CN102898433B

CN102898433B - 一种汉防己甲素的没食子酸盐、其药物组合物、其制备方法及其用途

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Publication number: CN102898433B
Application number: CN201210363948.4A
Authority: CN
Inventors: 孙从新; 冀蕾; 郑礼
Original assignee: China Medicament Research & Development Center Co Ltd
Current assignee: China Medicament Research & Development Center Co Ltd
Priority date: 2012-09-26
Filing date: 2012-09-26
Publication date: 2015-04-15
Anticipated expiration: 2032-09-26
Also published as: CN102898433A

Abstract

本发明公开了一种汉防己甲素的没食子酸盐、其药物组合物、其制备方法及其用途。本发明对汉防己甲素进行结构修饰，制备了一种汉防己甲素的新衍生物即汉防己甲素没食子酸盐。理化常数测试显示，汉防己甲素没食子酸盐溶解度比汉防己甲素增强43倍。药理实验表明，汉防己甲素没食子酸盐对肿瘤株细胞的增殖有明显的抑制作用，其作用优于汉防己甲素；其还表现出了明显的比汉防己甲素强的降血压、抗炎、镇痛作用，毒性小于汉防己甲素。因而，可以汉防己甲素没食子酸盐为活性成分制备抗肿瘤、降血压、抗炎、镇痛药物，应用前景广阔。

Description

一种汉防己甲素的没食子酸盐、其药物组合物、其制备方法及其用途

技术领域

本发明属于药物领域中新的化合物及其制备方法与应用，具体涉及一种新的汉防己甲素衍生物即汉防己甲素的没食子酸盐，还公开了其制备方法及其用于制备抗肿瘤、降血压及抗炎、镇痛等药物的用途。

背景技术

大多数天然来源的成分分布广泛、结构多样、活性显著，对其进行结构修饰、改造和全合成，一直是新药研发的一个主要思路，也是天然药物化学研究的热点之一。

汉防己甲素(Tetrandrine，Tet)，又叫粉防己碱，属双苄基异喹啉类化合物(见式Ⅱ)，该化合物来源于天然产物防己科植物汉防己（Stephania tetrandra S．Moore）的根。现代药理研究证实，汉防己甲素是一种钙离子拮抗剂，主要作用于钙离子通道，影响钙离子的跨膜转运以及在细咆内的分布利用，其对肝纤维化、肝门脉高压、矽肺乃至心肌纤维化等具有临床治疗意义（海峡药学，2008，20(8)，119-121）。目前，国内已有汉防己甲素片及注射液上市，主要用于治疗高血压、矽肺和关节炎等。近年来研究发现，汉防己甲素不仅能直接抑制肿瘤生长，并且具有放疗增敏、逆转耐药、减轻放化疗毒副反应的作用（时珍国医国药，2010，21(1)，212-213）。目前，汉防己甲素的各种抗肿瘤作用研究多局限于基础实验阶段，但由于汉防己甲素具有脂溶性强、水溶性差、生物利用度低等缺点，影响了它的药效发挥。因此，对该化合物以增强水溶性、提高生物利用度为目的进行结构改造，将是非常必要和有意义的。

式Ⅱ

已有针对汉防己甲素的结构改构，如汉方己甲素成季铵盐或母核取代基的各种结构修饰（CN1111160C；Supramolecular Chemistry(2008),20(4),427-435.），其不足为改造后的化合物活性不够好或工艺复杂等。

发明内容

本发明的目的是提供了一种水溶性好、生物利用度高的汉防己甲素衍生物。

本发明所提供的汉防己甲素衍生物，是汉防己甲素没食子酸盐（命名为NIP-hm），其化学结构式如式I所示：

式I

本发明另一目的在于提供一种药物组合物，包括前述的汉防己甲素没食子酸盐及药学上可接受的辅料。

所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、崩解剂、防腐剂、溶剂、增稠剂、增溶剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂等，必要时还可加入香味剂、甜味剂及色素等。

所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、悬浮液、糖浆、口腔含片、舌下含片、注射剂、软膏剂、栓剂或吸入剂等。

本发明还一目的在于提供所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途，所述肿瘤包括但不限于肺癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌和宫颈癌。

