13a_ (S)去氧娃儿藤宁的盐、 其制法和药物组合物与用途 技术领域
本发明涉及一种 13a-(S)去氧娃儿藤宁的盐, 13a-(S)去氧娃儿藤宁的盐的制 备方法, 含有它们的药物组合物以及这类化合物在制备预防和 /或治疗癌症和 / 或炎症疾病的药物中的应用。
背景技术
菲并吲哚里西啶生物碱主要分布于萝摩科娃儿藤属植物中,具有多种药理活 性, 其中的抗肿瘤作用和抗炎作用令人关注。 在美国国家癌症研究院 (NCI) 抗 肿瘤筛选中发现, 这类生物碱对于 60种肿瘤细胞株具有显著的作用, 半数生长 抑制剂量 (GI5Q ) 在 10_8M水平, 并且对于恶性肿瘤, 比如黑色素瘤和肺癌细胞 有良好的选择性, 对于耐药癌细胞系有效, 并且与其它抗癌药没有交叉耐药性。
(+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁 (已申请化合物专利, 申请号 200610076298.X) 是分离于萝摩科娃儿藤属植物三分丹中一个菲并吲哚里西啶生物碱,具有很强的 抗肿瘤活性, 体外实验表明这个化合物对 Ketr3、 HCT-8、 A549、 BGC-803 Bel-7402、 B 16BL6、 KB、 CaSE-17、 HL-60肿瘤细胞株的 IC5。在 0.1~0.3μΜ之 间, 说明(+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁具有体外抗肿瘤作用。 体内试验表明 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁对于小鼠肝癌 H22和小鼠 Lewis肺癌的生长具有明显的 抑制作用,表明其在体内仍然具有较好的抗肿瘤活性。初步的毒性实验表明本化 合物毒性较低, 未表现出肝、 肾毒性。
对这类化合物抗肿瘤活性的作用机理的研究表明, 其对于细胞的 DNA和 RNA以及蛋白质的合成皆有影响 Bioorg Med Chem Lett. 2006, 16: 4300-4304. ) , 进一步分子药理学的研究表明,其作用机理与临床应用的各种抗肿瘤药的作用机 理截然不同,这类化合物对于影响 RNA转录过程的 F-κΒ信号通路具有选择性 的强效抑制作用, 并且这种作用强度与其细胞毒活性的强度相互对应 [Mo/ Cancer Ther. 2006, 5(10):2484-2493.] , 但具体的作用靶点还在研究之中。
这类化合物的抗炎作用也与其抑制 F-κΒ信号通路有关, 而此作用又与其 阻断 F-κΒ 信号通路上游的 MEKK1 的作用密切相关 [Mol Pharm. 2006,69(3):749-758.] , 但具体的作用靶点还是未知的。 但是 (+)-13a-(S)-去氧娃儿 藤宁的脂溶性较高, 不溶于水。 发明内容
本发明的要解决的技术问题在于提供通式 (I)所示的 13a-(S)去氧娃儿藤宁的 盐、 及其药效学上可接受的水合物或前体药物。
本发明要解决的又一技术问题在于提供制备通式 (I) 所示的 13a-(S)去氧娃 儿藤宁的盐、 及其药效学上可接受的水合物或前体药物的方法。
本发明要解决的又一技术问题在于提供一种药物组合物,其包括至少一个通 式 (I) 所示的 13a-(S)去氧娃儿藤宁的盐、及其药效学上可接受的水合物或前体药 物及其药用载体和 /或赋形剂。
本发明要解决的再一技术问题在于提供通式 (I) 所示的 13a-(S)去氧娃儿藤 宁的盐、 及其药效学上可接受的水合物或前体药物在制备用于预防和 /或治疗癌 症和 /或炎症药物中的应用。 为解决上述技术问题, 本发明采用的技术方案为:
本发明系关于如式 (I) 之化合物:
( I )
其中, HX代表有机酸或者无机酸;
当 HX代表无机酸时, 其可以包括, 但并不限于盐酸、硫酸、磷酸、氢溴酸、 硝酸; 当 HX代表有机酸时, 其可以包括, 但并不限于酒石酸、 枸橼酸、 马来酸、
乳酸、 水杨酸、 苹果酸、 苯甲酸、 己二酸、 富马酸、 琥珀酸、 磺酸、 藻酸、 氨基 酸、 乙酰苯甲酸、 叶酸、 N-环己基氨基磺酸、 聚半乳糖醛酸、 甲磺酸、 对甲苯磺 酸、 枸杞酸、 柠檬酸。 优选的有机酸选自酒石酸、 枸橼酸、 马来酸、 乳酸、 水杨酸、 苹果酸、 苯甲 酸、 己二酸、 富马酸、 琥珀酸。 根据本发明, 优选的通式 (I)所示的 13a-(S)去氧娃儿藤宁的盐包括, 但不限 定于通式 (IA)所示的化合物:
