PT2060259E - Composições médicas para o tratamento intravesical do cancro da bexiga - Google Patents

Description

ΕΡ 2 060 259/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Composições médicas para o tratamento intravesical do cancro da bexiga"

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o beneficio do pedido provisório de patente U.S. 60/344,446, apresentado em 1 de Novembro de 2001 .

ANTECEDENTES DO INVENTO O cancro da bexiga representa aproximadamente 2% de todos os cancros malignos e é o quinto e o décimo cancro mais comum nos homens e nas mulheres, respectivamente. A Sociedade Americana de Cancro estimou que, em 1997, teriam ocorrido 54 500 novos casos e 11 700 mortes. Os cancros da bexiga superficiais (pTa, pTl e CIS) representam 70-80% dos cancros na apresentação inicial. O controlo do cancro da bexiga superficial poderá ser obtido por ressecção cirúrgica endoscópica, frequentemente seguida por um ciclo de imunoterapia ou de quimioterapia intravesical adjuvante com o objectivo de erradicar as células tumorais remanescentes e evitar a recorrência do tumor (Herr HW (1987) Intravesical therapy-a criticai review. Urol Clin N Am 14:399-404). Tanto os antineoplásicos (mitomicina C [MMC], epirrubicina e tioTEPA) como a imunoterapia (BCG) administrados por via intravesical são eficazes na redução das taxas de recorrência tumoral, embora não seja claro se a progressão da doença para tumores invasivos musculares é evitada (Newling D (1990) Intravesical therapy in the management of superficial transitional cell carcinoma of the bladder: the experience of the EORTC GU group, Br J Câncer 61:497-499; Oosterlink et al. (1993) A prospective European Organization for Research and Treatment of Câncer Genitourinary Group randomized trial comparing transurethral resection followed by a single instillation of epirubicin or water in single stage Ta, TI papillary carcinoma of the bladder. J Urol 149:749-752). Esta observação, juntamente com o facto da mortalidade devido ao cancro da bexiga ainda ser elevada, sublinha a necessidade de 2 ΕΡ 2 060 259/ΡΤ desenvolver agentes terapêuticos mais eficazes (Oosterlink et ai., 1993).

Um destes agentes terapêuticos é a MMC, que pertence a uma classe de compostos conhecida por fármacos biorredutores (Workman, 1994). A MMC representa um dos agentes antineoplásicos utilizados para tratar os cancros da bexiga superficiais (Maffezzini et al., 1996; Tolley et al., 1996). A MMC é activada numa espécie citotóxica por redutases celulares, embora o papel das enzimas redutases especificas que estão envolvidas na activação biorredutora permaneça mal definido e controverso (Cummings et ai., 1998a). Isto é particularmente verdadeiro para a enzima NQOl (NAD(P)H:quinona oxidorredutase, EC 1.6.99.2), a qual é uma flavoproteina citosólica que catalisa a redução com dois electrões de vários compostos baseados em quinonas, utilizando quer NADH quer NADPH como dadores de electrões (Schlager & Powis, 1988; Siegel et al., 1990). O composto estruturalmente relacionado E09 [5-(1-aziridinil)-3-(hidroximetil)-2-[(E)-3-hidroxiprop-l-enil]-l-metil-lH-indolo-4,7-diona] é, no entanto, um substrato muito melhor que a MMC para NQOl (Walton et al., 1991), e há uma boa correlação entre a actividade de NQOl e a quimiossensibilidade in vitro sob condições aeróbias (Robertson et al., 1994; Fitzsimmons et al., 1996; Smitkamp-Wilms et al., 1994). Sob condições hipóxicas, contudo, as propriedades de E09 são marcadamente diferentes, havendo pouca ou nenhuma potenciação da toxicidade de E09 observada nas células ricas em NQOl (Plumb & Workman, 1994) . Porém, em linhas celulares deficientes em NQOl, têm sido referidas razões elevadas de citotoxicidade hipóxica (Workman, 1994). Por conseguinte, E09 dispõe do potencial para explorar a fracção aeróbia dos tumores ricos em NQOl ou a fracção hipóxica dos tumores deficientes em NQOl (Workman, 1994). O composto E09 tem sido clinicamente avaliado. Contudo, apesar da comunicação de três remissões parciais em ensaios clinicos de fase I, não se observou qualquer actividade contra o NSCLC (cancro do pulmão de células não pequenas), o cancro gástrico, o cancro da mama, o cancro pancreático e o cancro do cólon em ensaios subsequentes de fase II (Schellens et al., 1994; Dirix et al., 1996). Estas constatações são particularmente decepcionantes em face não só dos estudos pré- 3 ΕΡ 2 060 259/ΡΤ clínicos (Hendriks et al., 1993), como também das referências de que vários tipos de tumores possuem níveis elevados de NQOl (Malkinson et al., 1992; Smitkamp-Wilms et al., 1995; Siegel et al., 1998). Foram propostas várias explicações possíveis para a ausência de eficácia clínica de E09 (Connors, 1996; Phillips et al., 1998). Estudos recentes demonstraram que o fracasso de E09 no aspecto clínico poderá não se dever a interacções farmacodinâmicas fracas, mas sim ser o resultado de uma fraca entrega do fármaco nos tumores (Phillips et al., 1998) . A rápida eliminação plasmática de E09 (11/2 = 10 min nos seres humanos), em conjugação com uma fraca penetração através das camadas multicelulares, sugere que o composto E09 não penetrará mais de alguns mícrones a partir de um vaso sanguíneo durante o seu período de vida farmacocinético (Schellens et al., 1994; Phillips et al., 1998). A administração intratumoral de E09 a tumores ricos e a tumores deficientes em NQOl produziu atrasos de crescimento significativos (embora não tenha sido feita uma distinção entre os danos na fracção aeróbia ou na fracção hipóxica), sugerindo que se o composto E09 puder ser entregue nos tumores, será possível obter efeitos terapêuticos (Cummings et al., 1998b). Embora estas características indesejáveis sejam uma contrariedade importante para o tratamento da doença sistémica, paradoxalmente elas poderão ser vantajosas para o tratamento dos cancros que ocorrem num terceiro compartimento, como seja o cancro da bexiga superficial. Neste cenário, a entrega do fármaco não é problemática por meio da via intravesical, e a penetração de E09 no tecido avascular pode ser aumentada através da manutenção de concentrações terapeuticamente relevantes do fármaco no interior da bexiga (utilizando, por exemplo, um período de instilação de uma hora). Embora este método de instilar o composto E09 no interior da bexiga possa ser útil, continua a existir a necessidade de dispor de veículos de entrega de fármacos que sejam capazes de entregar uma quantidade eficaz de E09 no interior da bexiga. J D de Vries et al. (Int J Pharmaceutics, 100 (1993) 181-188) investigaram a estabilidade química de E09, utilizando um ensaio de HPLC de fase inversa indicador da estabilidade, com detecções no UV e espectrofotometria no UV. A cinética de 4 ΕΡ 2 060 259/ΡΤ degradação de Ε09 foi estudada em função do pH, da composição do tampão, da força iónica e da temperatura. J D Jonkman-de Vries et al. (Câncer Chemother Pharmacol (1994) 34:416-422) referiram um estudo efectuado para criar uma forma farmacêutica parentérica estável de E09. O estudo investigou a liofilização de soluções aguosas de E09. J D Jonkman-de Vries et al. (Drug Development and

Industrial Pharmacy, 23(2), 137-144 (1997)) referiram um processo de fabrico de lotes de uma forma farmacêutica liofilizada parentérica de E09, no ambiente de uma farmácia hospitalar.

Choudry et al. (Br J Câncer (2001) 85(8), 1137-1146) descrevem composições para tratar o cancro da bexiga, em gue estas composições incluem E09. Este documento estuda a relação entre a actividade de NQOl no tecido tumoral e a selectividade de E09. Adicionalmente, Choudry et ai. ensinam gue a entrega de E09 num veículo ácido resulta em maior actividade no interior da bexiga, com qualquer fármaco absorvido na corrente sanguínea tornando-se relativamente inactivo devido à subida do pH. Contudo, este documento não discute métodos para a estabilização de uma composição de E09 reconstituída.