本发明还一目的在于提供所述的组合物在制备降血压药物中的用途。

本发明还一目的在于提供所述的汉防己甲素没食子酸盐化合物或其所述的组合物在制备抗炎药物或镇痛药物中的用途。

本发明再一目的在于提供一种制备汉防己甲素没食子酸盐的方法：室温（一般为20-30℃），避光，将汉防己甲素悬浮于极性溶剂中，搅拌下，加入溶于极性溶剂的没食子酸在20-40℃（优选30℃）下进行反应，反应完毕，浓缩，抽滤，洗滤饼，干燥，得到汉防己甲素没食子酸盐。

制备中，所述汉防己甲素与没食子酸的摩尔比为1:2-4，优选1:2.2；所述极性溶剂为乙醇、甲醇或丙酮，优选为乙醇；所述汉防己甲素与极性溶剂的质量/体积比（w/v）为1:50-100。

所述汉防己甲素与没食子酸的反应时间为24-30小时。

本发明采用以上方案的有益效果：本发明对汉防己甲素进行结构修饰，制备了一种汉防己甲素的新衍生物即汉防己甲素没食子酸盐。理化常数测试显示，汉防己甲素没食子酸盐溶解度比汉防己甲素增强43倍。药理实验表明，汉防己甲素没食子酸盐对肺癌NCI-H460、SPC-A-I、卵巢癌SKOV-3、乳腺癌MCF-7、肝癌Bele7402、HepG2、宫颈癌HeLa、Caski等8种肿瘤株细胞的增殖均有明显的抑制作用，其作用优于汉防己甲素。汉防己甲素没食子酸盐还表现出了明显的比汉防己甲素强的降血压、抗炎、镇痛作用。此外，汉防己甲素没食子酸盐的毒性小于汉防己甲素。因而，可以汉防己甲素没食子酸盐为活性成分制备抗肿瘤、降血压、抗炎、镇痛药物，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为汉防己甲素的HPLC图谱

图2为没食子酸的HPLC图谱

图3为汉防己甲素没食子酸盐的HPLC图谱

具体实施方式

本发明以天然化合物汉防己甲素为先导化合物设计合成了一种汉防己甲素衍生物，即汉防己甲素没食子酸盐，以克服汉防己甲素水溶性差，生物利用度低的缺点。

没食子酸(Gallic acid，GA)又叫五倍子酸，是一种易溶于水的有机酸，化学名为3,4,5-三羟基苯甲酸（见式Ⅲ）。没食子酸为自然界中多种常见中药材的有效活性成分，如山茱萸、藏药红景天、诃子的果实、何首乌、芍药、泽漆、拳参等。没食子酸作为一种有机酸，水溶性好，且易被消化道所吸收，其作用机制已较明确，因其对肝脏、肾脏、心血管有较强的亲和力，生物学效应比较广泛，其突出作用是抗肿瘤，对多种致癌、促癌物有抵抗作用，且对肿瘤形成各阶段都有预防和抑制作用（中医药信息，2011，28(1)，109-111）。本发明的发明人将难溶性生物碱汉防己甲素与水溶性好的有机酸没食子酸成盐，一方面通过成盐增强水溶性、提高生物利用度；另一方面，考虑汉防己甲素与没食子酸均有抗肿瘤作用，期望通过“强强联合”发挥协同增效的抗肿瘤作用。其目标是通过增强汉防己甲素的水溶性，提高其生物利用度，从而开发出抗肿瘤、降血压及抗炎、镇痛等方面的新药。

因此，本发明第一方面为提供汉防己甲素没食子酸盐（命名为NIP-hm），其化学结构式如式I所示：

式I

本发明另一方面是，提供汉防己甲素没食子酸盐在抗肿瘤方面的用途，所述肿瘤指人肿瘤疾病，包括但不限于肝肿瘤、肺肿瘤、卵巢肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤等。

本发明涉及的另一方面是，提供汉防己甲素没食子酸盐在降血压方面的用途。

本发明涉及的另一方面是，提供汉防己甲素没食子酸盐在抗炎方面的用途。

本发明涉及的另一方面是，提供汉防己甲素没食子酸盐在镇痛方面的用途。

基于上述用途，本发明还提供了一种药物组合物，包括汉防己甲素没食子酸盐及药学上可接受的辅料。

所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、悬浮液、糖浆、口腔含片、舌下含片、注射剂、软膏剂、栓剂或吸入剂等。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明式I所示的化合物-汉防己甲素没食子酸盐，可通过如下方法合成：

