogeneizados em ácido fórmico 0,1%/metanol usando pérolas de zircônia (Biospec Products) e o misturador de minipérolas equipado com um recipiente de microtubo (Biospec Products) durante 60 s. As amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm (centrífuga Allegra" 25 R, Beckman-Coulter) durante 2 min a oe 4 ºC. 150 mL de ácido trifluoracético em metanol 0,1% foram adicionados para as amostras, misturadas e agitadas em vórtice a 14.000 rpm (centrífuga Allegra" 25 R, Beckman Coulter) por 15 min a 4 ºC. Toda a análise da amostra foi realizada com UPLCMS/MS. O limite de quantificação para DTX foi 10 ng/ml, com uma recuperação de 97% das amostras de controle reforçadas. Na análise, a precisão (% RSD) foi menor do que 15% em todos os casos.
Camundongos instilados com Taxotere6 não apresentaram DTX detectável no soro em todos os pontos de tempo. HPG- Cg/10-MePEG-NH,; carregado com DTX exibiu os mais altos níveis de soro no ponto de tempo de 2 h (150,87 + 34,98 vs 23,97 +
16,71 ng/ml, P < 0,01, ANOVA bicaudal, pós teste de Bonferroni). No entanto, as concentrações no soro de DTX possuíam várias ordens de magnitude menores do que as concentrações na urina e tecido da bexiga (Tabela 12). HPG- Cg/i1o-MePEG-NH, carregado com DTX resultou em quantidades significativamente maiores no acúmulo de tecido da bexiga em comparação com o Taxotere& ou HPG-Cg,10-MePEG carregado com DTX (P < 0,001, ANOVA 1 fator, teste de comparação múltipla de Bonferroni). Não houve diferença significativa (P > 0,05, ANOVA 1 fator) no acúmulo de tecido da bexiga o acumulação entre os grupos de tratamento de Taxotere O e HPG-Cg/10-MePEG carregado com DTX.
As concentrações de urina . final eram cerca de 5 a 7 vezes menores do que a solução de dosagem inicial.
Isto foi devido à diluição da urina ' 15 durante o período de 2h de instilação intravesical.
No entanto, não houve diferença significativa (P > 0,05, ANOVA 1 fator) nas concentrações de urina final de DTX entre grupos de tratamento diferentes.
Nenhuma toxicidade local ou sistêmica foi observada em qualquer grupo.
Tabela 12 Absorção do fármaco de formulações DTX intravesicais em xenoenxertos ortotópicos o Formulações de DTX Curina “Chexiga FCsoro (Nng/mL) (No. de camundongos) vpg/ (vg/g) 5h 1h 2h. mL) Taxotere* (3) 31,4 + 1,24 + BLOQ BLOQ BLOQ 15,5 0,54 DTX/HPG-Cg/10-MePEG (4) 53,8 +t+1,09+ 55,87 27,88 23,97 + 8,1 0,70 16,71 DTX/HPG-Cg/10-MePEG- NH, 27,6 + 13,07 81,47 88,21 150,87 (4) 4,0 + 4,32 + + + 34,98 23,76 39,42 *'Concentração final de DTX na urina do camundongo após 2h a e — a o a aa ss —>—*—
de instilação intravesical medido por HPLC *Concentração de DTX no tecido da bexiga de camundongo após a instilação intravesical de 2 h medido por LC/MS/MS *Concentração de DTX no soro de camundongo tomado em 0,5, 1 e 2 h após a instilação pós-intravesical medida por LC/MS/MS BLOQ, abaixo do limite de quantificação (o menor limite de quantificação foi de 10 ng/mL). Os dados mostrados são a média + DP Exemplo 23 Avaliação do microambiente tumoral e oe absorção de HPGs marcados com rodamina O microambiente tumoral da bexiga e a distribuição de . HPGS marcados com rodamina no tecido tumoral foram avaliados. ' 15 Marcação com Rodamina de HPGs Os polímeros HPG-Cg,/10-MePEG e HPG-Cg/,i1o-MePEG-NH, foram covalentemente marcados com tetrametil- rodaminacarbonilazida (TMRCA) como anteriormente relatado (Savic R, Luo L, Eisenberg A, Maysinger D.
Science 2003; 300: 615-8; Mugabe C, Liggins RT, Guan D, et al.
Int 3 Pharm XXX ; 404: 238-49). Camundongos nus do sexo feminino oe de quinze semanas de idade com tumores de bexiga ortotópicos (33 dias após a inoculação do tumor) foram anestesiados com isoflurano.
Uma sutura superficial em bolsa de polipropileno 6-0 foi colocada ao redor do canal uretral e a bexiga foi esvaziada por compressão manual.
Um angiocateter Jelco de calibre 24 lubrificado passou através da uretra para dentro da bexiga e, em seguida, 50 uL de PBS, rodamina livre (TMRCA), HPG-Cg/10-MePEG-TMRCA e/ou HPG- Cg/1o-MePEG-NH;-TMRCA foram instilados e a sutura em bolsa foi amarrada por um período de 2 horas, durante o que os camundongos foram mantidos anestesiados.
Após o período de 2h, a sutura em bolsa foi removida, a bexiga foi esvaziada por compressão manual e lavada duas vezes com 150 pl de PBS (pH 6,0). Os camundongos foram eutanasiados e as bexigas foram removidas e congeladas em um bloco de alumínio, a seguir imersas em OCT para criossecção.
Criossecções de 10 um foram cortadas em distâncias de 1, 2 e 3 mm da borda da bexiga.
As seções foram secas em temperatura ambiente e visualizadas para fluorescência de rodamina usando objetiva de 10 x (resolução de 0,75 um/pixel). As lâminas foram fixadas em solução 1:1 de acetona:metanol durante 10 min e coradas utilizando um aparelho de coloração de ação capilar LL personalizado para CD3l (anti-CD3l de hâmster 1:50 com Alexa 647 anti-hâmster secundário) e Hoechst 33342 (corante . nuclear). Após a visualização fluorescente de CD31l e Hoechst 33342, as seções foram contracoradas de modo claro
' 15 com hematoxilina, montadas e visualizadas em campo claro.
Análises da imagem: as imagens foram reduzidas até a resolução de 1,5 um/pixel para melhorar a manipulação no software Image J.
Com algoritmos fornecidos pelo usuário, grande quantidade de imagens foram então criadas, alinhadas e cortadas até os limites de tecido tumoral com os artefatos a removidos; necrose foi adicionalmente cortada oe baseando-se na imagem de hematoxilina.
O lúmen da bexiga foi artificialmente traçado ao longo do limite do tecido tumoral nas imagens de Hoechst 33342. As macros de análise fornecidas pelo usuário foram executadas para gerar os seguintes tipos de dados: a) limiar: foi determinado manualmente para incluir a mancha positiva mas desconsiderou o fundo fora de áreas de necrose; a macro determina o número de pixels positivos incluídos ou excedendo esse limite e foi reportado como uma média para toda a seção tumoral, b) intensidade: foi reportada como a intensidade média de coloração para uma seção tumoral inteira, ou a intensidade média de pixels classificados com base nas suas distâncias de uma segunda mancha (ou seja: CD31) ou limite artificialmente traçado (lúmen da bexiga). Cálculos para determinar as médias + erro padrão foram realizados e exibições gráficas criadas usando o Microsoft Excel; a análise estatística de variância não paramétrica (testes de Kruskal-Wallis) foi realizada usando Prism v5 para o software Macs.
O microambiente tumoral da bexiga e a distribuição de HPGsS marcados com rodamina no tecido tumoral foram avaliados.
Os tecidos tumorais de bexiga eram altamente o vascularizados, com uma distância média de 40 a 60 um para o vaso sanguíneo mais próximo (Figura 30A). Nenhuma . diferença significativa foi observada entre os diferentes grupos (P = 0,8). A quantidade de fluorescência dentro dos ' 15 tumores de bexiga inteiros foi medida.
HPG-Cg/,10-MePEG-NH, marcado com rodamina (HPG-Cg/10-MePEG-NH;-TMRCA) exibiu a maior absorção do tumor em comparação com os outros grupos (P = 0,037). Não houve diferença significativa (P > 0,05) na absorção do tumor das bexigas instiladas com rodamina livre (TMRCA) e HPG-Cg/10-MePEG marcado com rodamina (Figura 30B). O perfil de profundidade da absorção da rodamina nos oe tecidos tumorais foi avaliado em função da distância do lúmen da bexiga.
Nanopartículas de HPG-Cg,10-MePEG-NH,;-TMRCA demonstraram a melhor absorção tumoral em todas as distâncias do lúmen, exibindo um aumento de 5 a 6 vezes em relação às nanopartículas de HPG-Cg/10-MePEG-TMRCA (Figura
30C
EXEMPLO 24: Síntese e caracterização de HPG-Cg/10-MePEG e HPG-Cg/10-MePEG-COOH A polimerização dos HPGs modificados com núcleo O/DGE foi realizada de acordo com os protocolos descritos no nosso relatório anterior (Kainthan, R.
K.; Brooks, D.
E.
Bioconjugate Chem. 2008, 19, 2231-2238). A funcionalização dos HPGs de núcleo modificado Cg/19 foi realizada de acordo com protocolos relatados anteriormente (Haxton, . J.; Burt, H.
M.
Dalton Trans. 2008, 5872-5875). Para uma reação típica, 5,0 g de HPG-Cg10-0H ou HPG-Cg,/io-MePEGs,5s foi dissolvido em 100 mL de piridina e a solução foi mantida sob uma atmosfera de nitrogênio, seguido pela adição de dimetilaminopiridina e anidrido succínico, que foram ajustados de acordo com a quantidade alvo dos grupos de ácido carboxílico em HPGs.
Para a síntese de HPG com a maior quantidade de grupos COOH, todos os grupos hidroxila o livres disponíveis foram alvejados para a modificação de carboxilatos; portanto, quantidades em excesso de . dimetilaminopiridina (0,075 g, 0,61 mmol) e de anidrido succínico (4,5 g, 45 mmol) foram adicionadas à mistura ' 15 reacional.
Através do cálculo dos mols teóricos dos grupos hidroxila livres, foi determinado que havia 348 mols dos grupos hidroxila livres por mol de HPG e, assim, teoricamente, o mesmo número de grupos carboxila por mol de HPG.
Portanto, o HPG resultante foi nomeado de HPG-Cg/107 MePEGç«,5-COOH318. Oo uso de quantidades menores de dimetilaminopiridina (0,015 g, 0,12 mmol) e de anidrido o succínico (0,9 g, 9 mmol) produziu HPGs em que nem todas as hidroxilas livres foram alvejadas para modificação.
O número teórico de grupos carboxilato adicionados ao HPG foi determinado através do cálculo do número de mols de anidrido succínico adicionados à mistura reacional.
Portanto, este HPG contendo baixo teor de carboxilato foi nomeado HPGCg/10-MePEGç«,s-COOH;113. Após a adição de dimetilaminopiridina e do anidrido succínico, a solução foi agitada usando uma barra de agitação magnética de um dia para o outro em temperatura ambiente.
