CN108863992B - 多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物的制备方法及用途 - Google Patents

多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物的制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物、含多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物的药物制剂、制备方法及用途。所述的多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物具有下述结构：

Description

多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物的制备方法及用途
技术领域
本发明属于有机合成和药物领域，具体涉及用于治疗恶性肿瘤的多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物、含多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物的药物制剂、制备方法及用途，特别是涉及通过卡巴他赛与多氨基多羧酸单酸酐或多氨基多羧酸双酸酐反应来制备多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物，以及此多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
癌症泛指所有的恶性肿瘤，是一类严重威胁人类健康的多发病和常见病。近40年以来，癌症的发病率和死亡率一直呈上升趋势。据世界卫生组织报告，在2016年，全球约有1410万新发癌症病例，约有820万患者死于癌症。在男性癌症人群中，肺癌、前列腺癌、肝癌是癌症死亡的主要原因，而女性患者中，乳腺癌、宫颈癌、胃癌、肝癌为发病率和死亡率较高的恶性肿瘤[1]。
卡巴他赛是法国Sanofi-aventis公司研发的前列腺癌的二线药物，是一种化学半合成紫杉烷类小分子化合物。2010年6月，美国FDA批准卡巴他赛注射剂临床用于联合泼尼松对采用过含多西他赛治疗方案进行治疗的转移性激素不应性前列腺癌患者。卡巴他赛是一种微管抑制剂，能和微管蛋白相结合，对微管双聚体装配为微管具有重要作用，而且可以避免去多聚化有效控制微管分解，确保微管更具有稳定性，在G2和M期对细胞形成阻滞作用，防止癌细胞产生有丝分裂及大量增殖[2]。研究结果表明，卡巴他赛对多西他赛敏感肿瘤诱惑性，对包括多西他赛化疗不敏感肿瘤模型也存在抗肿瘤效果。
卡巴他赛为白色或类白色粉末，几乎不溶于水，溶于甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、氯仿、乙醚、二甲基亚砜等有机溶剂。卡巴他赛的水溶性差(8μg/ml)给其静脉给药带来了极大困难，现今唯一商业化生产的卡巴他赛注射剂为
Figure BDA0001734769370000011
从其处方信息可知： JEVTANA药盒中含有两组成分(a)JEVTANA注射液，其包含在1.5ml聚山梨醇80中的60 mg卡巴他赛，以及(b)稀释剂，其包含约5.7ml 13％(w/w)乙醇。
Figure BDA0001734769370000012
注射液中的过量使用的助溶剂聚山梨醇80易引起多种不良反应，如：过敏反应、皮疹、红斑、低气压、支气管痉挛等[3]，限制了卡巴他赛的临床应用。因此提高卡巴他赛的水溶性，可防止不良反应的发生。
针对卡巴他赛水溶性差及助溶剂聚山梨醇80的毒副作用，目前的解决方法主要集中在改变药物剂型方面。改变剂型的方法主要有两种，第一种是选用其他的乳化助溶剂，如胆固醇、泊洛沙姆、大豆油、聚乙二醇(分子量200～3000)、蛋黄卵磷脂、甘油等[4-6]，替换聚山梨醇80，提高药物水溶性降低乳化剂毒性；另一种方式是将卡巴他赛包封或键合在牛血清白蛋白、人血清白蛋白、聚多糖、聚乳酸等生物材料上[7-10]，提高其水溶性。但这一系列制剂改良方式存在诸多问题，如制备工艺复杂、重现性差、难以实现规模化生产等。因此开发易于工业化生产、且具有高效抗肿瘤效果的水溶性卡巴他赛化合物，具有重要的学术价值和社会意义。
本实验室长期致力于水溶性紫杉醇的研究，前期开发了氨基多羧酸修饰紫杉醇类化合物及氨基多羧酸修饰多烯紫杉醇类化合物，提高了紫杉醇及多烯紫杉醇的水溶性，同时其抗肿瘤活性也优于前体化合物紫杉醇及多烯紫杉醇，并申请了相关专利。因此，从氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物开发高效、低毒、水溶性好的卡巴他赛类化合物，可以极大丰富治疗恶性肿瘤的药物和途径。