室温（一般为20-30℃），避光，将汉防己甲素悬浮于极性溶剂中，搅拌下，加入溶于极性溶剂的没食子酸在20-40℃（优选30℃）下进行反应，反应完毕，浓缩，抽滤，洗滤饼，干燥，得到汉防己甲素没食子酸盐。

在上述汉防己甲素没食子酸盐的合成方法中，所述汉防己甲素与没食子酸的摩尔比为1:2-4，优选1:2.2。

所述极性溶剂为乙醇、甲醇或丙酮等，优选为乙醇。

所述汉防己甲素与极性溶剂的质量/体积比（单位：g/ml）为1:50-100。

所述汉防己甲素与没食子酸的反应时间为24-30小时。

具体合成路线如下：

式I

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1-5汉防己甲素没食子酸盐的制备

合成汉防己甲素没食子酸盐（式Ⅰ）的原料配方及反应参数如表1所示：

表1实施例1-5合成汉防己甲素没食子酸盐（式Ⅰ）的原料配方及反应参数

实施例	汉防己甲素	没食子酸	极性溶剂	反应温度	反应时间
						实施例1	10.00g，0.016mol	6.01g，0.035mol	乙醇，650mL	30℃	24h
实施例2	20.00g，0.032mol	12.00g，0.070mol	乙醇，1550mL	30℃	26h
						实施例3	20.00g，0.032mol	21.76g，0.128mol	乙醇，2000mL	40℃	28h
实施例4	20.00g，0.032mol	10.88g,0.064mol	甲醇,1000mL	20℃	30h
						实施例5	20.00g，0.032mol	16.32g,0.096mol	丙酮,1800mL	25℃	30h

实施例1、合成汉防己甲素没食子酸盐（式Ⅰ）

参考前述以结构式表示的合成路线及表1所示的原料配方和反应条件，本发明汉防己甲素没食子酸盐（式Ⅰ）的合成方法为：室温，避光，将汉防己甲素（10g，0.016mol）投入600mL无水乙醇中，搅拌，白色浑浊，滴加入溶于50mL无水乙醇的没食子酸（6.01g，0.035mol），加毕，控温约30℃搅拌反应24h，减压浓缩蒸出约500mL乙醇，室温搅拌2h，抽滤，乙醇洗，干燥，得乳白色固体；滤液浓缩，抽滤，乙醇洗，干燥，合并滤饼共计得到乳白色固体14.88g，收率95％。测试产物结果如下：

熔点（m.p.）：179-181℃。

¹H-NMR（d₆-DMSO，300MHz）：δ2.18(s,3H),2.26-2.38(m,2H),2.50(s,3H),2.59-2.86(m,7H),3.03(s,3H),3.15-3.21(m,1H),3.29(s,3H),3.34-3.53(m,3H),3.67(s,3H),3.81(s,3H),3.91-3.94(m,1H),5.93(s,1H),6.30-6.40(m,3H),6.62(s,1H),6.66-6.70(m,1H),6.76-6.79(m,1H),6.90-6.93(m,5H),7.07-7.10(m,1H),7.43-7.46(m,1H);¹³C-NMR（d₆-DMSO，300MHz）：δ21.3,25.2,36.4,41.7,42.2,42.3,43.5,44.9,55.8,55.9,56.0,56.2,59.5,61.3,62.8,106.6,108.9,112.3,113.1,115.6,119.8,120.8,121.4,121.6,122.6,123.1,128.0,128.3,128.5,130.7,132.7,134.5,135.6,137.7,138.1,143.5,145.6,146.9,148.0,148.1,149.1,151.1,153.2,167.7。确证为汉防己甲素没食子酸盐（式Ⅰ）。

实施例2、合成汉防己甲素没食子酸盐（式Ⅰ）

参考前述以结构式表示的合成路线及表1所示的原料配方和反应条件，实施例2中汉防己甲素没食子酸盐（式Ⅰ）的合成方法与实施例1相同，得到乳白色固体28.19g，收率90％。测试结果m.p.176-177℃，¹H-NMR（d₆-DMSO，300MHz）与实施例1相同，确证为汉防己甲素没食子酸盐（式Ⅰ）。

