FI84874C

FI84874C - Foerfarande foer inkapsling av biologiskt aktiva aemnen, enligt metoden framstaelld kapsel, dess anvaendning och foder innehaollande den.

Info

Publication number: FI84874C
Application number: FI895216A
Authority: FI
Inventors: Eeva-Liisa Syvaeoja; Jouko Setaelae; Juha Nousiainen; Hannu Kalsta
Original assignee: Valio Meijerien
Priority date: 1989-11-02
Filing date: 1989-11-02
Publication date: 1992-02-10
Also published as: EP0426463A2; NO904754L; EP0426463A3; FI895216A0; US5104662A; FI84874B; NO904754D0; JPH03169337A

Description

1 84874

Menetelmä biologisesti aktiivisten aineiden kapseloimiseksi, menetelmällä valmistettu kapseli, sen käyttö ja sitä sisältävä rehu 5 Keksinnön kohteena on menetelmä biologisesti aktii visten aineiden kapseloimiseksi geeliyttämällä ne suoli-liman kanssa, menetelmällä valmistettu kapseli, sen käyttö rehun lisukkeena ja kapselia käsittävä rehu.

Biologisesti aktiivisten aineiden antamisessa suun 10 kautta ongelmana on usein se, että aineet tuhoutuvat ruoansulatuskanavassa, yleensä vatsalaukussa, ennen kuin ne pääsevät vaikutuskohtaan, suoleen. Tämä ongelma on ratkaistu kapseloimalla aktiiviset aineet suojaavalla materiaalilla, joka kestää vatsalaukun olosuhteet ja hajoaa vasta suolis-15 tossa.

Kapselointimenetelmää on käytetty eri lääkeaineille. Laajassa katsauksessaan Sanders (1985, Chem. & Eng. News, April 1: 31) totesi lääkeaineiden kapseloinnin pyrkivän lääkkeen hallittuun vapautumiseen. Kapseloinnissa on käy-20 tetty erilaisia hydrogeelejä (esim. hydroksietyylimetakry-laatti), polymeerimatrikseja (esim. etyleenivinyyliasetaat-ti) tai bioadhesiivisiä matrikseja (esim. karboksimetyyli-selluloosa), eli kyseessä ovat olleet synteettiset kapselointi järjestelmät .

25 Kapselointimenetelmä, jolla voidaan kapseloida rehu ja, ravintoaineita, farmaseuttisia valmisteita tms. kuvataan FI-patenttijulkaisussa 64173. Kapselointimateriaalina käytetään polymeerien seos, jossa yhtenä pääkomponenttina on metyyliakrylaatti. Kapselointimenetelmä, jolla voidaan 30 kapseloida fysiologisesti aktiivisia materiaaleja kuvataan myös JP-hakemusjulkaisussa 84/113192. Kapselointimateriaalina käytetään CaC03, HC1 ja vaha.

Nyt on yllättäen havaittu, että suolilima soveltuu erinomaisesti biologisesti aktiivisten aineiden kapselointi -35 seksi. Näin ollen on kehitetty uusi kapselointimenetelmä, 2 84874 mä, joka perustuu suoliliman glykoproteiinien toiminnallisten, biokemiallisten ja fysiologisten ominaisuuksien hyödyntämiseen. Menetelmä on teknisesti yksinkertainen eikä kapselointiaineella ole haitallisia sivuvaikutuksia, 5 koska se ei ole synteettinen, vaan luonnontuote.

Suojakapselin valmistuksessa on erityisesti hyödynnetty suoliliman reversiibeliä vedensitorniskykyä, joka mahdollistaa kylmäkuivatun suolilimakapselin turpoamisen ruoansulatuskanavan nesteissä, ja suoliliman entsymaattis-10 ta pilkkoontumiskestävyyttä mahalaukussa ja pilkkoontumis- herkkyyttä ohutsuolessa, jotka mahdollistavat biologisesti aktiivisten aineiden kuljettamisen toimintakykyisinä mahalaukun kautta ohutsuoleen ja toimintakykyisten biologisesti aktiivisten aineiden vapauttamisen ohutsuolen distaali-15 päässä. Kapselimateriaalin mukana ruoansulatuskanavaan siirtyy sulatuksen kannalta edullisia biologisia tekijöitä, jotka ovat mukana limassa, kuten esimerkiksi lysot-syymi, haiman entsyymit ja yleensä suolinesteessä olevat ruoansulatusentsyymit.