( IA)
其中, HX优选自酒石酸、 枸橼酸、 马来酸、 乳酸。 根据本发明, 优选的 13a-(S)去氧娃儿藤宁的盐包括, 但不仅限于以下化合
CAT-1 具体操作包括如下步骤: 将等当量的 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁 (CAT-1 ) 和相应的酸 HX悬浮于无水 乙醇中, 在 50°C下搅拌反应 30分钟, 反应液变澄明, 将反应液放冷至室温, 蒸 干后得到相应的盐固体。
得到的固体用乙醇重结晶纯化。
本发明中 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁的制备参照专利《右旋去氧娃儿藤宁, 其 制法和其药物组合物与用途》 (申请号 200610076298.X) 和专利 《13a-(S) 去氧 娃儿藤宁衍生物, 其制法和药物组合物与用途》(申请号 200910079163.2)。通过 与相应的酸成盐, 其活性得到保持, 药代动力学性质得到优化。 本发明还涉及一种含有药物有效剂量的如通式 I所述的 13a- (S)去氧娃儿藤 宁的盐和药学上可接受的载体的药物组合物。
本发明还涉及含有作为活性成份的 13a-(S)去氧娃儿藤宁的盐和常规药物赋 形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有 0.1〜95重量%的 13a-(S) 去氧娃儿藤宁的盐。 在单元剂型中 13a-(S)去氧娃儿藤宁的盐一般含量为 0.1〜 lOOmg, 优选的单元剂型含有 4〜50mg。
13a_ (S)去氧娃儿藤宁的盐的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。 用 于此目的时, 如果需要, 可将 13a_ (S)去氧娃儿藤宁的盐与一种或多种固体或液 体药物赋形剂和 /或辅剂结合, 制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或 剂量形式。
13a_ (S)去氧娃儿藤宁的盐或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药, 给药途径可为肠道或非肠道, 如口服、 肌肉、 皮下、 鼻腔、 口腔粘膜、 皮肤、 腹 膜或直肠等。
13a_ (S)去氧娃儿藤宁的盐或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给
药。 注射包括静脉注射、 肌肉注射、 皮下注射、 皮内注射和穴位注射等。
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、 微粒剂型、 乳剂剂型、 混悬剂型。 其他剂型例如片剂、 胶囊、 滴丸、 气雾剂、 丸 剂、 粉剂、 溶液剂、 混悬剂、 乳剂、 颗粒剂、 栓剂、 冻干粉针剂等。
13a_ (S)去氧娃儿藤宁的盐可以制成普通制剂、 也可以是缓释制剂、 控释制 剂、 靶向制剂及各种微粒给药系统。
例如为了将单位给药剂型制成片剂, 可以广泛使用本领域公知的各种载体。 关于载体的例子是, 例如稀释剂与吸收剂, 如淀粉、 糊精、 硫酸钙、 乳糖、 甘露 醇、 蔗糖、 氯化钠、 葡萄糖、 尿素、 碳酸钙、 白陶土、 微晶纤维素、 硅酸铝等; 湿润剂与粘合剂, 如水、 甘油、 聚乙二醇、 乙醇、 丙醇、 淀粉浆、 糊精、 糖浆、 蜂蜜、葡萄糖溶液、 阿拉伯胶浆、 明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、 甲基纤维素、 磷酸钾、 聚乙烯吡咯烷酮等; 崩解剂, 例如干燥淀粉、 海藻酸盐、 琼脂粉、 褐藻 淀粉、 碳酸氢钠与枸橼酸、 碳酸钙、 聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、 十二烷基磺酸 钠、 甲基纤维素、 乙基纤维素等; 崩解抑制剂, 例如蔗糖、 三硬脂酸甘油酯、 可 可脂、 氢化油等; 吸收促进剂, 例如季铵盐、 十二烷基硫酸钠等; 润滑剂, 例如 滑石粉、 二氧化硅、 玉米淀粉、 硬脂酸盐、 硼酸、 液体石蜡、 聚乙二醇等。 还可 以将片剂进一步制成包衣片, 例如糖包衣片、 薄膜包衣片、 肠溶包衣片, 或双层 片和多层片。