实施例3、合成汉防己甲素没食子酸盐（式Ⅰ）

参考前述以结构式表示的合成路线及表1所示的原料配方和反应条件，实施例3中汉防己甲素没食子酸盐（式Ⅰ）的合成方法与实施例1相同，得到乳白色固体28.01g，收率91％。测试结果m.p.178-181℃，¹H-NMR（d₆-DMSO，300MHz）与实施例1相同，确证为汉防己甲素没食子酸盐（式Ⅰ）。

实施例4、合成汉防己甲素没食子酸盐（式Ⅰ）

参考前述以结构式表示的合成路线及表1所示的原料配方和反应条件，实施例4中汉防己甲素没食子酸盐（式Ⅰ）的合成方法与实施例1相同，得到乳白色固体27.09g，收率88％。测试结果m.p.176-179℃，¹H-NMR（d₆-DMSO，300MHz）与实施例1相同，确证为汉防己甲素没食子酸盐（式Ⅰ）。

实施例5、合成汉防己甲素没食子酸盐（式Ⅰ）

参考前述以结构式表示的合成路线及表1所示的原料配方和反应条件，实施例5中汉防己甲素没食子酸盐（式Ⅰ）的合成方法与实施例1相同，得到乳白色固体26.17g，收率85％。测试结果m.p.180-182℃，¹H-NMR（d₆-DMSO，300MHz）与实施例1相同，确证为汉防己甲素没食子酸盐（式Ⅰ）。

实施例6、汉防己甲素没食子酸盐的HPLC测定

测定实施例1-5合成的汉防己甲素没食子酸盐的HPLC图谱，具体方法如下：

（1）色谱条件

色谱柱：迪马C18(2)4.6×250mm，5cm

流动相：0.2％磷酸水(A)：甲醇（B）

柱温：25℃

流速：0.8mL/min

检测波长：280nm

进样量：10μl

（2）含量测定

测定方法：外标法

对照品及样品溶液的配制：将精密称定好的样品及对照品（汉防己甲素和没食子酸）用甲醇超声溶解并稀释至10mL，过0.45μm的微孔滤膜，即得。

（3）结果

汉防己甲素的HPLC图谱如图1所示，没食子酸的HPLC图谱如图2所示，汉防己甲素没食子酸盐的HPLC图谱如图3所示，表明获得了结构正确的汉防己甲素没食子酸盐，汉防己甲素：没食子酸的摩尔比为1:2。

实施例7、测定汉防己甲素没食子酸盐的溶解度

测定方法：按照中国药典2010年版二部范例中溶解度测定方法：取样品，精密称取适量，置于一定量的溶剂（水）中（25±2℃），每隔5分钟强力振摇30秒，观察30分钟内的溶解情况。

实验结果如表2所示，实验结果显示，汉防己甲素没食子酸盐（式I）的溶解度较汉防己甲素有较大幅度增加。

表2汉防己甲素没食子酸盐及汉防己甲素的溶解度

名称	溶解度	溶解度增加倍数
			汉防己甲素	8mg/100mL	-----
汉防己甲素没食子酸盐	350mg/100mL	43

实施例8、体外抗肿瘤研究

实验原理：MTT的化合物(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide)，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲臜染料（formazan）。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。因此，在570nm测定吸光度时，由于颜色的不同导致吸光度不同，因而，可以对细胞数量进行定量。

实验材料：1640培养基、胰酶、血清、MTT化合物、DMSO、96孔板、细胞培养瓶和冻存管。

人癌细胞系：人肝癌细胞株Bele7402、HepG-2，宫颈癌细胞株HeLa、Caski，人非小细胞肺癌细胞株NCI-H460、SPC-A-I，人乳腺癌细胞株MCF-7，人卵巢癌细胞株SKOV3。