20

Suoliliman aineosat ja niiden ominaisuudet

Suoliliman ominaisuuksia on käsitelty kirjallisuudessa esim. Journal of Applied Bact. 66 (1989): 407-417, 25 Physiology of the gastrointestinal tract, 2nd ed., Raven Press, London.

Ruoansulatuskanavan epiteeliä peittää suolilima eli musiini. Sen tehtävänä on suojella epiteeliä ja toimia liukastusaineena. Suolilima koostuu vedestä, veren seeru-30 min ja solujen makromolekyyleistä, somaattisista ja mik-robisoluista sekä glykoproteiineistä.

Musiini-glykoproteiinien rakenteelle ominaisia ovat peptidi-alayksiköt ja niihin sidostuneet oligosakkaridi-ketjut. Kukin alayksikkö on yksi pitkä peptidi, jonka mo-35 lekyylipaino on useita satoja tuhansia daltoneja. Pepti- 3 84874 liittyessä päittäin toisiinsa muodostuu glykoproteiini, jonka molekyylipaino on useita miljoonia daltoneja.

Oligosakkaridiketjuissa on tavallisesti 2-8 soke-rimolekyyliä. Tyypillisiä sokereita ovat N-asetyyligalak-5 toosiamiini (GalNAc) ja N-asetyylineuramiinihappo (NeuAc) eli sialihappo.

Oligosakkaridiketjut ovat sidostuneet siten, että peptidi-alayksikössä on useita sekä tiheästi glykosyloitu-neita että glykosyloitumattomia, ns. paljaita kohtia.

10 Oligosakkaridiketjujen koostumuksella, rakenteella ja paikallisella tiheydellä peptidiketjussa on voimakas vaikutus glykoproteiinien liukoisuuteen, viskositeettiin, sähkövaraukseen ja denaturaatioon. Yleisesti ottaen oligosakkaridiket jut tehostavat musiini-glykoproteiineissa kal-15 siumin kelatoimiskykyä, vedensitomiskykyä, geelinmuodostus-kykyä ja proteolyysinkestävyyttä.

Musiini-glykoproteiinit ovat niihin sidostuneiden oligosakkaridiketjujen vaikutuksesta vesiliuoksessa voimakkaasti hydratoituneita, elastisia ja osittain kierteisiä 20 makromolekyylejä, jotka elektronimikroskooppikuvissa näkyvät pitkinä nauhamaisina juosteina (4 - 6 pm).

Suoliliman muodostuminen ohutsuolessa 25 Musiini-glykoproteiinit syntetisoituvat ohutsuolen epiteelin limasoluissa ja tiivistyvät niiden jyväsiin. Tiivistymistä tehostavat kaksiarvoiset kationit (Ca2*, Mg2* ja Zn2 4 ). Erityisesti kalsiumionit sitoutuvat voimakkaasti oligosakkaridiketjuihin ja tehostavat glykoproteiinien 30 tiivistymistä ja tiiviinä pysymistä.

Limasolut erilaistuvat pikarisoluiksi, jotka erittävät glykoproteiinipitoisia jyväsiä ohutsuoleen. Kationit diffundoituvat jyväsistä ulos ja suolinestettä imeytyy jyväsiin. Tällöin glykoproteiinit sitovat vettä, jonka 35 seurauksena jyväset turpovat voimakkaasti. Glykoproteiinien 4 84874 hydratoitumisen seurauksena suoleen muodostuu geelimäistä suolllimaa, musllnla.

Geelinä suolillma poikkeaa agarl- ja alginaattigee-leistä. Nämä ovat suolllimaa elastlsempla ja kemiallisesti 5 yhtenäisempiä, mikä johtuu säännöllisistä molekyylien välisistä sidoksista. Suolillma on edellä mainittuja kasvilima-geelejä huokoisempi, mikä mahdollistaa ravinteiden ja epi-teelieritteiden esteettömän diffuusion suolessa.

