CN104116710A - 靶向肿瘤的pH敏感聚合物胶束组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物制剂领域，涉及靶向肿瘤的pH敏感聚合物胶束组合物，尤其是包载难溶性抗肿瘤药物的pH敏感靶向聚合物胶束组合物。本发明采用一定比例的生物相容的pH敏感两亲性嵌段聚合物、连接靶向配体或抗体的两亲性聚合物构建靶向肿瘤的pH敏感聚合物胶束，其包载难溶性抗肿瘤药物。经试验证明，本发明的聚合物胶束组合物具有pH依赖性的释放特征，并以高浓度蓄积于肿瘤组织，对肿瘤细胞具有特异性靶向抑制生长的作用，为难溶性抗肿瘤药物提供了一种新型的载体和制剂策略。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂领域，涉及靶向肿瘤的pH敏感聚合物胶束组合物，尤其是包载难溶性抗肿瘤药物的pH敏感靶向聚合物胶束组合物。
背景技术
目前临床上治疗肿瘤的常用化疗药物多为疏水性药物，其在水中的溶解度非常低，难于制备合适的制剂，往往采取各种方法增加其溶解度，如将其制成盐类、加入助溶剂及低分子表面活性剂等增溶。由于表面活性剂易得，所以临床使用时采用低分子表面活性剂增溶往往成为首选。但该剂型血液稳定性很差，低分子表面活性剂等辅料的毒副作用也很大，而且释放行为不易控制。因此，研究开发难溶性抗肿瘤药物的载体对临床肿瘤治疗有着重要的意义。近年来，聚合物胶束载药系统引起了广泛地关注。
聚合物胶束是两亲性聚合物在水环境中自组装形成的独特的核-壳结构，能够增溶难溶性药物，并且其纳米级粒径可避免被巨噬细胞识别和吞噬，通过肿瘤组织EPR效应而增强被动靶向性，减少药物不良反应，被认为是最有前景的抗肿瘤药物传递系统之一。然而，常规的聚合物胶束存在两大缺陷：一是胶束在体循环中过早的释药，增加了全身的毒副作用；二是肿瘤部位释放药物的浓度或药物的蓄积不够，达不到有效治疗浓度。因此，降低体内循环时药物的释放、控制聚合物胶束到达肿瘤部位或肿瘤细胞后再快速释放药物是提高抗肿瘤药物的有效性和安全性的一种有效方式。具有响应外部刺激(如温度、pH、超声、酶等)而触发释放的智能型聚合物胶束传递系统在这方面具有十分明显的优势，并已经成为抗肿瘤药物制剂的研究热点，其中pH依赖性释放药物的pH敏感聚合物胶束最引人关注。这是因为，一方面，实体瘤的细胞外间质pHe为6.5-7.2，低于正常组织的pH7.4；细胞内部含有pH更低的内涵体(pH5.5-6.0)和溶酶体(pH4.5-5.0)。另一方面，聚合物胶束主要通过内吞被细胞摄取，胶束到达的细胞内位点是内涵体/溶酶体。胶束由胞外内化入胞及随后的过程要经历pH的梯度变化。当外部环境的pH高于形成聚合物胶束的嵌段聚合物的pKa时，聚合物胶束以紧密完整的形态包载药物，基本不释放；当外部环境的pH低于形成聚合物胶束的嵌段聚合物的pKa时，胶束急剧膨胀，甚至解聚，药物便快速释放。因此，在肿瘤部位或入胞后的胶束响应其pH环境的变化释药加快。利用这一特性可以实现体内特定部位(肿瘤)或细胞内(内涵体、溶酶体、细胞质)靶向给药。为了将抗肿瘤药物更加特异性输送至肿瘤部位，还可用对肿瘤细胞具有特异性识别功能的配基和配体对胶束表面进行修饰，增强肿瘤细胞对胶束的内吞作用，实现主动靶向递送药物，从而提高药物在肿瘤部位的聚集浓度和释放量。
目前，在公开的现有技术中，由于生物相容性和生物可降解性的限制，形成pH敏感聚合物胶束的pH敏感嵌段聚合物的亲水链段一般仅局限于聚乙二醇(PEG)，而处于胶束亲水表面的PEG可能阻碍胶束的细胞摄取和随后的胞内过程。此外，pH敏感聚合物胶束的pH敏感嵌段普遍是疏水链段呈现pH敏感性，由其形成胶束的pH敏感区域在胶束内核，其对外部环境pH的刺激响应较迟缓，因此在弱酸性条件下的释放虽然快于pH7.4的情况，但还是相对缓慢。
因此，为了降低抗肿瘤药物对正常细胞或组织的毒副作用、促进胶束在肿瘤组织和细胞内的快速释放以及增加抗肿瘤药物在肿瘤组织和细胞内的累积，研制一种将难溶性抗肿瘤药物靶向输送至肿瘤部位并在肿瘤组织和胞内同时快速释放的聚合物胶束载体系统，有着广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于克服常规聚合物胶束过早释药以及肿瘤部位释放药物的浓度或药物的蓄积不够的问题。