Água deionizada (100 mL) foi adicionada ao frasco e a mistura foi mantida sob agitação durante 30 min.
Os solventes foram removidos por rotaevaporação com a adição periódica de água para permitir melhor evaporação da piridina por destilação azeotrópica. Os produtos finais foram dissolvidos em metanol e dialisados contra uma mistura 80:20 de metanol/água deionizada durante 3 dias usando à tubulação de diálise de acetato de celulose (MWCO 10000 g/mol, Spectrum Laboratories Inc., Rancho Domunguez, CA). O meio de diálise foi trocado a cada 8 h, cada vez com uma concentração de metanol menor, até que durante os três estágios finais, O médio de diálise foi de 100% de água. Os polímeros foram o obtidos por liofilização. RMN *? C de HPG-Cg/10-MePEG-COOH (400 MHz, metanol-d) - õe: O (tetrametilsilano, referência interna), 14,73 (CHs, alquila em O/DGE), 23,92-33,24 (C(O0) CH;CH;COOH), 48,51-49,86 1 15 (solvente, metanol-d,), 59,29 (CH3;O-MePEG), 64,19-65,36 (- CHOH, grupos álcoois primários no polímero que não reagiram), 69,98-73,74 (-CH2-0-, -CH-O em polímero), 78,93- 80,14 (CH no polímero), 173,84-174,16 (C(O)CHCH;COOH), 175,92 (C(O) CHXCH.COOH). Na preparação de todos os HPGs funcionalizados, quantidades alvo dos grupos MePEG e COOH foram adicionadas oe às misturas reacionais. As quantidades alvo de MePEG e COOH de vários HPGs funcionalizados estão resumidas na Tabela
13. Os rendimentos reacionais para os HPGs muito ou pouco funcionalizados com carboxilato foram de 84 e 74%, respectivamente. Polímeros de HPG são descritos pela seguinte nomenclatura: HPG-Cg/10-MePEGA-COOHB, em que HPG- Cg/10 representa o HPG alquil substituído, A é o conteúdo alvo de MePEG conjugado com o polímero, com base na estequiometria dos reagentes (mols de MePEG/mol do iniciador TMP) e B é o conteúdo molar esperado de COOH por mol de polímero HPG, com base no peso molecular calculado do polímero a partir de dados de GPC.
Tabela 13 Propriedades de uma Série de Poligliceróis Hiperramificados Derivatizados de Alquila Cg/10 com Superfície Modificada Composição Dados de Peso molecular “ polimérica * titulação * COOH Mo PDI Tamanho de (mol /mol (g/mol) (M/Mn) partícula * HPG) (nm) HPG-Cg/10-0H N/A N/D N/D 9,2 + 3,5 o HPG-Cg/10-MePEGs.5 N/A 7,6 x 1,2 8,7 + 3,8 - 10º HPG-Cg/10-COOH N/D N/D N/D 5,3 + 1,8 | HPG-Cg/10-MePEGs,5- 318 1,3 x 1,4 5,9 + 2,1 COOH346 10º HPG-Cg/10-MePEGç«.5=- 87 9,1 x 1,3 7,4 + 3,0 COOH113 10º oe ºA nomenclatura é designada como a seguir.
HPG-Cg/10-O0H é o “polímero base” e todos os outros tiveram a superfície modificada com MePEG e COOH, expressos como o número teórico de mols de grupo de superfície adicionados na reação por mol de HPG.
Mols dos grupos de COOH por mol de HPG conforme determinado por titulação baseada no pH. “Peso do peso molecular médio e índice de capacidade de polidispersão determinado por GPC.
O número do peso molecular médio é calculado por Mw/PDI. “Tamanho de partícula (diâmetro), conforme determinado pelo espalhamento de luz dinâmico.
Análise de RMN
Após a purificação, todos os HPGs foram caracterizados pela análise de RMN. Os espectros de RMN dos polímeros de HPG foram obtidos usando um espectrômetro Avance II+ Bruker a 400 Mhz (Bruker Corporation, Milton, ON). Os polímeros foram dissolvidos em DMSO-d; ou metanol-d, (Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA). Espectros de próton e de carbono unidimensionais foram obtidos, bem como experimentos de coerência heteronuclear simples quântica | multiplamente editada (HSQC), correlação heteronuclear de | múltiplas ligações (HMBC) e experimentos de RMN HSQC-TOCSY oe (espectroscopia de correlação total). Os deslocamentos químicos foram referenciados para o pico de solvente ' residual. Os espectros bidimensionais foram analisados usando Sparky (T. D. Goddard e D. G. Kneller, Sparky 3, " 15 Universidade da Califórnia, São Francisco). As frações molares de COOH nos HPGs foram estimadas a partir dos dados de HSQC como a seguir: Para cada uma das modificações, o pico correspondendo aos quatro prótons do metileno foi integrado e a sua integral foi corrigida para o número de prótons. Esse valor foi dividido pela integral do grupo metila de TMP (corrigido para a multiplicidade de prótons) oe para produzir a fração molar de COOH.
A partir da figura 31, pode ser visto que todos os picos de polímeros HPG-Cg/10-MePEG« 5-COOH funcionalizados foram atribuídos aos componentes estruturais dos HPGs e eram consistentes com relatórios anteriores (Kainthan, R.
K.; Mugabe, C; Burt, H. M.; Brooks, D. E. Biomacromolecules 2008, 9, 886-895; Kainthan, R. K.; Janzen, J.; Kizhakkedathu, J. N.; Devine, D. V.; Brooks, D. E.
Biomaterials 2008, 29, 1693-1704; Haxton, K. J.; Burt, H.
M. Dalton Trans. 2008, 5872-5875). HSQC, HMBC e HSQC-TOCSY foram usados para estimar as frações dos substituintes, da cadeia Cg/10, do MePEG e do COOH em HPGs usando volumes de
NO NS Do 122 pico integrados.
Grau de ramificação e grau de polimerização Polímeros hiperramificados são tipicamente caracterizados pelo grau de ramificação (DB) e pelo grau de polimerização (DPn) usando as seguintes equações (Hólter, D.; Burgath, A.; Frey, H.
Acta Polym. 1997, 48, 30-35): DESTE, 2 (2 onde DB é o grau de ramificação, D, L3 e Lu o representam as frações de unidades dendríticas, lineares 1- 3, e lineares 1-4, respectivamente.
As estruturas das . unidades de repetição dendríticas e lineares do glicidol que estão presentes na estrutura hiper-ramificada estão ] 15 resumidas na Figura 32. Além disso, o grau de polimerização (DPn) destes polímeros é calculado da seguinte forma (Sunder, A.; Hanselmann, R.; Frevy, H.; Mu ' lhaupt, R.
Macromolecules 1999, 32, 4240-4246): DP = T+lu+lu+D, " T-D e oe onde D, li3 e Lá, são definidos como acima, T representa a fração de unidades terminais e fc é a funcionalização da molécula do núcleo (que é 3 para TMP). D é dado pela soma das unidades primária e secundária, Dp e Ds (Ver Figura 32) e Li3, Lu e T são definidos de forma análoga.
Quando uma combinação de experimentos de HMBC 2D e HSQC-TOCSY é utilizada, uma série de picos correspondentes às unidades primárias e secundárias de Li3, Lu, T e D foram atribuídos para um polímero de HPG não modificado (que foi sintetizado como material de referência, sem componente alquila Cs, e sem adição de MePEG ou modificação carboxila, dados não mostrados) e os volumes de pico de um HSQC multiplamente editado foram usados para calcular DB e DPn.
Os resultados obtidos para o nosso HPG não modificado foram DB) 0,51 e DPn) 14,83, e as abundâncias relativas para as unidades estruturais é de 39% para unidades lineares, 20% para unidades dendríticas e 41% para unidades terminais.
Esses valores estão de acordo com os valores da literatura (Sunder, A.; Hanselmann, R.; Frey, H.; Mu 'lhaupt, R.
Macromolecules 1999, 32, 4240-4246; Hólter, D.; Burgath, A.; Frey, H.
Acta Polym. 1997, 48, 30-35). Ao o comparar o espectro HSQC do HPG modificado com as cadeias alquila Cg/10 (HPG-Cg/10-O0H), com o espectro HSQC do HPG não . modificado, dois novos picos são visíveis na região espectral do núcleo polímero do primeiro (figura 33). Um ' 15 pico foi atribuído ao grupo R-metileno da cadeia alifática, enquanto que o segundo pico não pôde ser atribuído sem ambiguidade.
Com base nos deslocamentos químicos, este pico pode corresponder a uma unidade T com uma cadeia alquila ligada ao grupo hidroxila secundária; no entanto, esta especulação não pôde ser confirmada.
Uma situação semelhante foi observada para HPG-MePEGs,s.
O pico do grupo | o R-metileno do MePEG pôde ser atribuído, mas o pico adicional, desconhecido, não pôde ser atribuído sem ambiguidade.
Semelhantemente ao HPG-Cg/10-OH, os deslocamentos químicos do novo pico são semelhantes a uma unidade tipo Lu.
Em suma, DB e DPn não puderam ser calculados a partir dos dados de RMN devido à falta de atribuição de sinais de modo não ambíguo.
Os dados de RMN permitem uma caracterização direta dos grupos hidroxila livre através da observação de unidades lineares ou terminais e da confirmação de que todos os padrões e modificações da ramificação esperadas (alquila, MePEG e carboxila) estão presentes.
A figura 33 ilustra os vários picos atribuídos em espectros de RMN, mostrando a presença do padrão de ramificação esperado e dos grupos MePEG, cadeias alquila e COOH.
Frações molares de COOH Para todos os polímeros de HPG modificados com COOH, as frações molares de COOH foram estimadas a partir dos espectros de RMN HSQC. Por esse método, o número de grupos COOH no polímero de HPG não é um número absoluto, porque ele é expresso como em relação aos grupos TMP metílicos presentes na amostra. É considerado que cada molécula de o HPG contém apenas um TMP; no entanto, a quantidade de TMP por mol de HPG no vários lotes do polímero não foi . independente quantificada. Portanto, esses números servem como um indicador qualitativo de quantos grupos hidroxila ' 15 foram protegidos com COOH. Além disso, devido ao fato dos polímeros HPG-Cg/10-MePEGç«, 5-7 COOH terem sido ambos sintetizados a partir do mesmo lote de HPG-Cg/10-MePEGçs,5, espera-se que o teor de TMP seja idêntico e que os espectros de RMN possam ser comparados para determinar a quantidade relativa de COOH nos dois polímeros HPG-Cg/10- MEePEG«,5-COOH. As razões molares indicam que há um maior oe teor de COOH de 2,8 vezes no HPG-Cg/1o0-MePEG«s,s-COOH3«g em comparação com HPG-Cg/,1o0-MePEG«,5s-COOH13. Isso está de acordo com a razão de 3,1 vezes do teor de COOH alvo nos dois polímeros. Para os polímeros HPG-Cg/10-COOH e o HPG-Cg/107 MEePEGç«,5-COOH3.s de alta densidade carboxila, nenhum pico correspondendo aos grupos lineares ou terminais foram observados, indicando que não há grupos hidroxila presentes neste polímero (ver Figura 34 para um espectro de RMN representativo). Para o polímero com baixa densidade de COOH, HPG-Cg/10-MePEG«,5-COOH113, OS picos dos grupos lineares e terminais foram observados além dos novos Ppicos, indicando apenas uma saturação parcial dos grupos hidroxila com ácidos carboxílicos (dados não mostrados). FT-IR Os espectros de FT-IR para os HPGs foram obtidos utilizando um espectrômetro FTIR da Perkin-Elmer (Perkin- Elmer, Woodbridge, ON) com um acessório de amostragem ATR universal.