汉防己甲素(Tet)溶液：称取1.02mg汉防己甲素用甲醇配制成1μg/mL；

汉防己甲素没食子酸盐（NIP-hm）溶液：称取1.56mg NIP-hm用甲醇进行配制，相当含汉防己甲素为1μg/mL，含没食子酸为0.13μg/mL；

没食子酸(GA)溶液：用水配制成0.13μg/mL。

MTT溶液：5mg/L，用PBS（pH 7.2）进行配置，-20℃避光保存。使用浓度为0.5mg/mL。

实验中除汉防己甲素没食子酸盐（NIP-hm）为以实施例1-5方法制备得到外，其余材料和试剂均商购得到。

实验方法：

（1）复苏细胞：将细胞从液氮罐中取出，立即置于40℃水中，待细胞融化后，加入含有5mL 10％血清的1640培养基中，孵箱中培养4-5h，弃尽旧的培养基，加入新鲜的10％血清的1640培养基中。

（2）当细胞密度达到100％时，以1:3进行传代，其中2瓶冻存，1瓶用于后续实验。

（3）细胞密度达到100％时，细胞毒性实验每孔加入100μl 5000个细胞(具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等因素决定，但是最少不能少于2500个细胞/孔，最多不能多于25000个细胞/孔)。

（4）培养24h后，分别加入5个浓度的药物达到终浓度分别为0.3ng/mL、3.3ng/mL、33ng/mL、110ng/mL、330ng/mL，每个浓度做5个复孔，余下的孔做空白对照和阴性对照（未加药物的正常细胞），分别取与药物作用48h和72h，每孔加入10μl MTT溶液，作用4h后，吸尽上清，加入150μl DMSO，37℃放置15min，震荡，沉淀溶解后，570nm测定OD值。

肿瘤细胞生长抑制率％=（对照组平均OD值-实验组平均OD值）/对照组平均OD值×100％

浓度大于110ng/mL，肿瘤抑制率小于50％认为无效。

实验结果：

实验结果如表3所示，NIP-hm(汉防己甲素没食子酸盐)对NCI-H460、SPC-A-I，SKOV-3、MCF-7、Bele7402、HepG2、HeLa、Caski等8种肿瘤株细胞体外的增殖有明显的抑制作用，72h的IC₅₀分别为：72h的IC₅₀分别为：21.8ng/mL(NCI-H460)、87.1ng/mL(SKOV-3)、32.9ng/mL(MCF-7)、38.2ng/mL(Bele7402)、27.4ng/mL(HeLa)、17.8ng/mL(SPC-A-I)、13.3ng/mL(Caski)、31.1ng/mL(HepG2)。

Tet对体外NCI-H460、SPC-A-I、SKOV-3、Bele7402、HeLa、Caski等6种肿瘤株细胞体外的增殖有明显的抑制作用，72h的IC₅₀分别为：108.8ng/mL(NCI-H460)、183.7ng/mL(SKOV-3)、499.8ng/mL(Bele7402)、75.3ng/mL(HeLa)、8.2ng/mL(SPC-A-I)、46.3ng/mL(Caski)。

GA在与NIP-hm同等浓度下对上述NCI-H460、SKOV3、MCF-7、Bele7402、HeLa、SPC-A-I、Caski、HepG-2等8种肿瘤株细胞体外的增殖作用不显著。表明GA的体外抑制肿瘤增长作用所需浓度要高于NIP-hm，也显示GA抗肿瘤作用强度明显小于NIP-hm。据文献报道（中医药信息，2011，28(1)，109-111），GA对多种致癌、促癌物有抵抗作用，其作用机制是对肿瘤形成各阶段都有预防和抑制作用，其作用机制显示通过体内多途径发挥作用，但在体外作用所需浓度较高。

比较二者的作用，NIP-hm对体外肿瘤细胞株体外的增殖抑制强度明显高于Tet，IC₅₀明显下降。

从表3试验结果，可以看出本发明的NIP-hm具有明显的抗肿瘤作用，其作用明显优于Tet及GA。以高浓度330ng/mL作用72h为例分析，可以看出Tet、GA对各瘤株的抑制作用分别为：NCI-H460（62.4%、40.7%）、SKOV3（69.4%、17.1%）、MCF-7（38.5%、8.1%）、Bele7402（50.9%、29.2%）、HeLa（86.1%、16.8%）、SPC-A-I（65.0%、31.9%）、Caski（72.1%、54.5%）、HepG-2（22.8%、68.8%）。本发明的NIP-hm对各瘤株的抑制作用分别为：NCI-H460（89.6%）、SKOV3（86.8%）、MCF-7（90.4%）、Bele7402（86.4%）、HeLa（90.7%）、SPC-A-I（81.1%）、Caski（92.6%）、HepG-2（80.1%），可见Tet引入GA后各瘤株的抑制作用明显增加，表明引入GA后，抗肿瘤作用增强，具有明显协同增效作用。