BREVE SUMÁRIO DO INVENTO

De acordo com o presente invento, é disponibilizada uma formulação anticancerosa tal como definida na reivindicação 1.

Num aspecto amplo, o presente invento refere-se a composições destinadas ao tratamento do cancro. Mais especificamente, as composições do presente invento compreendem produtos farmacêuticos formulados para instilação intravesical para tratamento do cancro da bexiga. Os produtos farmacêuticos compreendem 5-(1-aziridinil)-3-(hidroximetil)-2-[(E)-3-hidroxiprop-l-enil]-l-metil-lH-indolo-4,7-diona (E09) e um veículo de formulação. Os veículos de formulação aqui descritos melhoram as características físicas da solução, como a solubilidade, a liofilização e a facilidade de reconstituição da solução liofilizada. 5 ΕΡ 2 060 259/ΡΤ A composição do presente invento compreende 5-(1-aziridinil)-3-(hidroximetil)-2-[(E)-3-hidroxiprop-l-enil]-1-metil-lH-indolo-4,7-diona (E09) e um veículo de formulação que é uma mistura de terc-butanol e água. Estas concretizações da composição do presente invento podem ser liofilizadas por meio de técnicas conhecidas ou desenvolvidas na especialidade.

De acordo com uma concretização mais específica do presente invento, a composição do presente invento compreende E09 e um agente de revestimento. 0 agente de revestimento permite uma melhor adesão da composição à parede da bexiga. Consequentemente, a composição e, em particular, o composto E09 contacta e poderá ser capaz de penetrar no tecido avascular que a constitui durante um período de tempo suficiente para tratar o cancro da bexiga. Em uma concretização do presente invento, o agente de revestimento é o propilenoglicol. Em outras concretizações exemplificativas do presente invento, o agente de revestimento pode ser seleccionado entre o grupo que consiste em hidroxipropilcelulose, carboximetilcelulose, cloridrato de quitosano, lectina ou policarbofilo. As composições do presente invento podem ser entregues na parede da bexiga por um lipossoma. As composições do presente invento também podem ser entregues na parede da bexiga por uma microesfera. Em alternativa, as composições do presente invento podem ser entregues a um doente intravenosamente.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Validação do anticorpo policlonal anti-NQOl de rato para utilização na análise imuno-histoquímica de NQOl humana. Painel A: análise de transferência de Western de extractos celulares (12,5 p,g de proteína carregada por pista) quanto a NQOl. As pistas 1-5 representam extractos de DLD-1 ( 794 ± 121 nmol/min/mg) , HT-29 (688 ± 52 nmol/min/mg) , H460 (1652 ± 142 nmol/min/mg), MT1 (287 ± 53 nmol/min/mg) e RT112 (30 + 3 nmol/min/mg), respectivamente, em que os valores entre parênteses representam a actividade de NQOl. A pista 6 representa os marcadores de peso molecular (marcadores de peso molecular de proteínas ECL, Amersham Pharmacia Biotech, Reino Unido). Painel B: análise de transferência de Western utilizando NQOl recombinante humana purificada. As pistas 1-5 6 ΕΡ 2 060 259/ΡΤ representam quantidades de proteína de 0,25; 0,125; 0,0625; 0,0312 e 0,0156 pmol, respectivamente. Painel C: análise de transferência de Western de extractos celulares (25 /,cg de proteína carregada por pista) derivados de células H460 (pistas 1-2) e de células BE (pistas 3-4).

Figura 2. Localização imuno-histoquímica de NQOl em tumores da bexiga, na bexiga normal, na uretra e no uréter humanos. Os tumores (painéis A, B e C) foram classificados como G2 pTa (painel A [x 200]), G3 pT2 (painel B [x 100]) e G3 pT4 (painel C [x 200]), os quais possuíam níveis elevados a intermédios de actividade de NQOl, tal como determinada por métodos bioquímicos. O painel D (xlOO) representa uma secção histológica através de uma secção da bexiga de aspecto macroscopicamente normal, proveniente de um doente que foi submetido a uma cistectomia para um tumor G3 pT4; não foi identificado nenhum tumor nestas secções, embora fosse evidente alguma alteração inflamatória. Os painéis E e F (x200) representam a uretra e o uréter, sem qualquer evidência de carcinoma invasivo ou in situ nestas secções. Todas as secções foram coradas com anticorpo anti-NQOl. A coloração negativa (sem anticorpo primário) mostrou-se límpida (resultados não apresentados).

Figura 3. Relação entre a actividade de NQOl e a resposta de um painel de linhas celulares a E09 (painel A) ou a MMC (painel B) , sob um pHe fisiológico normal de 7,4 (O) ou valores de pHe ácidos de 6,0 (□) . Os resultados da análise de regressão (tal como determinados por gráficos Sigma Plot) para E09, a pH 7,4, foram r = 0,886; declive = -0,52; a pH 6,0, os resultados da análise de regressão para E09 foram r = 0,804 e declive = -0,51. Para MMC, a análise de regressão a pH 7,4 originou r = 0,849; declive = -0,19; e a pH 6,0, r = 0,609; declive = -0,23.

Figura 4. Resposta de esferóides multicelulares de HT-29 após uma exposição de uma hora a E09, em condições de pH extracelular ácido (pHe = 6,0; 0) e fisiológico (pHe = 7,4; 0) . Os valores apresentados são as médias de 3 experiências independentes + desvio padrão. 7 ΕΡ 2 060 259/ΡΤ

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

As concretizações do presente invento referem-se a composições destinadas ao tratamento do cancro da bexiga por via de instilação intravesical. A composição do presente invento compreende uma solução tamponada compreendendo 5 — (1 — aziridinil)-3-(hidroximetil)-2-[(E)-3-hidroxiprop-l-enil]-1-metil-lH-indolo-4,7-diona (E09) e um veiculo de formulação que compreende terc-butanol/água. Os veículos de formulação são misturas de solventes que melhoram a solubilidade e a estabilidade de E09. De acordo com as várias concretizações do presente invento, o composto E09 dissolve-se nos veículos de formulação sem qualquer manipulação física, como seja a moagem. Como as composições do presente invento são capazes de dissolver maiores quantidades de E09, obtém-se uma flexibilidade adicional relativamente às unidades de dose. De acordo com uma concretização, é contemplado um teor de 8,0 mg de E09 por unidade de dose. Em outras concretizações, as doses de instilação variam entre aproximadamente 0,5 mg e aproximadamente 16 mg num volume total de 40 ml.

Além de melhorar a solubilidade de E09, os veículos de formulação são bons veículos de liofilização. Por exemplo, os veículos de formulação minimizam o tempo necessário para liofilizar as composições aqui descritas. Por conseguinte, é possível liofilizar as composições aqui descritas em menos de aproximadamente 4,5 dias. Além disso, as composições são estáveis após serem submetidas ao processo de liofilização (ver Tabela 4) . Crê-se que os veículos de formulação aqui descritos minimizam a cristalização de E09 durante o processo de liofilização. Consequentemente, ao reduzir a quantidade de cristalização de E09, é necessário um volume mais pequeno de líquido para reconstituir as composições do presente invento. Em resultado disso, é possível obter um tamanho de lote maior devido aos volumes de reconstituição reduzidos para a composição liofilizada. A composição do presente invento compreende E09 e um veículo de formulação compreendendo terc-butanol e água. Em uma descrição exemplificativa, o veículo de formulação compreende terc-butanol a 40% em água. Como os peritos na especialidade compreenderão, a quantidade de terc-butanol poderá ser variada. A solução de terc-butanol dissolve melhor 8 ΕΡ 2 060 259/ΡΤ ο composto Ε09 em comparação com a água. Ao utilizar um veículo de formulação à base de terc-butanol, a solubilidade de E09 é de pelo menos 9,5 mg/ml, enquanto a solubilidade de E09 é de aproximadamente 0,2 mg/ml em água. Consequentemente, é necessário um menor volume de terc-butanol para dissolver uma dada quantidade de E09. Adicionalmente, uma maior quantidade de E09 poderá ser dissolvida numa dada solução. Isto é, as composições aqui descritas terão uma concentração mais elevada de E09 em comparação com uma solução em que E09 está dissolvido em água.