一方面，本发明提供一种用于治疗肿瘤的包载难溶性抗肿瘤药物的pH敏感靶向聚合物胶束组合物。该组合物包含pH敏感两亲性嵌段聚合物、连接靶向肿瘤细胞的配体或抗体的两亲性聚合物和难溶性抗肿瘤活性成分。所述pH敏感两亲性嵌段聚合物的亲水链段是具有pH敏感性的聚(2-烷基-2-噁唑啉)(PAOz)，疏水链段选自聚酯(PE)、聚乙二醇维生素E琥珀酸酯(TPGS)、维生素E琥珀酸酯(VES)等；所述的pH敏感两亲性嵌段聚合物是二嵌段、三嵌段聚合物和/或它们的混合物。其中，所述的亲水链段PAOz的分子量为300～20000，优选1000～15000，更优选4000～10000；疏水链段中的PE的分子量为800～20000，优选1000～15000，更优选2000～10000；疏水链段中TPGS的聚乙二醇部分的分子量为200～2000，优选400～1500，更优选600～1200。
所述的聚(2-烷基-2-噁唑啉)(PAOz)嵌段中的烷基是含有1-6个碳原子的烷基，优选1-4个碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丙基、正丁基，更优选甲基、乙基。
所述的疏水链段选自聚乳酸、聚己内酯、聚丁内酯、聚戊内酯、聚乙交酯丙交脂、胆酸、TPGS、维生素E琥珀酸酯、磷脂、磷脂衍生物。优选聚乳酸、聚己内酯、聚乙交酯丙交酯、维生素E琥珀酸酯、磷脂。更优选聚乳酸、维生素E琥珀酸酯、磷脂。
所述的连接靶向配体或抗体的两亲性聚合物可以是连接靶向配体或抗体的所述pH敏感两亲性嵌段聚合物或者是靶向配体-或抗体-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺。当连接靶向配体或抗体的两亲性聚合物是连接靶向配体或抗体的所述pH敏感两亲性嵌段聚合物时，所述的pH敏感两亲性嵌段聚合物至少一部分，优选至少5％，更优选至少10％，最优选至少20％连接靶向配体或抗体。当连接靶向配体或抗体的两亲性聚合物是靶向配体-或抗体-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺时，所述的pH敏感两亲性嵌段聚合物与靶向配体-或抗体-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的摩尔比为10∶0.2-1∶10，优选10∶1-3∶10，更优选10∶3-10∶10
所述的靶向配体-或抗体-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇部分的分子量为600～20000，优选1000～15000，更优选4000～10000。
所述的靶向肿瘤细胞的配体或抗体选自但不限于叶酸、维生素B12、RGD、RGDYK、NGR、YPSMA-1单抗、氯毒素、2C5单抗、转铁蛋白、低密度脂蛋白、透明质酸，以及它们的混合物。
所述的难溶性抗肿瘤活性成分选自但不限于紫杉烷类药物如紫杉醇、喜树碱类药物如9-硝基喜树碱、蒽环类药物如阿霉素、鬼臼毒素半合成衍生物类药物如替尼泊苷、替尼类药物如索尼替尼。优选紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素。
另外，本发明的组合物还可以包含药学上可接受的添加剂。
本发明用于治疗肿瘤的包载难溶性抗肿瘤药物的pH敏感靶向聚合物胶束组合物可以通过本领域公知的方法制备，例如透析法、薄膜分散法、乳化法、溶剂挥发法、冻干法、共溶剂挥发法、注入法等。胶束的平均粒径在200nm以下，优选100nm以下。
另一方面，本发明还涉及包载难溶性抗肿瘤药物的pH敏感的靶向聚合物胶束组合物用于治疗肿瘤的用途。
另一方面，本发明涉及以下方案：
方案1.一种聚合物胶束组合物，其包含难溶性抗肿瘤药物、pH敏感的两亲性嵌段聚合物、靶向肿瘤细胞的配体-或抗体-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺以及任选的可药用辅料。
方案2.如方案1所述的聚合物胶束组合物，其中的pH敏感两亲性嵌段聚合物与靶向肿瘤细胞的配体-或抗体-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的摩尔比为10∶0.2-1∶10，优选10∶1-3∶10，更优选10∶3-10∶10。
方案3.如方案1-2任一项所述的聚合物胶束组合物，其中的pH敏感的两亲性嵌段聚合物的亲水链段为600～20000Da，优选1000～15000，更优选4000～10000分子量的聚(2-烷基-2-噁唑啉)(PAOz)，疏水链段选自聚酯(PE)、TPGS、维生素E琥珀酸酯(VES)、胆酸、磷脂和磷脂衍生物，优选选自聚乳酸、聚己内酯、聚乙交酯丙交酯、维生素E琥珀酸酯、磷脂，更优选选自聚乳酸、维生素E琥珀酸酯、磷脂；并且所述的两亲性嵌段聚合物是二嵌段聚合物、三嵌段聚合物和/或它们的混合物。
方案4.如方案3所述的聚合物胶束组合物，其中的亲水链段PAOz中的烷基是含有1-6个碳原子的烷基，优选1-4个碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丙基、正丁基，更优选甲基、乙基。