参考文献
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Figure BDA0001734769370000021
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发明内容
本发明的目的在于提供一种多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物。
本发明的第二个目的是提供一种多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物的药物制剂，其中包含作为活性成分的多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物和赋形剂、增溶剂、增溶乳化剂、抗氧化剂。
本发明的第四个目的是提供一种多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物及其药物制剂作为抗肿瘤药物的用途。
本发明的技术方案概述如下：
一种多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物，具有下述结构：
Figure BDA0001734769370000031
其中，
Figure BDA0001734769370000041
Figure BDA0001734769370000042
一种多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物的制备方法，其特征是按照1:1.1～1:3的比例将卡巴他赛和多氨基多羧酸单酸酐(制备化合物A)或多氨基多羧酸双酸酐(制备化合物 B)在碱性催化剂作用下反应，得到多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物，所述的多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物具有下述结构：
Figure BDA0001734769370000043
其中，
Figure BDA0001734769370000044
Figure BDA0001734769370000051
上述方法优选是：将卡巴他赛和多氨基多羧酸单酸酐(摩尔当量为卡巴他赛的1.1～3 倍，制备化合物A)或多氨基多羧酸双酸酐(摩尔当量为卡巴他赛的1.1～3倍，制备化合物B) 溶于N,N-二甲基甲酰胺或N-甲基吡咯烷酮或二甲基亚砜中，在碱性催化剂条件下，-10～40℃反应5～48h，反应完全后抽滤去除不溶物，滤液加入冰乙醚，-40℃静置2h以上，待沉淀完全析出，离心收集沉淀，溶解于水和乙腈混合液中，乙醚萃取，收集水相并冷冻干燥，得到所述的多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物。
一种多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物的药物制剂，其特征是活性成分为多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物，冻干赋形剂为甘露醇或葡萄糖，助溶剂为碳酸氢钠或碳酸钠或碳酸钾或氢氧化钠或氢氧化钾，乳化助溶剂为甘油或聚乙二醇(分子量300或400)或丙二醇，抗氧化剂为亚硫酸氢钠或亚硫酸钠或硫代硫酸钠。
一种多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物及其药物制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物水溶性好，在碳酸氢钠水溶液中可完全溶解，且制备方式简单、便捷、收率高，适用于规模化生产。
附图说明
图1为本发明实施例1的三乙烯四胺六乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT-TTHA的合成路线。
图2为本发明实施例1的三乙烯四胺六乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT-TTHA的高分辨质谱。
图3为本发明实施例2的二乙烯三胺五乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT-DTPA的合成路线。
图4为本发明实施例2的二乙烯三胺五乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT-DTPA的高分辨质谱。
图5为本发明实施例3的乙二胺四乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT-EDTA的合成路线。