A faixa de varredura foi de 4000 a 650 cm* com uma resolução de 4 cm '. Os espectros de FT-IR de HPG-Cg/10-MePEG«s.5, HPG-Cg/107 MePEGç«.5-COOH3.g E HPG-Cg/10-MePEG«s,5-COOH1; são mostrados na Figura 35. O pico a 2800-3000 cm'* é consistente com as o vibrações C-H e ocorre em todos os HPGs.
Os picos em 1680- 1780 cm'* surgiram das bandas CdO, indicando a presença de . grupos COOH nos polímeros HPG-Cg/10-MePEG-COOH.
Os picos em 1200-1400 e 1000-1180 cm-1 surgiram de uma flexão C-H e da ' 15 vibração C-O, respectivamente, e, portanto, eles podem ser encontrados em todos estes polímeros.
Ao comparar os espectros de FT-IR de HPG-Cg/10-MePEGs,.5, the HPG-Cg10" MePEGçs,5-COOH 13, e HPG-Cg/10-MePEGç«, 5-COOH318, pode ser observado que o pico de OH (3300 - 3500 cm-1) diminui e o pico de Cdo (1680-1780 cm-1) no HPG-Cg/1o0-MePEG-COOH aparece, indicando os grupos OH foram consumidos e oe convertidos em COOH.
O espectro do HPG-Cg/10-MePEGs,s-COOH3468 mostrou a eliminação próxima do pico OH, indicando que os grupos OH foram consumidos e convertidos em grande escala ao COOH, enquanto que O pico de OH para HPG-Cg/10-MePEGs,57 COOH113 foi diminuído, mas ainda evidente, de acordo com os resultados de RMN.
Além disso, o último HPG também mostra um pico de CdO menor, indicando uma razão molar mais baixa de COOH em comparação com o HPG-Cg/10-MePEG«s,s-COOH3a8g.
OS dados de FT-IR mostraram boa evidência para apoiar as mudanças na funcionalização dos HPGs e também confirmaram que os reagentes que não reagiram foram removidos pelos procedimentos de purificação.
Peso molecular os peso do peso molecular médio (Mw) e as polidispersões dispersões (PDI) dos HPGs foram determinados por cromatografia de permeação em gel (GPC) equipado com um detector de espalhamento de luz laser multiângulo (MALLS) (GPC-MALLS) e um detector Optilab RI (Wyatt Technology Inc., Santa Barbara, CA). Solução de nitrato de sódio aquosa 0,1 N foi utilizada como a fase móvel em uma vazão de 0,8 mL/min.
Os detalhes foram descritos em um relatório anterior (Kainthan, R.
K.; Brooks, D.
E.
Bioconjugate Chem. o 2008, 19, 2231-2238; Kumar, K.
R.; Kizhakkedathu, JJ.
N.; Brooks, D.
E.
Macromol.
Chem.
Phys. 2004, 205, 567-573). Os . valores de dn/dc para vários HPGs foram determinados como sendo de 0,146, 0,165 e 0,138 para HPG-Cg/10-MePEG«s,5, HPG- ' 15 Cg/107MePEGÇ«,57-COOH3a8 e HPG-Cg/10-MePEG«,5-COOH113, respectivamente, em soluções aquosas de NaNO3 O,1 N, e foram utilizados para o cálculo do peso molecular dos polímeros.
Os dados foram processados usando o software Astra fornecido por Wyatt Technology Corp.
Os números dos pesos moleculares médios dos polímeros foram calculados dividindo Mv por PDI. oe Os pesos moleculares e as polidispersões destes HPGs são mostrados na Tabela 13. Os HPGs funcionalizados (HPG- Cg/10-MePEGs,5-COOH) mostraram um aumento no peso molecular em comparação com HPG-Cg/,/10-MePEGs,5s.
Além disso, foi verificado que após a funcionalização da superfície, as polidispersões dos de polímeros não foram alteradas significativamente, indicando uma modificação da superfície relativamente uniforme.
Os valores do peso molecular foram semelhantes aos relatados anteriormente para HPG-Cg/10-MePEG (Kainthan, R.
K.; Mugabe, C; Burt, H.
M.; Brooks, D.
E.
Biomacromolecules 2008, 9, 886-895; Kainthan, R.
K.; Janzen, J.; Kizhakkedathu, IJ.
N.; Devine, D.
V.; Brooks, D.
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Biomaterials 2008, 29, 1693-1704; Mugabe, C; Hadaschik, B.
A.; Kainthan, R.
K.; Brooks, D.
E.; So, A.
I.; Gleave, M.
E.; Burt, H.
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BJU Int. 2009, J 03, 978-986; Kainthan, R.
K.; Brooks, D.
E.
Bioconjugate Chem. 2008, 19, 2231- ' 2238). Titulação dos grupos COOH Titulações potenciométricas/pH para quantificar a concentração total de HPGs com COOH enxertado na superfície foram realizadas em um titulador T-50 M (Mettler Toledo, Mississauga, Ontário). Amostras de HPG-Cg,10-MePEGs,s-COOH348 o e de HPG-Cg/10-MePEGç«,5-COOH113 foram dissolvidas na concentração de 0,2 mg/ml em 10 mL de NaOH 10 mM.
O pH de . cada solução foi manualmente aumentado até cerca de 11 pela adição de NaOH 0,1 M.
As amostras foram a seguir tituladas 7 15 com HCl 0,01 M.
As injeções foram estabelecidas em uma faixa dinâmica de 10 a 50 pl, e um intervalo de tempo de 30 a 60 s entre injeções era para garantir que o equilíbrio foi estabelecido.
As titulações terminaram quando o PH atingiu 3.0. Os pontos finais das titulações foram determinados utilizando o método de extrapolação/intersecção padrão.
Os valores da titulação de ) COOH relatados representam a média de três medições.
As razões molares dos grupos COOH conjugados com os HPGs foram medidas por titulação potenciométrica/pH (Tabela 13) e demonstraram boa concordância com as razões em mol alvos e os pesos moleculares medidos.
Por exemplo, o peso molecular do HPG-Cg/10-MePEG«s,5-COOH13 também pode ser calculado pela adição do número do peso molecular médio de HPG-Cg/10-MePEG«,5 (6,3 X 10º) com o peso molecular atribuído aos grupos COOH, que é igual ao número de grupos carboxilato por molécula de HPG (87 de acordo com os dados de titulação) multiplicado pelo peso molecular do grupo carboxilato (101 g/mol). Com base nesse cálculo, o número
Dn a Pe o | 128 do peso molecular médio de HPG-Cg/10-MePEG«,5-COOH113 É 7,2 xXx 10º g/mol, de acordo com o valor medido (7,0 x 10º g/mol). Solubilidade As características de solubilidade dos polímeros HPG foram avaliadas pela dissolução de pesos conhecidos do polímero em vários tampões aquosos ou água destilada.
As amostras foram suavemente agitadas em vórtice para acelerar a dissolução.
A absorvância das soluções poliméricas a 550 nm foi medida regularmente para sinais de turbidez por vários dias avaliar se o polímero permaneceu em solução. o Para alguns dos polímeros HPG derivatizados de ácido carboxílico, o pH da solução foi ajustado para facilitar a . dissolução.
Como potenciais nanotransportadores de fármaco, as ] 15 características de solubilidade em meio aquoso destes polímeros são críticas.
Verificou-se que o polímero HPG- Cg/10-MePEG tinha boa solubilidade em água (maior que 100 mg/mL) em água destilada, tampão PBS (pH 7,4) e urina sintética.
Verificou-se que HPG-Cg/10-COOH é praticamente insolúvel em meios aquosos ou PBS (pH 7,4) e é apenas solúvel em soluções alcalinas, como NaOH 0,1 N, devido à oe maior diminuição no pH neutro.
Os componentes hidrofóbicos (cadeias alquila) do núcleo HPG provavelmente dominaram as características de solubilidade.
HPGs derivatizados com carboxilato também conjugados com grupos MePEG apresentaram maior solubilidade em água.
Assim, verificou-se que HPG- Cg/10-MePEG«s,5s-COOH;113 poderia ser completamente dissolvido em PBS 10 mM em uma concentração de 100 mg/ml sem aquecimento, embora o pH da solução tenha diminuído de 7,4 para 4,5. HPG com uma maior quantidade de carboxilato (HPG-Cg/10-MePEG6«,5- COOH318) foi pouco solúvel em água ou em tampão PBS e excedeu a capacidade tamponante, resultando na acidificação do tampão PBS e reduzindo o pH de 7,4 para cerca de 3,8. A solução apresentou significativa turbidez, conforme medido pela absorvância a 550 nm, demonstrando uma fração residual insolúvel do polímero (dados não mostrados). A adição de hidróxido de sódio foi necessária para atingir uma concentração de 100 mg/ml e uma solução límpida em pH 4,25. Tamanho de partículas e potencial zeta As análises do tamanho de partículas e do potencial zeta foram realizadas utilizando um analisador de tamanho de partículas Malvern NanoZS (Malvern Instruments Ltd., Malvern, Reino Unido) usando cubetas de dimensionamento o descartáveis. As soluções poliméricas em uma concentração de 15 mg/ml foram preparadas em NaCl 1 mM em pH 6,0 e foram . filtradas com filtro de seringa de 0,22 pm (Pall Life Sciences, Ann Arbor, MI) antes da medição. ' 15 Polímeros HPG terminados em carboxila tinham tamanhos de partícula na faixa de 5 a 10 nm (Tabela 13). OS potenciais zeta das nanopartículas foram fortemente negativos em -41,2 t+ 3,2 e -60,3 + 2,1 mV para HPG-Cg/107 MePEGç,5-COOH113 E HPG-Cg/10-MePEG6«,5-COOH3a«8g, respectivamente. A diminuição do potencial zeta é atribuída ao número de grupos carboxila conjugados com a superfície dos HPGs.
oe EXEMPLO 25: Ligação de cisplatina aos HPGs A ligação da cisplatina aos HPGs modificados com carboxila foi avaliada através da preparação de soluções 10 mo/mL dos polímeros em NaOH 0,01 M. A essas soluções, a cisplatina foi adicionada de modo que a concentração final do fármaco variou de 0,5 a 4 mg/mL. O pH de cada solução foi ajustado para 6,0 com pequenos volumes de NaOH 5 M. As soluções foram incubadas de um dia para o outro a 37 ºC, com agitação a 50 rpm. As soluções foram transferidas para os dispositivos de filtração centrífuga Omega Nanosep 3 K (Pall Life Sciences, Ann Arbor, MI) e centrifugadas a 5000 rpm durante 10 min. Um pequeno volume do filtrado (10 a 40 uL) foi diluído para 400 ul com NaOH 0,01 M e a concentração da cisplatina não ligada no filtrado foi analisada por um ensaio colorimétrico de o-fenilenodiamina (OPDA) descrito anteriormente (Haxton, K.