方案5.如方案3-4任一项所述的聚合物胶束组合物，其中的疏水链段选自分子量为800～20000，优选1000～15000，更优选2000～10000的聚酯，以及聚乙二醇部分的分子量为200～2000，优选400～1500，更优选600～1200的TPGS。
方案6.如方案1-5任一项所述的聚合物胶束组合物，其中的靶向配体-或抗体-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇部分的分子量为600～20000，优选1000～15000，更优选4000～10000。
方案7.如方案1-6任一项所述的聚合物胶束组合物，其中的靶向肿瘤细胞的配体或抗体选自叶酸、维生素B12、RGD、RGDYK、NGR、YPSMA-1单抗、氯毒素、2C5单抗、转铁蛋白、低密度脂蛋白、透明质酸，以及它们的混合物。
方案8.如方案1-7任一项所述的聚合物胶束组合物，其中的难溶性抗肿瘤药物选自紫杉烷类药物如紫杉醇、喜树碱类药物如9-硝基喜树碱、蒽环类药物如阿霉素、鬼臼毒素半合成衍生物类药物如替尼泊苷、替尼类药物如索尼替尼。优选选自紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素。
方案9.如方案1-8任一项所述的聚合物胶束组合物，其中所述胶束的平均粒径在200nm以下，优选100nm以下。
方案10.如方案1-9任一项所述的聚合物胶束组合物用于制备治疗性肿瘤的药物的用途。
为了达到本发明的目的，本发明进行了本发明组合物的体外释放试验、细胞毒试验、细胞摄取试验、活体成像试验。体外释放试验用于说明本发明组合物的pH敏感性，细胞毒试验和细胞摄取试验用于说明本发明组合物的抗肿瘤活性，活体成像试验用于说明本发明组合物的肿瘤靶向性。
附图说明 参考附图1-图8，通过本发明的以下描述，本发明的上述及其它目的和特征将是显而易见的。
附图1为本发明实施例1聚合物的核磁氢谱图。
附图2显示了本发明实施例14中胶束的粒径分布。
附图3显示了本发明实施例14中胶束的透射电镜形态图。
附图4显示了本发明实施例14中胶束的体外释放图。
附图5显示了本发明实施例1中二嵌段聚合物的细胞毒性图。
附图6显示了本发明实施例14中胶束对前列腺癌细胞LNCaP的细胞毒性图。
附图7显示了本发明实施例14中胶束被前列腺癌细胞LNCaP的细胞摄取图。
附图8显示了本发明实施例14中胶束在接种前列腺癌细胞LNCaP的裸鼠中的活体成像图。图中A组为包载DiR的PEG5000-PLA3000胶束，B组为包载DiR的对应实施例12的胶束，C组为包载DiR的对应实施例13的胶束，D组为包载DiR的对应实施例14的胶束。图中的1、2、3、4和5所指示的组织分别为肿瘤、心、肝、脾、肺和肾。
如上所述，本发明的组合物具有显著的pH敏感性、肿瘤细胞靶向性和抗肿瘤活性，从而可实现肿瘤治疗的有效性和安全性。
具体实施方式
以下实施例用于进一步详细说明本发明，但绝对不是对本发明范围的限制。
实施例1聚(2-乙基-2-噁唑啉)-聚乳酸(PEOz4300-PLA2700)的合成
在装有搅拌器的三口烧瓶中，加入2-乙基-2-噁唑啉(10g，150mmol)、乙腈(40mL)、对甲苯磺酸甲酯(0.35g)，在80℃的油浴温度下、氮气氛搅拌反应30h。冷却后，加入KOH的甲醇溶液后，继续反应4h。除去溶剂，残余物用THF溶解，过硅胶柱，流出液倒入过量的冷乙醚中沉淀、抽滤，真空干燥12h。将丙交酯用乙酸乙酯重结晶3次，室温下真空干燥，测定其熔点为127℃。将得到的PEOz-OH粉末置于100mL圆底烧瓶中，加入约70mL甲苯，采用分水器共沸除水，使挥发出来的甲苯变澄清后停止加热。然后加入需要量的重结晶后的丙交酯和催化剂辛酸亚锡，抽真空通氮气保护，140℃下反应36h。旋蒸除去甲苯后，用二氯甲烷复溶，滴加至剧烈搅拌的0℃的无水乙醚中沉淀、过滤，沉淀复溶后，再用冷乙醚沉淀、真空干燥得到本发明的二嵌段共聚物PEOz4300-PLA2700。图1为共聚物的核磁氢谱图。
实施例2聚(2-乙基-2-噁唑啉)-聚乳酸-聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOz5000-PLA3000-PEOz5000)的合成
