CN102702140A - 一种水溶性紫杉醇化合物的制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开的水溶性紫杉醇化合物、含水溶性紫杉醇化合物的药用组合物、制备方法及用途，化合物具有如下结构：

Description

一种水溶性紫杉醇化合物的制备方法及用途

技术领域

本发明属于有机合成和药物领域，具体涉及一种用于治疗恶性肿瘤的水溶性紫杉醇化合物、含水溶性紫杉醇化合物的药用组合物、制备方法及用途，特别是涉及通过将紫杉醇与水溶性部分三乙烯四胺六乙酸酐反应来制备水溶性紫杉醇化合物，以及此水溶性紫杉醇化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

紫杉醇是美国化学家Wani和Wall从太平洋紫杉树皮中提取分离得到的一种四环二萜类天然产物。它可以促进微管蛋白聚合，抑制微管蛋白解聚，致使快速分裂的肿瘤细胞终止于有丝分裂阶段而死亡，是继阿霉素和顺铂之后的第三代抗肿瘤药物。1992年美国FDA正式批准紫杉醇用于卵巢癌的治疗，此后紫杉醇很快应用于多种常见恶性肿瘤如：乳腺癌、肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌等，并取得了显著的疗效。紫杉醇为脂溶性药物，在水中的溶解度只有0.25μg/mL，造成了对该药制剂应用方面的限制，只能借助于助溶剂制成针剂使用。临床上传统应用的注射剂采用非离子表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)作为溶媒，但其毒性大，过敏反应发生率高，易引起低血压、皮疹和呼吸困难等不良反应。因此，解决紫杉醇的水溶性问题，提高疗效同时降低不良反应，成为近年来紫杉醇新药研究的热点。

现有的解决紫杉醇水溶性难题的方法包括改变剂型和化学结构修饰两大方面。其中，改变剂型的方法包括制备紫杉醇脂质体、紫杉醇微乳、紫杉醇微球和紫杉醇白蛋白纳米粒等。上述载药系统虽然在一定程度上改善了药物的水溶性，但是也存在不少缺陷，比如：只有含量小于2％的紫杉醇脂质体在物理化学状态上是稳定的，紫杉醇微球亦被证实存在毒性问题，而且改变剂型的方法只能减轻不良反应，却无法从根本上提高药效。化学结构修饰的方法有在2’-羟基或7-羟基位置上引入羧酸、磺酸、硫代硫酸、磷酸、氨基酸等助溶小分子基团，亦有将紫杉醇结合在聚乙二醇、聚甲基丙烯酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸等水溶性高分子载体上。但上述结构修饰方法目前仍存在许多问题，如：合成方法复杂、分离纯化手段要求高、产物不稳定易析出、收率低等，导致水溶性紫杉醇的制备仅停留在实验室小试阶段，根本无法进行大规模的工业化生产。因此，继续开发易于工业化生产、高效低毒的新型水溶性紫杉醇化合物，具有重要的学术价值和社会意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有高水溶性的紫杉醇化合物。

本发明的第二个目的是提供一种水溶性紫杉醇化合物的制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种药物组合物，其中包含作为活性成分的水溶性紫杉醇化合物和药学上可接受的载体。

本发明的第四个目的是提供一种新的水溶性紫杉醇化合物及其药物组合物作为抗肿瘤药物的用途。

本发明的技术方案概述如下：

水溶性紫杉醇化合物，具有下述结构：

其中

R₂＝H

水溶性紫杉醇化合物的制备方法，其特征是将紫杉醇与三乙烯四胺六乙酸酐在碱性催化剂催化下反应得到水溶性紫杉醇化合物，所述水溶性紫杉醇化合物具有下述结构：

其中

R₂＝H

上述方法优选的是：按比例将0.2-0.5g紫杉醇和0.1-0.8g的三乙烯四胺六乙酸酐溶于80-160mL二甲基亚砜中，在碱性催化剂催化下，室温搅拌反应12-96小时，反应完毕加入160-320mL无水乙醚，静置待沉淀析出完全后，重结晶，过滤得到粗品，依次用二氯甲烷，乙醇洗涤，得到所述水溶性紫杉醇化合物。

