CN101560198A - 一种新的异穿心莲内酯磺化物、含有该磺化物的药物组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了如通式(I)所表示的化合物及其钾盐、钠盐或铵盐，还公开了包含通式(I)化合物、穿心莲内酯磺化物E、穿心莲酸及穿心莲内酯的药物组合物，以及它们的制备方法。利用该方法获得的化合物和组合物有较好的拮抗炎症因子、抗菌、解热、抗肿瘤的作用。本发明还公开了使用上述化合物和组合物制备的口服或注射剂型。

Description

一种新的异穿心莲内酯磺化物、含有该磺化物的药物组合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种新的穿心莲内酯衍生物及包含该衍生物的组合物，及其制备方法和在制备抗炎、抗菌、抗病毒和抗肿瘤药物中的用途。

背景技术

穿心莲内酯(andrographolide)为穿心莲(Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees)中的二萜类化合物，分子式：C₂₀H₃₀O₅，为无色方型或长方型结晶，m.p.230～232℃，[α]_D ²⁰-126°(C＝0.2，H₂O)。味极苦，可溶于甲醇、乙醇、丙醇、吡啶中，微溶于氯仿、乙醚，难溶于水及石油醚。因穿心莲内酯不溶于水，给制备注射液带来了困难。目前，有多种方法被用来制备穿心莲内酯的各种水溶性衍生物，以制备注射液，其中喜炎平注射液即为穿心莲内酯总磺化物制成的注射液，中国专利CN 1162420C中公开了穿心莲内酯的磺化工艺，中国专利CN 1290838C进一步公开了以该磺化工艺得到的穿心莲内酯总磺化物的物质组成。该专利表明，该总磺化物含有至少11种以上的各种磺化物及其衍生物。因而难以制定产品的质量标准，并影响到产品的临床疗效。

发明内容

本发明要解决的技术问题是寻找一种新的水溶性穿心莲内酯磺化物及组合物，该磺化物及含有该磺化物的组合物的制备方法，所制得的化合物、组合物较“水溶性穿心莲内酯磺化工艺”(专利授权号CN 1162420C)中得到的混合物有更好的质量可控性。该磺化物及含有该磺化物的组合物与药学上可用载体形成的药物组合物可用于制备抗炎、拮抗炎症因子、抗菌、解热、抗病毒和抗肿瘤的药物。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种新化合物，符合下述通式(I)所示，及其钾盐、钠盐或铵盐，其化学名称为14-去氧-8(R)-12(S)-8(12)环氧穿心莲内酯-19-硫酸酯；英文名称为14-deoxy-8(R)-12(S)-8(12)-epoxy andrographolide-19-sulfonate；简称异穿心莲内酯-19-硫酸酯；

R可以为：H、Na、K或NH₄。

一种药物组合物，包含通式(I)所示的化合物、穿心莲内酯磺化物E(化学名称：3，14，19-三羟基-8(9)，12(13)-赖百当二烯-15，16-内酯-19-硫酸酯)、穿心莲酸及穿心莲内酯，其重量比例为：10％～30％∶30％～75％∶5％～30％∶5％～30％，四种成分的总含量占组合物的重量比例≥90％。其中优选异穿心莲内酯-19-硫酸酯与穿心莲内酯磺化物E占组合物的重量比例≥50％。

一种药物组合物，包含通式(I)所述的化合物、穿心莲内酯磺化物E、穿心莲酸及穿心莲内酯，其特征在于四种成分的色谱归一化百分含量比例为10％～30％∶40％～75％∶5％～15％∶5％～15％。所采用的色谱分析条件如下：

色谱柱：反相C18色谱柱，5μm，250×4.6mm；

流动相A：乙腈-异丙醇1∶2(v/v)

流动相B：水(含0.2％磷酸)

流动相：流动相A-流动相B 25％∶75％(v/v)；流速：1mL/min

柱温：30℃；检测波长：225nm。

上述组合物的制备方法包括以下步骤

(1)将浓硫酸与无水乙醇混合，加入穿心莲内酯单体粉末，充分搅拌，室温放置；

(2)放置24小时后，加入氢氧化钠水溶液调pH值6-8；

(3)加入乙醇溶液，搅拌过滤，滤渣以乙醇溶液洗涤；

(4)回收乙醇溶液得水溶液，过滤得滤液；

(5)滤液通过柱色谱，以ODS反相硅胶为固定相，以乙醇-水或甲醇-水进行洗脱，回收溶剂，常规冷冻干燥或减压干燥得组合物。

其中步骤(1)中的浓硫酸与无水乙醇的体积比优选为1∶1，穿心莲内酯与无水乙醇的比例优选为1∶1(重量g∶体积ml)。步骤(2)中使用的是20％-50％的氢氧化钠水溶液。步骤(3)中使用的是90％-95％的乙醇溶液。步骤(5)中使用的是30％-35％的乙醇水或甲醇水溶液。