De acordo com outra concretização mais específica do presente invento, a composição compreende E09, um veículo de formulação e um agente de volume. Em uma disposição exemplificativa, a lactose pode ser utilizada como agente de volume. Como os peritos na especialidade compreenderão, está contemplada a utilização de outros agentes de volume conhecidos ou desenvolvidos na especialidade. A composição do presente invento é tamponada. Em uma concretização, a composição está tamponada para um pH no intervalo compreendido entre 9 e 9,5. A composição pode ser tamponada com quaisquer agentes tampão conhecidos ou desenvolvidos. As composições do presente invento podem ser quer misturadas para entrega intravesical quer liofilizadas. Como os peritos na especialidade entenderão, as composições do presente invento podem ser liofilizadas pelos métodos conhecidos ou desenvolvidos na especialidade. As composições liofilizadas podem ser reconstituídas com um veículo de reconstituição. De acordo com uma formulação possível, o veículo de reconstituição compreende bicarbonato de sódio a 2%, edetato dissódico a 0,02% e propilenoglicol: água (60:40 v/v) . Este veículo de reconstituição dissolve a composição liofilizada e produz uma solução estável para administração durante um máximo de 24 horas. Adicionalmente, o veículo de reconstituição fornece uma ampola com um volume extraível de 5 ml de E09 reconstituído, compreendendo propilenoglicol/água/ bicarbonato de sódio/edetato de sódio, 60/40/2/0,02% v/v/p/p.

Em outro aspecto mais específico do presente invento, as composições do presente invento também compreendem agentes de revestimento. Os agentes de revestimento do presente invento proporcionam uma melhor adesão da composição à parede da 9 ΕΡ 2 060 259/ΡΤ bexiga. Consequentemente, a composição e, em particular, o composto E09 contacta e poderá ser capaz de penetrar no tecido avascular que a constitui durante um período de tempo suficiente para tratar o cancro da bexiga. Em uma concretização do presente invento, o agente de revestimento é o propilenoglicol. Em outras composições comparativas, o agente de revestimento pode ser seleccionado entre o grupo que consiste em hidroxipropilcelulose, carboximetilcelulose, cloridrato de quitosano, lectina ou policarbofilo.

As composições do presente invento podem ser entregues na parede da bexiga por um lipossoma. De acordo com uma possibilidade, os lipossomas utilizados são unilamelares ou multilamelares e contêm pelo menos um fosfolípido catiónico, como seja a estearilamina, o 1,2-diacil-3-trimetilamónio-propano (TAP) ou o 1,2-triacil-3-dimetilamónio-propano (DAP). Em alternativa, os lipossomas de superfície poderão ser revestidos com polietilenoglicol para prolongar a semivida de circulação dos lipossomas. Ainda em outra possibilidade, lipossomas com carga neutra, como sejam a fosfatidilcolina e o colesterol, também podem ser utilizados para o aprisionamento lipossómico das composições do presente invento. Em alternativa, as composições podem ser entregues na parede da bexiga por uma microesfera, como aquelas conhecidas ou desenvolvidas na especialidade.

Ainda em outra possibilidade, as composições podem ser entregues intravenosamente a um doente. A composição liofilizada do presente invento pode ser reconstituída utilizando os veículos de formulação aqui descritos. A composição reconstituída pode depois ser diluída para uma concentração desejada e entregue intravenosamente a um doente.

As experiências seguintes foram realizadas para determinar a actividade de NQOl numa série de tumores da bexiga e em tecido de bexiga normal humanos, por técnicas tanto enzimáticas como imuno-histoquímicas. Adicionalmente, as experiências que se seguem avaliam estratégias para reduzir uma possível toxicidade sistémica resultante da terapia intravesical, com base no facto de a actividade aeróbia de E09 contra as linhas celulares ser reforçada sob condições ácidas suaves (Phillips et al., 1992). A administração de E09 num 10 ΕΡ 2 060 259/ΡΤ veículo ácido resultaria em maior actividade no interior da bexiga, e qualquer fármaco absorvido na corrente sanguínea tornar-se-ia relativamente inactivo devido à subida do pH extracelular. As experiências seguintes também determinam o papel de NQOl na activação de E09 em condições ácidas.

Recolha de amostras de tumores e de bexigas normais. A aprovação ética para a recolha de tecidos foi obtida do comité ético local para a investigação (Local Research Ethical Committee, Bradford NHS Trust), e as amostras foram recolhidas dos doentes após consentimento informado. Recolheu-se um total de 17 pares de biópsias com pinça a frio de tumores da bexiga e de mucosa da bexiga de aspecto macroscopicamente normal na citoscopia, imediatamente antes da ressecção transuretral formal do tumor. Três amostras foram recolhidas de doentes que estavam a ser submetidos a uma cistectomia, e as amostras normais e dos tumores foram dissecadas pelos patologistas no espaço de uma hora após a remoção cirúrgica. As amostras foram ultracongeladas em azoto líquido e transportadas para análise da enzima NQOl. Recolheram-se biópsias adicionais da mucosa de bexiga normal imediatamente adjacente ao local de biopsia anterior, que foram enviadas no final do procedimento, juntamente com o tumor submetido a ressecção, em formalina, para análise histológica de rotina. Deste modo, a enzimologia do urotélio no tumor da bexiga e na bexiga normal pôde ser directamente correlacionada com a histologia do tecido apropriado em cada doente. A imuno-histoquímica foi efectuada a partir dos blocos de cera subsequentemente armazenados para histologia.

Determinação bioquímica da actividade de NQOl. As culturas de células em fase de crescimento exponencial foram digeridas com tripsina, lavadas duas vezes com solução salina equilibrada de Hanks (HBSS) e tratadas com ultra-sons em gelo (3x pulsos de 30 s a 40% do ciclo de utilização e configuração de saída 4, num aparelho de ultra-sons de células Semat 250). A actividade e a concentração proteica de NQOl foram determinadas da forma descrita abaixo. Os tecidos foram homogeneizados (homogenato a 10% p/v) em sacarose (0,25 M) , utilizando um homogeneizador de tecidos de 1 ml (Fisher Scientific). As fracções citosólicas foram preparadas por centrifugação do homogenato a 18000 g durante 4 min, seguida 11 ΕΡ 2 060 259/ΡΤ de centrifugação adicional do sobrenadante a 110 000 g durante lha 4°C, numa ultracentrífuga Óptima TL de Beckman. A actividade de NQOl no sobrenadante foi determinada espectrofotometricamente (espectrofotómetro DU650 de Beckman), através de medição da redução sensível ao dicumarol do diclorofenolindofenol (DCPIP, Sigma Aldrich, Reino Unido) a 600 nm (Traver et al., 1992) . Este ensaio tem sido extensamente validado para utilização na medição da actividade de NQOl em tecidos e em homogenatos de células, além de ser preferível a outros ensaios de determinação da actividade de NQOl (Hodnick & Sartorelli, 1997). Cada reacção continha NADH (200 IzM), DCPIP (40 /iM, Sigma Aldrich, Reino Unido), dicumarol (20 μΜ, quando necessário, Sigma Aldrich, Reino Unido), fracção citosólica de tecidos (50 p,1 por ensaio), num volume final de 1 ml de tampão Tris HC1 (50 mM, pH 7,4) contendo albumina sérica de bovino (0,7 mg ml-1, Sigma Aldrich, Reino Unido). As velocidades de redução de DCPIP foram calculadas a partir da parte linear inicial da curva de reacção (30 s), e os resultados foram expressos em termos de nmol de DCPIP reduzido/min/mg de proteína, utilizando um coeficiente de extinção molar de 21 mNT cirT1 para DCPIP. A concentração de proteína foi determinada utilizando o ensaio de Bradford (Bradford, 1976).