表3体外抗肿瘤实验结果

实施例9、抗高血压研究

实验方法：雄性Wistar大鼠10只（购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号:SCXK(京)2006-0009），测量其血压值并作为空白对照组；雄性SHR大鼠50只（购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号:SCXK(京)2006-0009），测量其血压值，根据血压随机分为5组，分别为模型对照组、阳性对照组（氨氯地平）、汉防己甲素(Tet)组、NIP-hm低剂量组、NIP-hm高剂量组，每组10只。分组第2天开始给药，空白对照组和模型对照组灌胃给予0.5％羧甲基纤维素钠（0.5％CMC-Na）水溶液，阳性对照组灌胃给予氨氯地平混悬液（用药剂量为5mg/kg，水为溶剂），Tet组灌胃给予Tet混悬液（用药剂量为50mg/kg，水为溶剂），NIP-hm低剂量及高剂量组分别灌胃给予对应浓度的NIP-hm混悬液（用药剂量为39mg/kg及78mg/kg，水为溶剂），每天给药1次，连续给药14d。测量动物血压。

实验结果：如表4所示，Tet组、NIP-hm低剂量组及高剂量组与模型对照组比较，收缩压均显著降低（P<0.01、P<0.05、P<0.01），说明Tet、NIP-hm低剂量及高剂量组均表现出了明显的降血压作用，而从各组收缩压平均值的大小来看，NIP-hm低剂量（39mg/kg的NIP-hm与25mg/kg Tet为等摩尔剂量）组与Tet组的降压作用相当；NIP-hm高剂量组（78mg/kg的NIP-hm与50mg/kgTet为等摩尔剂量）降压作用明显强于Tet组。

结论：Tet具有显著的降低收缩压作用，与之对应的等摩尔剂量的NIP-hm（NIP-hm高剂量组）也具有显著的降低收缩压作用，作用程度比Tet明显增强。NIP-hm低剂量也具有相当的降低收缩压作用，表明要达到同样的降压效果，可使用较低剂量的NIP-h。两方面的数据均表明NIP-hm的生物利用度提高了。

表4药物对SHR大鼠收缩压的影响（n=10）

注：与空白对照组比较，ΔP<0.05,ΔΔP<0.01,ΔΔΔP<0.001；

与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

实施例10、抗炎作用研究

实验方法：雄性ICR小鼠60只（购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号:SCXK(京)2006-0009），体重18-22g，按体重随机分为6组，每组10只。分别为：（1）空白对照组；（2）阳性对照组；（3）汉防己甲素(Tet)组；（4）没食子酸(GA)组；(5)NIP-hm低剂量组；(6)NIP-hm高剂量组。实验前1天开始给药，药物溶剂均为水，空白对照组小鼠灌胃给予0.5％CMC-Na溶液，阳性对照组小鼠灌胃给予布洛芬溶液混悬液（100mg/kg），Tet组小鼠灌胃给予Tet混悬液（80mg/kg），GA组小鼠灌胃给予GA溶液（44mg/kg），NIP-hm低及高剂量组分别灌胃给予对应浓度的NIP-hm混悬液（62mg/kg及124mg/kg），上、下午各1次，第2天上午给药后，用清水洗净各鼠右耳并擦干，于各鼠右耳前后两面涂布100％二甲苯0.02mL/只，2h后，颈椎脱臼处死各鼠，沿耳廓基线剪下双耳，用9mm直径打孔器分别在同一部位打下圆耳片，称重。计算各小鼠肿胀度及各组肿胀抑制率，每鼠右耳片重量减去左耳片重量即为肿胀度，肿胀抑制率=（空白对照组肿胀度-给药组肿胀度）/空白对照组肿胀度×100％。

实验结果：如表5所示，空白对照组鼠耳肿胀度均值达到0.01293g，说明造模成功。与空白对照组比较，阳性对照组肿胀度显著降低（P<0.01），其肿胀抑制率为45％，汉防己甲素及NIP-hm高剂量组肿胀度均显著降低（P<0.01），肿胀抑制率分别为52％及59％，显示出其对二甲苯引起的急性炎症具有抑制作用。GA组肿胀抑制率为25％，与NIP-hm对应的等未显示出显著的炎症抑制作用。