一种药物组合物，由上述化合物或组合物与药学上可接受载体组成。

一种药物组合物，由上述化合物或组合物与注射用水组成。

一种药物组合物，由上述化合物或组合物与甘露醇或其他冻干粉针辅料组成。

一种药物组合物，由上述化合物或组合物与口服制剂辅料组成。

本发明提供了异穿心莲内酯-19-硫酸酯及其制备方法，以及含有异穿心莲内酯-19-硫酸酯的组合物，并且提供了含有它们的药物组合物在制备抗炎、拮抗炎症因子、抗菌、解热、抗病毒和抗肿瘤药物中的应用。

本发明提供的异穿心莲内酯-19-硫酸酯为一新化合物，结构明确，较穿心莲内酯具有较好的水溶性，并且具有良好的抗菌、消炎、拮抗炎症因子、抗病毒及抗肿瘤活性，

本发明提供的含有异穿心莲内酯-19-硫酸酯、穿心莲磺化物E、穿心莲酸、穿心莲内酯的组合物较根据中国专利CN 1162420C得到的穿心莲内酯总磺化物具有组成简单，质量可控的优势，在同等剂量下具有更好的治疗效果。

附图说明

图1含异穿心莲内酯-19-硫酸酯、穿心莲磺化物E、穿心莲酸、穿心莲内酯的组合物的HPLC色谱图

图2异穿心莲内酯-19-硫酸酯红外图谱

图3异穿心莲内酯-19-硫酸酯核磁共振氢谱

图4异穿心莲内酯-19-硫酸酯核磁共振碳谱

图5异穿心莲内酯-19-硫酸酯质谱

图6对内毒素血症兔血清TNF-α的影响(x±s，n＝6；与模型组比：^*P＜0.05，^**P＜0.01)

图7组合物对内毒素血症兔血清IL-6的影响(x±s，n＝6，与模型组比：^*P＜0.05，^**P＜0.01)

具体实施方式

实施例1

本实施例公开了异穿心莲内酯及含异穿心莲内酯-19-硫酸酯、穿心莲磺化物E、穿心莲酸、穿心莲内酯的组合物的制备方法

(1)穿心莲内酯总磺化物的制备(参照中国专利，专利授权号CN1162420C)：

取无水乙醇1000mL置反应器中，缓慢滴加浓硫酸1000mL，搅匀，加入1000g穿心莲内酯，搅拌均匀后于室温下放置72h。置水浴中加入乙醇1000mL，搅匀，调pH至7.0，加入乙醇，至含醇量达80％，静置24h，加入少量活性炭，过滤，滤液回收乙醇，浓缩成稠膏，真空干燥即得穿心莲内酯的总磺化物。

(2)穿心莲内酯总磺化物经柱色谱分离制备含异穿心莲内酯-19-硫酸酯的组合物：

取穿心莲内酯总磺化物50g，加水50mL使完全溶解，过滤，样品液上预先处理好的ODS柱，先后用2倍柱体积的水和1.5倍柱体积的30％～35％甲醇水溶液水溶液进行洗脱，继续用1.5倍柱体积的30％～35％甲醇水溶液进行洗脱，并收集这部分的流出液，减压回收醇后冷冻干燥即得。

组合物的HPLC色谱图见附图1(Phenomenex luna C18色谱柱(250×4.6mm，5μm)，柱温30℃，检测波长225nm；流动相A：乙腈-异丙醇1∶2(v/v)，流动相B：水(含0.2％磷酸)，流动相：流动相A-流动相B 25∶75(v/v)，流速1mL/min)。附图1中保留时间8.17min、10.35min、11.67min、15.23min的色谱峰所对应的化合物分别为异穿心莲内酯-19-硫酸酯、穿心莲内酯磺化物E、穿心莲酸和穿心莲内酯。

该组合物经制备型HPLC进一步进行分离，得异穿心莲内酯-19-硫酸酯的单体化合物。色谱条件为：phenomenx luna C18-ODS制备型色谱柱(250×21.2mm，5μm)，流动相为乙腈-异丙醇-水8∶16∶76，流速8mL/min，检测波长225nm。

(3)异穿心莲内酯-19-硫酸酯的理化性质和波谱数据：

化学中文名称：14-去氧-8(R)-12(S)-8(12)-环氧-穿心莲内酯-19-硫酸酯

英文名称：14-deoxy-8(R)-12(S)-8(12)-epoxy andrographolide-19-sulfonate

无色针晶(甲醇)，易溶于甲醇、水，微溶于丙酮，不溶于乙醚、乙酸乙酯。

分子式：C₂₀H₃₀O₈S，分子量430。

ESI-MS：m/z 429[M-H]^-，m.p.202-203℃。

IR_max ^KBrcm^-1：3462(OH)，1748，1642(C＝C-C＝O)，1227，985，824.