J.; Burt, H.
M.
Dalton Trans. 2008, 5872-5875). A concentração da cisplatina ligada ao HPG foi determinada subtraindo-se a concentração da cisplatina não ligada no filtrado a partir da concentração inicial do fármaco adicionado ao HPG.
A ligação da cisplatina aos HPGs foi conseguida através da coordenação do fármaco aos grupos carboxilato o terminais no polímero (Figura 36). Para o HPG-Cg/10-MePEGçs,57 COOH113, a cisplatina se ligou ao polímero com eficiência de . quase 100% até um máximo de 1 mg/mL (10% p/p; Figura 37). Acima desta concentração, o fármaco livre foi detectado no ' 15 filtrado, indicando a saturação dos sítios de ligação de carboxilato e a presença de fármaco não ligado no meio.
HPG-Cg/10-MePEG«,5-COOH31g Se ligou até 2 mg/mL com 100% de eficácia antes do fármaco livre ser detectado no filtrado.
Este aumento no fármaco ligado é atribuído ao maior número de grupos carboxilato e, deste modo, o número de sítios de ligação de cisplatina no HPG-Cg/10-MePEGç6,5-COOH348 em ) comparação com o HPG-Cg/10-MePEGçs,5s-COOH113. EXEMPLO 26: Liberação da cisplatina in vitro A cisplatina foi ligada aos HPGs modificados com carboxilato conforme descrito acima com as concentrações de polímero final e de cisplatina 10 e 1 mg/mL, respectivamente.
Nas unidades de minidiálise Slide-A-Lyzer, 7000 MWCO (Thermo Scientific, Rockford, IL), 20 1pL, da solução de polímero ligado à cisplatina, ou uma solução de 1 mg/ml da solução de cisplatina livre foram adicionados e as amostras foram dialisadas a 37 ºC, com agitação, contra 4 L de PBS 1 mM ajustado para os pHs de 4,5, 6,0 e 7,4 ou urina sintética em pH 7,0. Urina sintética (Surine) foi comprada de Dyna-Tek Industries (Lenexa, KS). Nos pontos de tempo pré-determinados, três unidades de diálise foram removidas do meio de liberação, e todo o conteúdo foi removido com três lavagens da unidade de diálise seguido pela diluição de 1 mL com meio de liberação fresco.
A concentração de cisplatina dos conteúdos das unidades de diálise foi determinada pelo ensaio colorimétrico OPDA.
A porcentagem cumulativa de fármaco liberado foi calculada subtraindo a quantidade do fármaco remanescente da quantidade inicial do fármaco na bolsa de diálise no início oe do experimento.
Os dados foram expressos como porcentagem cumulativa de fármaco liberado em função do tempo. . A liberação da cisplatina livre em PBS foi rápida e 100% concluída em 7 h, demonstrando que a membrana não ] 15 impediu a liberação do fármaco livre até qualquer grande | extensão (Figura 38). Para todas as amostras de HPG ligado à cisplatina, verificou-se que o fármaco é liberado de maneira controlada, consideravelmente mais lento do que o fármaco livre.
Em PBS, independentemente do pH, a cisplatina ligada ao HPG-Cg/10-MePEG«,s-COOH;1:13 foi liberada quase que na mesma taxa em PBS com aproximadamente 5% o liberado nas primeiras 2 horas, 40% liberado depois de 1 dia e até 90% liberado após 7 dias.
A cisplatina ligada ao HPG-Cg/10-MePEG6g,5-COOH3«g nos pHs de 6,0 e 7,4 liberou o fármaco em PBS em taxas similares, de forma quase linear, com aproximadamente 3% da cisplatina ligada liberado em 2 h, 20% liberado em 1 dia e até 70% durante 7 dias.
A taxa de liberação para a cisplatina ligada ao HPG-Cg/10-MePEG«s,5s7 COOH3a6e em pH 4,5 foi mais rápida do que os suas opostas de pH mais elevado, com um perfil de liberação semelhante ao do HPG-Cg/107MePEGç«,5-COOH113. A taxa de liberação da cisplatina foi consideravelmente mais rápida na presença de urina, com pouco mais de 10% da dose liberada em 2 he a liberação completa do fármaco durante 2 dias para o HPG- Cg/10-MePEG«,5-COOH11;3 e 3 dias para HPG-Cg/,10-MePEGç,5-COOHs34e. Semelhante à liberação em PBS, a diferença da liberação de cisplatina entre os dois HPGs pode ser atribuída ao maior número de grupos carboxilato presentes no HPG-Cg/,10-MePEGs,57 COOH3.e. Como a urina é uma mistura complexa composta de vários componentes, não se pode afirmar que compostos são responsáveis pela maior liberação da cisplatina dos HPGs; no entanto, essa maior taxa de liberação pode ser vantajosa, fornecendo um mecanismo pelo qual a liberação do o fármaco aumenta por meio da diluição com urina. Por meio do deslocamento da cisplatina do HPG é possível que compostos . contendo nitrogênio na urina, como ureia, ácido úrico e creatinina podem se ligar e inativar a cisplatina. Embora 7 15 tenha sido demonstrado que a cisplatina complexa com estes compostos até certo grau, foi determinado que a maior parte da cisplatina presente na urina após a administração IV está na forma originalmente administrada e no produto de hidrólise monoaquoso altamente ativo (Tang, X.; Hayes Ii, J. W.; Schroder, L.; Cacini, W.; Dorsey, J.; Elder, R. C; Tepperman, K. Met. Based Drugs 1997, 4, 97-109). À luz o desta constatação, é provável que a maior parte da cisplatina liberada na forma de HPGs na urina é uma forma farmacologicamente ativa.
EXEMPLO 27: Avaliação da citotoxicidade Estudos de citotoxicidade foram realizados usando O ensaio de proliferação de células MTS (Promega, Madison, WI). Este ensaio não mede efeitos citolíticos imediatos dos agentes, mas mede o efeito do polímero sobre a proliferação celular durante longos períodos de tempo. Neste estudo, as células cancerosas da bexiga KU-7-luc foram gentilmente fornecidas pelo Dr. M. Tachibana (Universidade Keio, Tóquio, Japão). As células foram plaqueadas a 5000 células/poço em placas com 96 poços em 180 uL, de meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM), (Invitrogen Canada, Inc. Burlington, ON) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) (Invitrogen Canada, Inc. Burlington, ON), | 5 penicilina-estreptomicina 1% e L-glutamina 1% e deixado crescer durante 24 horas a 37 ºC em CO2 a 5% para atingir cerca de 80% de confluência para oS ensaios de citotoxicidade. As células foram a seguir incubadas durante 2 ou 72 h com HPGs apenas, variando de 0,01 a 100 mg/mL, ou cisplatina livre ou HPGs carregados com cisplatina com o concentrações de fármaco variando de 0,01 a 100 pug/mL. Após o tratamento, as células foram lavadas duas vezes com . solução salina balanceada de Hank (HBSS) e 180 ul de meio de cultura fresco foram adicionados em cada poço e as ' 15 células cresceram durante 72 h. A proliferação dessas células foi medida usando um ensaio de proliferação de células não radioativo aquoso CellTiter 96 (Promega, Madison, WI), conforme descrito anteriormente (Mugabe, C; Hadaschik, B. A.; Kainthan, R. K.; Brooks, D. E.; So, A. I.; Gleave, M. E.; Burt, H. M. BJU Int. 2009, 103, 978- 986) . Resumidamente, 180 ul de uma solução a 10% v/v de 3- oe (4, 5S-dimetiltiazol-2-il)-5- (3-carboxilmetonifenol)-2-(4- sulfofenil)-2H-tetrazólio em HBSS foi adicionado a cada poço e as células foram incubadas durante 2 h. A —absorvância foi medida em 490 nm, com uma referência de 620 nm utilizando um leitor de microplacas.
Os efeitos de inibição dos HPGs não carregados com fármaco e HPGs carregados com cisplatina sobre as células cancerosas da bexiga KU-7-luc foram investigados para os tempos de incubação de 2 e 72 h (Figura 39). Estes tempos de incubação foram escolhidos para permitir a imitação do período de instilação intravesical típico, bem como para realizar comparação contra as concentrações inibitórias previamente determinadas para a cisplatina.
Concentrações inibitórias em 50% (ICso)) para incubações de 2h foram determinadas como sendo de 1,3, 45,7, 47,0 e 63,0 mg/mL para HPG-Cg/10-0H, HPG-Cg/10-MePEGs,5, HPG-Cg/10-MePEGç«,5-COOH348 e HPG-Cg/10-MePEGç,5-COOH1 13, respectivamente.
Quando uma incubação durante 72 h foi usada, os polímeros inibiram a proliferação celular em um grau maior do que o verificado com uma incubação de 2 h.
O HPG-Cg/10-0H e HPG-Cg/10-MePEG6«,5 tinham ICsos de 0,1 e 0,2 ma/mL, respectivamente.
A TICso para os HPGs modificados com carboxilato diminuiu o aproximadamente dez vezes; no entanto, estes polímeros ainda exibiram um alto grau de compatibilidade celular com
. valores de ICs de aproximadamente 5 mg/mL.
A excelente biocompatibilidade global do HPG-Cg/10-MePEG e do HPG-Cg/107
' 15 MePEG-COOH provavelmente decorrem da compatibilidade celular conhecida das superfícies MePEG, assegurando pouca interação com a membrana plasmática das células.
O benefício adicional da carboxilação pode ser derivado da carga negativa líquida desta porção em um pH 7,4,
estabelecendo uma ligeira força repulsiva com a superfície da célula negativamente carregada.
Após um período de o incubação de 72 h, a cisplatina livre inibiu a proliferação celular de KU-7-luc com uma ICs, de 1 pg/ml (figura 40A), consistente com relatórios anteriores para esta combinação de fármaco e célula (Hadaschik, B.
A.; ter Borg, M.
G.; Jackson, J.; Sowery, R.
D.; So, A.
I.; Burt, H.
M.; Gleave,
M. E.
BJUINt. 2008, 101, 1347-1355). Com um período de incubação de 2 h, esse valor da 1ICs aumentou para aproximadamente 10 pg/ml (Figura 40B). Quando ligado aos polímeros HPG-Cg,/10-MePEG«s,5-COOH, a forma complexada da cisplatina também inibiu a proliferação de KU-7-luc com valores de ICso maiores observados para a incubação por 2 h (aproximadamente 50 ug/mL) em comparação com os valores de incubação de 72 (aproximadamente 5 upg/mL). Claramente, para ambas as incubações de 2 e 72 h, a forma complexada da cisplatina inibiu menos a proliferação celular do que o fármaco livre por um fator de quase 5. Este aumento da ICso para o fármaco complexado para os HPGs é provavelmente devido à lenta taxa de liberação do fármaco do polímero.