Imuno-histoquímica. Os anticorpos policlonais (produzidos em coelhos) contra NQOl de rato purificada foram uma oferta do Professor Richard Knox (Enact Pharma Plc). A validação do anticorpo para utilização nos estudos de imuno-histoquímica foi efectuada por análises de transferência de Western, utilizando NQOl recombinante humana purificada e extractos celulares derivados de um painel de linhas celulares de origem humana. Estas linhas celulares incluíram H460 (cancro do pulmão de não pequenas células humano), RT112 (carcinoma da bexiga humano), HT-29 (carcinoma do cólon humano), BE (carcinoma do cólon humano), MT1 (cancro da mama humano) e DLD-1 (carcinoma do cólon humano). A linha celular BE foi genotipada para a variante polimórfica C609T de NQOl e é um mutante homozigótico (e, por conseguinte, desprovido de actividade da enzima NQOl) no que diz respeito a este polimorfismo (Traver et al., 1992). As células foram lavadas em solução salina tamponada com fosfato gelada e lisadas por ultra-sons (30 segundos em gelo) em Tris HC1 (50 mM, pH 7,5) 12 ΕΡ 2 060 259/ΡΤ contendo EGTA 2 mM, PMSF 2 mM e leupeptina 25 Ftg ml'1. A concentração de proteína foi estimada utilizando o ensaio de Bradford (Bradford, 1976), e um total de 12,5 μρ de proteína (em tampão de amostra de Laemlli) foram aplicados num gel de SDS-PAGE a 12%. Após a transferência electroforética para papel de nitrocelulose, as membranas foram bloqueadas com TBS/Tween 20 (a 0,1%) contendo leite em pó magro a 5% durante 1 h à temperatura ambiente. As membranas foram lavadas com TBS/Tween 20 (a 0,1%) antes da adição do anticorpo de coelho anti-NQOl de rato (diluição 1:100) e incubadas à temperatura ambiente durante 1 h. As membranas foram extensamente lavadas com TBS/Tween 20 (a 0,1%), seguindo-se a adição do anticorpo secundário anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase de rábano (diluição de 1:5000 em TBS/Tween 20). As proteínas foram visualizadas por quimioluminescência baseada em ECL, tal como descrito pelo fabricante (Amersham Pharmacia Biotech, Bucks, Reino Unido).

Para os estudos imuno-histoquímicos, todos os tecidos (tanto o tumor como a mucosa de bexiga normal) foram fixados em formalina a 10%, processados de modo rotineiro e embutidos em cera de parafina. Duas secções de cada bloco de tecido foram colocadas numa lâmina: uma secção serviu de teste e a outra de controlo negativo (sem anticorpo primário). Um total de 5 secções de cada amostra foram coradas quanto a NQOl (mais controlos negativos), e as amostras normais e de tumores de um total de 17 doentes foram analisadas. As secções (5 μιη) foram libertadas da cera, reidratadas e incubadas com anticorpo primário (diluição de 1:400) durante 4 horas. As secções foram depois lavadas e incubadas com anticorpo de ratinho anti-IgG de coelho biotinilado durante 30 min, antes da coloração pela imunoperoxidase utilizando os reagentes VECTASTAIN ABC e DAB (Vector Laboratories Ltd., Peterborough, Reino Unido). As secções foram submetidas a coloração de contraste com hematoxilina de acordo com os procedimentos padrão.

Cultura de células e estudos de quimiossensibilidade. O composto E09 foi uma oferta de NDDO Oncology, Amsterdão, e a MMC foi obtida do Departamento de Farmácia, St Lukes Hospital, Bradford. A linha celular H460 (cancro do pulmão de não pequenas células humano) foi obtida de American Type Culture Collection (ATCC). As linhas celulares HT-29 (carcinoma humano 13 ΕΡ 2 060 259/ΡΤ do cólon), RT112/83 (carcinoma epitelial humano da bexiga), EJ138 (carcinoma humano da bexiga) e T24/83 (carcinoma humano de células de transição da bexiga) foram obtidas da European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC). As células A2780 (carcinoma humano dos ovários) e BE (carcinoma humano do cólon) foram uma oferta do Dr. T Ward (Paterson Institute, Manchester, Reino Unido). Todas as linhas celulares foram mantidas sob a forma de culturas em monocamada em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com soro fetal de vitelo (a 10%), piruvato de sódio (2 mM), L-glutamina (2 mM), penicilina/estreptomicina (50 Ul/ml / 50 μg/ml) e tamponado com HEPES (25 mM) . Todos os materiais para a cultura de células foram adquiridos de Gibco BRL (Paisley, Reino Unido). As células foram expostas a MMC ou a E09 numa gama de doses durante uma hora, e a quimiossensibilidade foi determinada após um período de recuperação de cinco dias utilizando o ensaio de MTT, cujos detalhes estão descritos em outra publicação (Phillips et al.r 1992). O pH do meio utilizado durante a exposição ao fármaco foi ajustado utilizando pequenas alíquotas de HC1 concentrado (40 ,A HC1 conc. [10,5 M] adicionados a 20 ml de meio origina um pH de 6,0) . As curvas de calibração foram realizadas ao longo de uma gama ampla de valores de pH no meio de cultura (pH 3,5 a 11), e a estabilidade das condições de pH foi monitorizada ao longo de um período de incubação de uma hora a 37°C. Não se observaram alterações significativas do pH do meio ao longo do período de exposição de uma hora ao fármaco, a todos os valores de pH (resultados não apresentados).

Os esferóides multicelulares de HT-29 foram preparados semeando 5 X 105 células em frascos T25, que haviam sido revestidos na base com ágar-ágar (a 1% p/v), e incubando durante 24 h a 37 °C. Os esferóides imaturos foram depois transferidos para um frasco de fundo deformado (Techne) contendo 250 ml de meio de crescimento RPMI 1640, e os esferóides foram mantidos em suspensão por meio de agitação a 50 rpm. Quando atingiram um diâmetro de aproximadamente 500 Am, os esferóides foram colhidos para os estudos de quimiossensibilidade. Os esferóides multicelulares foram expostos a uma gama de concentrações de E09, a pHe 6,0 e 7,4, durante uma hora a 3 7°C. Após a incubação com o fármaco, os esferóides foram lavados duas vezes com HBSS, antes da 14 ΕΡ 2 060 259/ΡΤ desagregação em células únicas utilizando tripsina e EDTA. Os esferóides desagregados foram depois lavados com HBSS, plagueados em placas de 96 poços (1 x 103 células por poço) e incubados a 37°C durante guatro dias. A guimiossensibilidade foi avaliada utilizando o ensaio de NM da forma descrita em outra publicação (Phillips et al., 1992). O papel de NQOl na activação de E09, a valores de pHe de 7,4 e 6,0, foi avaliado utilizando o inibidor de NQOl, ácido flavona-acético (FAA), cujos detalhes estão descritos em outra publicação (Phillips, 1999). O FAA é um inibidor competitivo de NQOl em relação a NADH e, a uma concentração final de 2 mM, a inibição de NQOl é >95%, ao passo que a actividade da citocromo P450-redutase e da citocromo b5-redutase não é substancialmente alterada (<5% inibição). Resumidamente, células H460 (ricas em NQOl) foram plaqueadas em placas de 96 poços, a uma densidade de 2 x 103 células por poço. Após uma incubação durante a noite a 37°C, o meio foi substituído por meio fresco (pH 7,4) contendo uma concentração não tóxica de FAA (2 mM) e incubado durante uma hora a 3 7°C. O meio foi depois substituído por meio fresco contendo E09 (gama de concentrações do fármaco) e FAA (2 mM) , a pHe 7,4 ou a pHe 6,0. Após uma hora adicional de incubação a 37°C, as células foram lavadas duas vezes com HBSS e incubadas a 37°C em meio de crescimento durante cinco dias. A quimiossensibilidade foi determinada pelo ensaio de NM como descrito acima, e os resultados foram expressos em termos de valores de CI50, razões de select ividade (CI50 a pHe 7,4/CIso a pHe 6,0) e razões de protecção (CI50 para as combinações FAA/E09 / CI50 para E09 sozinho).