在装有搅拌器的三口烧瓶中，加入2-乙基-2-噁唑啉(10g，150mmol)、乙腈(40mL)、对甲苯磺酸甲酯(0.47g)，在80℃的油浴温度下、氮气氛搅拌反应30h。冷却后，加入KOH的甲醇溶液后，继续反应4h。除去溶剂，残余物用THF溶解，过硅胶柱，流出液倒入过量的冷乙醚中沉淀、抽滤，真空干燥12h。将得到PEOz-OH粉末(4g)溶于氯苯(80mL)，在氮气氛下加入D，L-丙交酯(6.3g)和辛酸亚锡(0.63g)，在140℃温度下反应24h。将反应液倒入过量的乙醚中沉淀、过滤，在室温下真空干燥12h。将得到的PEOz-PLA(0.47g)和4-二甲氨基吡啶(0.47g)溶于二氯甲烷中，并用冰水混合物冷却至0℃，然后将交联剂己二酰氯(0.47g)的二氯甲烷溶液滴入上述溶液中，回流反应48h；反应后的溶液用水洗涤两次，无水硫酸镁干燥，乙醚中沉淀，真空干燥即得本发明的三嵌段共聚物PEOz5000-PLA3000-PEOz5000。
实施例3聚乳酸-聚(2-乙基-2-噁唑啉)-聚乳酸(PLA2000-PEOz8000-PLA2000)的合成
将2-乙基-2-噁唑啉(9.9g)和1，4-二溴-2-丁烯(420mg)溶于丙酮(40mL)，在氮气氛下于100℃搅拌回流20h。冷却至室温后，向反应瓶中加入0.1mol/L KOH的甲醇溶液(40mL)后，继续反应4h。过硅胶柱，流出液倒入过量的冷乙醚中沉淀、抽滤，真空干燥24h。将得到HO-PEOz-OH粉末(2g)溶于氯苯(20mL)，在氮气氛下加入D，L-丙交酯(0.58g)和辛酸亚锡(30mg)，在140℃温度下反应24h。将反应液倒入过量的乙醚中沉淀、过滤，在室温下真空干燥12h，得到本发明的三嵌段共聚物PLA2000-PEOz8000-PLA2000。
实施例4聚丙交酯乙交酯-聚(2-乙基-2-噁唑啉)-聚丙交酯乙交酯(PLGA3000-PEOz10000-PLGA3000)的合成
将2-乙基-2-噁唑啉(9.9g)和1，4-二溴-2-丁烯(0.47g)溶于丙酮(40mL)，在氮气氛下于100℃搅拌回流20h。冷却至室温后，向反应瓶中加入0.1mol/L KOH的甲醇溶液(40mL)后，继续反应4h。过硅胶柱，流出液倒入过量的冷乙醚中沉淀、抽滤，真空干燥24h。将得到HO-PEOz-OH粉末(2g)溶于氯苯(20mL)，在氮气氛下加入D，L-丙交酯(1.26g)、乙交酯(0.51g)和辛酸亚锡(30mg)，在140℃温度下反应24h。将反应液倒入过量的乙醚中沉淀、过滤，在室温下真空干燥12h，得到本发明的三嵌段共聚物PLGA3000-PEOz10000-PLGA3000。
实施例5 叶酸-聚(2-乙基-2-噁唑啉)-聚乳酸(FA-PEOz6000-PLA3000)的合成
将2-乙基-2-噁唑啉(10g)和对甲苯磺酸甲酯(510mg)溶于乙腈(40mL)，在氮气氛下搅拌回流20h。冷却至室温后，向反应瓶中通入NH3，继续反应2h。冷乙醚沉淀、抽滤，真空干燥后得到端基分别为氨基和羟基分子量为6000的PEOz(HO-PEOz-NH2)。
取适量叶酸(FA)、EDC和NHS，在二氯甲烷中反应2h，得到叶酸的活泼酯FA-NHS。然后加入适量摩尔比的HO-PEOz-NH2，反应过夜，冷乙醚沉淀精制，真空干燥即得HO-PEOz-FA。
将得到HO-PEOz-FA粉末(2g)溶于氯苯(20mL)，在氮气氛下加入D，L-丙交酯(0.82g)和辛酸亚锡(30mg)，在140℃温度下反应24h。将反应液倒入过量的乙醚中沉淀、过滤，在室温下真空干燥12h，得到本发明的二嵌段共聚物FA-PEOz6000-PLA3000。
实施例6 RGDYK-聚(2-乙基-2-噁唑啉)-聚乳酸(RGDYK-PEOz4300-PLA2700)的合成
将2-溴丙酸乙酯(200mg)和2-乙基-2-噁唑啉(10g)溶于乙腈(100mL)，在氮气氛下加热搅拌回流12h。冷却至室温后，以氢氧化钾的甲醇溶液为终止反应，冷乙醚沉淀、抽滤，真空干燥后得端基分别为羧基和羟基、分子量为4300的PEOz(HOOC-PEOz-OH)。
将得到HOOC-PEOz-OH粉末(1.5g)溶于苯(20mL)，在氮气氛下加入D，L-丙交酯(1.2g)和辛酸亚锡(20mg)，在140℃温度下反应24h。将反应液倒入过量的乙醚中沉淀、过滤，在室温下真空干燥12h，得到HOOC-PEOz4300-PLA2700。
以适量的甲醇溶解HOOC-PEOz4300-PLA2700粉末(3.5g)，加入适量的EDC和NHS，搅拌10分钟，加入适量的RGDYK溶液，反应5小时，分离除去未反应的RGDYK，即得本发明的二嵌段共聚物RGDYK-PEOz4300-PLA2700。
实施例7 YPSMA-1-聚(2-乙基-2-噁唑啉)-聚乳酸(YPSMA-1-PEOz4300-PLA2700)的合成
分子量为4300的HOOC-PEOz-OH的合成方法参见实施例6。
HOOC-PEOz4300-PLA2700的合成方法参见实施例6。