EXEMPLO 28: Penetração de DTX e mitomicina F das diferentes formulações no tecido de bexiga de porco com ou sem pré-tratamento A penetração de DTX das formulações de DTX e à o penetração de mitomicina F das formulações de mitomicina F no tecido da bexiga suína foram avaliadas.
Seções de tecido . de bexiga suína recém-retiradas foram montadas em células de difusão de Franz e foram tratadas com o fármaco ' 15 anticâncer DTX formulado em Tween 80, HPG-Cg/10-MePEG ou HPG-Cg/10-MePEG-NH, durante 2 horas.
Em alguns experimentos, o tecido da bexiga suína foi pré-tratados com solução de quitosana (sem fármaco) ou solução de HPG-Cg/10-MePEG-NH, (sem fármaco) durante 1 hora antes de ser tratado com DTX formulado em Tween 80, HPG-Cg/10-MePEG ou HPG-Cg/10-MePEG-NH,. Para estudos de penetração da mitomicina F, seções de oe tecido de bexiga suína recém-retiradas foram montadas em células de difusão de Franz e foram tratadas com formulações do fármaco anticâncer mitomicina F durante 2 horas.
O tecido da bexiga suína foi pré-tratado com solução de HPG-Cg/1o-MePEG-NH, (sem fármaco) durante 1 hora antes de ser tratado com formulações de mitomicina F.
A concentração de tecido versus os perfis de profundidade do tecido foram obtidos e as exposições do fármaco foram obtidas a partir de cálculos de área sob à curva (AUC). Acetonitrila e diclorometano grau HPLC foram obtidos de Fisher Scientific (Fairlawn, NJ). O fluido do líquido de cintilação, CytoScint”" ES, foi comprado de MP Biomedicals
(Irvine, XXX). Sais de Tyrode foram comprados de Sigma- Aldrich (St.
Louis, MO) (Tyrode contêm o seguinte em g/L: NaCl: 8,0, KCl: 0,3, NaH>;PO4.5H,0: 0,093, KH;PO,: 0,025, NaHCO3: 1,0, glicose: 2,0). Docetaxel foi obtido da Natural Pharma (Langley BC.
Canadá). Taxotereê 20 mg/0,5 mL comercial (Sanofi Aventis, Laval, QC) foi comprado de BC Cancer Agency no Hospital Geral de Vancouver.
DTX marcado com trítio em etanol foi comprado de Moravek Biochemicals (Brea, CA) com uma atividade específica de 23,2 Ci/mmol.
HPG-Cg/10-MePEG foi preparado pela adaptação do protocolo oe descrito no Exemplo 10 e HPG-Cg/io-MePEG-NH, foi preparado pela adaptação do protocolo descrito no Exemplo 18. . Quitosana foi fornecida por Novamatrix FMC.
Bexigas suínas foram compradas da Britco Inc. (Langley, BC). Bexigas . 15 urinário recém extirpadas foram retiradas do sítio de porcos com 6 a 10 meses de idade do sexo masculino pesando entre 90 e 113 Kg.
Os mols de amina por mol de HPG-MePEG-NH,; foram medidos para os polímeros de HPG-MePEG-NH; usando métodos diferentes, incluindo um método de titulação direto, um método de titulação pelo resto e um ensaio de fluorescamina oe (Tabela 14). Tabela 14 Medições de Mol de amina por mol de HPG- MePEG-NH,o Amostra Método de Método de Método de titulação titulação pelo| derivatização direta? resto” de (mol de (mol de fluorescamina”º amina/mol de amina/mol de (mol de HPG) HPG) amina/mol de HPG) (baixo teor)
(alto teor) “Método de titulação direto - titulado contra HCl Método de titulação pelo resto - titulado contra NaOH após a adição de uma quantidade conhecida de HCl “Quantificação de fluorescência após derivatização com fluorescamina (ensaio de fluorescamina descrito no Exemplo 15) Preparação de HPG-Cg/10-MePEG, HPG-Cg/10-MePEG-NH, e formulações de Tween 80 carregadas com DTX o HPG-Cg/10-MePEG e HPG-Cg/10-MePEG-NH, carregado com DTX foram preparados usando a técnica de evaporação de . solvente.
DTX e HPG-Cg/10-MePEG ou HPG-Cg/10-MePEG-NH> foram dissolvidos em acetonitrila e seco em uma estufa a 60 ºC " durante 1 h e esquichado com nitrogênio para eliminar traços do solvente orgânico.
Antes da secagem, a solução de polímero/fármaco foi reforçada com uma pequena alíquota de ?*H DTX.
A matriz de polímero/fármaco resultante foi reconstituída com tampão Tyrode a 60 ºC (pH 7,4) e agitada em vórtice durante 2 min.
A concentração final do fármaco foi de 0,5 mg/ml e ela foi usada a 37 ºC.
DTX foi preparado o 20 em Tween 80 diluindo a solução concentrada de TaxotereG& (contendo 40 mg de DTX e 1040 mg de Tween 80 por mL) com tampão tyrode para produzir uma concentração final de 0,5 mg/mL de DTX.
As soluções foram dopadas com uma pequena quantidade de *H DTX antes da diluição.
Preparação de formulações de mitomicina F A mitomicina F (MW = 363,4) foi preparada em tampão de Tyrode.
Ela foi recebida de American Radiolabeled Chemicals Inc (St Louis, MO) * Cat ART-1689. A atividade foi de 1 a 10 Ci/mmol, 1 mCi/mL em etanol.
A solução foi preparada dissolvendo 50 ul do estoque etanólico em 3 ml de tampão, uma diluição de 300x.
| 138 Preparação da solução de quitosana e solução de HPG- Cg/10-MePEG-NH; para uso como um pré-tratamento A quitosana usada para preparar as soluções de quitosana é PROTASAN” UP CL 213 (H do Produto: 4210106) e é baseada em uma quitosana onde entre 75 e 90% dos grupos acetila são removidos.
O polímero catiônico é um sal de cloreto solúvel em água altamente purificado e bem caracterizado.
Tipicamente, o peso molecular de PROTASAN UP CL 213 está na faixa de 150000 a 400000 g/mol (medido como acetato de quitosana). A solução de quitosana foi o preparada dissolvendo-a em água até uma concentração de solução de 0,5% p/v. . A solução de HPG-Cg/10-MePEG-NH, para uso como um pré- tratamento foi preparada dissolvendo HPG-Cg/10-MePEG-NH; em 7 15 acetonitrila.
A solução resultante foi seca em uma estufa a 60 ºC durante 1 h e foi esguichada com nitrogênio para eliminar traços do solvente orgânico.
O polímero resultante foi reconstituído com tampão Tyrode a 60 ºC (pH 7,4) e agitado em vórtice durante 2 min.
Preparação do tecido Bexigas suínas recém-extirpadas foram removidas do o excesso de tecido adiposo sobre a parede exterior e abertas longitudinalmente nos lados laterais esquerdo e direito e foram cortadas em pedaços de aproximadamente 2 cm x 2 cm em um banho raso de tampão tyrode a 37 ºC borbulhado com carbogênio (95% de O;/5% de CO;). Todos os estudos foram realizados em até 5 horas após o sacrifício.
O pedaços de bexiga foram montados em um aparelho de célula de difusão de Franz, de modo que Oo lado luminal da parede da bexiga foi exposto à solução do fármaco.
Estas seções de tecido não estavam esticadas e mediram aproximadamente 2 a 3 mm de espessura.
As câmaras receptoras foram preenchidas com 10 mL de tampão tyrode a 37 ºC (pH 7,4). O tecido em excesso foi cortado ao redor do perímetro da célula de difusão. A câmara doadora da célula de difusão foi preenchida com 1 mL de solução de fármaco de 0,5 mg/ml e a área de exposição do tecido foi 0,64 cm2. Cada célula de difusão foi definida em um banho com água raso e incubada a 37 ºC durante 2 horas. Para alguns experimentos, as amostras de tecidos foram pré- tratados com uma solução de quitosana (sem fármaco) ou uma solução de HPG-Cg/10-MePEG-NH; (sem fármaco) durante 1 hora antes de serem tratadas com as formulações carregadas com DTX ou mitomicina F. As amostras de tecido foram lavadas o três vezes com tampão tyrode para remover todo o fármaco não ligado. As amostras de tecido foram cortadas e BR rapidamente congeladas em placas de metal com nitrogênio líquido em um leito de gelo seco.
' 15 Secionamento com criótomo de tecido O tecido da bexiga congelado foi montado com Shandon Cryomatrix"” (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA) em um suporte do criótomo. O tecido da bexiga foi cortado com lâminas de criótomo de baixo grau Shandon MB35 Premier (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA) a -20 ºC em um criótomo eletrônico Shandon (Thermo Electron Corporation, Cheshire, o Inglaterra) com um sistema de refrigeração R404A. Os tecidos foram cortados. As seções de tecido foram colocadas em tubos eppendorf de 1,5 mL previamente pesados e armazenadas congeladas a -20 “ºC.
Quantificação do fármaco no tecido Duzentos upL de acetonitrila foram adicionados às fatias de tecido pesadas para a extração do fármaco. As amostras foram agitadas em vórtice até que todas as fatias de tecido estivessem livremente submersas em acetonitrila e foram deixadas em temperatura ambiente durante 24 horas para garantir a completa extração do fármaco. As amostras extraídas, incluindo todas as fatias de tecido, foram transferidas para frascos de cintilação e 5 mL de líquido de cintilação foi adicionado.
As contagens de *H DTX ou de *H mitomicina F foram medidas por contagem de líquido de cintilação e foram quantificados usando curvas de calibração da solução estoque original.
Análise dos perfis do nível de profundidade do tecido Os perfis de nível de profundidade do tecido foram analisados para concentrações médias de DTX ou mitomicina E em todas as camadas da parede da bexiga até o músculo, por exemplo, urotélio, lâmina própria e muscular.
Os níveis oe médios de tecido foram determinados como a quantidade total de fármaco encontrada na camada de tecido dividido pelo . peso total do tecido para aquela camada.
A área sob o perfil de profundidade do nível de tecido (AUC) foi - 15 calculada usando a regra do trapezoide linear, como a seguir. auci= X Cmztlx(0, +, izo 2 Onde t é a profundidade do tecido em pum e C é a concentração em upg/g. o Uma estimativa por extrapolação da concentração de fármaco pg/g) a O um foi necessária para calcular a AUC.
Dados para a penetração de DTX no tecido da bexiga suína a partir das formulações de DTX sem pré-tratamento são mostrados na Figura 41. Ambos dHPGs avaliados que continham amina resultaram em maior concentração de fármaco até profundidades de cerca de 1500 um, em comparação com as formulações sem amina, incluindo a formulação de Tween 80 (Taxotere6) e um dHPG que não continha nenhuma funcionalidade amina.
