CN109675053A - 鬼臼毒素及其衍生物的靶向制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类鬼臼毒素及其衍生物的靶向制剂及其制备方法，其包含鬼臼毒素及其衍生物与酸敏感开环葫芦脲，其中鬼臼毒素及其衍生物和酸敏感开环葫芦脲的摩尔比为3~10:1；本发明利用开环葫芦脲具有C型空腔，可与鬼臼毒素及其衍生物药物形成包合作用，由于开环葫芦脲是柔性分子可以根据药物大小改变空腔尺寸，与药物形成很好的空腔匹配，进而大大增强药物的水溶性，便于药物液体制剂的形成；并且该开环葫芦脲具有pH刺激响应性，能在酸性条件下自主释放药物，从而能实现抗肿瘤药物的靶向释放；本发明对于抗肿瘤药物新制剂的开发，具有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及制药和药物制剂技术领域，具体说是涉及鬼臼毒素及其衍生物的靶向制剂及其制备方法。
背景技术
鬼臼毒素是一种非生物碱类木脂素类毒素。它提取自鬼臼的根茎。它的乙醇溶液和软膏的商品名分别为慷定来和化疣敌，可作为外用药物用于治疗由人类乳头瘤病毒引起的尖锐湿疣。鬼臼毒素具有良好的抗肿瘤活性，但因其毒性也很大，所以临床应用很少，目前主要是要解决怎么降低鬼臼毒素对正常细胞的毒副作用。鬼臼毒素和它的合成衍生物如依托泊苷和替尼泊苷等在抗病毒和抗肿瘤制剂等医疗应用上显示出广泛选择。其抗癌活性在很大程度上已被研究并在肺癌、淋巴瘤和生殖肿瘤的化疗中使用。公开号为CN106937529A的中国专利是在鬼臼毒素分子上进行衍生化，增加了一些水溶性的基团，制备一系列鬼臼毒素衍生物；公开号CN 107670037A是将鬼臼毒素制备成金纳米棒鬼臼毒素脂质体，减小其细胞毒性。这些鬼臼毒素衍生物和包合物在一定程度上增加了鬼臼毒素的水溶性并且降低其细胞毒性，但是衍生化过程比较繁琐，环糊精包合没有靶向性。
发明内容
本发明目的在于提供一种鬼臼毒素及其衍生物的靶向制剂，其为溶解性好、结合常数高，可以靶向给药的鬼臼毒素及其衍生物和酸敏感开环葫芦脲的包合物，该包合物含有鬼臼毒素或依托泊苷、酸敏感开环葫芦脲，其中鬼臼毒素或依托泊苷与开环葫芦脲的摩尔比为3~10:1；
本发明中酸敏感开环葫芦脲选自如下结构式：
式Ⅰ（a）；
式Ⅱ（b）；
式Ⅲ（c）；
其中R1选自H、CH3，R2选自H、CH3，R1和 R2不同时为CH3。
本发明中所述鬼臼毒素及其衍生物结构式如下：
，其中R1选自H、；R2选自CH3、H；即为以下物质：
。
本发明所述酸敏感开环葫芦脲（式Ⅰ）的合成方法参照文献中方法进行合成（MaoD, Liang Y, Liu Y, et al. Acid‐Labile Acyclic Cucurbit [n] uril MolecularContainers for Controlled Release[J]. AngewandteChemie, 2017, 129(41): 12788-12792.），而酸敏感开环葫芦脲（式Ⅱ），酸敏感开环葫芦脲（式Ⅲ）则是在酸敏感开环葫芦脲（式Ⅰ）的基础上衍生化而来；主要分为三步反应，首先从单体合成二聚体，从二聚体到四聚体后再到六聚体，再在六聚体上进行修饰。
本发明鬼臼毒素及其衍生物的靶向制剂的制备方法是将酸敏感开环葫芦脲溶解于水中，将鬼臼毒素及其衍生物溶解于有机溶剂中；然后将鬼臼毒素及其衍生物有机溶剂溶液加入到酸敏感开环葫芦脲溶液中，在20℃~60℃条件下搅拌3d~7d，在35℃~45℃下减压浓缩，浓缩液过滤，滤液浓缩干燥，制得鬼臼毒素及其衍生物的靶向制剂。