图6为本发明实施例3的乙二胺四乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT-EDTA的高分辨质谱。
图7为本发明实施例4的三乙烯四胺六乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT2-TTHA的合成路线。
图8为本发明实施例4的三乙烯四胺六乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT2-TTHA的高分辨质谱。
图9为本发明实施例5的二乙烯三胺五乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT2-DTPA的合成路线。
图10为本发明实施例5的二乙烯三胺五乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT2-DTPA的高分辨质谱。
图11为本发明实施例6的乙二胺四乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT2-EDTA的合成路线。
图12为本发明实施例6的乙二胺四乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT2-EDTA的高分辨质谱。
图13为本发明实施例25多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物对人乳腺癌细胞 MCF-7的抗肿瘤作用。
图14为本发明实施例26多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物对人非小细胞肺癌细胞A549的抗肿瘤作用。
图15为本发明实施例27多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物对人前列腺癌细胞PC-3的抗肿瘤作用。
图16为本发明实施例29多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物对小鼠H22肝癌的体内抗肿瘤作用实验结果图。
图17为本发明实施例29多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物对H22肝癌荷瘤小鼠的体重影响实验结果图。
图18为本发明实施例29多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物对H22肝癌荷瘤小鼠的脏器指数影响实验结果图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明，其目的仅在于更好的理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围：
实施例1三乙烯四胺六乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT-TTHA的合成
将1mmol卡巴他赛及3mmol三乙烯四胺六乙酸单酸酐溶于30ml N,N-二甲基甲酰胺中，加入1.5mmol N-二甲氨基吡啶及3mmol三乙胺，40℃搅拌反应5h。反应完毕后，抽滤去除体系中的不溶物，滤液用200ml冰乙醚沉淀，-40℃放置过夜，待沉淀析出完全，离心收集固体物质。沉淀用水和乙腈完全溶解，乙醚萃取，收集水相，冷冻干燥，得到三乙烯四胺六乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT-TTHA 1.01g，产率77.0％(合成路线见图1，高分辨质谱见图2)。
实施例2二乙烯三胺五乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT-DTPA的合成
将1mmol卡巴他赛及2mmol二乙烯三胺五乙酸单酸酐溶于30ml N-甲基吡咯烷酮中，加入1.5mmol N-二甲氨基吡啶及2mmol三乙胺，-10℃搅拌反应48h。反应完毕后，抽滤去除体系中的不溶物，滤液用300ml冰乙醚沉淀，-40℃放置过夜，待沉淀析出完全，离心收集固体物质。沉淀用水和乙腈完全溶解，乙醚萃取，收集水相，冷冻干燥，得到二乙烯三胺五乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT-DTPA1.07g，产率88.0％(合成路线见图3，高分辨质谱见图4)。
实施例3乙二胺四乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT-EDTA的合成