Especificidade do substrato. A influência do pHe ácido na especificidade do substrato para a enzima NQOl humana purificada foi determinada da forma previamente descrita (Phillips, 1996; Walton et al., 1991). A redução mediada por NQOl da espécie quinona para a espécie hidroquinona é difícil de detectar por meio de ensaios convencionais, sendo, assim, necessária a utilização de um passo gerador de um sinal repórter. Neste ensaio, a hidroquinona actua como um aceitador de electrões intermediário, que subsequentemente reduz o citocromo C que pode ser facilmente detectado espectrofotometricamente. A NQOl humana recombinante foi 15 ΕΡ 2 060 259/ΡΤ obtida de Ε. coli transformada com o plasmídeo de expressão pKK233-2 contendo a sequência de ADNc completa da NQOl humana isolada de (Beall et al., 1994). Após a indução com IPTG, a NQOl foi purificada por cromatografia de afinidade com azul de cibacron, num processo cujos detalhes estão descritos em outra publicação (Phillips, 1996). A proteína purificada apresentou um peso molecular de aproximadamente 31 kDa e uma actividade específica de 139 /Amoles de DCPIP reduzido/min/mg proteína (Phillips, 1996). A redução de E09 pela enzima NQOl recombinante humana foi determinada a pH 6,0 e 7,4, através de medição da velocidade de redução do citocromo c a 550 nm, num espectrofotómetro DU 650 de Beckman, de acordo com os métodos previamente publicados (Phillips, 1996). Os resultados foram expressos em termos de μιηοΐεε de citocromo c reduzido/min/mg proteína, utilizando um coeficiente de extinção molar de 21,1 mM-1 cm-1 para o citocromo c.

Medição do pH intracelular. O pH intracelular foi determinado utilizando o indicador de pH fluorescente BCECF (2,7-bis-(2-carboxietil)-5-(e-6)carboxifluoresceína (Molecular Probes, Eugene, E.U.A.) de acordo com as instruções dos fabricantes. Frascos de células confluentes foram lavados com HBSS para remover quaisquer vestígios de meio RPMI contendo soro e depois foram incubados com a forma esterificada de BCECF (BCECF-AM), a uma concentração de 2 [tM em HBSS, durante uma hora a 37°C. O detergente não desnaturante Pluronic foi adicionado à sonda para ajudar à dispersão. As células foram depois lavadas para remover todos os vestígios de BCECF-AM e, em seguida, foram colocadas em contacto com tripsina, antes de serem suspensas em meio RPMI isento de soro/isento de vermelho de fenol (Gibco BRL, Paisley, Reino Unido), a uma concentração de 106 células por ml, a pH 6 durante uma hora. A medição da fluorescência foi determinada num espectrofotómetro de fluorescência de Perkin-Elmer, em cuvetes descartáveis de 4 ml de qualidade UV (Fischer Scientific), com comprimentos de onda de excitação de 500 nm e 450 nm (fenda de passagem de banda de excitação de 10 nm) e comprimento de onda de emissão fixo de 530 nm (fenda de passagem de banda de emissão de 2,5 nm) . Estes valores foram determinados como sendo as configurações óptimas para o instrumento e o sistema em estudo. Efectuou-se uma calibração in situ para cada determinação de pHi com uma gama de seis pH entre 4 e 9, utilizando o ionóforo nigericina 16 ΕΡ 2 060 259/ΡΤ a uma concentração de 22,8 p,M para equilibrar o pHe com o pHi. O cálculo da razão de fluorescência a 500 nm/450 nm foi efectuado após subtracção da fluorescência do fundo dos brancos a cada pH (RPMI isento de soro e isento de vermelho de fenol sem células).

Actividade de NQOl em amostras de tumores e de bexiga normal. A actividade bioquímica de NQOl em pares de amostras de mucosa tumoral (categoria/fase variando entre G2 pTa e G2/G3 T4) e de mucosa normal da bexiga (com três amostras de cistectomia) recolhidas de uma série de 20 doentes está apresentada na Tabela 1. Dentro das amostras de tumores, observou-se um intervalo amplo de actividade de NQOl que variou entre 571,4 nmol/min/mg e um valor indetectável (<0,1 nmol/min/mg). Nas amostras de mucosa da bexiga histologicamente normal, a actividade de NQOl variou entre 190,9 e <0,1 nmol/min/mg. Na maioria dos doentes, a actividade de NQOl no tumor foi maior que na mucosa da bexiga normal. A categoria e a fase do tumor não se correlacionaram com a actividade de NQOl (Tabela 1).

Validação do anticorpo NQOl e localização imuno-histoquímica de NQOl. A análise de transferência de Western demonstra que o anticorpo policlonal anti-NQOl de rato reage de forma cruzada com a NQOl humana (Figura 1), observando-se uma banda única a aproximadamente 31 kDa tanto para os extractos celulares como para a NQOl humana purificada. A titulação da NQOl purificada resulta numa diminuição da intensidade da banda (Figura 1B) e, nos extractos celulares, a intensidade da banda foi qualitativamente consistente com a actividade enzimática de NQOl (Figura IA) . Adicionalmente, o anticorpo não detecta NQOl na linha celular BE, que é desprovida de actividade de NQOl em resultado do polimorfismo C609T (Figura 1C) . Não se observaram bandas não específicas nas transferências de Western. A coloração pela imunoperoxidase da proteína NQOl em tecido tumoral, na parede da bexiga, no uréter e na uretra está apresentada na Figura 2. Os tumores superficiais e invasivos (pTa - painel A, G3 pT2 -painel B e G3 pT4 - painel C) com níveis elevados a intermédios de NQOl, tal como determinados por meio de ensaios bioquímicos (doentes n.os 1, 4 e 5 na Tabela 1), apresentaram uma coloração claramente positiva para NQOl. A coloração ficou 17 ΕΡ 2 060 259/ΡΤ confinada ao citoplasma das células tumorais, com pouca ou nenhuma coloração das células estromais (painéis B e C).

Em outros tumores com níveis intermédios ou baixos de actividade de NQOl, a coloração foi heterogénea com bolsas de células contendo níveis elevados de proteína NQOl (resultados não apresentados). As secções da parede de bexiga normal foram obtidas de um doente que foi submetido a uma cistectomia (tumor da bexiga G3 pT4); o uréter e a uretra foram obtidos de outro doente que foi submetido a uma cistectomia (tumor da bexiga G3 pT3a). Na parede da bexiga, não se observou qualquer coloração de NQOl no urotélio (painel D) , embora estivesse presente uma ligeira coloração nas camadas do músculo liso. A uretra (painel E) mostrou-se negativa, embora células na superfície luminal do uréter estivessem coradas positivamente (painel F). As camadas basais do revestimento do uréter estavam, no entanto, coradas negativamente (painel F) . Não se observou qualquer evidência de malignidade invasiva ou de carcinoma in situ no uréter e na uretra ou na secção da parede da bexiga apresentadas (painel D) . Em 16 outras amostras de biopsia e de cistectomia de bexigas normais, não se observou qualquer coloração positiva do urotélio (resultados não apresentados).