¹H NMR(MeOD)δ：1.07(3H，s，H-20)，1.13(3H，s，H-17)，1.21(3H，s，H-18)，1.62(1H，m，H-9)，2.06(1H，m，H-11)，2.40(1H，dd，J＝7.8，13.7Hz，H-11)，3.26(1H，dd，J＝4.2，11.6Hz，H-3)，4.15(1H，d，J＝10.4Hz，H-19)，4.27(1H，d，J＝10.4Hz，H-19)，4.65(1H，m，H-12)，4.85(2H，brs，H-15)，7.43(1H，t，J＝1.6Hz，H-14).

¹³C NMR(MeOD)δ：16.57(C-20)，20.01(C-6)，23.64(C-18)，28.03(C-2)，31.93(C-17)，33.79(C-11)，36.99(C-10)，40.82(C-1)，43.35(C-4)，53.83(C-5)，37.35(C-7)，59.58(C-9)，70.40(C-19)，72.36(C-15)，74.26(C-12)，80.18(C-3)，84.25(C-8)，138.43(C-13)，146.56(C-14)，175.06(C-16).

(4)异穿心莲内酯-19-硫酸酯的结构鉴定：

该化合物的Kedde试剂反应显阳性，表明其中含有不饱和内酯环结构。ESI-MS显示该化合物的准分子离子峰为m/z 429([M-H]⁺)，结合¹H NMR和¹³CNMR数据，推测化合物的分子式为C₂₀H₃₀O₈S，为穿心莲内酯磺化物E的一种异构体。

¹H NMR谱显示有一个烯氢质子信号δ7.43(1H，t，J＝1.6Hz，H-14)；三个甲基质子信号，分别在δ1.07，1.13及1.21；一对连氧亚甲基质子信号δ4.85(2H，m，H-15)，一对连氧碳上的偕质子信号δ4.15(1H，d，J＝10.4Hz，H-19)和4.27(1H，d，J＝10.4Hz，H-19)，2个位于低场区的连氧次甲基质子信号δ3.26(1H，dd，J＝4.2，11.6Hz，H-3)和4.65(1H，m，H-12)；另外还有一组亚甲基上的偕质子信号2.06(1H，m，H-11)和2.40(1H，dd，J＝7.8，13.7Hz，H-11)，两个质子为典型的AB耦合系统，提示该亚甲基与手性中心相连。

¹³C-NMR谱共给出20个碳原子的共振信号，结合DEPT及HSQC谱信息显示，其中含1个内酯羰基碳信号δ175.06(s，C-16)、1对烯碳信号δ138.43(s，C-13)，146.56(d，C-14)、3个甲基信号δ31.93(C-17)，23.64(C-18)，16.57(C-20)和5个连氧碳信号：δ84.25(s，C-8)，80.18(d，C-3)，74.26(d，C-12)，72.36(t，C-15)及70.40(t，C-19)。进一步与磺化物E的¹³C-NMR数据对照，其烯碳信号δ129.08(s，C-13)和甲基碳信号δ19.82(C-17)分别向低场位移～10ppm至δ138.43(s，C-13)，δ31.93(C-17)处，并增加了连氧季碳信号δ84.25(C-8)和连氧次甲基碳信号δ74.26(d，C-12)，同时C-14的连氧次甲基碳信号δ66.70及Δ^8，9间的两个烯键季碳信号δ130.26(C-8)，137.98(C-9)消失。据此推测，磺化物E的C-14羟基脱水形成Δ^12，13双键，然后在双键Δ^8，9、Δ^12，13上发生水的加成反应，C-8、C-12上的-OH进一步脱水形成五员呋喃环，最终转化为异穿心莲内酯-19-硫酸酯。进一步通过¹H-¹H COSY及HMBC谱可对¹³C-NMR和¹H-NMR信号进行归属。