Suoliliman muodostumiseen tarvittavan musiini-glyko-10 proteiinin määrä vaihtelee 15 - 50 mg/ml. Tällä konsentraa-tioalueella suolilima on löysä glykoproteiinipohjainen geeli, jonka sisäiset tilat täyttävät suolineste ja kaikki siinä esiintyvät aineosat kuten vesi, lipidit, entsyymit sekä irronneet epiteelisolut ja mikrobit.

15

Suoliliman hajoaminen ruoansulatuskanavassa

Mahalaukussa suolllimaa hajoittaa pepsiini, ohutsuolessa proksimaalisesti haiman ja limakalvon proteaasit 20 sekä distaalisesti glykosidaasit ja mikrobien proteinaasit. Hajoaminen ilmenee Ilmakerroksen ohenemisena.

Mahalaukussa suolilima laimenee ensiksi mahanesteeseen ja turpoaa. Pepsiinin pilkkoessa glykoproteiineja, alayksikköjen paljaista kohdista vapautuu liukoisia glyko-25 peptidejä, jotka eivät kykene uudestaan muodostamaan geeliä.

Ohutsuolessa glykoproteiinien alayksikköjen peptidi-ketjut voivat pilkkoontua vasta kun glykosidaasit ovat poistaneet suuren osan oligosakkaridiketjuista, joiden 30 voimakas sähkövaraus estää proteaasien toiminnan. Ohutsuolen distaalipäässä suoliliman viskositeetti alenee nopeasti, kun glykoproteiinit pilkkoontuvat liukoisiksi glykopep-tideiksi, jotka eivät kykene uudestaan muodostamaan geeliä.

Paksusuolessa glykoproteiinit ja peptidi-alayksiköt 35 pilkkoontuvat proteaasien, proteinaasien, glykosidaasien 5 84874 pilkkoontuvat proteaasien, proteinaasien, glykosidaasien ja sulfataasien vaikutuksesta. Normaalitilassa ulosteissa esiintyy vain pieniä määriä musiini-glykoproteiineja.

5 Eri eläinten suoliliman väliset erot

Eri nisäkäslajien suoliliman musiini-glykoproteii-nien aminohappoprofiili on varsin yhtenäinen, samoin hiilihydraattien määrä ja laatu, kun taas esim. hiilihydraat-10 ti-eli oligosakkaridiketjujen pituus voi vaihdella huomattavasti .

Eri eläinlajien suoliliman ominaisuudet suoja- ja liukastusaineena ovat kuitenkin varsin yhtenäiset.

Kaikille musiini-glykoproteiineille on yhteistä 15 suuri koko, korkea hiilihydraattipitoisuus ja veden-sitomisominaisuudet, jotka yhdessä ovat tämän keksinnön mukaisen musiinikapselin ominaisuuksien ja käytön perusta.

Keksinnön mukaiselle kapselointimenetelmälle on 20 tunnusomaista, että biologisesti aktiiviset aineet geeliy-tetään suoliliman kanssa. Sopivan annostusmuodon saamiseksi on edullista suorittaa geeliyttäminen alginaatin ja kalsiumin läsnäollessa. Kalsium! aikaansaa alginaatin saostuksen. Kapseloitavina aineina tulevat kysymykseen 25 mitkä tahansa biologisesti aktiiviset aineet kuten esim. mikro-organismit, entsyymit, vasta-aineet ja antibiootit. Erityisesti menetelmä soveltuu mikro-organismien tai niiden biologisesti aktiivisten komponenttien kapseloimisek-si. Mikro-organismit ovat edullisesti maitohappobakteereja 30 ja biologisesti aktiiviset komponentit entsyymejä. Maitohappobakteereja esim. Lactobacillus- ja Streptococcus-su-kuun kuuluvia bakteereja käytetään suolistoprobiootteina, koska ne vaikuttavat edullisesti suoliston toimintaan mm. alentamalla pH:ta, jolloin haitallisten suolistobakteerien 35 kasvu estyy. Usein probiootteina käytetään adhesiivisten 6 84874 Tämän keksinnön piiriin kuuluu lisäksi kapseli, jolle on tunnusomaista, että se käsittää suolilimaa ja sen kanssa geeliytettyjä biologisesti aktiivisia aineita. Aktiivisina aineina ovat edullisesti mikro-organismit, eri-5 tyisesti maitohappobakteerit. Keksinnön piiriin kuuluu myös biologisesti aktiivisia aineita, kuten mikro-organismeja, edullisesti maitohappobakteereja sisältävän suolilimakap-selin käyttö eläinten rehun lisukkeena sekä rehu, joka käsittää biologisesti aktiivisia aineita, kuten mikro-or-10 ganismeja, edullisesti maitohappobakteereja sisältävän suolillmakapselin.