Influência do pH na quimiossensibilidade e na especificidade do substrato. A capacidade de E09 para actuar como um substrato para NQOl não foi influenciada pelo pH, com actividades específicas de 21,10 ± 2,3 e de 21,30 + 1,5 pmol citocromo C reduzido/min/mg de proteína, a pH 7,4 e 6,0, respectivamente. A resposta de um painel de linhas celulares com uma gama de actividade de NQOl (< 1,0 a 1898 ± 276 nmol/min/mg) a E09 e MMC, a valores de pHe de 7,4 e de 6,0, está apresentada na Tabela 2 e na Figura 2. A pHe = 7,4, verificou-se uma boa correlação entre a actividade de NQOl e a quimiossensibilidade a E09 (Figura 3) . No caso da MMC (Tabela 2, Figura 3), foi evidente uma relação entre NQOl e a quimiossensibilidade (a pHe 7,4), embora esta relação não fosse tão proeminente como aquela apresentada por E09, com uma gama estreita de valores de CI50 (intervalo de 0,9 a 7,0 ttM) observada nas linhas celulares que cobrem uma gama ampla de actividade de NQOl (variando entre <1,0 e 1898 nmol/min/mg). Ambos os compostos MMC e E09 são preferencialmente mais 18 ΕΡ 2 060 259/ΡΤ tóxicos para as células a valores de pHe de 6,0, embora se observe uma potenciação muito maior da actividade de E09, com os valores de RS (RS = razão de selectividade definida como CI5o pHe 7,4 / CI50 pHe 6,0) variando entre 3,92 e 17,21 para E09 em comparação com 1,02 a 4,50 para MMC (Tabela 2). A actividade de E09 foi reforçada tanto nas linhas celulares ricas como deficientes em NQOl quando o pHe foi reduzido para 6,0, e a relação entre NQOl e a quimiossensibilidade permaneceu boa quando as células foram expostas a E09 sob condições ácidas (Fiqura 3). Não se observou morte de células nas culturas de controlo quando o pHe foi reduzido para 6,0 (na ausência de fármaco), tal como determinado pelo ensaio de MTT. A resposta das células H460 a E09 a valores de pHe de 7,4 e 6,0, na presença e na ausência de FAA (2 mM), está apresentada na Tabela 3. A ambos os valores de pHe, a resposta das células H460 a E09 foi reduzida na presença de FAA. As razões de protecção, definidas como sendo o valor de CI50 para E09 mais FAA dividido pelo valor de CI5o para E09 sozinho, foram similares para as células sujeitas a valores de pHe ácido e fisiológico (14,63 e 13,95, respectivamente; Tabela 3). As razões de selectividade, definidas como sendo o valor de CI50 a pHe 7,4 dividido pelo valor de CI50 a pHe 6,0, na presença e na ausência de FAA, também foram similares, com valores de RS de 6,31 e 6,02 para E09 sozinho e para E09 mais FAA, respectivamente (Tabela 3). A resposta dos esferóides multicelulares de HT-29 a E09 está apresentada na Figura 4. Os esferóides expostos a E09 foram significativamente mais receptivos a pHe 6,0 que a pHe 7,4, com valores de CI50 de 9,89 ± 0,89 e de 24, 24 + 3,29 AM, respectivamente. Os esferóides foram significativamente menos receptivos a E09 em comparação com as mesmas células expostas a E09 sob a forma de monocamadas, a ambos os valores de pHe, com razões dos valores de CI50 esf eróides/monocamadas de 202 e 341, aos valores de pHe de 7,4 e 6,0, respectivamente.

Influência de condições de pHe ácido sobre o pHi. Os valores de PM após uma incubação de uma hora a pHe 6,0 foram de 6,44 ± 0,04; 6,51 ± 0,02 e 6,42 ± 0,05 nas células A549, RT112/83 e A2780, respectivamente. A adição do ionóforo nigericina (após uma incubação de uma hora a pHe 6,0) resultou no equilíbrio do pHe e pHi. 19 ΕΡ 2 060 259/ΡΤ

Em termos do desenvolvimento de fármacos biorredutores, dois dos factores críticos que, no final, determinarão a selectividade são a enzimologia dos tumores e a presença de hipoxia (Workman, 1994). Tal como sublinhado na introdução, a presença ou ausência de NQOl é central para a concepção de estratégias terapêuticas apropriadas baseadas no composto E09 e destinadas a visar quer a fracção aeróbia (células ricas em NQOl) quer a fracção hipóxica (tumores deficientes em NQOl) dos tumores. Workman (1994) destacou um mecanismo proposto para as diferentes propriedades de E09 sob condições aeróbias e hipóxicas, com base na hipótese de que é a semiquinona (produto da redução com um electrão) e não a hidroquinona que é responsável pela toxicidade. Nas células deficientes em NQOl, a semiquinona produzida em resultado de redutases de um electrão seria relativamente não tóxica, uma vez que reverteria rapidamente para o composto parental via o ciclo redox. A espécie do tipo radical livre gerada em resultado do ciclo redox seria destoxifiçada pela superóxido-dismutase ou pela catalase, mas sob condições hipóxicas, a semiquinona seria relativamente estável. Se esta fosse a espécie tóxica principal, então a actividade de E09 contra as células pobres em NQOl seria potenciada. Nas células ricas em NQOl, contudo, o produto principal formado seria a hidroquinona. A toxicidade aeróbia poderia ser gerada em resultado da oxidação inversa da espécie hidroquinona para a espécie semiquinona ou a quinona parental (Butler et al., 1996), resultando na geração de radicais livres. Sob condições hipóxicas, contudo, a hidroquinona será mais estável e se esta for relativamente não tóxica, então a actividade de E09 contra as células ricas em NQOl sob hipoxia não seria potenciada. Embora o mecanismo de acção de E09 sob condições aeróbias e hipóxicas seja complexo, os resultados biológicos sugerem que E09 deveria visar a fracção aeróbia de tumores ricos em NQOl ou a fracção hipóxica de tumores deficientes em NQOl (Workman, 1994). A análise da actividade de NQOl em tecidos tumorais e em tecidos de bexiga normal identificou claramente os doentes cujos tumores são ou ricos em NQOl ou deficientes em NQOl (Tabela 1). Dentro do subconjunto de tumores ricos em NQOl, a actividade enzimática é elevada em relação ao urotélio de uma bexiga normal. Os estudos imuno-histoquímicos confirmam estas medições bioquímicas, com a coloração confinada às células 20 ΕΡ 2 060 259/ΡΤ tumorais em oposição às células estromais normais (Fig. 2, painéis A, B e C) . Nos tecidos de bexiga normal, a coloração de NQOl mostrou-se ausente do revestimento urotelial da bexiga (Fig. 2, painel D) e da uretra (Fig. 2, painel E). Observou-se uma leve coloração das camadas superficiais do uréter (Fig. 2, painel F) , embora as camadas basais subjacentes do uréter estivessem coradas negativamente. De forma similar, uma coloração fraca das camadas de músculo liso da bexiga, do uréter e da uretra foi também observada (resultados não apresentados).

Estes estudos sugerem que uma proporção dos doentes com tumores da bexiga (de várias categorias e em várias fases da doença) exibe um diferencial significativo em termos de actividade de NQOl, que poderia ser potencialmente explorado por terapias baseadas no composto E09 dirigidas contra a fracção aeróbia das células tumorais. No que diz respeito à capacidade de E09 para matar selectivamente células deficientes em NQOl hipóxicas, também existe um subconjunto de doentes cujos tumores são desprovidos de actividade de NQOl (Tabela 1). Não se sabe se os tumores da bexiga contêm ou não regiões de baixa tensão de oxigénio, e são necessários estudos adicionais utilizando marcadores de hipoxia, como seja o pimonidazole (Kennedy et al., 1997), para considerar este assunto e estabelecer a relação entre a actividade de NQOl e a hipoxia em tumores.