化合物中中主要的NOESY

在化合物的C-8、C-12间形成了环氧结构，从而使C-8、C-9和C-12成为手性碳。为进一步确定该化合物的相对构型，进一步进行了NOESY谱分析。图谱显示其主要的相关峰有H-3/H18、H-3/H-5、H-5/H-9和H-9/H-17，表明H-3，H-5，H-9和C-4位及C-8上连接的甲基位于环的同一侧；H-12/H-20、H-20/H-19有相关峰，表明H-12与H-19及C-10上连接的甲基同在环的另一侧。根据以上信息，并结合母体化合物穿心莲内酯的立体构型，可以推断磺化物Z的C-8和C-12分别为R构型和S构型，同时B/C环是顺式稠合，命名14-去氧-8(R)-12(S)-8(12)-环氧-穿心莲内酯-19-硫酸酯。

文献(Swapan Pramanick.Andropanolide and Isoandrographolide，MinorDiterpenoids from Andrographis paniculata：Structure and X-ray CrystallographicAnalysis J.Nat.Prod.2006，69，403-405)和专利(唐春山，叶文才，胡永美，杨小玲.中国专利，CN1290838C，2005.)分别报道了异穿心莲内酯-19-硫酸酯的母体化合物异穿心莲内酯及其8(S)-型立体异构体的¹³C NMR数据。与母体化合物异穿心莲内酯相比，磺化物Z的δC-19向高场位移近6ppm，其他各碳的化学位移变化小于4ppm，表明硫酸酯化确实发生在C-19位的羟基上。进一步8(S)-型立体异构体进行对照，磺化物Z的δC-5，C-6，C-7均向高场区位移3-4ppm，C-11、C-12向低场区位移约4ppm，而C-17的化学位移值变化较大，向低场区位移约10ppm，其它各碳信号化学位移值差异不大。这一结果表明，构型对C-17位甲基碳的化学位移有着显著的影响，也提示两个化合物在C-17位甲基构型上的差异。

异穿心莲内酯-19-硫酸酯与相关化合物的¹³C-NMR化学位移对照

[1]In CDCl₃，125MHz.Swapan Pramanick.Andropanolide and Isoandrographolide，Minor Diterpenoidsfrom Andrographis paniculata：Structure and X-ray Crystallographic Analysis J.Nat.Prod.2006，69，403-405.

[2]In CD₃OD，75MHz.唐春山，叶文才，胡永美，杨小玲.中国专利，CN1290838C，2005.

实施例2

异穿心莲内酯-19-硫酸酯按实施例1方法制备，称取1g，用葡萄糖等渗溶液约800mL溶解，加0.1％活性炭搅拌10分钟，滤过，加葡萄糖等渗溶液至1000mL，滤过，用10％氢氧化钠溶液调节pH值至4.5-6.5，灌封(大容量注射液，规格为50mL/瓶、100mL/瓶、250mL/瓶、500mL/瓶)，于100℃灭菌30分钟，经澄明度检查，包装即得。

实施例3

组合物按实施例1制备，称取组合物25g，加注射用水600mL，搅拌溶解，加入25g甘露醇，搅拌溶解后，加注射用水至1000mL，混匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，所得溶液分装于7mL西林瓶中，每瓶2mL，盖塞，放入冻干机中，按照设计的冻干曲线进行冷冻干燥，得组合物冻干粉针(每支50mg)。

实施例4

组合物按实施例1制备，称取组合物25g，用注射用水约800mL溶解，加0.1％活性炭搅拌10分钟，滤过，加注射用水至1000mL，滤过，，用10％氢氧化钠溶液调节pH值至4.5-6.5，滤过，滤液灌装于10mL玻瓶中，于100℃灭菌30分钟，经澄明度检查，包装即得。

试验例1：

本试验例考察了异穿心莲内酯-19-硫酸酯及含异穿心莲内酯-19-硫酸酯组合物溶解度

按中国药典(2005版)一部凡例中关于溶解度的试验法操作。

穿心莲内酯由江西青峰药业提供，异穿心莲内酯-19-硫酸酯及含异穿心莲内酯-19-硫酸酯组合物按实施例1制备。

分别称取研成细粉的异穿心莲内酯-19-硫酸酯及含异穿心莲内酯-19-硫酸酯组合物，置于25ml 25±2℃的水溶液中，每隔5分钟强有力振摇30秒钟，观察30分钟内的溶解情况，如无目视可见的溶质颗粒时，即视为完全溶解。

测定结果

	50mg/ml	200mg/ml	500mg/ml
				异穿心莲内酯-19-硫酸酯	澄清透明	澄清透明	澄清透明
含异穿心莲内酯-19-硫酸酯的组合物	澄清透明	澄清透明	澄清透明
				穿心莲内酯	不溶颗粒	不溶颗粒	不溶颗粒