以适量的甲醇溶解HOOC-PEOz4300-PLA2700粉末(4.5g)，加入适量的EDC和NHS，搅拌10分钟，加入适量的YPSMA-1溶液，调节溶液pH值至8.5，反应8小时，分离除去未反应的YPSMA-1，即得本发明的二嵌段共聚物YPSMA-1-PEOz4300-PLA2700。
实施例8 PEOz2000-VES的合成
将对甲苯磺酸甲酯(150mg)和2-乙基-2-噁唑啉(5g)溶于乙腈(80mL)，在氮气氛下加热搅拌回流12h。冷却至室温后，以NH3为终止剂，冷乙醚沉淀精制后真空干燥，制备得到端基为氨基、分子量为2000的PEOz(PEOz-NH2)。取适量VES、EDC和NHS，在二氯甲烷中反应2小时，即得VES的活泼酯(VES-NHS)。然后加入适量摩尔比的PEOz-NH2，以TEA为催化剂，反应4h后，冷乙醚沉淀精制，真空干燥即得本发明的PEOz2000-VES。
实施例9 包载阿霉素的pH敏感聚合物胶束的制备
采用透析法。预先将盐酸阿霉素(DOX·HCl)溶于DMSO中，加入过量三乙胺(与DOX·HCl摩尔比为3∶1)，避光搅拌过夜，使盐酸与三乙胺充分反应。然后将适量PEOz4300-PLA2700溶于DMSO中，加入上述DOX溶液，药材比为2∶10，混合均匀后装入透析袋(MWCO＝3500)中，用透析袋夹封住两端，浸入1000mL去离子水的透析液中并搅拌。透析持续12h，每隔2～3h换水一次。将透析袋内溶液经0.45μm滤膜过滤即得本发明胶束组合物。
实施例10 包载阿霉素的叶酸修饰的pH敏感聚合物胶束的制备
采用透析法。预先将盐酸阿霉素(DOX·HCl)溶于DMSO中，加入过量三乙胺(与DOX·HCl摩尔比为5∶1)，避光搅拌过夜，使盐酸与三乙胺充分反应。然后将PEOz6000-PLA3000(合成方法参见实施例1)和FA-PEOz6000-PLA3000以摩尔比1∶0.2溶于DMSO中，加入上述DOX溶液，药材比为10∶1，混合均匀后装入透析袋(MWCO＝3500)中，用透析袋夹封住两端，浸入1000mL去离子水的透析液中并搅拌。透析持续12h，每隔2～3h换水一次。将透析袋内溶液经0.45μm微孔滤膜过滤即得本发明胶束组合物，冻干可得胶束粉末。
实施例11 包载阿霉素的叶酸修饰的pH敏感聚合物胶束的制备
采用透析法。预先将盐酸阿霉素(DOX·HCl)溶于DMSO中，加入过量三乙胺(与DOX·HCl摩尔比为3∶1)，避光搅拌过夜，使盐酸与三乙胺充分反应。然后将PEOz6000-PLA4000(合成方法参见实施例1)和DSPE-PEG6000-FA(市售可得)以摩尔比1∶0.3溶于DMSO中，加入上述DOX溶液，药材比为2∶10，混合均匀后装入透析袋(MWCO＝3500)中，用透析袋夹封住两端，浸入1000mL去离子水的透析液中并搅拌。透析持续12h，每隔2～3h换水一次。将透析袋内溶液经0.45μm滤膜过滤即得本发明胶束组合物。
实施例12 包载紫杉醇的RGDYK修饰的pH敏感聚合物胶束的制备
采用薄膜分散法制备。将1mg紫杉醇、200mg的PEOz4300-PLA2700和RGDYK-PEOz4300-PLA2700(摩尔比为1∶0.2)充分溶于适量甲醇中，在50℃下旋转蒸发去除溶剂，加预热50℃的水，涡旋振荡5min使薄膜完全水化，经0.2μm的微孔滤膜过滤即得本发明胶束组合物，加入适量的PEG6000，冻干可得胶束粉末。
实施例13 包载紫杉醇的YPSMA-1修饰的pH敏感聚合物胶束的制备
采用薄膜分散法制备。将1mg紫杉醇、200mg的PEOz4300-PLA2700和YPSMA-1-PEOz4300-PLA2700(摩尔比为1∶0.2)充分溶于适量甲醇中，在50℃下旋转蒸发去除溶剂，加预热50℃的水，涡旋振荡5min使薄膜完全水化，经0.2μm的微孔滤膜过滤即得本发明胶束组合物，加入适量的PEG6000，冻干可得胶束粉末。
实施例14 包载紫杉醇的RGDYK和YPSMA-1单抗修饰的pH敏感聚合物胶束的制备
采用薄膜分散法制备。将1mg紫杉醇、150mg的PEOz4300-PLA2700、YPSMA-1-PEOz4300-PLA2700和RGDYK-PEOz4300-PLA2700(PEOz4300-PLA2700与YPSMA-1-PEOz4300-PLA2700和RGDYK-PEOz4300-PLA2700的摩尔比为1∶0.4，YPSMA-1-PEOz4300-PLA2700和RGDYK-PEOz4300-PLA2700的摩尔比为1∶1)充分溶于适量甲醇中，在50℃下旋转蒸发去除溶剂，加预热50℃的水，涡旋振荡5min使薄膜完全水化，经0.2μm的微孔滤膜过滤即得本发明胶束组合物，加入适量的PEG6000，冻干可得胶束粉末。