Enquanto os estudos bioquímicos e imuno-histoquímicos demonstram que existe um subconjunto de doentes que possui a enzimologia tumoral apropriada para activar E09 (em condições aeróbias), a quimioterapia intravesical pode resultar em toxicidade sistémica devido à entrada do fármaco na corrente sanguínea. Este estudo também avaliou uma possível estratégia para minimizar qualquer risco de toxicidade sistémica, com base na hipótese de que a administração de E09 num veículo ácido reforçaria a potência de E09 (Phillips et al., 1992) no interior da bexiga e de que qualquer fármaco que chegasse à corrente sanguínea ficaria relativamente inactivo devido a uma subida do pHe. A selectividade para as células aeróbias ainda seria determinada pela actividade de NQOl e, por conseguinte, é essencial determinar o papel que NQOl desempenha na activação de E09 sob condições de pHe ácido. Em um painel de 21 ΕΡ 2 060 259/ΡΤ linhas celulares com um espectro amplo de actividade de NQOl, a redução do pHe para 6,0 aumenta a potência de E09 sob condições aeróbias em todos os casos (com valores de RS variando entre 3,92 e 17,21; Tabela 2) . No caso da MMC, a potência também é reforçada a valores de pHe baixos, embora a magnitude do aumento da toxicidade dependente do pH seja reduzida (valores de RS variando entre 1,02 e 4,50; Tabela 2) em comparação com E09. No que diz respeito à MMC, uma explicação para a maior actividade sob condições ácidas tem sido atribuída ao facto de a MMC se tornar um substrato para NQOl em condições ácidas (Pan et al., 1993; Siegel et al., 1993) . Isto não é o caso para E09, uma vez que as velocidades de redução de E09 pela NQOl humana purificada não são influenciadas pelo pH (21,10 ± 2,30 e 21,30 ± 1,50 limol de citocromo C reduzido/min/mg proteína a pH 7,4 e 6,0, respectivamente). Estudos recentes demonstraram que a actividade de E09 é aumentada sob condições ácidas (pHe = 6.5) , mas apenas quando o pH intracelular é reduzido (pHi = 6.5) por co-incubação com nigericina (Kuin et al., 1999). Os resultados deste estudo estão de acordo com esta constatação, uma vez que o pHi se torna ácido (os valores de pHi variam entre 6,42 ± 0,05 e 6,51 ± 0,02 dependendo da linha celular) quando as células são cultivadas em condições de pHe 6,0.

No painel de linhas celulares utilizadas neste estudo, existe uma boa correlação entre a actividade de NQOl e a quimiossensibilidade a ambos os valores de pHe de 7,4 e 6,0 (Figura 3) . Uma forte relação entre a actividade de NQOl e a resposta em condições aeróbias (a pHe 7,4) foi anteriormente estabelecida por vários grupos (Robertson et al., 1994;

Fitzsimmons et al., 1996; Smitkamp-Wilms et al., 1994), e há uma evidência clara de que NQOl desempenha um papel central no mecanismo de acção de E09 em condições aeróbias (Workman, 1994) . A boa correlação entre a actividade de NQOl e a resposta a pH 6,0, em conjunto com o facto de E09 ainda ser um bom substrato para NQOl a pH 6,0, sugere que NQOl desempenha um papel significativo no mecanismo de acção de E09 a valores de pHe ácidos e sob condições aeróbias. Tem interesse salientar, contudo, que a actividade de E09 contra as células BE (que são desprovidas de actividade de NQOl em resultado do polimorfismo C609T; Traver et al., 1992) também é aumentada em condições de pHe ácido (Tabela 2) . Isto sugere que existe um 22 ΕΡ 2 060 259/ΡΤ mecanismo independente de NQOl para a maior actividade de E09 em condições ácidas. Tal é confirmado pela utilização do inibidor de NQOl, FAA, em que as "razões de protecção" (definidas como sendo a razão dos valores de CI50 para E09 mais FAA divididos pelos valores de CI50 para E09) são similares a ambos os pHe 7,4 e 6,0 (13,95 e 14,63, respectivamente; Tabela 3). Se NQOl desempenhou um papel central na activação de E09 a pHe 6,0, então a razão de protecção a pHe 6,0 seria significativamente maior que a razão de protecção a pHe 7,4. O mecanismo por trás da activação de E09 independente de NQOl não é claro, embora seja um facto bem conhecido que a reactividade das estruturas de aziridina em anel é aumentada pela protonação, resultando em abertura do anel e formação do ião aziridinio que é uma espécie alquilante potente (Mossoba et al., 1985; Gutierrez, 1989). Em alternativa, E09 é um substrato para outras redutases de um electrão (Maliepaard et al., 1995; Saunders et al., 2000) e é necessário efectuar estudos adicionais para avaliar se o metabolismo de E09 por estas enzimas é ou não dependente do pH. A potência de E09 pode ser adicionalmente aumentada por redução do pHe para valores inferiores a 6,0 (Phillips et al., 1992), mas é improvável que estas condições proporcionem benefícios clínicos significativos, uma vez que o composto E09 se torna progressivamente mais instável quando o pH é reduzido para 5,5 (ti/2 = 37 min) . De um ponto de vista farmacológico, a administração de E09 num veículo a pH 6,0 parece desejável. Isso não só resultaria num aumento significativo da actividade de E09, como a estabilidade de E09 também seria suficiente (11 /2 = 2,5 h) para manter os parâmetros de exposição ao fármaco num nível terapêutico.

No que diz respeito à actividade de E09 contra modelos de cultura tridimensionais in vitro, este estudo demonstrou que a redução do pHe para 6,0 aumenta a potência de E09 contra os esferóides multicelulares, embora a magnitude deste efeito seja reduzida em comparação com as culturas em monocamada (Figura 4). Não se sabe se a redução do pHe resulta ou não em maior morte celular ao longo do esferóide ou se ela está confinada à superfície do esferóide exposta ao meio. Em comparação com a MMC, estudos prévios utilizando histoculturas expostas a MMC demonstraram a não existência de uma diferença de toxicidade entre as condições de pHe fisiológico e ácido 23 ΕΡ 2 060 259/ΡΤ (Yen et al., 1996). O aumento dependente do pH da toxicidade de E09 contra os esferóides sugere que a manipulação do pHe poderá não só ser útil no tratamento de um tumor da bexiga sólido com múltiplas camadas, como também oferecer uma vantagem sobre a MMC. Deve, no entanto, referir-se que os esferóides multicelulares são significativamente menos receptivos a E09 que as monocamadas, presumivelmente devido às fracas propriedades de penetração do composto E09 através do tecido avascular (Phillips et al., 1996). E09 pode, no entanto, matar >90% das células nos esferóides (Figura 4), o que sugere que, pelo menos a doses mais elevadas, a penetração de E09 é suficiente para erradicar as células que se situam a alguma distância da superfície do esferóide.

Em conclusão, os resultados deste estudo demonstraram que, dentro de uma população de doentes com tumores da bexiga em várias fases e categorias da doença, existe uma grande heterogeneidade relativamente à expressão de NQOl. A maioria dos doentes tem tumores possuindo níveis elevados de NQOl, ao passo que um pequeno subconjunto de doentes parece ser desprovido de actividade de NQOl. A natureza heterogénea da actividade de NQOl aqui descrita é consistente com vários outros estudos em vários tipos de tumores (Malkinson et al., 1992; Smitkamp-Wilms et al., 1995; Siegel et al., 1998). Estas constatações reforçam a ideia de que a determinação do "perfil enzimático" dos doentes individuais poderia ser valioso antes da intervenção terapêutica com fármacos biorredutores (Workman, 1994) . Que seja do nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a caracterizar a actividade e a localização celular de NQOl em tumores da bexiga e a proporcionar indicações fortes no sentido de apoiar o estudo de E09 contra os tumores da bexiga superficiais e localmente invasivos. Este estudo demonstrou claramente que, em condições aeróbias, E09 é muito mais potente em condições ácidas (pH 6,0) que a pH fisiológico (pH 7,4). O mecanismo para esta potência acrescida de E09 parece ser independente de NQOl e, embora isto não melhore (ou reduza) a selectividade, poderá revelar-se benéfico em termos de reduzir a dose terapeuticamente eficaz de E09. A redução da dose, juntamente com uma redução da potência de E09 devido ao pHe mais elevado na corrente sanguínea, sugere que a toxicidade sistémica resultante da administração intravesical de E09 seria baixa. Adicionalmente, 24 ΕΡ 2 060 259/ΡΤ este estudo mostra que, em condições fisiológicas, a actividade de E09 é muito mais baixa em tecidos com uma expressão "normal" de NQOl em comparação com os tecidos que expressam níveis "elevados" de NQOl (isto é, os tumores). Os resultados deste estudo proporcionam indicações fortes em apoio da proposta de que a administração intravesical de E09 poderá ter aplicação contra os tumores da bexiga.