所述碱性催化剂为三乙胺、4-二甲氨基吡啶、碳酸钠、碳酸钾和碳酸氢钠至少一种。

本发明的一种含水溶性紫杉醇化合物的药物组合物是将结构为

其中

R₂＝H的水溶性紫杉醇化合物与一种或多种药学上可接受的载体混合，使所述水溶性紫杉醇的量占该药物组合物总重量的0.5-60％。

本发明的一种含水溶性紫杉醇化合物的药物组合物，可以是口服制剂、液体制剂。其中口服制剂为普通片剂、胶囊剂、缓释片、滴丸或颗粒剂；液体制剂为口服液、冻干粉针、注射液、大小输液或静脉滴注液等。

所述的药学上可接受的载体，包括制剂中常规的稀释剂、填充剂(如甘露醇、乳糖、聚乙二醇)，粘合剂(淀粉、微晶纤维素)，崩解剂(如羧甲基纤维素、低取代羟丙基纤维素)，润滑剂(如滑石粉、硬脂酸镁)，湿润剂(如丙二醇、乙醇)，稳定剂(EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、乙醇胺、碳酸氢钠、烟酰胺)等。上述辅料可以是常用剂量，以常用的配比与水溶性紫杉醇化合物混合，当水溶性紫杉醇化合物的用量确定后，各药用辅料之间的配比可以根据需要适当调节。

压片制成片剂的使用，用作赋型剂的辅料有MgSO₄、玉米淀粉、滑石粉，规格有：25mg、30mg、40mg、50mg。

一种水溶性紫杉醇化合物及其药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的水溶性紫杉醇化合物制备方法简便、快速、收率高(大于75％)，适宜于大规模的工业化生产。紫杉醇经此方法结构修饰后，化学性质稳定，水溶性有很大的提高(大于1mg/mL)，毒性低(LD₅₀＝107.52mg/kg)，在体内经代谢又可释放出游离的紫杉醇，且具有较好的生物利用度和抗肿瘤效果。

附图说明

图1为本发明实施例1水溶性紫杉醇化合物的紫外光谱。

图2为本发明实施例1水溶性紫杉醇化合物的红外光谱。

图3为本发明实施例1水溶性紫杉醇化合物的质谱图。

图4为本发明实施例1水溶性紫杉醇化合物的核磁共振氢谱。

图5为本发明实施例1水溶性紫杉醇化合物对MCF-7乳腺癌细胞的抗肿瘤作用。

图6为本发明实施例1水溶性紫杉醇化合物对HepG-2肝癌细胞的抗肿瘤作用。

图7为本发明实施例1水溶性紫杉醇化合物对H460肺癌细胞的抗肿瘤作用。

图8为本发明实施例1水溶性紫杉醇化合物对体内小鼠H₂₂肝癌的抗肿瘤作用实验结果图。

图9为本发明实施例1水溶性紫杉醇化合物对体内小鼠H₂₂肝癌的抗肿瘤作用实验结果照片。

图10为本发明实施例1水溶性紫杉醇化合物小鼠急性毒性实验药物对动物体重影响的实验结果。

具体实施方式

实施例1

将0.5g紫杉醇和0.58g的三乙烯四胺六乙酸酐溶于160mL二甲基亚砜中，再加入250μL三乙胺，230mg 4-二甲氨基吡啶，室温搅拌反应96小时，加入320mL无水乙醚，静置待沉淀析出完全后，过滤得到粗品，依次用二氯甲烷、乙醇溶液洗涤，得到水溶性紫杉醇化合物0.62g，收率79.62％。水溶性紫杉醇的表征图谱见图1、图2、图3、图4。紫杉醇核磁共振氢谱中4.56-4.61ppm C2’H三重峰(t，J＝7.7Hz，1H)变为5.45ppm、5.48ppm与C2’H化学位移峰重合，显示复合信号，则表明2’位点有酯化作用，三乙烯四胺六乙酸的NCH2CH2N和CH2OOH共振分别在2.80-2.92ppm处显示复合系列信号。

实施例2

将0.2g紫杉醇和0.24g的三乙烯四胺六乙酸酐溶于80ml二甲基亚砜中，再加入35.9mg碳酸钾，27.6mg碳酸钠，室温搅拌反应12小时，加入160mL无水乙醚，静置待沉淀析出完全后，离心得到粗品，依次用二氯甲烷、乙醇溶液洗涤，水溶性紫杉醇化合物0.24g，收率77.05％。

实施例3

将0.3g紫杉醇和0.36g的三乙烯四胺六乙酸酐溶于120mL二甲基亚砜中，再加入25mg碳酸氢钠，69mg 4-二甲氨基吡啶，室温搅拌反应72小时，加入240mL无水乙醚，静置待沉淀析出完全后，离心得到粗品，依次用二氯甲烷、乙醇溶液洗涤，得到水溶性紫杉醇化合物0.37g，收率79.19％。