将1mmol卡巴他赛及1.5mmol乙二胺四乙酸单酸酐溶于30ml二甲基亚砜中，加入1mmol N-二甲氨基吡啶及1.5mmol三乙胺，25℃搅拌反应24h。反应完毕后，抽滤去除体系中的不溶物，滤液用300ml冰乙醚沉淀，-40℃放置过夜，待沉淀析出完全，离心收集固体物质。沉淀用水和乙腈完全溶解，乙醚萃取，收集水相，冷冻干燥，得到乙二胺四乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT-EDTA 0.95g，产率85.5％(合成路线见图5，高分辨质谱见图6)。
实施例4三乙烯四胺六乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT2-TTHA的合成
将1mmol卡巴他赛及3mmol三乙烯四胺六乙酸双酸酐溶于40ml二甲基亚砜中，加入4mmol N-二甲氨基吡啶及6mmol三乙胺，40℃搅拌反应24h。反应完毕后，加入200ml 冰乙醚沉淀，-40℃放置2h，待沉淀析出完全，离心收集固体物质。沉淀用水和乙腈完全溶解，乙醚萃取，收集水相，冷冻干燥，得到三乙烯四胺六乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT2-TTHA 0.91g，产率85.4％(合成路线见图7，高分辨质谱见图8)。
实施例5二乙烯三胺五乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT2-DTPA的合成
将1mmol卡巴他赛及2.5mmol的二乙烯三胺五乙酸双酸酐溶于30ml N,N-二甲基甲酰胺中，加入2.5mmol N-二甲氨基吡啶及5mmol三乙胺，混合均匀，30℃搅拌反应 30h。反应完毕后，加入200ml冰乙醚沉淀，-40℃放置4h，待沉淀析出完全，离心收集固体物质。沉淀用水和乙腈完全溶解，乙醚萃取，收集水相，冷冻干燥，得到二乙烯三胺五乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT2-DTPA 0.88g，产率86.7％(合成路线见图9，高分辨质谱见图10)。
实施例6乙二胺四乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT2-EDTA的合成
将1mmol卡巴他赛及1.1mmol乙二胺四乙酸双酸酐溶于30ml N-甲基吡咯烷酮中，加入1.2mmol N-二甲氨基吡啶及2.2mmol三乙胺，混合均匀，10℃搅拌反应48h。反应完毕后，加入200ml冰乙醚沉淀，-40℃放置4h，待沉淀析出完全，离心收集固体物质。沉淀用水和乙腈完全溶解，乙醚萃取，收集水相，冷冻干燥，得到乙二胺四乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT2-EDTA0.78g，产率80.9％(合成路线见图11，高分辨质谱见图12)。
实施例7三乙烯四胺六乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT-TTHA的合成
将3mmol卡巴他赛及6mmol三乙烯四胺六乙酸单酸酐溶于60ml二甲基亚砜中，加入3mmol N-二甲氨基吡啶及6mmol三乙胺，40℃搅拌反应10h。反应完毕后，抽滤去除体系中的不溶物，滤液用400ml冰乙醚沉淀，-40℃放置6h，待沉淀析出完全，离心收集固体物质。沉淀用水和乙腈完全溶解，乙醚萃取，收集水相，冷冻干燥，得到三乙烯四胺六乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT-TTHA3.44g，产率87.3％。
实施例8二乙烯三胺五乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT-DTPA的合成
将3mmol卡巴他赛及9mmol二乙烯三胺五乙酸单酸酐溶于100ml N,N-二甲基甲酰胺中，加入4mmol N-二甲氨基吡啶及9mmol三乙胺，25℃搅拌反应36h。反应完毕后，抽滤去除体系中的不溶物，滤液用500ml冰乙醚沉淀，-40℃放置4h，待沉淀析出完全，离心收集固体物质。沉淀用水和乙腈完全溶解，乙醚萃取，收集水相，冷冻干燥，得到二乙烯三胺五乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT-DTPA3.12g，产率85.9％。
实施例9乙二胺四乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT-EDTA的合成