Observou-se que oO efeito da adição de amina é dependente da concentração.
A figura 41 mostra que a maior concentração de fármaco nos tecidos, em particular em profundidades de até cerca de 1500 um, foi obtida utilizando a formulação dHPG que continha o maior teor de amina (37 mol/mol). AUCS nas faixas de profundidade de tecido indicadas foram calculadas (Tabelas 15a e 15b), mostrando melhorias das formulações de dHPG em relação ao Taxotere na faixa de 1,3 a 2,4 vezes. Os valores de Cavg e Cmax nas faixas de profundidade de tecido indicadas foram calculados (Tabela 15 c). Tabela 15a AUC (180-2640 um) calculada para a penetração de docetaxel com administração em vários oe veículos sem pré-tratamento HPG- HPG-MePEG- | Tween HPG-MePEG- | mol) mol) Bs Número de vezes de mudança do 1 1,3 2,2 Taxotere Quantidade de ee a da [a | oe Tabela 15b AUC (180-1560 um) calculada para a penetração de docetaxel com administração em vários veículos sem pré-tratamento HPG- HPG-MePEG- Tween |MePEG (O |NH> (10 HPG-MePEG- 80 mol) mol) NH> (37 mol)
E A EA mudança 1 1,2 2,4
E PIE EN NE análises 1 2 2
Tabela 15c Valores de Cavg e Cmax calculados para as faixas de profundidade de tecido de 180 a 2640 e 180 a 1560 (um), para a penetração de docetaxel com administração em vários veículos sem pré-tratamento HPG- HPG-MePEG- Valores de C Tween |MePEG (O |NH7 (10 HPG-MePEG- max/avg (180-2640) |80 mol) mol) NH> (37 mol) lema | 35,2] 1056 75 220 [lecavo | 2030 sea asso na RS a E adetEa o de mudança 1,0 2,8 1,6 ea ck natal Marto Eaaea . UN 38,1 13,2 6,1 e e a ra
RA NESTE (180-1560) ema — | sal os6 ns 2202 eso | 254" 7a6 sal ass a doa de mudança 1,0 3,1 1,5 EST e o C (avg) 5,3 23,6 12,6 3,3 Dados para a penetração de DTX no tecido da bexiga suína a partir das formulações de DTX com pré-tratamento com quitosana ou HPG-Cg/10-MePEG-NH; são mostrados nas Figuras 42 e 43. O objetivo do experimento foi diferenciar a função do polímero dHPG da quitosana, que também é um polímero que contém funções amina. Quitosana foi contemplada como um polímero para uso na distribuição intravesical; no entanto, no contexto de um pré-tratamento para facilitar a absorção do fármaco nos tecidos, foi demonstrado que dHPGs de determinada composição são melhores. Os dados mostram que, com o pré-tratamento com quitosana, a formulação Tween 80 (Taxotere&O) proporciona | relativamente pouca penetração tecidual, proporcionando a menor concentração de tecido para docetaxel na bexiga em todas as profundidades de tecido.
Da mesma forma, o pré- tratamento com quitosana resultou em uma melhoria modesta na penetração no tecido do docetaxel, quando o fármaco foi administrado no veículo HPG-Cg/1-MePEG (sem amina), no | entanto, isso apenas foi melhor do que o grupo tratado com Taxotere (pré-tratado com quitosana). Um melhor efeito na | 10 penetração tecidual do docetaxel foi observado quando dHPGs o continham aminas (37 mols de amina/mol de polímero) (chamados de HPG-Cg/10-MePEG-NH>, nas Figuras 42 e 43). Da . mesma forma, quitosana não apesentou qualquer benefício para a distribuição quando ela foi usada como um pré- . 15 tratamento para a formulação de HPG-Cg/10-MePEG-NH>, carregada com docetaxel.
O desempeno de cada uma foi comparado medindo a área sob a curva (AUC, Figura 43) da concentração de tecido em relação à profundidade do tecido (Figura 42), que é uma medida da exposição total do fármaco.
Os resultados mostram que a maior exposição foi obtida quando o pré-tratamento ou o tratamento utilizou dHPG contendo o amina.
Os valores de AUC calculados para a faixa de profundidade do tecido de 180 a 3360 (um) e os valores de Cavg e Cmax calculados para as faixas de profundidade do tecido de 180 a 1560 e 180 a 3360 (um), para a penetração de docetaxel a partir de várias formulações após vários regimes de pré-tratamento são mostrados nas Tabelas 15d e 15e.
Tabela 15d AUC (180-3360 um) calculada para a penetração de docetaxel com administração em vários veículos após vários regimes de pré-tratamento o see E Grupo: - sem (Taxote- - HPG-MePEG- | MePEG-NH, |MePEG-NH,
pré- re) - |jQuitosana) NH, - sem - trata- |Quitosa- pré- Quitosana mento na tratamen- (média to de 4 análises ) Pré- Nenhum |Quitosa- HPG-MePEG- Quitosana Nenhum |Quitosana tratamento na NH; Veículo de iTaxotere oe HPG- HPG- administra- Taxotere |HPG-MePEG| Taxotere MePEG-NH;, |MePEG-NH, ção - 4x5 Número de replica- 5 5 5 5 5 - |Ivalores tas | 146642 62282 | 113817 149441 142930 154003 | Aumento de vezes 1 1,8 2,4 2,3 2,5 “Taxotere- Quitosana” IAaumento de oe Vezes “Taxotere- 1 1.3 2,3 3,0 2,9 3,1 Sem pré- tratamento” Desvio 24996 34271 44998 19627 23451 Padrão lrro paagrão| — — | 11178 15327 20124 8778 10488 Tabela 15e Valores de Cavg e Cmax calculados para as faixas de profundidade de tecido de 180 a 1560 e 180 a 3360 (um), para a penetração de docetaxel com administração em vários veículos após vários regimes de pré-tratamento
| 145 HPG- Tween 80| Taxo- HPG- HPG- MePEG- (Taxoter | tere MePEG- | MEPEG NH; -Sem e) - HPG- NH — - pré- Quitosa- | MePEG Quito- |Quito- trata- na —-NH; sana sana mento Valores para a faixa de profundidade: 180 a 1560 um 38,47 |s89,08| 91,39 | 93,64 | 67,85 ) Aumento de vezes em ' relação 1 2,3 2,4 2,4 1,8 Cí(avg) ao grupo Taxotere- Quitosana Desvio 16,33 30,78 30,58 30,94 | 23,44 padrão 149,0 139,5 | 110,3 oe Aumento de vezes em Címax) relação 1 2,4 2,0 2,3 1,8 ao grupo Taxotere- Quitosana Valores para a faixa de profundidade: 180 a 3360 um 22,55 |52,76| 51,94 | 55,07 | 40,18 C(avg) Aumento 1 2,3 2,3 2,4 1,8 de vezes em relação ao grupo Taxotere- Quitosana fm | eo fes] ne [os bes 20,79 45,28 47,95 47,53 | 34,49 padrão Lo Lt Et It ET pp q | o Aumento de vezes - em C (max) relação 1 2,4 2,0 2,3 1,8 7 ao grupo Taxotere- Quitosana Os dados para a penetração de mitomicina F no tecido da bexiga suína com pré-tratamento com HPG-Cg/,10-MePEG-NH, são mostrados na Figura 44. Imagens SEM de estudos de penetração ex vivo de oe 5 bexigas de porco Os efeitos da penetração de fármaco observados no Exemplo 28 acima foram correlacionados com a aparência do tecido da bexiga após a exposição a vários tratamentos.
Para estes tratamentos, nenhum fármaco foi utilizado e apenas uma única exposição a um único veículo por bexiga foi utilizada.
Após o tempo de exposição de 2 h, o tecido da bexiga foi coletado, lavado com tampão e estabelecido de um dia para o outro com Pparaformaldeido a 4% e glutaraldeido a 2%, pós-estabelecido com OsO0, a 1%, desidratado em etanol e seco até o ponto crítico.
Bexigas inteiras foram divididas em dois e revestidas de modo catódico com ouro. Toda a superfície inspecionada por SEM (Hitachi S4700, 3-5 KV) e imagens representativas foram registrados (mínimos de 3 campos por amostra). As imagens representativas são mostradas (com cerca de 130 pm de largura x 100 um de altura).
As imagens SEM revelaram que o urotélio das bexigas tratadas apenas com tampão, e também as bexigas tratadas com HPG-Cg/10-MePEG (sem amina) mostrou o urotélio intacto ou bastante intacto, por exemplo, sem perda de células guarda-chuva. Ao contrário, após a exposição ao veículo de o pré-tratamento de quitosana, a superfície da bexiga apresentou uma aparência bem diferente, com o urotélio ' tendo perdido a sua camada superior de células guarda-chuva (Figura 45). Após a exposição ao HPG-Cg/10-MePEG-NH, com 10 - 15 mol de amina/mol de HPG em concentrações de solução de 1 e 10% p/v, a perda parcial de células guarda-chuva do urotélio foi observada (Figura 46). Ao contrário, quando um HPG-Cg/10-MePEG-NH, com maior teor de amina (37 mol/mol) foi usado, mais perda de célula guarda-chuva pôde ser observada. Observou-se que o efeito é dependente da concentração. Uma concentração de solução de 0,1% p/v oe resultou em pouca ou nenhuma mudança na aparência da superfície da bexiga, enquanto que uma perda parcial e completa das células guarda-chuva foi Observada após tratamento com soluções com concentrações de 1 e 10% p/v, respectivamente (Figura 46). Sem se ater à teoria, acredita-se que o efeito de amina pode ser alterar a superfície da bexiga, efetuando uma mudança em Sua permeabilidade ao fármaco. Foi demonstrado que o efeito é dependente do teor de amina e da concentração de polímero.
Exemplo 29 Estudos de penetração in vivo de bexigas de camundongo O efeito da exposição de formulações diferentes (sem fármaco) em bexigas de camundongo foi avaliado. Camundongos nus atímicos do sexo feminino de onze semanas de idade (Harlan, Indianapolis, IN) foram anestesiados até um plano profundo usando 4% de isoflurano e 2 L/min de O,. A bexiga foi totalmente expressa e as formulações foram instiladas através de um cateter cirurgicamente implantado. Uma sutura em bolsa de polipropileno foi colocada ao redor do canal uretral antes de um angiocateter de calibre 24 Jelco lubrificado (BDickenson) passar pela uretra para dentro da bexiga. Um volume de 50 pL foi injetado, os animais foram o levemente invertidos (cranialmente) e a sutura em bolsa foi amarrada para fora enquanto o cateter foi removido em um . movimento rápido. Os camundongos permaneceram anestesiados (em 1,5 a 2% de isoflurano, 2L/min de O:) até que a - 15 instilação de 2 horas fosse concluída. A sutura em bolsa foi removida e deixou-se que os animais se recuperassem.