所述有机溶剂为甲醇、乙醇、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺，丙酮，氯仿或四氢呋喃。
将酸敏感开环葫芦脲溶解于pH5.0的氘代水中分别在37℃中孵育3h、6h和三天，然后分别进行1HNMR研究酸敏感主体在酸性环境中的裂解过程；酸敏感主体裂解原理如下所示（以式Ⅰ为例，R1=H，R2=H）；结果见图4，从图中可以看出酸敏感开环葫芦脲在弱酸性条件下裂解过程是缓慢的裂解，证明其可以在弱酸性条件下缓慢的释放药物。
。
本发明制备的包合物具有酸敏感性，其可以在肿瘤细胞处靶向释放，其释放模式图如图1所示。
本发明包合物的制备方法简便易行、条件温和、适合工业化生产。
本发明制得的包合物溶解性好、稳定性好，安全性高，可有效克服鬼臼毒素及其衍生物药物本身水溶性差和生物利用度低的缺点，本发明包合物对正常细胞没有毒性，对癌细胞活性较好，具有与阿霉素和顺铂相当的活性；结合其微酸性环境（癌细胞的生理环境）的释放性质，该包合物具有癌细胞靶向性。
附图说明
图1是酸敏感开环葫芦脲包合物裂解模式图；
图2是鬼臼毒素与酸敏感开环葫芦脲包合物的核磁共振氢谱（1H NMR）对比图，其中（a）酸敏感开环葫芦脲；（b）鬼臼毒素和酸敏感开环葫芦脲包合物；（c）鬼臼毒素；
图3是依托泊苷与酸敏感开环葫芦脲包合物的核磁共振氢谱（1H NMR）对比图，其中：（a）酸敏感开环葫芦脲；（b）依托泊苷和酸敏感开环葫芦脲包合物；（c）依托泊苷；
图4是酸敏感主体在pH5.0时裂解不同时间的核磁共振氢谱（1H NMR）对比图，其中（a）酸敏感开环葫芦脲；（b）酸敏感开环葫芦脲在pH5.0裂解3h；（c）酸敏感开环葫芦脲在pH5.0裂解6h；（d）酸敏感开环葫芦脲在pH5.0裂解3d；（e）酸敏感开环葫芦脲合成原料。
具体实施方式
下面通过实施例进一步对本发明中所述方法进行描述，但本发明保护范围不受实施例限制，本实施例中使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂，使用的方法如无特殊说明均为常规方法。
实施例1：本鬼臼毒素及其衍生物的靶向制剂包含鬼臼毒素及其衍生物与酸敏感开环葫芦脲，其中鬼臼毒素及其衍生物和酸敏感开环葫芦脲的摩尔比为3:1；结构式如下：
；
上述包合物的制备如下：
（a）将0.124 mmol的酸敏感开环葫芦脲（R1为CH3，R2为H）溶于12 mL蒸馏水中，25℃下搅拌至溶解，将0.371 mmol的鬼臼毒素（依托泊苷）溶于乙醇溶液中；然后将鬼臼毒素（依托泊苷）乙醇溶液加入到酸敏感开环葫芦脲溶液中，在25℃条件下搅拌7d，在35℃下减压浓缩除去乙醇，浓缩液使用4.5μm微孔滤膜过滤，滤液浓缩真空干燥制得酸敏感开环葫芦脲与鬼臼毒素（依托泊苷）的包合物，产率分别为95%、95%；
（b）将0.124 mmol的酸敏感开环葫芦脲（R1为H，R2为H）溶于12 mL蒸馏水中，30℃下搅拌至溶解，将0.371 mmol的鬼臼毒素（依托泊苷）溶于甲醇溶液中，然后将鬼臼毒素（依托泊苷）甲醇溶液加入到酸敏感开环葫芦脲溶液中，在30℃条件下搅拌6d，在40℃下减压浓缩除去甲醇，浓缩液使用4.5μm微孔滤膜过滤，滤液浓缩真空干燥制得酸敏感开环葫芦脲与鬼臼毒素（依托泊苷）的包合物，产率分别为90%、93%；从图2、3可已看出包合物中药物在氘代水中有质子H的特征峰，而药物本身是不溶于水的，这可以证明药物被包合进了酸敏感开环葫芦脲的空腔。