将3mmol卡巴他赛及7.5mmol乙二胺四乙酸单酸酐溶于60ml N-甲基吡咯烷酮中，加入3mmol N-二甲氨基吡啶及7.5mmol三乙胺，10℃搅拌反应48h。反应完毕后，抽滤去除体系中的不溶物，滤液用400ml冰乙醚沉淀，-40℃放置2h，待沉淀析出完全，离心收集固体物质。沉淀用水和乙腈完全溶解，乙醚萃取，收集水相，冷冻干燥，得到乙二胺四乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT-EDTA2.93g，产率87.9％。
实施例10三乙烯四胺六乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT2-TTHA的合成
将3mmol卡巴他赛及6mmol三乙烯四胺六乙酸双酸酐溶于50ml二甲基亚砜中，加入3mmol N-二甲氨基吡啶及12mmol三乙胺，40℃搅拌反应40h。反应完毕后，用300ml 冰乙醚沉淀，-40℃放置6h，待沉淀析出完全，离心收集固体物质。沉淀用水和乙腈完全溶解，乙醚萃取，收集水相，冷冻干燥，得到三乙烯四胺六乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT2-TTHA 2.67g，产率83.6％。
实施例11二乙烯三胺五乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT2-DTPA的合成
将3mmol卡巴他赛及4.5mmol二乙烯三胺五乙酸双酸酐溶于50ml N-甲基吡咯烷酮中，加入6mmol N-二甲氨基吡啶及9mmol三乙胺，混合均匀，30℃搅拌反应30h。反应完毕后，用300ml冰乙醚沉淀，-40℃放置4h，待沉淀析出完全，离心收集固体物质。沉淀用水和乙腈完全溶解，乙醚萃取，收集水相，冷冻干燥，得到二乙烯三胺五乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT2-DTPA 2.23g，产率73.2％。
实施例12乙二胺四乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT2-EDTA的合成
将3mmol卡巴他赛及7.5mmol乙二胺四乙酸双酸酐溶于80ml N-甲基吡咯烷酮中，加入3mmol N-二甲氨基吡啶及15mmol三乙胺，混合均匀，30℃搅拌反应24h。反应完毕后，用300ml冰乙醚沉淀，-40℃放置过夜，待沉淀析出完全，离心收集固体物质。沉淀用水和乙腈完全溶解，乙醚萃取，收集水相，冷冻干燥，得到乙二胺四乙酸修饰卡巴他赛化合物CBT2-EDTA 2.34g，产率80.9％。
实施例13CBT-TTHA冻干粉针剂的制备
取实施例1制备的CBT-TTHA 0.2g，甘露醇6g，亚硫酸氢钠0.01g，溶于40ml 注射用水中，再加入1g药用活性炭，室温搅拌20min，过滤除活性炭，再用0.22μm滤膜过滤除菌，分装到5ml的西林瓶中，每瓶2ml，冷冻干燥。
实施例14CBT-TTHA冻干粉针剂的制备
取实施例7制备的CBT-TTHA 2.0g，葡萄糖20g，碳酸氢钠0.4g，亚硫酸钠0.03g，溶于100ml注射用水中，再加入10g药用活性炭，室温搅拌20min，过滤除活性炭，再用 0.22μm滤膜过滤除菌，分装到10ml的西林瓶中，每瓶5ml，冷冻干燥。
实施例15CBT-DTPA冻干粉针剂的制备
取实施例2制备的CBT-DTPA 0.2g，葡萄糖8g，甘油0.2ml，亚硫酸钠0.01g，溶于80ml注射用水中，再加入1g药用活性炭，室温搅拌20min，过滤除活性炭，再用0.22 μm滤膜过滤除菌，分装到5ml的西林瓶中，每瓶2ml，冷冻干燥。
实施例16CBT-DTPA冻干粉针剂的制备
取实施例8制备的CBT-DTPA 2.0g，甘露醇30g，碳酸钠0.6g，亚硫酸钠0.05g，溶于200ml注射用水中，再加入10g药用活性炭，室温搅拌20min，过滤除活性炭，再用 0.22μm滤膜过滤除菌，分装到10ml的安西林瓶中，每瓶5ml，冷冻干燥。
实施例17CBT-EDTA冻干粉针剂的制备
取实施例3制备的CBT-EDTA 0.2g，甘露醇8g，聚乙二醇(分子量300)0.5ml，硫代硫酸钠0.01g，溶于40ml注射用水中，再加入1g药用活性炭，室温搅拌20min，过滤除活性炭，再用0.22μm滤膜过滤除菌，分装到5ml的西林瓶中，每瓶2ml，冷冻干燥。
实施例18CBT-EDTA冻干粉针剂的制备
取实施例9制备的CBT-EDTA 2.0g，葡萄糖30g，碳酸钾0.45g，亚硫酸钠0.01g，溶于200ml注射用水中，再加入10g药用活性炭，室温搅拌20min，过滤除活性炭，再用 0.22μm滤膜过滤除菌，分装到10ml的西林瓶中，每瓶5ml，冷冻干燥。
实施例19CBT2-TTHA冻干粉针剂的制备