例如为了将给药单元制成丸剂,可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于 载体的例子是, 例如稀释剂与吸收剂, 如葡萄糖、 乳糖、 淀粉、 可可脂、 氢化植 物油、 聚乙烯吡咯烷酮、 单硬脂酸甘油脂、 高岭土、 滑石粉等; 粘合剂, 如阿拉 伯胶、 黄蓍胶、 明胶、 乙醇、 蜂蜜、 液糖、 米糊或面糊等; 崩解剂, 如琼脂粉、 干燥淀粉、 海藻酸盐、 十二烷基磺酸钠、 甲基纤维素、 乙基纤维素等。
例如为了将给药单元制成胶囊, 将有效成分 13a_ (S)去氧娃儿藤宁的盐与上 述的各种载体混合, 并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可 将有效成分 13a_ (S)去氧娃儿藤宁的盐制成微囊剂, 混悬于水性介质中形成混悬 剂, 亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。
例如, 将 13a_ (S)去氧娃儿藤宁的盐制成注射用制剂, 如溶液剂、 混悬剂溶 液剂、 乳剂、 冻干粉针剂, 这种制剂可以是含水或非水的, 可含一种和 /或多种 药效学上可接受的载体、 稀释剂、 粘合剂、 润滑剂、 防腐剂、 表面活性剂或分散
剂。 如稀释剂可选自水、 乙醇、 聚乙二醇、 1, 3-丙二醇、 乙氧基化的异硬脂醇、 多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂、肪酸酯等。另外, 为了制备等渗注射液, 可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油, 此外, 还可以添加常规 的助溶剂、 缓冲剂、 PH调节剂等。 这些辅料是本领域常用的。
此外, 如需要, 也可以向药物制剂中添加着色剂、 防腐剂、 香料、 矫味剂、 甜味剂或其它材料。
为达到用药目的,增强治疗效果,本发明的药物或药物组合物可用任何公知 的给药方法给药。
13a- (S)去氧娃儿藤宁的盐药物组合物的给药剂量取决于许多因素, 例如所 要预防或治疗疾病的性质和严重程度, 患者或动物的性别、 年龄、 体重、 性格及 个体反应, 给药途径、 给药次数、 治疗目的, 因此本发明的治疗剂量可以有大范 围的变化。 一般来讲, 本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。 可以根据 13a_ (S)去氧娃儿藤宁的盐组合物中最后的制剂中所含有的实际药物 数量, 加以适当的调整, 以达到其治疗有效量的要求, 完成本发明的预防或治疗 目的。 13a_ (S)去氧娃儿藤宁的盐的每天的合适剂量范围: 13a_ (S)去氧娃儿藤宁 的盐的用量为 0.001〜100mg/Kg体重,优选为 0.1〜60mg/Kg体重,更优选为 1〜 30mg/Kg体重,最优选为 2〜15mg/Kg体重。成人患者服用的 13a-(S)去氧娃儿藤 宁的盐每日为 10〜500mg, 优选为 20〜100mg, 可一次服用或分 2〜3次服用; 儿童服用的剂量按照每 kg体重 5〜30mg, 优选为 10〜20mg/kg体重。 上述剂量 可以单一剂量形式或分成几个, 例如二、三或四个剂量形式给药, 这受限于给药 医生的临床经验以及治疗手段的给药方案。13a-(S)去氧娃儿藤宁的盐或组合物可 单独服用, 或与其他治疗药物或对症药物合并使用。
本发明还涉及 13a- (S)去氧娃儿藤宁的盐在制备治疗癌症和 /或炎症疾病的 药物中的应用, 特别是在人结肠癌、 人胃癌、 人卵巢癌、 宫颈癌、 肝癌、 肺癌、 胰腺癌、 淋巴癌和神经交质瘤等癌症中的应用。
本发明的有益技术效果:
(+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁的脂溶性较高, 不溶于水, 在光照或者空气下容易 发生芳构化产生杂质, 通过将其成盐以后发现, 水溶性大幅度提高。
通过对 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁的盐进行体外活性筛选和药效学实验,发现 其抗肿瘤活性与原型化合物 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁的活性相当, 说明
(+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁成盐后期抗肿瘤活性得到保持。