As soluções de dosagem preparadas eram límpidas de incolor a ligeiramente âmbar. A concentração da solução de polímero foi de 1 ou 10% p/v. O polímero HPG-MePEG foi usado, que não tinha amina, e dois polímeros HPG-MePEG-NH, foram usados com 8 a 10 mols (baixo teor) e 37 mols (alto o teor) de amina por mol de HPG (baseando-se no peso molecular de HPG nominal de 65 Kg/mol). Os resultados da concentração de dosagem estão resumidos na Tabela 16. Tabela 16 Resumo da concentração da formulação dosagem do polímero
E incolor incolor seed A (10)
EE a Ad o a Aa o o o a | | : | 149
AE (37) | Fm (37) | 'NT significa não testado. As bexigas foram extirpadas de cada camundongo para SEM e histologia. Todos os animais foram observados após a administração durante 2 horas e antes de cada coleta de tecido para avaliação da mortalidade e morbidez. Nenhum sinal de mortalidade ou morbidez foram observados, com o exceção de certa pequena quantidade de sangue no sítio de instilação. .: Análise SEM Os tecidos foram lavados 3 vezes com PBS, fixados de ] um dia para o outro em paraformaldeído a 2% e, a seguir, transferidos para tampão cacodilato 0,1 M. Os tecidos foram pós-fixados em tetróxido de ósmio a 1% durante 1 h em temperatura ambiente, em seguida, desidratados em etanol, misturados com água, no aumento da porcentagem de etanol na mistura, começando em 30 e aumentando até 100%. As amostras foram secas por desidratação pelo método do ponto crítico o e, em seguida, foram revestidas de modo catódico com ouro- paládio duas vezes (uma vez a 90º e a segunda vez a 45º). As amostras foram examinadas em microscopia eletrônica de varredura com S4700 da Hitachi na Instalação de Biovisualização. Cada bexiga foi visualizada em baixa ampliação e, em seguida, toda a superfície foi novamente examinada em alta ampliação. Várias imagens (9-10) foram capturadas em diversas ampliações Tabela 17 Resumo da concentração de formulação o Formulação |Densidade| Concentração de amina do polímero 2 24 | (mol /mol (% p/v) | de HPG) | | secmeres | o | 10 —— Írntacra|intacea|Incacta| teor) teor) teor) - *N/A significa não aplicável.
NT significa não testado.
Intacta: sem sinais de perda de célula guarda-chuva ' +: perda muito pequena ou parcial de células guarda-chuva ++: perda substancial ou completa das células guarda-chuva A superfície da bexiga de camundongo tratada com uma instilação de PBS durante 2 horas teve uma camada de células guarda-chuva intacta e uma aparência dobrada, conforme visto na imagem SEM da superfície da bexiga do camundongo na Figura 47. A superfície da bexiga de o 10 camundongo tratada com uma instilação de solução de HPG- MePEG a 10% p/v durante 2 horas teve uma camada de células guarda-chuva intacta imediatamente após o período de instilação de 2 horas.
Uma camada de células guarda-chuva intactas também foi observada em 6 horas e 24 horas após a instilação da solução de HPG-MePEG (Figura 48). Como mostrado na Figura 48, as células da superfície tinham uma aparência plana.
A superfície da bexiga do camundongo tratada com uma instilação da solução de HPG-MePEG-NH,; (10 mol/mol) a 10% p/v durante 2 horas tinha uma camada de células guarda-chuva intactas imediatamente após o período de instilação de 2 horas (Figura 49). Em 6 horas após a instilação de solução HPG-MePEG-NH, (10 mol/mol) a 10% p/v,
a superfície da bexiga do camundongo exibiu a perda de uma única célula guarda-chuva, expondo as camadas inferiores do epitélio.
Em 24 horas após a mesma instilação, a superfície da bexiga do camundongo tinha uma camada de superfície guarda-chuva intacta (Figura 49). A superfície da bexiga do camundongo tratada com uma instilação da solução de HPG- MePEG-NH, (37 mol/mol) a 1% p/v durante 2 horas apresentou perda completa das células guarda-chuva, expondo as camadas inferiores do epitélio imediatamente após o período de o instilação de 2 horas, conforme mostrado na Figura 50. Em 6 horas após a instilação da solução HPG-MePEG-NH, (37
. mol/mol) a 1% p/v, a superfície da bexiga do camundongo ainda apresentava uma perda substancial de células guarda-
. 15 chuva.
Em 24 horas após a instilação da solução HPG-MePEG- NH> (37 mol/mol) a 1% p/v, a superfície da bexiga do camundongo apresentava uma superfície parcialmente intacta
(seção superior da Figura 50) com perda significativa de células guarda-chuva (canto inferior esquerdo da Figura
50). A superfície de bexiga de camundongo tratada com a instilação de 2 horas de solução a 10% (37 mol/mol) de HPG-
o MePEG-NH, exibiu uma completa perda de células qgquarda- chuva, expondo as camadas inferiores do epitélio imediatamente após o período de instilação de 2 horas,
conforme mostrado na Figura 51. Em 6 horas após a instilação da solução de HPG-MePEG-NH; (37 mol/mol) a 10%
p/v, a superfície da bexiga do camundongo também apresentou perda total das células guarda-chuva.
Em 24 horas após a instilação, a superfície da bexiga do camundongo tinha uma camada de células guarda-chuva intacta; no entanto, as células da superfície pareceram menores e com aparência menos plana do que as outras camadas intactas observadas
(Figura 51). Observou-se que o efeito das formulações sobre a perda de células guarda-chuva é dependente do teor de amina do dHPG e da concentração de dHPG.
Histologia Os tecidos foram avaliados quanto a alterações nas juntas apertadas (tight junctions), esfoliação de células e infiltrações de células inflamatórias.
Os resultados da análise histológica estão resumidos na Tabela 18. Como pode ser visto a partir dos resultados de histologia, sinais de inflamação e necrose não foram observados na superfície da bexiga do camundongo após a exposição às formulações de o dHPG.
Tabela 18 Histologia da Superfície da Bexiga dos : Camundongos Formula- |Teor de |Concentra- |Tempo |[Infiltra- |Sinais de|Sinais 1 ção amina ção da da ção de inflama- |de (mol / solução (% |Jamos- |neutrófi- |ção necro- mol) p/v) tra los se (h) tratado O ox o |e — fausente —fausente [ausente | | ses- po | MePEG-NH, | (baixo le — ausente — ausente |ausente | teor) (a1to |ée — fausente —|ausente ausente | teor) bo de [ausente favsente Jausente |
. 153 Análise de urina A urina foi coletada no momento do sacrifício.
Após a eutanásia do animal, a bexiga foi exposta e o seu conteúdo foi removido por punção da bexiga e retirada através de uma agulha de calibre 25G.
À urina foi armazenada em gelo (mas não congelada) e transportada para fins de avaliação.
A urina foi analisada quanto à presença de células.
Algumas gotas de urina foram colocadas em uma lâmina de microscópio o e observadas por microscópio quanto à presença de células.
Todas as células presentes foram contadas com uma lâmina . hemocitométrica.
As contagens de células na urina coletada de camundongos imediatamente após a instilação de 2 horas e ] no momento da coleta da bexiga (2, 6 e 24 horas), são mostradas na Figura 52. Análise de Sangue O sangue foi coletado mediante término por inalação de CO; por punção cardíaca após o último suspiro, cerca de 500-700 ul foram colocados em tubos Microtainer com EDTA.
Cada tubo foi invertido várias vezes para assegurar a oe 20 mistura homogênea do sangue e EDTA para evitar coagulação.
As amostras de sangue foram armazenadas em gelo até que todas as amostras fossem coletadas em um ponto de tempo particular e, em seguida, elas foram processadas para gerar plasma.
O plasma foi gerado pela centrifugação de amostras a 2500 rpm durante 15 minutos a 4 ºC (rpm baseado no rotor GH 3.8 A da Beckman , RCFavg: 200 x g). O sobrenadante do plasma foi removido por pipetagem e foi colocado em frascos rotulados e armazenado a -80 ºC.
Sangue foi analisado quanto aos níveis de TNFa utilizando a plataforma MesoScale e kits de ensaio padrão.
Os níveis de TNFa circulantes no sangue de camundongo em 2, 6 e 24 h após a instilação com as várias formulações são mostrados na Figura 53. Nenhum TNFa foi detectado em qualquer uma das amostras.
Embora várias modalidades da invenção são divulgadas neste documento, muitas adaptações e modificações podem ser feitas dentro do escopo da invenção de acordo com o conhecimento geral comum do homem da técnica.
Tais modificações incluem a substituição de equivalentes conhecidos por qualquer aspecto da invenção para atingir o mesmo resultado substancialmente da mesma maneira.
As o faixas numéricos incluem os números que definem a faixa.
A palavra "compreendendo” é usada neste documento como um . termo em aberto, substancialmente equivalente à frase "incluindo, mas sem se limitar, a", e a palavra - 15 "compreende" possui um significado correspondente.
Como usado aqui, as formas do singular "uma", "uma" e "o/a" incluem as referências no plural, a menos que o contexto claramente estabeleça de outra forma.
Deste modo, Por exemplo, referência a "um item" inclui mais de um desse | item.
A citação das referências neste documento não é um o reconhecimento de que tais referências são da técnica anterior da presente invenção e nem constitui qualquer | reconhecimento quanto ao conteúdo ou a data destes documentos.
Qualquer/quaisquer documento(s) de prioridade e todas as publicações incluindo, mas sem se limitar, às patentes e pedidos de patente citados neste relatório | descritivo são incorporados aqui por referência como se | cada publicação individual fosse individualmente e | especificamente indicada para ser incorporada por referência neste documento como se ela fosse plenamente estabelecida.
A invenção inclui todas as modalidades e variações substancialmente conforme descrito acima e com
| ” 155 referência aos exemplos e desenhos. .
o : 1/155 “ss POLIGLICEROL HIPERRAMIFICADO, USO DE UM POLIGLICEROL HIPERRAMIFICADO, MÉTODO DE ADMINISTRAÇÃO DE UMA PORÇÃO BIOLOGICAMENTE ATIVA A UM TECIDO BIOLÓGICO,
COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E MÉTODO DE SÍNTESE DE UM
POLIGLICEROL HIPERRAMIFICADO Campo da invenção Esta invenção refere-se à terapêutica, seus usos e métodos para a administração de fármacos ou outras porções biologicamente ativas aos tecidos biológicos. Em particular, a invenção refere-se aos polímeros baseados em o poligliceróis hiperramificados derivatizados (dHPGs) e aos métodos para o tratamento de câncer, infecções e inflamações ou doenças autoimunes. í Antecedentes da Invenção Câncer de bexiga é a segunda malignidade genitourinária mais comum. No momento do diagnóstico inicial, cerca de 70% dos casos não são músculo-invasivos. As opções atuais de tratamento para a doença superficial incluem tratamento de câncer de bexiga topicamente via instilação intravesicular de um agente quimioterapêutico dentro da bexiga com um cateter. No entanto, essas opções o de tratamento possuem eficácia limitada. Apesar da quimioterapia e/ou imunoterapia intravesical, até 80% dos pacientes com câncer de bexiga que não é músculo-invasivo desenvolvem tumores recorrentes, dos quais de 20 a 30% se desenvolvem em tumores mais agressivos potencialmente letais (Dalbagni, G. (2007) Nat. Clin. Pract. Urol. 4: 254- 260). Acredita-se que a falha no tratamento seja devido em parte ao curto tempo de interrupção dos fármacos ativos contra as células do câncer de bexiga na bexiga. Por exemplo, taxanos não são geralmente usados para instilação intravesicular devido à baixa biodisponibilidade das

Claims (23)

REIVINDICAÇÕES
1. POLIGLICEROL HIPERRAMIFICADO, caracterizado pelo fato de compreender: um núcleo que compreende poliglicerol hiperramificado derivatizado com cadeias alquila C1-C2x; E uma parte externa que compreende pelo menos um substituinte hidrofílico ligado a grupos hidroxila do núcleo, sendo que pelo menos um substituinte hidrofílico compreende pelo menos um grupo funcional selecionado de um ou mais dos seguintes: -NHo, =NH.', -NH;]' e -NR3, em que cada R é independentemente um grupo alquila C;-Ck; Ou um grupo R é, independentemente, um grupo alquila C1;-Ck e dois grupos R, em conjunto, formam um grupo alquila cíclico C;3- Ci12 de modo que R; forma uma amina quaternária com o nitrogênio, e sendo que o poliglicerol hiperramificado compreende de cerca de 1 a cerca de 200 mols de pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado.