取实施例4制备的CBT2-TTHA 0.2g，0.04g碳酸氢钠，丙二醇1ml，甘露醇5g，硫代硫酸钠0.01g，溶于40ml注射用水中，再加入1g药用活性炭，室温搅拌20min，过滤除活性炭，再用0.22μm滤膜过滤除菌，分装到5ml的安西林瓶中，每瓶2ml，冷冻干燥。
实施例20CBT2-TTHA冻干粉针剂的制备
取实施例10制备的CBT2-TTHA 2.0g，0.34g碳酸氢钠，聚乙二醇400 2ml，葡萄糖30g，亚硫酸钠0.05g，溶于200ml注射用水中，再加入10g药用活性炭，室温搅拌20min，过滤除活性炭，再用0.22μm滤膜过滤除菌，分装到10ml的西林瓶中，每瓶5ml，冷冻干燥。
实施例21CBT2-DTPA冻干粉针剂的制备
取实施例5制备的CBT2-DTPA0.2g，0.034g碳酸钠，聚乙二醇300 5ml，葡萄糖 8g，亚硫酸氢钠0.01g，溶于40ml注射用水中，再加入1g药用活性炭，室温搅拌20min，过滤除活性炭，再用0.22μm滤膜过滤除菌，分装到5ml的西林瓶中，每瓶3ml，冷冻干燥。
实施例22CBT2-DTPA冻干粉针剂的制备
取实施例11制备的CBT2-DTPA2.0g，0.2g氢氧化钠，甘油4ml，甘露醇30g，亚硫酸钠0.03g，溶于200ml注射用水中，再加入4g药用活性炭，室温搅拌20min，过滤除活性炭，再用0.22μm滤膜过滤除菌，分装到20ml的西林瓶中，每瓶10ml，冷冻干燥。
实施例23CBT2-EDTA冻干粉针剂的制备
取实施例6制备的CBT2-EDTA0.2g，0.04g碳酸氢钠，甘露醇8g，PEG300 3ml，亚硫酸氢钠0.05g，溶于200ml注射用水中，再加入3g药用活性炭，室温搅拌20min，过滤除活性炭，再用0.22μm滤膜过滤除菌，分装到10ml的西林瓶中，每瓶5ml，冷冻干燥。
实施例24CBT2-EDTA冻干粉针剂的制备
取实施例12制备的CBT2-EDTA 2.0g，0.13g氢氧化钾，丙二醇3ml，葡萄糖40g，溶于200ml注射用水中，再加入3g药用活性炭，室温搅拌20min，过滤除活性炭，再用0.22μm 滤膜过滤除菌，分装到20ml的安西林瓶中，每瓶10ml，冷冻干燥。
实施例25多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物的体外抗肿瘤效果(MCF-7)
由实施例1-6制备的CBT-TTHA，CBT-DTPA，CBT-EDTA，CBT2-TTHA，CBT2-DTPA 及CBT2-EDTA对人乳腺癌细胞MCF-7的体外抗肿瘤评价，包括如下步骤：
①取对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7，胰蛋白酶消化后，重悬在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中，以密度为1×104细胞/孔接种于96孔板，然后将96孔板放入细胞孵育箱中培养24h。
②弃去培养基，每孔中加入不同浓度的药物溶液100μl，药物浓度依次为0.0625nM、12.5nM、250nM、5μM及100μM，重复5个复孔，放入培养箱中孵育48h。
③MTS法检测细胞存活率：吸出孔中液体，每孔中加入20μl MTS试剂及80μl无血清培养基，继续培养4h。酶标仪检测各孔在490nm处的光吸收值。以无化合物孵育培养的细胞作为空白对照，计算细胞存活率，结果见图13。
实施例26多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物的体外抗肿瘤效果(A549)
由实施例1-6制备的CBT-TTHA，CBT-DTPA，CBT-EDTA，CBT2-TTHA， CBT2-DTPA及CBT2-EDTA对人非小细胞肺癌细胞A549的体外抗肿瘤评价，包括如下步骤：
①取对数生长期的人非小细胞肺癌细胞A549，胰蛋白酶消化后，重悬在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中，以密度为1×104细胞/孔接种于96孔板，然后将96孔板放入细胞孵育箱中培养24h。
②弃去培养基，每孔中加入不同浓度的药物溶液100μl，药物浓度依次为0.0625nM、12.5nM、250nM、5μM及100μM，重复5个复孔，放入培养箱中孵育48h。
③MTS法检测细胞存活率：吸出孔中液体，每孔中加入20μl MTS试剂及80μl无血清培养基，继续培养4h。酶标仪检测各孔在490nm处的光吸收值。以无化合物孵育培养的细胞作为空白对照，计算细胞存活率，结果见图14。
实施例27多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物的体外抗肿瘤效果(PC-3)
由实施例1-6制备的CBT-TTHA，CBT-DTPA，CBT-EDTA，CBT2-TTHA， CBT2-DTPA及CBT2-EDTA对人前列腺癌细胞PC-3的体外抗肿瘤评价，包括如下步骤：