将透析制得的胶束溶液采用Malvern使Zetasizer Nano ZS仪进行进行动态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)分析，测定胶束的粒径及其分布。仪器的激光束波长设定为525nm，入射光与散射光束的夹角为173°，测定温度为25℃。测定结果见附图2。由图可见，该实施例的本发明胶束的平均粒径为38nm，粒度分布均匀，多分散性指数小于0.20。
采用醋酸双氧铀负染法，用透射电子显微镜观察聚合物胶束的形态。结果见图3。由图可见，该实施例的本发明胶束呈球形，大小较均匀。
实施例15 包载多西紫杉醇的RGDYK修饰的pH敏感聚合物胶束的制备
采用薄膜分散法制备。将1mg多西紫杉醇、100mg的PEOz2000-VES和RGDYK-PEOz2000-VES(合成方法参见实施例6)(PEOz2000-VES与RGDYK-PEOz2000-VES的摩尔比为1∶0.5)充分溶于适量甲醇中，在50℃下旋转蒸发去除溶剂，加预热50℃的水，涡旋振荡5min使薄膜完全水化，经0.2μm的微孔滤膜过滤即得本发明胶束组合物，冻干可得胶束粉末。
实施例16 包载多西紫杉醇的RGDYK修饰的pH敏感聚合物胶束的制备
采用薄膜分散法制备。将2mg多西紫杉醇、100mg的PEOz5000-PLA3000-PEOz5000和RGDYK-PEOz6000-PLA4000(合成方法参见实施例6)(PEOz5000-PLA3000-PEOz5000与RGDYK-PEOz6000-PLA4000的摩尔比为1∶0.3)充分溶于适量甲醇中，在50℃下旋转蒸发去除溶剂，加预热50℃的水，涡旋振荡5min使薄膜完全水化，经0.2μm的微孔滤膜过滤即得本发明胶束组合物，冻干可得胶束粉末。
实施例17 包载替尼泊苷的YPSMA-1修饰的pH敏感聚合物胶束的制备
采用薄膜分散法制备。将1mg替尼泊苷、210mg的YPSMA-1-PEOz4300-PLA2700充分溶于适量甲醇中，在50℃下旋转蒸发去除溶剂，加预热50℃的水，涡旋振荡5min使薄膜完全水化，经0.2μm的微孔滤膜过滤即得本发明胶束组合物，加入适量的PEG6000，冻干可得胶束粉末。
试验例1 靶向肿瘤细胞的pH敏感聚合物胶束的体外释放试验
为了评价本发明胶束组合物的pH敏感性，如下对实施例14中的本发明组合物在不同pH下的体外释放进行考察。
采用透析袋法。分别吸取一定体积的载药胶束溶液置于活化好的透析袋(MWCO：3500)中，并用透析夹密封，然后置于装有35mL、pH分别为5.0、6.5、7.4的PBS缓冲液(10mM，含0.2％的Tween 80)的50ml三角瓶中，于37℃、100rpm的水浴摇床中振荡。分别在1、2、4、8、12和24h取出1mL释放液，同时补充1mL新鲜的释放介质。将各时间点的释放液样品经0.22μm滤膜过滤后，用HPLC方法分析测定紫杉醇的含量，并计算药物的累积释放百分数数。结果见图4。
结果显示，实施例14中的本发明胶束组合物的体外释放具有pH依赖性，说明实施例14中的本发明胶束组合物在到达肿瘤部位或进入肿瘤细胞内能快速释放。
试验例2 形成胶束的主要材料的细胞毒性试验
为了评价形成本发明胶束组合物的主要材料对肿瘤细胞生长的抑制作用，如下对形成实施例14中的本发明胶束组合物的实施例1的二嵌段聚合物进行细胞毒性试验。
采用SRB法。将融合达到90％的肿瘤细胞LNCaP消化后计数。按照5×104细胞/ml的密度接种于96孔板中。将96孔板置于培养箱中培养24h后，移去培养液，每孔加入不同浓度的实施例1中的二嵌段共聚物待测液，每个浓度设6个平行孔，以RPMI-1640完全培养液为对照组。继续培养24h，移去待测液，每孔加入10％TCA溶液200μL，于4℃静置固定1h。移去TCA溶液，用去离子水清洗5次，在40℃下烘干，每孔加入0.4％SRB的1％醋酸溶液100μL，室温静置染色30min。移去SRB染液，用1％乙酸冲洗5次，40℃烘干。每孔加入10mM Tris缓冲液150μL，37℃震荡30min，在酶标仪上540nm处测定各孔吸光度值(OD值)，计算细胞相对存活率。结果见图5。
结果显示，实施例1的二嵌段聚合物的浓度高达12mg/mL时，仍未显示出明显的细胞毒性，说明该材料本身对细胞的毒性较小。
试验例3 靶向肿瘤细胞的pH敏感聚合物胶束的细胞毒性试验
为了评价本发明胶束组合物对肿瘤细胞生长的抑制作用，如下对实施例14中的本发明组合物进行细胞毒性试验，并以游离的紫杉醇、实施例12和实施例13的组合物作为对照。