取人体正常细胞（293T）、人肝癌组织细胞（HePG2）、人结肠癌细胞（HCT-116）和人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）悬液（浓度为1×104个/100μL）各100μL加入96孔板，在 5% 二氧化碳浓度、37℃及饱和湿度下培养；然后用鬼臼毒素（依托泊苷）、酸敏感开环葫芦脲及其包合物对细胞进行处理；用MTT法分别测定OD值，求出生长抑制率，对比包合物与未被包合的鬼臼毒素对肿瘤细胞增殖的抑制作用，并计算IC50值；上述实验平行进行三次后取其平均值；
表1不同物质在不同细胞中的IC50值（μM）
表中1代表酸敏感开环葫芦脲（a，R1为CH3，R2为H），2代表酸敏感开环葫芦脲（a，R1为H，R2为H）；
从表1中可以看出酸敏感开环葫芦脲（R1=CH3, R2=H；R1=H, R2=H）无论是对正常细胞还是癌细胞均无毒性，而鬼臼毒素及其衍生物本身对正常细胞的毒性大；酸敏感开环葫芦脲（R1=CH3, R2=H；R1=H, R2=H）与鬼臼毒素及其衍生物的包合物对正常细胞没有毒性，对癌细胞有一定毒性，且与阿霉素和顺铂相比较，其对肿瘤细胞的作用效果不亚于后两者。
实施例2：本鬼臼毒素及其衍生物的靶向制剂包含鬼臼毒素及其衍生物与酸敏感开环葫芦脲，其中鬼臼毒素及其衍生物和酸敏感开环葫芦脲的摩尔比为4:1；结构式如下：
；
（a）将0.116 mmol的酸敏感开环葫芦脲（R1为CH3，R2为H）溶于10 mL蒸馏水中，35℃下搅拌至溶解，将0.464 mmol的鬼臼毒素（依托泊苷）溶于丙酮溶液中，在40℃条件下搅拌5d，在45℃下减压浓缩去丙酮，浓缩液使用4.5μm微孔滤膜过滤，滤液浓缩真空干燥制得酸敏感开环葫芦脲与鬼臼毒素（依托泊苷）的包合物，产率分别为98%、98%；
（b）将0.116 mmol的酸敏感开环葫芦脲（R1为H，R2为H）溶于10 mL蒸馏水中，40℃下搅拌至溶解，将0.446 mmol的鬼臼毒素（依托泊苷）溶于乙腈中，在50℃条件下搅拌4d，在35℃下减压浓缩去乙腈，浓缩液使用4.5μm微孔滤膜过滤，滤液浓缩真空干燥制得酸敏感开环葫芦脲与鬼臼毒素（依托泊苷）的包合物，产率分别为95%、92%。
取人体正常细胞（293T）、人肝癌组织细胞（HePG2）、人结肠癌细胞（HCT-116）和人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）悬液（浓度为1×104个/100μL）各100μL加入96孔板，在 5% 二氧化碳浓度、37℃及饱和湿度下培养；然后用鬼臼毒素（依托泊苷）、酸敏感开环葫芦脲及其包合物对细胞进行处理；用MTT法分别测定OD值，求出生长抑制率，对比包合物与未被包合的鬼臼毒素对肿瘤细胞增殖的抑制作用，并计算IC50值；上述实验平行进行三次后取其平均值；
表2不同物质在不同细胞中的IC50值（μM）
表中1代表酸敏感开环葫芦脲（b，R1为H，R2为H），2代表酸敏感开环葫芦脲（b，R1为CH3，R2为H）
从表2中可以看出酸敏感开环葫芦脲（R1=CH3, R2=H；R1=H, R2=H）无论是对正常细胞还是癌细胞均无毒性，而鬼臼毒素及其衍生物本身对正常细胞的毒性大；酸敏感开环葫芦脲（R1=CH3, R2=H；R1=H, R2=H）与鬼臼毒素及其衍生物的包合物对正常细胞没有毒性，对癌细胞有一定毒性，且与阿霉素和顺铂相比较，其对肿瘤细胞的作用效果不亚于后两者。
实施例3：本鬼臼毒素及其衍生物的靶向制剂包含鬼臼毒素及其衍生物与酸敏感开环葫芦脲，其中鬼臼毒素及其衍生物和酸敏感开环葫芦脲的摩尔比为9:1；结构式如下：
；