Esimerkki 1 Märkä musiini otettiin porsaan ohutsuolesta mekaani-15 sesti puristamalla suolen ratkomisen yhteydessä. Mekaaniseen puristukseen liittyi huuhtelu ja pesu noin 40 eC-as-teisella vedellä. Märkä musiini kuivattiin lyofilisoimalla ja jauhettiin huhmareessa.

4 g lyofilisoitua maitohappobakteerivalmistetta ja 20 6 g lyofilisoitua musiinijauhetta sekoitettiin 50 - 150 ml:aan l-%:ista natriumalginaattiliuosta tasaiseksi massaksi. Seosta tiputettiin 100 ml:n luer-kantaisista ruiskuista 1 metrin korkeudelta 1 M CaCl2-liuokseen +4 -+40 eC:n lämpötilassa. Muodostuneita kapseleita pidettiin tässä 25 liuoksessa ja lämpötilassa edelleen korkeintaan 30 minuuttia, minkä jälkeen ne huuhdeltiin kaksi kertaa kylmällä vedellä ja lyofilisoitiin kuiviksi.

Em. tavalla tehdyistä kuivista kapseleista määritettiin maitohappobakteerien määrä maljavalumenetelmällä an-30 aerobisesti MRS-agarilla (37 *C, 3 vrk), jonka perusteella laskettiin annokset sikakokeisiin. Maitohappobakteerien kokonaismäärä oli 107 cfu/g, mikä vastasi valmistusvaiheessa lisättyä määrää.

7 84874

Esimerkki 2

Esimerkissä 1 valmistetuista kapseleista suoritettiin in vitro sulavuuskokeita. 2,5 g kapseleita sulatettiin ensin 37 °C:n vesihauteessa 100 mlrssa 0,1 N suolahappoa, 5 johon oli lisätty pepsiiniä 10 mg. Neljän tunnin inkuboin-nin jälkeen säädettiin suodoksen pH 8,Oraan natriumhydrok-sidilla ja lisättiin vielä 50 ml 0,067 M fosfaattipuskuria, jossa oli pankreatiinia 27 mg. Inkubointia jatkettiin 24 h 37 °C:ssa. Pepsiinikäsittely ei vaikuttanut kapselei-10 hin. Pankreatiinisulatuskaan ei rikkonut kapseleita, mutta ne olivat jo hyvin turvonneita.

Esimerkki 3

Koe suoritettiin fysiologisena kokeena neljällä noin 15 30 kiloa painavalla sialla, joilla oli fisteli ohutsuolessa ileumissa näytteiden ottamista varten. Siat ruokittiin kahdesti päivässä ohra-soija -dieetillä, joka tyydytti sikojen ravinnetarpeen. Koemalli oli ryhmäjaksokoe, jossa jakson pituus oli kaksi viikkoa. Ensimmäisellä jaksolla 20 kaksi sikaa sai kapseloimatonta maitohappobakteeria (MHB) ja kaksi sikaa MHB-suolilimakapselia. Toisella jaksolla käsittely vaihdettiin. Käytetty maitohappobakteeri oli kylmäkuivattu Lactobacillus fermentum, joka oli eristetty sian ohutsuolen sisällöstä.

25 Maitohappobakteereja annettiin eläimille sama kon- sentraatio, joka oli 2 g/sika/pv. Jokaisen jakson neljänä viimeisenä päivänä kerättiin näytteet sonnasta ja ohutsuolen sisällöstä (taulukko).