结论：异穿心莲内酯-19-硫酸酯及含异穿心莲内酯-19-硫酸酯的组合物在水中的溶解度均大于500mg/ml。

试验例2

1.试验目的：测定异穿心莲内酯-19-硫酸酯、含异穿心莲内酯-19-硫酸酯的组合物经静脉一次给药小鼠的急性反应和死亡情况。

2.试验材料：

2.1试验药物

异穿心莲内酯-19-硫酸酯、含异穿心莲内酯-19-硫酸酯的组合物，按实施例1制备。使用前用生理盐水配成浓度100mg/mL的溶液。

穿心莲内酯总磺化物，根据中国专利CN 1162420C制备

2.2受试动物

ICR小鼠，体重18g～20g，雌雄各半。

3.试验条件：

给药前后，实验小鼠雌雄分笼，全价颗粒饲料喂养，自由饮水，室温20±2℃，湿度45％-65％。

4.试验方法及结果：

4.1方法：取ICR小鼠80只，体重18-20g，雌雄各半，随机均分为4组，每组20只。分别为对照组(生理盐水，25ml/kg)、异穿心莲内酯-19-硫酸酯组(2500mg/kg)、含异穿心莲内酯-19-硫酸酯的组合物组(2500mg/kg)、总磺化物组(2500mg/kg)。各组分别一次给小鼠尾静脉注射相应受试物25mL/kg。连续观察两周，记录受试小鼠的行为、活动、摄食量、体重、粪便、死亡等情况，对濒死及死亡动物及时进行大体解剖，未死亡小鼠于两周后处死进行尸检。

4.2试验结果：

组别	动物数(只)	死亡动物数(只)	最大给药量(mg/kg)
				对照组	20	0	/
异穿心莲内酯-19-硫酸酯	20	0	2500
				含异穿心莲内酯-19-硫酸酯	20	0	2500

的组合物
				总磺化物	20	0	2500

3个给药组静脉一次给药后，当天见其毛色光滑，活动、摄食、粪便色泽及质地正常，与对照组比较无明显差异；且两周内无死亡及其他异常现象发生；两组同时处死后进行尸检，各主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)经肉眼观察未见异常改变，与对照组比较无明显差别。

4.3试验结论：

经静脉一次给药的最大给药量试验结果表明：给药后均无明显的毒性反应，两周内亦无死亡。

试验例3

1.材料

1.1药物：

异穿心莲内酯-19-硫酸酯、含异穿心莲内酯-19-硫酸酯的组合物，按实施例1制备。使用前用生理盐水配制。

穿心莲内酯总磺化物，根据中国专利CN 1162420C制备。

1.2动物：

昆明种小鼠，雄性，体重22-25g；清洁级新西兰兔，体重2.5-3.0kg，均雌雄兼用，合格证号SYXK(鲁)20030020。

1.3试剂：

内毒素(LPS)，E.coli.Serotype O111：B4，Sigma，批号034K4105；2，4-二硝基苯酚，上海化学试剂厂，批号20030312；营养琼脂，中国药品生物制品检定所；地塞米松磷酸钠注射液，泗水希尔康药业有限公司，批号0403121；TNF-α、IL-6试剂盒，晶美生物工程有限公司(进口分装)。

1.4菌株：

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎链球菌，均由烟台大学药学院提供。

1.5主要仪器：

酶标仪，Synergy HT多功能酶标仪，美国Bio-Tek公司。

1.6试验环境：

温度25±3℃，湿度45％-65％。

2.实验方法及结论

2.1对内毒素引起的家兔体温升高的抑制作用

实验前两天每日测家兔体温1次，挑选体温在38.0-39.5℃，且自身体温变化小于0.3℃的新西兰兔30只，2.5-3.0kg，雌雄各半，随机分为5组，每组6只。一组于左耳缘静脉注射生理盐水；二组于左耳缘静脉注射异穿心莲内酯-19-硫酸酯、三组至五组分别于左耳缘静脉注射组合物，高剂量：300mg/kg，中剂量：150mg/kg，低剂量：75mg/kg。各组注射容积均为5mL/kg。于给药前测量一次体温作零时基础体温，给药后立即于兔右耳缘静脉注射内毒素200EU/kg，测量给药后1h，2h，3h，4h，6h时的体温。结果见下表。

2.1.2结果显示：异穿心莲内酯-19-硫酸酯150mg/kg、组合物300mg/kg及150mg/kg对内毒素所致的新西兰兔发热均有良好的解热作用，75mg/kg的解热作用不明显。