①取对数生长期的人前列腺癌细胞PC-3，胰蛋白酶消化后，重悬在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中，以密度为1×104细胞/孔接种于96孔板，然后将96孔板放入细胞孵育箱中培养24h。
②弃去培养基，每孔中加入不同浓度的药物溶液100μl，药物浓度依次为10-2，10-1， 1，101，102，103，104nM，重复5个复孔，放入培养箱中孵育48h。
③MTS法检测细胞存活率：吸出孔中液体，每孔中加入20μl MTS试剂及80μl无血清培养基，继续培养4h。酶标仪检测各孔在490nm处的光吸收值。以无化合物孵育培养的细胞作为空白对照，计算细胞存活率，结果见图15。
实施例28多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物的体外抗肿瘤效果(MCF-7/A549/NCI-H460/PC-3/HeLa/Hep G2/Bel-7402/SGC-7901)
由实施例7-24制备的CBT-TTHA，CBT-DTPA，CBT-EDTA，CBT2-TTHA， CBT2-DTPA、CBT2-EDTA及其药物制剂对人乳腺癌细胞MCF-7、人非小细胞肺癌细胞A549、人大细胞肺癌细胞NCI-H460、人前列腺癌细胞PC-3、人宫颈癌细胞HeLa、人肝癌细胞 HepG-2、人肝癌细胞BEL-7402、人胃腺癌细胞SGC-7901的体外抗肿瘤评价，包括如下步骤：
①取对数生长期的肿瘤细胞，胰蛋白酶消化后，重悬在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，以密度为1×104细胞/孔接种于96孔板，然后将96孔板放入细胞孵育箱中培养24h。
②弃去培养基，每孔中加入不同浓度的药物溶液100μl，药物浓度依次为10-2，10-1， 1，101，102，103，104nM，重复5个复孔，放入培养箱中孵育48h。
③MTS法检测细胞存活率：吸出孔中液体，每孔中加入20μl MTS试剂及80μl无血清培养基，继续培养4h。酶标仪检测各孔在490nm处的光吸收值。以无化合物孵育培养的细胞作为空白对照，以Reed-Muench法计算半数有效浓度(IC50，见表1-3)。
表1多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物的体外抗肿瘤活性(IC50，nM)
Figure BDA0001734769370000121
表2多氨基多羧酸修饰卡巴他赛药物制剂的体外抗肿瘤活性(IC50，nM)
Figure BDA0001734769370000131
表3多氨基多羧酸修饰卡巴他赛药物制剂的体外抗肿瘤活性(IC50，nM)
Figure BDA0001734769370000132
实施例29多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物治疗移植性肝癌H22小鼠效果评价
由实施例7-12制备的CBT-TTHA，CBT-DTPA，CBT-EDTA，CBT2-TTHA， CBT2-DTPA及CBT2-EDTA治疗移植性肝癌H22小鼠在体实验过程，包括如下步骤：
①抽取接种7-9天的小鼠肝癌H22种鼠腹水，用生理盐水1：3稀释，配置成肿瘤细胞悬液，以每只0.2ml接种于体重18-20g的KM小鼠右前肢腋窝皮下，制成实体瘤模型。
②接种后，待肿瘤生长一周，肿瘤大小达到160mm3时，对肿瘤小鼠随机分组，模型组、CBT组(8mg/kg)、CBT-TTHA组(12mg/kg)，CBT-DTPA组(11mg/kg)。给药组尾静脉注射药物，模型组尾静脉注射生理盐水，每2天给药一次，给药10天。
③小鼠体重和肿瘤大小的测量：2天测量一次，测量10天；测量肿瘤长、宽，根据公式：肿瘤体积(mm3)＝1/2×长×宽2，绘制小鼠体重增长曲线和肿瘤生长曲线，结果见图16-17。
④最后一次给药两天后，处死小鼠，解剖取出心、肝、脾、肺、肾以及胸腺，并称取其重量，计算脏器指数(脏器指数＝脏器重量/(体重-肿瘤重量)，单位：mg/g)，脏器指数实验结果见图18。
由图16可知：经过十天对比治疗，在相同条件下，CBT组和多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物CBT-TTHA组、CBT-DTPA组肿瘤生长得到显著抑制，且CBT-TTHA组及 CBT-DTPA组肿瘤抑制效果和CBT组相当。
由图17可知：经过十天对比治疗，在相同条件下，CBT组体重明显下降，表明 CBT存在较强的毒性；而多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物CBT-TTHA组和CBT-DTPA组动物体重和正常组相当，表明其对动物的生长无明显影响。