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Tabela 1.

Relatórios de histologia dos tumores e actividade de NQOl em pares de amostras de tumores da bexiga e de mucosa de bexiga normal.

Doente n.° Histologia do tumor Actividade de NQOl Tumor (nmol/min/mg) Actividade de NQOl Normal (nmol/min/mg) Razão dos níveis de NQOl no tecido tumoral face ao tecido normal i f, s, 1, p G2 pTa 571,4 <0,1 571,0 2 m, s, r G3 pT2 273,3 <0,1 273,0 3 f, s, i GlpTa 107,80 <0,1 107, 0 4 m, e, i G3 pT2/3 73,36 <0,1 73,3 s m, s, i G3pT4 (C) 81,30 4,10 19,8 h 6 G2PT1 309,50 25,20 12,1 7 m, n, r, o G3 pT2 10, 00 <0,1 10,0 8 f n, i G3pT2 9,80 <0,1 9, 80 9 m, n, i G2 pT2 4,40 <0,1 4, 40 10 m,s,c G3 pT2 34, 01 8, 50 4, 00 H m's G 1 pTa 69, 76 22,20 3,14 12 , , n GlpTa 42, 16 15,30 2, 73 13 m,n,i G3 pT2 179,6 72,12 2,49 14 m,e,i G2/G3 T4 (C) 89, 70 63,30 1,41 15 m,n,r G3 pT2 0,40 <0,1 0,40 16 m,e, c, o G3 PT3 (C) 21,60 61, 70 0,35 17 f n,i G2 PTI 58, 40 190,90 0,30 18 m,e,o G2 PTI <0,1 <0,1 0 19 f n,i G2 PT I. <0,1 <0,1 0 20 m,e,c,r G2 pTO <0,1 <0,1 0 mHomem, fMulher, sFumador, χΝ§ο fumador, eEx-fumador, *Quimioterapia intravesical antes da recolha da amostra, rRadioterapia antes da recolha da amostra, Apresentação inicial, pMalignidade prévia diferente de bexiga, hHistorial clinico não disponível, °Possível exposição ocupacional a agentes carcinogéneos (isto é, trabalhador da indústria de corantes). (C) designa amostras de cistectomia. Em todos os casos, os níveis de proteínas após a preparação da fracção citosólica foram superiores a 0,1 mg/ml. 30 ΕΡ 2 060 259/ΡΤ

Tabela 2.

Relação entre a actividade de NQOl e a quimiossensibilidade a E09 e a MMC em condições de pHe fisiológico e ácido.

Linha celular Fár- maco NQOl (nmol/min/mg) CI50 pHe 7,4 (nM) CI50 pHe 6, 0 (nM) RS* H460 E09 16521142 60 + 10 9,5+2 6,31 HT-29 E09 688152 120+53 29 + 10 4,13 T24/83 E09 - 285128 290165 60118 4,83 A2 78 0 E09 159133 200+50 51114 3,92 EJ138 E09 83114 310+95 3917 7,94 RT112 E09 3013 1050+75 61113 17, 21 BE E09 <0,1 5300+169 1300+75- 4, 07 H460 MMC 16521142 900+200 220+130 4, 50 HT-29 MMC 688152 1050+2100 500+240 2,10 T24/83 MMC 285128 2150193 21001800 1, 02 A2 78 0 MMC 159133 2400+340 1400+130 1, 71 EJ138 MMC 83114 1600+200 14001250 1,14 RT112 MMC 3013 3350+250 2000+500 1,67 BE MMC <0,1 7000+192 4400+215 1, 59

Todos os resultados apresentados são a média de 3 experiências independentes (valores do DP omitidos no interesse da apresentação). *RS (razão de selectividade) = CI50 a pH 7, 4 / CI50 a pH 6,0

Tabela 3. Resposta de células H460 a E09, na presença ou ausência de FAA (2 mM), a valores de pHe de 7,4 e 6,0. Fármaco pHe O LO M O RS* ** RP E09 7,4 60,0±8,1 - E09 6,0 9,512,6 6,31 - E0 9/FAA 7,4 837145 - 13, 95 E0 9/FAA 6,0 139127 6,02 14, 63 RS = Razão de selectividade definida como sendo a razão dos valores de CI50 a pHe=7,4 divididos pelos valores de CI50 a pHe=6,0. RP = Razão de protecção definida como sendo a razão dos valores de CI5o para E09 mais FAA divididos pelos valores de CI50 para E09 sozinho.

Todos os valores representam a média ± desvio padrão para três experiências independentes. 31 ΕΡ 2 060 259/ΡΤ

Tabela 4. Ε09 (Neoquin) 8 mg/frasco de produto liofilizado

Armazena- Parâmetro de tempo (meses) mento teste 0 1 2 3 6 O o LO teor* 102,7 ± 1,2 na na 103,8 ± 0,8 100,6 ± 0,6 pureza* * 99,9 ± 0,008 na na 99,5 ± 0,03 9 9,6 ± 0, 03 humidade residual*** 6, 0% na na 7,0% 6,3% pH após reconstituição**** 9,5 na na na 9,4 25 °C/6 0%HR teor 102,7 ± 1,2 103,4 ± 0, 7 102,1 ± 0,2 102,6 ± 1,3 97, 4 ± 1,0 pureza 99,9 ± 0,008 99,9 ± 0, 05 99,9 ± 0, 01 99,2 ± 0,07 98, 7 ± 0,2 humidade residual 6, 0% na na 5,9% 5, 9% pH após reconstituição**** 9,5 na na na 9,4 40 °C/75%HR teor 102,7 ± 1,2 102,3 ± 1,1 100,4 ± 1,3 101,3 ± 0,2 86, 4 ± 2,0 pureza 99,9 ± 0,008 99,8 ± 0, 01 99, 7 ± 0, 04 98,4 ± 0,07 97,5 ± 0,2 humidade residual 6, 0% na na 6,2% 6,3% pH após reconstituição**** 9,5 na na na 9,5 *teor como % do teor apresentado no rótulo n=3 “pureza como pureza cromatográfica n=3

Lisboa, 2010-04-19

Claims (9)

1. ΕΡ 2 060 259/ΡΤ 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Formulação anticancerosa compreendendo uma solução tamponada que compreende: 5-(1-azaridinil)-3-(hidroximetil)-2-[(E)-3-hidroxiprop-l-enil]-1-metil-lH-indolo-4,7-diona (E09) e um veículo de formulação compreendendo terc-butanol/água.
2. 2. Formulação anticancerosa de acordo com a reivindicação 1, em que a solução tamponada possui um pH que varia entre 9 e 9,5.
3. 3. Formulação anticancerosa de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que compreende adicionalmente um agente de volume.
4. 4. Formulação anticancerosa de acordo com a reivindicação 3, em que o agente de volume é a lactose.
5. 5. Formulação anticancerosa de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que compreende adicionalmente uma composição de revestimento.
6. 6. Formulação anticancerosa de acordo com a reivindicação 5, em que a composição de revestimento é seleccionada entre propilenoglicol, hidroxipropilcelulose, carboximetilcelulose, cloridrato de quitosano, lectina e policarbofilo.
7. 7. Formulação anticancerosa de acordo com a reivindicação 1, em que o veículo de formulação compreende terc-butanol a 40%/água.
8. 8. Método de preparação de uma formulação compreendendo 5-(1-azaridinil)-3-(hidroximetil)-2-[(E)-3-hidroxiprop-l-enil]-1-metil-lH-indolo-4,7-diona (E09), em que o método compreende preparar uma formulação tal como definida na reivindicação 1 e liofilizar a formulação para proporcionar um liofilizado.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, que compreende adicionalmente a etapa de reconstituição do liofilizado num veículo de reconstituição. Lisboa, 2010-04-19