上述结果表明，NIP-hm低剂量也具有相当的抗炎作用，表明要达到同样的抗炎作用效果，可使用较低剂量的NIP-hm，而与Tet、GA等摩尔剂量的高剂量的NIP-hm抗炎作用效果有明显提高。两方面的数据均表明NIP-hm的生物利用度提高了。

结论：Tet具有显著的抗炎作用，与之对应的等摩尔剂量的NIP-hm（高、低剂量组）也均具有显著的抗炎作用，且作用程度明显强于Tet。

表5对二甲苯引起的小鼠耳肿胀的影响（Mean±SD，n=10）

组别	剂量mg/kg	鼠耳肿胀度	肿胀抑制率（%）
				空白对照组	0.5％CMC-Na	0.01293±0.00479	-
阳性对照组	100	0.00709±0.00310**	45
				Tet组	80	0.00622±0.00368**	52
GA组	44	0.00970±0.00425	25
				NIP-hm低剂量组	62	0.00633±0.00290*	51
NIP-hm高剂量组	124	0.00530±0.00317**	59

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

实施例11、镇痛作用研究

实验方法：雄性ICR小鼠70只（购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号:SCXK(京)2006-0009），雌雄各半，体重18-22g，按体重随机分为7组，每组10只。分别为：（1）空白对照组；（2）模型对照组；（3）阳性对照组；（4）汉防己甲素(Tet)组；（5）没食子酸(GA)组；(6)NIP-hm低剂量组；(7)NIP-hm高剂量组。实验前1天开始给药，药物溶剂均为水，空白对照组及模型对照组小鼠灌胃给予0.5％CMC-Na溶液，阳性对照组小鼠灌胃给予布洛芬溶液混悬液（100mg/kg），Tet组小鼠灌胃给予Tet混悬液（80mg/kg），GA组小鼠灌胃给予GA溶液（44mg/kg），NIP-hm低及高剂量组分别灌胃给予对应浓度的NIP-hm混悬液（62mg/kg及124mg/kg），上下午各1次，第2天上午给药后1小时，各组小鼠腹腔注射0.6％醋酸0.2mL/只，空白对照组小鼠腹腔注射生理盐水0.2mL/只，记录15min内各组小鼠扭体次数及开始扭体的时间。

实验结果：如表6所示，与模型对照组比较，阳性对照组表现出较强的抑制小鼠扭体作用（P<0.001），Tet组、GA组、NIP-hm低及高剂量组均表现出显著的抑制扭体作用（P<0.05或P<0.01），显示出较好的镇痛作用。而就其扭体次数来看，NIP-hm高剂量组与Tet及GA组的镇痛作用基本相当。

上述结果表明，NIP-hm低剂量也具有相当的镇痛作用，表明要达到同样的镇痛作用效果，可使用较低剂量的NIP-hm，而与Tet、GA等摩尔剂量的高剂量的NIP-hm镇痛作用效果有明显提高。两方面的数据均表明NIP-hm的生物利用度提高了。

结论：Tet及GA具有显著的镇痛作用，与之对应的等摩尔剂量的NIP-hm（高、低剂量组）也均具有显著的镇痛作用，作用程度优于Tet及GA。

表6对醋酸引起的小鼠扭体反应的影响（Mean±SD，n=10）

组别	剂量mg/kg	开始扭体时间（s）	扭体次数
				空白对照组	0.5％CMC-Na	900±0	0±0
模型对照组	0.5％CMC-Na	157±28	43±18△△
				布洛芬组	100	566±360	5±6**
Tet组	80	240±238	36±13*
				GA组	44	334±301	29±13**
NIP-hm低剂量组	62	179±78	27±16*
				NIP-hm高剂量组	124	241±240	20±14**