2.2异穿心莲内酯-19-硫酸酯对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响

取昆明种小白鼠80只，随机分为8组。模型组、异穿心莲内酯-19-硫酸酯高剂量组(50mg/kg)、中剂量组(25mg/kg)、低剂量组(12.5mg/kg)、总磺化物高剂量组(50mg/kg)、中剂量组(25mg/kg)、低剂量组(12.5mg/kg)、地塞米松阳性对照组(2mg/kg)。各组连续给药三天，末次给药后40min，将50μl二甲苯涂于小鼠右耳廓两面致炎，左耳不涂作为对照，致炎后1h脱臼处死小鼠，沿耳廓基线剪下两耳，用直径9mm的打孔器分别在同一部位打下耳片，即时称重，计算各组肿胀度及抑制率。

肿胀度(mg)＝左耳耳片重(mg)-右耳耳片重(mg)

抑制率(％)＝(模型组平均耳片重-给药组平均耳片重)/模型组平均耳片重×100％

2.结果

对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响(x±s，n＝10)

注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

结论：与模型组比较，异穿心莲内酯-19-硫酸酯3个剂量可显著抑制二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀，同等剂量下而总磺化物却无抑制作用。

2.3对炎症因子释放的影响

新西兰兔36只，2.5-3.0kg，雌雄各半，随机分为6组：模型对照组，地塞米松组、生理盐水对照组和组合物5、10、20mg/kg剂量组，每组6只，耳缘静脉给药。模型组iv LPS 2mg/kg，其余各组先iv LPS 2mg/kg后立即iv缓慢注入相应剂量的药物或空白溶媒，给药体积均为2ml/kg体重。给药前(0h)及给药后1、2、4、6、12h分别从耳中央动脉采血，每次采血1ml，采血后补充等体积生理盐水。分离血清用于细胞因子IL-6和TNF-α的测定。所有数据应用SPSS统计软件进行方差分析。

内毒素血症时体内产生过多的炎症细胞因子是造成组织损伤的主要原因之一，其中最主要的是TNF-α和IL-6。由上图可见，LPS攻击兔后，模型组血清TNF-α和IL-6迅速升高，2h达峰值，TNF-α随后迅速降低，6h已明显降低，而IL-6降低缓慢，至6h还处于较高水平，至12h才降至较低水平。与模型组比，组合物能显著降低TNF-α和IL-6的水平，并呈剂量依赖性，说明组合物能够抑制内毒素引起的炎性细胞因子TNF-α和IL-6的分泌。

2.4抗菌作用

用生理盐水将组合物配成2％的注射液，微孔滤膜过滤除菌后作初始浓度，再用生理盐水减半稀释至1/2，1/4，1/8，1/16，1/32浓度。用注射用生理盐水将注射用炎琥宁配制成2％注射液，过滤除菌后作初始浓度，再用生理盐水减半稀释至1/2，1/4，1/8，1/16，1/32浓度，分别吸取1mL于无菌试管内，加入9mL营养琼脂摇匀，接种细菌后于37℃恒温培养箱内培养24h，观察并记录结果见下表。

结果：异穿心莲内酯-19-硫酸酯及组合物具有较强的抗菌作用。

2.5体外抗病毒作用

2.5.1试药：将异穿心莲内酯-19-硫酸酯制成浓度为10mg/mL的溶液。在使用时，将溶液用培养基稀释至所需浓度备用。

2.5.2培养基：在扩增MDCK(来源于狗肾)、MA-104(来源于猴肾)与HEp-2细胞(来源于人咽癌)时使用10％胎牛血清E’-MEM。使用MDCK细胞作为流感病毒的宿主细胞，MA-104细胞用作轮状病毒的宿主细胞，HEp-2细胞用作RS病毒的宿主细胞。

2.5.3试验方法：

1)对流感病毒的作用：将MDCK细胞平板接种在6孔平板上，密度为5×10⁵细胞/孔，在5％二氧化碳的条件下在35℃下培养过夜。将流感病毒(A/PR/8/34毒株)用无血清培养基稀释至200PFU/mL，按0.5mL/孔的比率进行感染和吸附达1小时。感染和吸附完成后，加入E’-MEM培养基，其中含有预定浓度的试药以及0.6％高贵琼脂、1％牛血清白蛋白和3ug/mL乙酰化胰蛋白酶。充分凝结后，将平板倒置，继续培养3天。培养完成后，将存活细胞用1％中性红染色，将细胞用10％福尔马林固定，借助流水除去琼脂培养基，计数噬斑的数量。根据处理组和未处理组的噬斑数量计算对轮状病毒的抑制率。