2. POLIGLICEROL HIPERRAMIFICADO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: (a)pelo menos um grupo funcional é -NH;; (b) pelo menos um substituinte hidrofílico é metoxipolietilenoglicol (MePEG) ou polietilenoglicol (PEG); (c) pelo menos um substituinte hidrofílico é MePEG; (d) pelo menos um grupo funcional é -NH; e pelo menos um substituinte hidrofílico é MePEG ou PEG; ou (e) pelo menos um grupo funcional é -NH; e pelo menos um substituinte hidrofílico é MePEG.
3. POLIGLICEROL HIPERRAMIFICADO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) de cerca de 1 até cerca de 100 mols do pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado; (b) de cerca de 1 até cerca de 40 mols do pelo menos um grupo funcional por mol de poliglicerol hiperramificado; (c) de cerca de 10 a cerca de 40 mols do pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado; ou (d) de cerca de 10 até cerca de 30 mols de pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado.
4, POLIGLICEROL HIPERRAMIFICADO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que: (a) as cadeias alquila Ci-Cx são cadeias alquila Cs-C207 (b) as cadeias alquila Ci-Cx são cadeias alquila CgrCig; OU (c) as cadeias alquila Ci-Cx são cadeias alquila Cg-C1o-
5. POLIGLICEROL HIPERRAMIFICADO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma porção biologicamente ativa.
6. POLIGLICEROL HIPERRAMIFICADO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a porção biologicamente ativa é selecionada de:
(a) um ou mais fármacos hidrofóbico; (b) taxano, ou um análogo do mesmo; (c) um ou mais dentre valrubicina, cisplatina, paclitaxel, docetaxel; (d) vimblastina; (e) mitomicina ou um análogo da mesma; (f) metotrexato; (g) doxorrubicina ou um análogo da mesma; (h) epirrubicina; (i) gencitabina; (3) everolimo; (k) suramina; e (1) uma combinação de porções
7. POLIGLICEROL HIPERRAMIFICADO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a combinação de porções é selecionada dentre: metotrexato, vimblastina e doxorrubicina (M-VAC); e M-VAC e cisplatina.
8. POLIGLICEROL HIPERRAMIFICADO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que uma porção do pelo menos um substituinte hidrofílico pode estar localizada no núcleo.
9. POLIGLICEROL HIPERRAMIFICADO, o poliglicerol hiperramificado sendo caracterizado pelo fato de compreender: um núcleo que compreende poliglicerol hiperramificado; e uma parte externa que compreende pelo menos um substituinte hidrofílico ligado a grupos hidroxila do núcleo, sendo que o pelo menos um substituinte hidrofílico compreende pelo menos um grupo funcional selecionado de um ou mais dos seguintes grupos: -NH>,, =NH2', -NH;' e -NR;', em que cada R é independentemente um grupo alquila C;,-Ck; ou um grupo R é independentemente um grupo alquila C1;-Ck e dois grupos R juntos formam um grupo alquila cíclico C3-C12, de modo que R; forma uma amina quaternária com o nitrogênio, e em que o poliglicerol hiperramificado compreende de cerca de 1 até cerca de 200 mols do pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado, para uso como um pré-tratamento ou cotratamento para aumentar a absorção de fármaco em um tecido.
10. POLIGLICEROL HIPERRAMIFICADO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o núcleo está adicionalmente derivatizado com cadeias de alquila C;- Cao.
11. POLIGLICEROL HIPERRAMIFICADO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que: (a) pelo menos um grupo funcional é -NH;; (b) pelo menos um substituinte hidrofílico é metoxipolietilenoglicol (MePEG) ou polietilenoglicol (PEG); (c) pelo menos um substituinte hidrofílico é MePEG; (d) pelo menos um grupo funcional é -NH; e pelo menos um substituinte hidrofílico é MePEG ou PEG; ou (e) pelo menos um grupo funcional é -NH; e pelo menos um substituinte hidrofílico é MePEG.
12. POLIGLICEROL HIPERRAMIFICADO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que: (a) o poliglicerol hiperramificado compreende de cerca de 1 a cerca de 100 mols do pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado.
(b) de cerca de 1 até cerca de 40 mols do pelo menos um grupo funcional por mol de poliglicerol hiperramificado; (c) de cerca de 10 a cerca de 40 mols do pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado; ou (d) de cerca de 10 até cerca de 30 mols de pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado.
13. POLIGLICEROL HIPERRAMIFICADO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que: (a) as cadeias de alquila C;,-Cx, são cadeias de alquila Cs-Ca0o; (b) as cadeias de alquila C;i-Cx são cadeias de alquila Cs-Cig; OU (c) as cadeias de alquila C;,-Cx são cadeias de alquila Cg-Ci1o.
14, POLIGLICEROL HIPERRAMIFICADO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a razão de cadeias de alquila C1i-Cxw para unidades de glicerol é maior em um centro do núcleo em comparação com uma periferia do núcleo; e que o poliglicerol hiperramificado compreende de cerca de 1 a cerca de 200 mols do pelo menos um substituinte hidrofílico por mol de poliglicerol hiperramificado.
15. POLIGLICEROL HIPERRAMIFICADO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 9 a 14, caracterizado pelo fato de compreender ainda uma porção biologicamente ativa.
16. POLIGLICEROL HIPERRAMIFICADO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a porção biologicamente ativa é selecionada dentre: (a) um ou mais fármacos hidrofóbico; (b) taxano, ou um análogo do mesmo; (c) um ou mais dentre valrubicina, cisplatina, paclitaxel, docetaxel; (d) vimblastina; (e) mitomicina ou um análogo da mesma; (f) metotrexato; (g) doxorrubicina ou um análogo da mesma; (h) epirrubicina; (i) gencitabina; (3) everolimo; (k) suramina; e (1) uma combinação de porções
17. POLIGLICEROL HIPERRAMIFICADO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a combinação de porções é metotrexato, vimblastina e doxorrubicina (M-VAC) ou M-VAC e cisplatina.
18. POLIGLICEROL HIPERRAMIFICADO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 9 a 17, caracterizado pelo fato de que pelo menos um substituinte hidrofílico compreende pelo menos um grupo funcional que é -OH, -COOH, -NHS, -SH, -NHo, -NH3' ou -NR;, em que cada grupo R é independentemente um grupo alquila C;,-C; ou um grupo R é, independentemente, um grupo alquila C1,-C; e dois grupos R juntos formam um grupo alquila cíclico C3-C1i2, de modo que R; forma uma amina quaternária com o átomo de nitrogênio.
19. MÉTODO DE ADMINISTRAÇÃO DE UMA PORÇÃO BIOLOGICAMENTE ATIVA A UM TECIDO BIOLÓGICO, o método sendo caracterizado pelo fato de compreender: administrar um poliglicerol hiperramificado carregado com a porção biologicamente ativa ao tecido biológico, em que o poliglicerol hiperramificado compreende: um núcleo que compreende poliglicerol hiperramificado derivatizado com cadeias de alquila Ci-Coo, sendo que a razão de cadeias de alquila C;i-Cx, para unidades de glicerol é maior em um centro do núcleo em comparação com uma periferia do núcleo; e uma parte externa que compreende pelo menos um substituinte hidrofílico ligado a grupos hidroxila do núcleo, sendo que o poliglicerol hiperramificado compreende de cerca de 1 a cerca de 200 mols do pelo menos um substituinte hidrofílico por mol de poliglicerol hiperramificado.
20. USO DE UM POLIGLICEROL HIPERRAMIFICADO para administração de uma porção biologicamente ativa a um tecido biológico, caracterizado pelo fato de que o poliglicerol hiperramificado compreende: um núcleo que compreende poliglicerol hiperramificado derivatizado com cadeias de alquila Ci-Coo, em que a razão de cadeias de alquila C;i-Cx, para unidades de glicerol é maior em um centro do núcleo em comparação com uma periferia do núcleo; e uma parte externa que compreende pelo menos um substituinte hidrofílico ligado a grupos hidroxila do núcleo, sendo que o poliglicerol hiperramificado compreende de cerca de 1 a cerca de 200 mols do pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado.
21. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelo fato de compreender um poliglicerol hiperramificado e uma porção biologicamente ativa, em que o poliglicerol hiperramificado compreende: um núcleo que compreende poliglicerol hiperramificado derivatizado com cadeias de alquila Ci-Coo, sendo que a razão de cadeias de alquila C;i-Cx, para unidades de glicerol é maior em um centro do núcleo em comparação com uma periferia do núcleo; e uma parte externa que compreende pelo menos um substituinte hidrofílico ligado a grupos hidroxila do núcleo, em que o poliglicerol hiperramificado compreende de cerca de 1 a cerca de 200 mols do pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado.
22. MÉTODO DE SÍNTESE DE UM POLIGLICEROL HIPERRAMIFICADO, o método sendo caracterizado pelo fato de compreender: polimerização um epóxido de glicerol e um grupo epóxido de alquila C1-Cxw ou um grupo alquilglicidil éter C1-C20, de tal modo que todo ou substancialmente todo o epóxido de alquila C;i-Cx ou alquilglicidil éter C;i-Cx seja polimerizado antes de todo, ou substancialmente todo o epóxido de glicerol seja polimerizado para formar poliglicerol hiperramificado; e derivatização de grupos hidroxila do poliglicerol hiperramificado com pelo menos um substituinte hidrofílico, sendo que o poliglicerol hiperramificado compreende de cerca de 1 a cerca de 200 mols do pelo menos um grupo funcional por mol do poliglicerol hiperramificado.
23. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelo fato de compreender um poliglicerol hiperramificado de uma qualquer das reivindicações 1 a 18 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
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