采用SRB法。将融合达到90％的肿瘤细胞LNCaP消化后计数。按照5×104细胞/ml的密度接种于96孔板中。将96孔板置于培养箱中培养24h后，移去培养液，每孔加入不同体积的实施例14的胶束待测液，每个浓度设6个平行孔，以1640完全培养液为空白对照组。继续培养24h，移去待测液，每孔加入10％TCA溶液200μL，于4℃静置固定1h。移去TCA溶液，用去离子水清洗5次，在40℃下烘干，每孔加入0.4％SRB的1％醋酸溶液100μL，室温静置染色30min。移去SRB染液，用1％乙酸冲洗5次，40℃烘干。每孔加入10mM Tris缓冲液150μL，37℃震荡30min，在酶标仪上540nm处测定各孔吸光度值(OD值)，计算细胞相对存活率。结果见图6。
结果显示，游离紫杉醇的IC50为11.56±0.45μg/mL，实施例12中胶束的IC50为1.96±0.31μg/mL，实施例13中胶束的IC50为1.55±0.13μg/mL，实施例14中胶束的IC50为0.82±0.23μg/mL，表明实施例14中的胶束组合物具有显著的靶向性和抗肿瘤活性。
试验例4 靶向肿瘤细胞的pH敏感聚合物胶束的细胞摄取试验
为了评价本发明胶束组合物被肿瘤细胞摄取作用，如下对实施例14中的本发明组合物进行细胞摄取试验。为了便于测定，以荧光探针香豆素-6代替紫杉醇，按照实施例12、13和14的方法制备胶束，并以游离的香豆素-6和实施例12和13的组合物作为对照。
用无血清的RPMI-1640培养液分别复溶实施例12、实施例13、实施例14中的冻干胶束粉末，使香豆素-6的浓度皆为1mg/mL，并以的游离香豆素-6作为对照。
将处于对数生长期的肿瘤细胞LNCaP用0.25％胰酶消化，离心后制成单细胞悬液并接种于6孔细胞培养板中，每孔培养液体积为3mL，细胞数为8×105个/孔，在37℃、5％CO2的条件下培养24h，使细胞贴壁。弃去培养液，将2mL上述各待测液分别加入相应孔中，继续培养相应时间后，吸去培养液，用3mL冷PBS轻洗细胞3次，每孔加入0.4mL0.25％胰蛋白酶消化液，置于37℃培养箱中孵育5min，待细胞消化成圆球状后，每孔加入0.6mL含血清培养液终止消化并吹打成单细胞悬液，转移至1.5ml离心管中。1500rpm离心5min，用预冷的PBS漂洗两次并用1mL PBS重悬细胞，吹打成单细胞悬液。将上述细胞悬液过300目细胞筛后转移至流式管中，用流式细胞仪测定细胞摄取的香豆素-6的荧光强度(激发波长488nm/测定波长521nm)，比较各测试样品在细胞内的摄取情况。每次分析所用细胞数不少于105，收集的细胞数为10000个。数据使用FCS Express V3软件进行分析。结果见图7。
结果显示，对于肿瘤细胞LNCaP，实施例12和13的细胞摄取明显高于香豆素-6，而实施例14的细胞摄取明显高于实施例12和13，表明实施例14中的胶束组合物具有显著的靶向性。
试验例5 靶向肿瘤细胞的pH敏感聚合物胶束的活体成像试验
为了评价本发明胶束组合物的肿瘤细胞靶向性，如下对本发明实施例14的组合物进行活体成像试验。为了便于观察，以荧光探针DiR代替紫杉醇如下制备对应于实施例12、13和14的胶束组合物，并以非pH敏感的聚乙二醇-聚乳酸(PEG5000-PLA3000)包载的DiR作为对照。
DiR溶液的配制：精密称取5mg DiR至50mL容量瓶中，加入无水甲醇定容，制备得到浓度为0.1mg/mL的DiR甲醇储备液，锡箔纸包裹于4℃避光保存待用。
包载DiR的PEG5000-PLA3000的胶束的制备：采用薄膜分散法。精密称取适量的PEG5000-PLA3000溶于甲醇中，加入适量体积的DiR储备液，使最终的药材比为1∶250(w/w)，混合均匀后在50℃下旋转蒸发挥干溶剂。加入5mL预热50℃的水水化，涡旋振荡5min，经0.2μm的微孔滤膜过滤后即得胶束溶液，避光于4℃保存待用。
对应于实施例12的DiR胶束的制备：采用薄膜分散法。精密称取适量的PEOz4300-PLA2700和RGDYK-PEOz4300-PLA2700(摩尔比为1∶0.2)溶于甲醇中，加入适量体积的DiR储备液，使最终的药材比为1∶250(w/w)，混合均匀后在50℃下旋转蒸发挥干溶剂。加入5mL预热50℃的水水化，涡旋振荡5min，经0.2μm的微孔滤膜过滤后即得胶束溶液，避光于4℃保存待用。
对应于实施例13的DiR胶束的制备：采用薄膜分散法。精密称取适量的PEOz4300-PLA2700和YPSMA-1-PEOz4300-PLA2700(摩尔比为1∶0.2)溶于甲醇中，加入适量体积的DiR储备液，使最终的药材比为1∶250(w/w)，混合均匀后在50℃下旋转蒸发挥干溶剂。加入5mL预热50℃的水水化，涡旋振荡5min，经0.2μm的微孔滤膜过滤后即得胶束溶液，避光于4℃保存待用。