2)对轮状病毒的作用：将MA-104细胞接种在6孔板上，密度为5×10⁵细胞/孔，在5％二氧化碳的条件下在37℃下培养过夜。将用10ug/mL乙酰化胰蛋白酶活化半小时的轮状病毒(Ku毒株)用无血清培养液稀释至140PFU/mL，按0.5mL/孔的比率进行感染和吸附达1小时。感染和吸附完成后，除去感染培养基，加入E’-MEM培养基，其中含有30ug/mL供试物、5ug/mL胰蛋白酶和1.4％琼脂糖。在5％CO₂的条件下，将感染有轮状病毒的MA-104细胞在37℃下培养3天，然后叠加含有0.005％中性红的0.7％琼脂糖，继续培养一天。培养完成后，将供试平板用3％甲醛溶液固定，除去用琼脂固化的供试培养基，然后计数噬斑的数量。根据处理组和未处理组的噬斑数量计算对轮状病毒的抑制率。

3)对RS病毒(呼吸合胞体病毒)的作用：将HEp-2细胞散播在6孔平板上，密度为5×10⁵细胞/孔，在5％二氧化碳的条件下在37℃下培养过夜。将RS病毒(A-2毒株)用无血清培养基稀释至140PFU/mL，按0.5mL/孔的比率进行感染和吸附达1小时。感染和吸附完成后，除去感染培养基，加入E’-MEM培养基，其中含有30ug/mL供试物、0.12％谷氨酰胺、2％胎牛血清和1％甲基纤维素。在5％CO₂的条件下，将感染有RS病毒的HEp-2细胞在35℃下培养3天，培养完成后，将供试平板用3％甲醛溶液固定，除去含有甲基纤维素的供试培养基，然后将供试平板用5％Giemza溶液染色，计数噬斑的数量。根据处理组和未处理组的噬斑数量计算组合物对RS病毒的抑制率。

2.5.4结果：在1ug/mL的组合物浓度下，以噬斑抑制率表示的抗流感病毒、轮状病毒及RS病毒的活性分别为100％、93％和95％，表明异穿心莲内酯-19-硫酸酯是良好的抗病毒剂。

2.6体外抗肿瘤作用

2.6.1实验材料

异穿心莲内酯-19-硫酸酯、含异穿心莲内酯-19-硫酸酯组合物按实施例1制备。

RPMI1640培养基：GIBCO公司生产。新生牛血清(超级)，杭州四季青生物工程材料有限公司，生产批号：000523。胰蛋白酶，Sigma公司生产。MTT，Sigma公司。注射用链霉素，山东瑞阳制药有限公司，1g(100万单位)/支，批号：200105101。注射用青霉素钠，山东鲁抗医药股份有限公司，80万单位/支，批号：L020318。其它常用化学试剂为国产分析纯。

细胞株：人肝癌细胞株SMMC-7721、人前列腺癌细胞株Bel-7402、人卵巢癌细胞株HO8910、人肺腺癌细胞株A549、人结肠癌细胞株HCT-8、人食管癌细胞株CaEs-17、人脑胶质瘤细胞株U251、人胃癌细胞株BGC-823、人胃腺癌细胞株SGC-7901、人早幼粒白血病细胞株HL60，均购自中国医学科学院药物研究所药理室。

仪器：CO₂培养箱(Forma 3110，USA)，超净工作台(BCN-1360，哈尔滨东联)，酶标仪(BioRad 550，USA)，倒置显微镜(Nikon)，细胞培养瓶(Costar，USA)，96孔细胞培养板(Costar，USA)。

2.5.2实验方法：

药物及试剂配制：RPMI1640培养基一袋加水1L，补加2g碳酸氢钠，10万单位青霉素和100mg链霉素，调节pH值至7.4，用0.22μm除菌滤膜过滤除菌。450mL培养基加灭活新生牛血清50mL即为完全培养液。胰蛋白酶用D-hanks缓冲液配成0.25％溶液，过滤除菌后4℃保存备用。

准确称取待测样品10.0mg，加到灭菌的0.5mL离心管中，加入DMSO 100μL，配成100mg/mL原液，-40℃冷冻保存。临用前融化后取适量以完全培养液稀释成相应浓度应用。

细胞培养及传代：细胞均贴壁培养于含10mL完全培养液细胞培养瓶中，于37℃、5％CO₂、饱和湿度下培养。细胞长满瓶底后用灭菌D-hanks液洗两次，加0.25％胰蛋白酶消化细胞2分钟，倒掉胰蛋白酶，待轻摇细胞能完全脱落后，加完全培养液30mL后，用移液管吹散细胞，分装于3个新的细胞培养瓶中，继续培养。