注：与空白对照组比较，△P<0.05,△△P<0.01；与模型对照组比较：*P<0.05,**P<0.01

实施例12、急性毒性试验

（1）口服急性毒性比较

汉防己甲素(Tet)，为白色类白色粉末,临用时用0.5％CMC-Na配成所需浓度，临用新配。灌胃给药，给药体积为1mL/只。

结果如表7和表9所示，Tet小鼠一次性灌胃给药，LD₅₀=4.49g/kg。动物未出现死亡剂量LD₀=2.74g/kg。

NIP-hm，为白色类白色粉末，临用时用0.5％CMC-Na配成所需浓度，临用新配。灌胃给药，给药体积为1mL/只。

结果如表8和表9所示，NIP-hm最大耐受量为4.32g/kg（相当于Tet的量2.81g/kg），动物未出现死亡。

结论：NIP-hm和Tet毒性比较，不死亡剂量接近，NIP-hm为最大耐受量4.32g/kg（相当于Tet的量2.81g/kg），Tet为LD₅₀=4.49g/kg，动物未出现死亡剂量LD₀=2.74g/kg。相对来说，NIP-hm毒性减小。

表7Tet小鼠灌胃给药后死亡及分布情况表

表8NIP-hm小鼠灌胃给药后死亡及分布情况表

表9Tet小鼠和NIP-hm小鼠的口服毒性比较结果

	Tet	NIP-hm	相当于Tet量
				途径	i.g	i.g	--
溶媒	0.5％CMC_Na混悬	0.5％CMC-Na混悬	--
				LD₅₀	4.49g/kg	--	4.49g/kg
LD₀	2.74g/kg	最大耐受量4.32g/kg	2.81g/kg

（2）注射急性毒性比较

实验方法：NIP-hm和Tet，为白色类白色粉末，临用时用橄榄油配成所需浓度，临用新配。小鼠一次皮下注射给药，给药体积为0.5mL/只。

结果：如表10所示，Tet一次性皮下注射最大给药量为0.925g/kg，NIP-hm一次性皮下注射最大耐受量为1.02g/kg（相当于Tet的量0.663g/g），注射的毒性略有变化。

结论：药物采用橄榄油配制成注射剂，Tet S.C的最大给药量为0.925g/kg，NIP-hmS.C的最大给药量为1.02g/kg（相当于Tet的量为0.663g/kg），认为注射能达到Tet的剂量为0.663g/kg，给与的量降低，均未观察到明显的毒性及变化。

表10NIP-hm和Tet的注射毒性比较

	Tet	NIP-hm	相当于Tet量
				途径	s.c	s.c
溶媒	橄榄油混悬	橄榄油混悬
				LD₅₀	--	--	--
最大耐受量	0.925g/g	1.02g/kg	0.663g/g

本发明申请的保护权限并不仅限于此，并且在不背离其基本特征的条件下本发明也可以其它形式体现，因此本发明实施方案和事实事例总的来说是说明性的、而不是限制性的，保护范围应按照权利要求书而不是按照上述说明确定，因此所有在权利要求的含义及其等同范围内的变化都应该包括在本发明范围中。

Claims

1.一种汉防己甲素没食子酸盐，其化学结构式如式I所示：

2.一种药物组合物，包括权利要求1所述的汉防己甲素没食子酸盐及药学上可接受的辅料。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于：所述辅料为药学领域常规的稀释剂、赋形剂、崩解剂、防腐剂、增稠剂、增溶剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂，香味剂、甜味剂及色素中的一种或几种的混合物。

4.根据权利要求2或3所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、糖浆、注射剂、软膏剂、栓剂或吸入剂。

5.权利要求1所述的化合物或权利要求2或3或4所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途，所述肿瘤为肺癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌或宫颈癌。

6.权利要求1所述的化合物或权利要求2或3或4所述的组合物在制备降血压药物中的用途。

7.权利要求1所述的化合物或权利要求2或3或4所述的组合物在制备抗炎药物或镇痛药物中的用途。

8.一种制备权利要求1所述汉防己甲素没食子酸盐的方法：

室温，避光，将汉防己甲素悬浮于极性溶剂中，搅拌下，加入溶于无水乙醇的没食子酸在20-40℃下进行反应，反应完毕，浓缩，抽滤，洗滤饼，干燥，得到汉防己甲素没食子酸盐。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述汉防己甲素与没食子酸的摩尔比为1:2-4；所述汉防己甲素与无水乙醇的质量/体积比为1:50-100。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述汉防己甲素与没食子酸的摩尔比为1:2.2。

11.根据权利要求8或9或10所述的制备方法，其特征在于：所述汉防己甲素与没食子酸的反应时间为24-30小时。