（1）将0.116 mmol的酸敏感开环葫芦脲（R1为H，R2为CH3）溶于10 mL蒸馏水中，45℃下搅拌至溶解，将1.04 mmol的鬼臼毒素（依托泊苷）溶于乙醇溶液中，然后将鬼臼毒素（依托泊苷）乙醇溶液加入到酸敏感开环葫芦脲溶液中，在60℃条件下搅拌3d，在35℃下减压浓缩除去乙醇，浓缩液使用4.5μm微孔滤膜过滤，滤液浓缩真空干燥制得酸敏感开环葫芦脲与鬼臼毒素（依托泊苷）的包合物，产率分别为90%、98%；
（2）将0.116 mmol的酸敏感开环葫芦脲（R1为H，R2为H）溶于10 mL蒸馏水中，50℃下搅拌至溶解，将1.04 mmol的鬼臼毒素溶于N,N-二甲基甲酰胺溶液中，然后将鬼臼毒素（依托泊苷）N,N-二甲基甲酰胺溶液加入到酸敏感开环葫芦脲溶液中，在45℃条件下搅拌5d，在40℃下减压浓缩除去N,N-二甲基甲酰胺，浓缩液使用4.5μm微孔滤膜过滤，滤液浓缩真空干燥制得酸敏感开环葫芦脲与鬼臼毒素（依托泊苷）的包合物，产率分别为产率为85%、92%。
取人体正常细胞（293T）、人肝癌组织细胞（HePG2）、人结肠癌细胞（HCT-116）和人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）悬液（浓度为1×104个/100μL）各100μL加入96孔板，在 5% 二氧化碳浓度、37℃及饱和湿度下培养；然后用鬼臼毒素（依托泊苷）、酸敏感开环葫芦脲及其包合物对细胞进行处理；用MTT法分别测定OD值，求出生长抑制率，对比包合物与未被包合的鬼臼毒素对肿瘤细胞增殖的抑制作用，并计算IC50值；上述实验平行进行三次后取其平均值；
表3不同物质在不同细胞中的IC50值（μM）
表中1代表酸敏感开环葫芦脲（c、R1为H，R2为CH3），2代表酸敏感开环葫芦脲（c，R1为H，R2为CH3）
从表3中可以看出酸敏感开环葫芦脲（R1=CH3, R2=H；R1=H, R2=H）无论是对正常细胞还是癌细胞均无毒性，而鬼臼毒素及其衍生物本身对正常细胞的毒性大；酸敏感开环葫芦脲（R1=CH3, R2=H；R1=H, R2=H）与鬼臼毒素及其衍生物的包合物对正常细胞没有毒性，对癌细胞有一定毒性，且与阿霉素和顺铂相比较，其对肿瘤细胞的作用效果不亚于后两者。
Claims (5)
1.一类鬼臼毒素及其衍生物的靶向制剂，其特征在于包含鬼臼毒素及其衍生物与酸敏感开环葫芦脲，其中鬼臼毒素及其衍生物和酸敏感开环葫芦脲的摩尔比为3~10:1。
2.根据权利要求1所述的鬼臼毒素及其衍生物的靶向制剂，其特征在于，酸敏感开环葫芦脲选自如下结构式：
式Ⅰ；
式Ⅱ；
式Ⅲ；
其中R1选自H、CH3，R2选自H、CH3，R1和 R2不同时为CH3。
3.根据权利要求1所述的鬼臼毒素及其衍生物的靶向制剂，其特征在于，鬼臼毒素及其衍生物结构式如下：
，其中R1选自H、；R2选自CH3、H。
4.权利要求1所述的鬼臼毒素及其衍生物的靶向制剂的制备方法，其特征在于：将酸敏感开环葫芦脲溶解于水中，将鬼臼毒素及其衍生物溶解于有机溶剂中；然后将鬼臼毒素及其衍生物有机溶剂溶液加入到酸敏感开环葫芦脲溶液中，在20℃~60℃条件下搅拌3d~7d，在35℃~45℃下减压浓缩，浓缩液过滤，滤液浓缩干燥，即得鬼臼毒素及其衍生物的靶向制剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：有机溶剂为甲醇、乙醇、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺，丙酮，氯仿或四氢呋喃。
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