8 84874 C Ο ώ in οοαιηοο vo cm <D > σ> ο vo »-ι γη vo o o\ φ ^ 01 (0 oooooooo

H I

O» Λ

0 H

o -

•H

XI N

o o

(-1 OOOOOvOlDHfSrH

M «VVVVS.VK

•H W (N ι-H !S H O CO O tS

g CO Oi

VO

Λ n β 0) ta to ® -h e o

r-l 0 3 O <H

h μ μ oioi n h co vj co x (0 C’H « ' vr-| •h ® o γ^ή ronooj vo G E rH U"> t—( rH CO Ή 3 Md)

^ Q) CO

Ή O.

β · to O J Ä

H H

*0 - en

•H

m o e x g o ® jtf <D -μ ro o

O H β COOCOCO^OCTifH

I—I O Q) «-K

3 3 E vocjvoir-ioinvocN

(0(0 μ a) m rH oo E< μ Φ .β Ή 3 4-t 3 Ä · fl O iJ n β 0) --

TO

O H

•H H g ta o o -f e \ Vi (0 E 3 Tj 3 <H > •μ - O ·Η 3 P op *

Ä OI * CO

H i—( O4 -H I I I -H ® <0 \(0H= = = U * > H X Olli 0) ΟΛΟ dl g

β E > E «· μ O

Λ E 03 O X > Ό · Λ -a ® b •Ηβ « μ o a * λ λ Φαί o a λ ο oh μ φ a μ a χ: * a a-* ta ta a λ λ -η ο a a w rt X <0 > X! β a Λ Λ g E 3 λ 3 λ o a x: £ ·* he o μ .* h λ o o.

λ 3 μ ,c x a .c μ μ * >μ H H H O H H -H _ ICO ΛΛμμΟΛΧΛΣ m o 2swa>sa2 « ÄO w g X - 9 84874

Kapseloidulla MHB-valmisteella saatiin merkitsevästi (P<0,05) korkeampi haihtuvien rasvahappojen tuotanto sekä korkeampi maitohapon tuotanto ileumissa. Suurempi happojen tuotanto vaikutti edullisesti ileumin sisällön 5 pH -arvoon, joka oli lähes merkitsevästi (P<0,06) alhaisem pi kapseloitua MHB-valmistetta saaneilla sioilla. Jauheena tai kapseloituna annettujen MHB-valmisteiden vaikutus ileumin sisällön maitohappobakteerien määrään ei ollut erilainen, mikä osoittaa kapseloitujen L. fermentum -baktee-10 rien ja sen lisäksi myös niiden entsyymien olleen toimintakykyisempiä (suurempi happotuotanto) ja siten kapseloinnin edullisen vaikutuksen.

Yhtään kapselia ei löydetty eläinten sontanäytteis-tä, mikä osoittaa kapselin hajoavan täydellisesti sian 15 ruoansulatuskanavassa.

Claims

10 84874

1. Menetelmä biologisesti aktiivisten aineiden kap-seloimiseksi, tunnettu siitä, että biologisesti 5 aktiiviset aineet geeliytetään suoliliman kanssa alginaa-tin ja kalsiumin läsnäollessa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että biologisesti aktiiviset aineet ovat mikro-organismeja tai niiden biologisesti aktii-10 visia komponentteja.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikro-organismit ovat maito-happobakteereja.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että biologisesti aktiiviset ai neet ovat entsyymejä.

5. Kapseli, tunnettu siitä, että se käsittää suolilimaa ja sen kanssa alginaatin ja kalsiumin läsnäollessa geeliytettyjä biologisesti aktiivisia aineita.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen kapseli, tun nettu siitä, että biologisesti aktiiviset aineet ovat mikro-organismej a.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen kapseli, tunnettu siitä, että mikro-organismit ovat maitohappo- 25 bakteereja.

8. Suoliliman kanssa alginaatin ja kalsiumin läsnäollessa geeliytettyjä biologisesti aktiivisia aineita sisältävän suolilimakapselin käyttö eläinten rehun lisukkeena .

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen käyttö, tun nettu siitä, että biologisesti aktiiviset aineet ovat mikro-organismeja, edullisesti maitohappobakteereja.

10. Rehu, tunnettu siitä, että se käsittää suoliliman kanssa alginaatin ja kalsiumin läsnäollessa 35 geeliytettyjä biologisesti aktiivisia aineita, kuten mik ro-organismeja, edullisesti maitohappobakteereja sisältävän suolilimakapselin. u 84874