药物处理：取刚刚长成完整单层的细胞一瓶，胰蛋白酶消化后收集细胞，用移液管吹打均匀，取两滴细胞悬液台酚蓝染色，于显微镜下计数活细胞数目(死细胞数目不得超过5％)，用完全培养液调整细胞数目至1×10⁵个细胞/毫升。于96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液，将培养板置于CO₂培养箱中培养12小时，取出培养板后于每孔中补加100μL含不同浓度等测样品的完全培养液，使得药物终浓度分别为43.0、21.5、8.6、4.3、2.15、1.08、0.54和0.27μg/mL，每个浓度设4个平行孔，另设4孔细胞加入不含药完全培养液作正常对照孔。加完药后培养板于微孔板振荡器上振荡混匀，置于CO₂培养箱中继续培养48小时。取出培养板，每孔加入5mg/mL的MTT液10μL，振荡混匀，继续培养4小时。弃去每孔中培养液，加150μL的DMSO溶解formazan结晶，振荡使完全溶解。于BIO-TEK酶标仪测定各孔光吸收，测定波长570nm，参考波长630nm。根据各孔OD值计算药物对细胞增殖的抑制率和对肿瘤细胞增殖的半数抑制浓度(IC₅₀)，结果见下表。

Claims (14)

1、下述通式(I)所表示的化合物及其钾盐、钠盐或铵盐，化学名称为14-去氧-8(R)-12(S)-8(12)环氧穿心莲内酯-19-硫酸酯；英文名称为14-deoxy-8(R)-12(S)-8(12)-epoxy andrographolide-19-sulfonate；简称异穿心莲内酯-19-硫酸酯；

R可以为：H、Na、K或NH₄。

2、一种药物组合物，包含权利要求1所示的化合物、穿心莲内酯磺化物E(化学名称：3，14，19-三羟基-8(9)，12(13)-赖百当二烯-15，16-内酯-19-硫酸酯)、穿心莲酸及穿心莲内酯，其重量比例为：10％～30％∶30％～75％∶5％～30％∶5％～30％，四种成分的总含量占组合物的重量比例≥90％。

3、根据权利要求2所述的组合物，其特征在于异穿心莲内酯-19-硫酸酯与穿心莲内酯磺化物E占组合物的重量比例≥50％。

4、一种药物组合物，包含权利要求1所述的化合物、穿心莲内酯磺化物E、穿心莲酸及穿心莲内酯，其特征在于四种成分的色谱归一化百分含量比例为10％～30％∶40％～75％∶5％～15％∶5％～15％。所采用的色谱分析条件如下：

色谱柱：反相C18色谱柱，5μm，250×4.6mm；

流动相A：乙腈-异丙醇1∶2(v/v)

流动相B：水(含0.2％磷酸)

流动相：流动相A-流动相B 25％：75％(v/v)；流速：1mL/min

柱温：30℃；检测波长：225nm。

5、权利要求2的组合物或权利要求4的组合物，其制备方法包括以下步骤

(1)将浓硫酸与无水乙醇混合，加入穿心莲内酯单体粉末，充分搅拌，室温放置；

(2)放置24小时后，加入氢氧化钠水溶液调pH值6-8；

(3)加入乙醇溶液，搅拌过滤，滤渣以乙醇溶液洗涤；

(4)回收乙醇溶液得水溶液，过滤得滤液；

(5)滤液通过柱色谱，以ODS反相硅胶为固定相，以乙醇水或甲醇水溶液进行洗脱，回收溶剂，常规冷冻干燥或减压干燥得组合物。

6、根据权利要求5所述的组合物制备方法，其特征在于，步骤(1)中的浓硫酸与无水乙醇的体积比为1∶1，穿心莲内酯与无水乙醇的比例为1∶1(重量g：体积ml)。

7、根据权利要求5所述的组合物制备方法，其特征在于，步骤(2)中使用的是20％-50％的氢氧化钠水溶液。

8、根据权利要求5所述的组合物制备方法，其特征在于，步骤(3)中使用的是90％-95％的乙醇溶液。

9、根据权利要求5所述的组合物制备方法，其特征在于，步骤(5)中使用的是30-35％的乙醇水或甲醇水溶液。

10、权利要求1所述的化合物、权利要求2所述的组合物或权利要求4所述的组合物在制备抗炎、拮抗炎症因子、抗菌、解热、抗病毒和抗肿瘤药物中的应用。

11、一种药物组合物，由权利要求1所述的化合物或权利要求2所述的组合物或权利要求4所述的组合物与药学上可接受载体组成。

12、权利要求11所述的组合物，由权利要求1所述的化合物或权利要求2所述的组合物或权利要求4所述的组合物与注射用水组成。

13、权利要求11所述的组合物，由权利要求1所述的化合物或权利要求2所述的组合物或权利要求4所述的组合物与甘露醇或其他冻干粉针辅料组成。

14、权利要求11所述的组合物，由权利要求1所述的化合物或权利要求2所述的组合物或权利要求4所述的组合物与口服制剂辅料组成。

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