实施例4

由实施例1所得水溶性紫杉醇化合物抗肿瘤的体外评价，包括如下步骤：

(1)将常规培养方法培养的处于生长对数期的乳腺癌细胞MCF-7，用胰蛋白酶消化，使贴壁细胞脱落，用含10％胎牛血清的1640培养基配成悬液，接种在96孔板培养，1×10⁴个细胞/孔，置CO2培养箱中孵育24小时使细胞贴壁。

(2)倾去培养液，每孔依次加入按倍数关系配制的一系列浓度递增的药物溶液100μL，浓度依次为0.39，0.78，1.56，3.125，6.25，12.5μM，每个浓度4个副孔，CO₂培养箱中孵育72小时。

(3)每孔加入50μL MTT(1mg/mL)，继续培养4小时。倾去培养液，每孔加入150μL DMSO溶解颜色结晶。

(4)酶标仪上检测各孔在490nm波长处光吸收值，以无化合物孵育培养的细胞作为空白对照。计算细胞存活率(％)＝给药组OD值/空白对照组OD值×100％(见图5)

实施例5

由实施例1所得水溶性紫杉醇化合物抗肿瘤的体外评价实验对象为肝癌细胞HepG-2，实施步骤同实施例4。(见图6)

实施例6

由实施例1所得水溶性紫杉醇化合物抗肿瘤的体外评价实验对象为肺癌细胞H460，实施步骤同实施例4。(见图7)

实施例7

由实施例1所得水溶性紫杉醇化合物治疗移植性肝癌H₂₂小鼠在体实验过程，包括如下步骤：

(1)在无菌条件下，抽取接种7天后的小鼠肝癌H₂₂种鼠的腹水，用无菌生理盐水按1∶3稀释，制成瘤细胞悬液，用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数法计数，调整细胞浓度为2×10⁷个/mL，以每只0.2mL接种于体重为18-22g健康昆明种小鼠的右前肢腋窝皮下，制成实体瘤动物模型。

(2)接种后24小时将小鼠随机分为空白对照组和水溶性紫杉醇化合物高、中、低剂量组，每组10只，分别称重。水溶性紫杉醇化合物高、中、低剂量组按10mg/kg，5mg/kg，1mg/kg尾静脉注射，空白对照组尾静脉注射生理盐水0.2mL/只，连续给药12d。

(3)最后一次给药后24小时，处死动物，称取小鼠体重，解剖瘤体、脾、肝，分别称重，计算抑瘤率(见图8)，抑瘤效果(见图9)

结果表明，此化合物对小鼠肝癌H₂₂具有极其显著的抑制作用，10mg/kg剂量组抑制率达到81.52％。

实施例8

由实施例1所得水溶性紫杉醇化合物小鼠急性毒性实验过程，包括如下步骤：

选取体重为20～22g昆明种小鼠50只，雌雄各半，随机分为5组，每组10只。各实验组按80mg/kg、95.28mg/kg、113.24mg/kg、134.59mg/kg和160mg/kg分别尾静脉注射水溶性紫杉醇化合物，每只小鼠注射剂量为0.25mL/20g。注射后常规饲养14天，观察用药后小鼠的活动度、摄食、毛发、大小便等情况，记录小鼠的死亡数。结果见表1，各实验组给药后，多数动物在1小时内死亡，死亡动物解剖肉眼观察，主要脏器未发生异常变化。134.59mg/kg、113.24mg/kg剂量组，未死动物出现体重下降和毛发稀疏现象，10天后恢复正常。其余未死动物在24小时后恢复正常状态，连续观察14天，小鼠活动、摄食、大小便正常，113.24mg/kg和134.59mg/kg两个实验组动物体重受药物影响较大(见图10)。处死动物解剖，取心、肝、脾、肺、肾，观察未见各脏器出现明显病变。经计算尾静脉注射水溶性紫杉醇化合物小鼠LD50值为107.52mg/kg。

表1水溶性紫杉醇化合物小鼠静脉注射LD50

实施例9  片剂

取1g水溶性紫杉醇化合物，加入0.5g淀粉、0.1g硬脂酸镁、0.2g羧甲基纤维素、2.7g乙醇(体积百分比含量为70％)、2.5g微晶纤维素、3.2g玉米淀粉，充分搅拌混合制成湿颗粒，在60-70℃干燥2-4小时压制成片，每片含30mg水溶性紫杉醇化合物。