对应于实施例14的DiR胶束的准备：采用薄膜分散法。精密称取适量的PEOz4300-PLA2700、YPSMA-1-PEOz4300-PLA2700和RGDYK-PEOz4300-PLA2700(PEOz4300-PLA2700与YPSMA-1-PEOz4300-PLA2700和RGDYK-PEOz4300-PLA2700的摩尔比为1∶0.4，YPSMA-1-PEOz4300-PLA2700和RGDYK-PEOz4300-PLA2700的摩尔比为1∶1)溶于甲醇中，加入适量体积的DiR储备液，使最终的药材比为1∶250(w/w)，混合均匀后在50℃下旋转蒸发挥干溶剂。加入5mL预热50℃的水水化，涡旋振荡5min，经0.2μm的微孔滤膜过滤后即得胶束溶液，避光于4℃保存待用。
荷瘤裸鼠模型的建立：将生长达到90％汇合的LNCaP细胞用0.25％胰酶进行消化，中和离心后弃去上清液，用空白1640培养基将细胞重新吹打分散悬浮，调整细胞浓度至1×107个/mL。取200μL细胞悬液(2×106个)皮下注射到雌性BALB/c裸鼠右侧腋下，接种后每天观察记录肿瘤体积变化，生长约一周后，肿瘤体积达到约200mm3即可给药进行活体成像观察。
活体成像试验：待肿瘤体积达到约200mm3时给药，采用尾静脉注射，分别用生理盐水将DiR标记的胶束稀释至一定浓度，使最大注射体积不大于0.2mL，给药剂量为50ng/g，每组3只。分别在给药3、6、9、12、24、48和72h后，将裸鼠用异氟烷麻醉，放入Kodak活体成像系统载物台上进行荧光及X光成像，采用多光谱活体成像系统照相。72h后处死各组裸鼠，并解剖取出不同器官(心，肝，脾，肺，肾，肿瘤)，用生理盐水漂洗后成像。结果见图8。
结果显示，B和C组的肿瘤部位(红圈标示处)在各时间点的荧光强度都高于A组，D组的肿瘤部位在各时间点具有最高的荧光强度，说明实施例12和13的胶束相对于PEG5000-PLA3000的胶束具有明显的肿瘤靶向性，并且实施例13的强于实施例12，而实施例14的胶束具有最强的肿瘤靶向性。
虽然已利用上述具体的实施方案对本发明进行了描述，但应认识到，本领域的技术人员还可进行各种的改进和改变，而且它们也应如权利要求书限定的本发明的范围之内。
Claims (8)
1.一种聚合物胶束组合物，其包含难溶性抗肿瘤药物、pH敏感的两亲性嵌段聚合物以及任选的可药用辅料，其中所述的pH敏感的两亲性嵌段聚合物至少一部分，优选至少5％，更优选至少10％，最优选至少20％连接靶向肿瘤细胞的配体或抗体。
2.如权利要求1所述的聚合物胶束组合物，其中的pH敏感两亲性嵌段聚合物的亲水链段为600～20000Da，优选1000～15000，更优选4000～10000分子量的聚(2-烷基-2-噁唑啉)(PAOz)；疏水链段选自聚酯(PE)、TPGS、维生素E琥珀酸酯(VES)、胆酸、磷脂、磷脂衍生物，优选选自聚乳酸、聚己内酯、聚乙交酯丙交酯、维生素E琥珀酸酯、磷脂，更优选选自聚乳酸、维生素E琥珀酸酯、磷脂；所述的两亲性嵌段聚合物是二嵌段聚合物、三嵌段聚合物和/或它们的混合物。
3.如权利要求1-2任一项所述的聚合物胶束组合物，其中的亲水链段PAOz中的烷基是含有1-6个碳原子的烷基，优选1-4个碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丙基、正丁基，更优选甲基、乙基。
4.如权利要求2-3任一项所述的聚合物胶束组合物，其中的疏水链段选自分子量为800～20000，优选1000～15000，更优选2000～10000的聚酯，以及聚乙二醇部分的分子量为200～2000，优选400～1500，更优选600～1200的TPGS。
5.如权利要求1-4任一项所述的聚合物胶束组合物，其特征在于所述的靶向肿瘤细胞的配体或抗体选自叶酸、维生素B12、RGD、RGDYK、NGR、YPSMA-1单抗、氯毒素、2C5单抗、转铁蛋白、低密度脂蛋白、透明质酸，以及它们的混合物。
6.如权利要求1-5任一项所述的聚合物胶束组合物，其中的难溶性抗肿瘤药物选自紫杉烷类药物如紫杉醇、喜树碱类药物如9-硝基喜树碱、蒽环类药物如阿霉素、鬼臼毒素半合成衍生物类药物如替尼泊苷、替尼类药物如索尼替尼。优选选自紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素。
7.如权利要求1-6任一项所述的聚合物胶束组合物，其中胶束的平均粒径在200nm以下，优选100nm以下。
8.如权利要求1-7任一项所述的聚合物胶束组合物用于制备治疗肿瘤的药物的用途。
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