由图18可知：经过十天对比治疗，在相同条件下，相比于正常组和模型组，CBT 组小鼠胸腺萎缩，胸腺指数显著降低，表明CBT组药物存在较强的毒性；同时CBT组脾脏指数明显增加，脾脏增大，表明CBT组小鼠机体免疫能力降低；除此之外，CBT组小鼠心脏指数也显著降低。而多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物CBT-TTHA组和CBT-DTPA组，相比于模型组，其胸腺指数和脾脏指数均未发生明显的变化。其他脏器指数，如肝、肺、肾，给药组和模型组之间未发现显著性差异。
实施例30多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物的溶解性测试
由实施例7-12制备的CBT-TTHA，CBT-DTPA，CBT-EDTA，CBT2-TTHA， CBT2-DTPA及CBT2-EDTA在水中及碳酸氢钠溶液中的溶解性测试。实验步骤如下：
称取10mg多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物于5ml离心管中，加入2ml水或 1ml0.5％碳酸氢钠水溶液，涡旋5min，观察其溶解性，结果见表4。
表4多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物的溶解性
Figure BDA0001734769370000151
+++完全溶解；++大部分溶解；+少部分溶解；—不溶解。

Claims (8)

1.一种多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物，具有下述结构：
Figure FDA0003315481430000011
其中，
Figure FDA0003315481430000012
Figure FDA0003315481430000013
Figure FDA0003315481430000014
Figure FDA0003315481430000015
2.根据权利要求1所述的一种多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物的制备方法，其特征是按照1:1.1～1:3的比例将卡巴他赛和多氨基多羧酸单酸酐或多氨基多羧酸双酸酐在碱性催化剂作用下反应，得到多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是包括如下步骤：将卡巴他赛和多氨基多羧酸单酸酐或多氨基多羧酸双酸酐溶于N,N-二甲基甲酰胺或N-甲基吡咯烷酮或二甲基亚砜中，在碱性催化剂条件下，-10～40℃反应5～48h，反应完全后抽滤去除不溶物，滤液加入冰乙醚，-40℃静置2h以上，待沉淀完全析出，离心收集沉淀，溶解于水和乙腈混合液中，乙醚萃取，收集水相并冷冻干燥，得到所述的多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物。
4.一种多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物的药物制剂，其特征在于：将权利要求1所述的多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物制成可用于静脉注射的冻干粉针。
5.根据权利要求4所述的多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物的药物制剂，其特征是包括以下组分：活性成分多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物，冻干赋形剂，助溶剂，乳化助溶剂，抗氧化剂。
6.根据权利要求5所述的多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物的药物制剂，其特征是所述的冻干赋形剂为甘露醇或葡萄糖；所述的助溶剂为碳酸氢钠或碳酸钠或碳酸钾或氢氧化钠或氢氧化钾；所述的乳化助溶剂为甘油或聚乙二醇或丙二醇；所述的抗氧剂为亚硫酸氢钠或亚硫酸钠或硫代硫酸钠。
7.根据权利要求1所述的多氨基多羧酸修饰卡巴他赛化合物或权利要求4-6任一项所述的药物制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征是所述的肿瘤为前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、宫颈癌。
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