实施例10  胶囊剂

取1.5g水溶性紫杉醇化合物，加入0.2g硬脂酸镁、2g羧甲基纤维素、4.8g微晶纤维素，充分搅拌混合制成湿颗粒，将制成的湿颗粒直接在60-70℃干燥2～4小时，然后充填入空胶囊壳中，每粒胶囊含水溶性紫杉醇化合物25mg。

实施例11  缓释片剂

取0.75g水溶性紫杉醇化合物，加入0.35g羟丙基甲基纤维素、1.25g羧甲基纤维素、1.35g乙醇(体积百分比浓度为70％)、0.05g硬脂酸镁等充分搅拌混合制成湿颗粒，在60-70℃干燥2-4小时压制成片。

或取1.5g水溶性紫杉醇化合物，加入1.4g羟丙基甲基纤维素、0.15g硬脂酸、0.4g乳糖、0.05g硬脂酸镁，充分搅拌混合干法制粒，压片，每片含水溶性紫杉醇化合物25mg。

实施例12  滴丸

取1g水溶性紫杉醇化合物，加入9g的聚乙二醇，90℃加热熔融，使原料和辅料充分混熔，将熔融物滴入二甲基硅油接受液体中，自然冷却形成滴丸，使每粒滴丸含水溶性紫杉醇化合物5-25mg。

实施例13  颗粒剂

取0.75g水溶性紫杉醇化合物，加入0.05g硬脂酸镁、0.45g羧甲基纤维素、0.5g微晶纤维素，充分搅拌混合用12-14目筛制成颗粒。在60-70℃干燥2-4小时，使每克颗粒剂含水溶性紫杉醇化合物25mg。

实施例14  口服液

取0.5g水溶性紫杉醇化合物，加入纯水74.5g和25g食用糖，搅拌使溶解，分装灭菌，制得。

实施例15  冻干粉针

取0.45g水溶性紫杉醇化合物，0.4g甘露醇，加入9.1g的注射用水中，搅拌使溶解，滴加体积比1∶1的盐酸水溶液，调节pH值至6.2，再加入0.05g针剂用活性炭，室温搅拌20分钟，过滤除活性炭，再用0.22μm滤膜过滤除菌，得澄明无菌液，灌入5mL管制瓶中，每瓶3mL，放入真空冷冻干燥器中进行冷冻干燥，制得。

实施例16  注射液

取1g水溶性紫杉醇化合物、9g氯化钠与90g注射用水配液，搅匀，滤过，灌封，于115℃热压灭菌30分钟，制得。

或取1g水溶性紫杉醇化合物、10g葡萄糖与89g注射用水配液，滴加体积比1∶1的盐酸水溶液，调节pH值至4.0，加活性炭0.1g，在搅拌下煮沸30分钟，过滤除活性炭，再用0.22μm滤膜过滤除菌，得澄明无菌液，灌封，于115℃热压灭菌30分钟，制得。

Claims (7)

1.一种水溶性紫杉醇化合物，其特征具有下述结构：

其中

R₂＝H

2.水溶性紫杉醇化合物的制备方法，其特征是将紫杉醇与三乙烯四胺六乙酸酐在碱性催化剂催化下反应得到水溶性紫杉醇化合物，所述水溶性紫杉醇化合物具有下述结构：

其中

R₂＝H

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是包括如下步骤：

按比例将0.2-0.5g紫杉醇和0.1-0.8g的三乙烯四胺六乙酸酐溶于80-160mL二甲基亚砜中，在碱性催化剂催化下，室温搅拌反应12-96小时，反应完毕加入160-320mL无水乙醚，静置待沉淀析出完全后，重结晶，过滤得到粗品，依次用二氯甲烷，乙醇洗涤，得到所述水溶性紫杉醇化合物。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征是所述碱性催化剂为三乙胺、4-二甲氨基吡啶、碳酸钠、碳酸钾和碳酸氢钠至少一种。

5.一种含水溶性紫杉醇化合物的药物组合物是将结构为

其中

R₂＝H的水溶性紫杉醇化合物与一种或多种药学上可接受的载体混合，使所述水溶性紫杉醇的量占该药物组合物总重量的0.5-60％。

6.权利要求1所述的水溶性紫杉醇化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

7.权利要求5所述的一种含水溶性紫杉醇化合物的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

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