通过对 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁的酒石酸盐、马来酸盐及枸橼酸盐进行后血 浆药代动力学研究, 发现实验小鼠对这些盐的吸收较快, 达峰时间短, 并且这些 盐在小鼠体内平均滞留时间(MRT)与 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁相比明显延长; 并且这些盐的生物利用度(AUC)与 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁相当或者提高, 比 如马来酸盐的生物利用度要明显高于原型药;小鼠口服 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁 酒石酸盐、马来酸盐及枸橼酸盐后,通过测定原型药在动物脑组织中的含量发现 酒石酸盐、 马来酸盐 3 个时间点的药物含量均高于原型药。 这说明 (+)-13a-(;s;)- 去氧娃儿藤宁成盐之后, 其药代动力学性质得到了优化。 附图说明
图 1 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁及其盐对 H22移植瘤生长的影响
图 2 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁及其盐对荷瘤 KM小鼠体重的影响
图 3 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁及其盐对 H22移植瘤生长的影响
图 4 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁小鼠血浆标准曲线
图 5 小鼠口服 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁三种盐及原型药 (6mg/kg) 血浆药时曲 线
图 6 小鼠口服 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁酒石酸盐 (6mg/kg) 后脑组织药物含量 图 7 小鼠口服 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁马来酸盐 (6mg/kg) 后脑组织药物含量 图 8 小鼠口服 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁枸橼酸盐 (6mg/kg) 后脑组织药物含量 具体实施方式
本发明实施例中所用的起始化合物, 可根据本领域的常规方法和 /或本领域 技术人员熟知的方法制备的, 并可按如下举例制备例制备。
下面的实施例用来进一步说明本发明, 但这并不意味着对本发明的任何限制。
英文缩写说明:
CTX: 环磷酰胺
LC/MS/MS: 液相质谱联用
DMSO: 二甲基亚砜
MRT(0-∞): 平均滞留时间
AUC(0-∞): 生物利用度
tl/2z: 半衰期
Tmax: 达峰时间
Cmax: 峰浓度
+CAT: C+)-13a-CS)-去氧娃儿藤宁 制备例: (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁的制备
参照专利 《右旋去氧娃儿藤宁, 其制法和其药物组合物与用途》 (申请号 200610076298.X) 和专利 《13a-(S) 去氧娃儿藤宁衍生物、 其制法和药物组合物 与用途》 (申请号 200910079163.2), 产物比旋光为 [o D° (c=0.25,CHCl3)= +102°, 66 = 99.1% [手性^)-11柱; 流动相: 异丙醇: 正己烷 (15: 85 ) , 0.1%三乙胺; λ= 254nm; t(major) =18.79min, t(minor) = 26.09 min], ESI-MS: 364.2 [M+H]+, 1H- MR (400 MHz, CDC13): 7.92(1H, d, J= 9.2Hz, H-l), 7.21(1H, dd, J= 9.2Hz, 2Hz, H-2), 7.88(1H, d, J= 2Hz, H-4), 7.90(1H, s, H-5), 7.12(1H, s, H-8), 4.00(3H, s, MeO), 4.04(3H, s, MeO), 4.09(3H, s, MeO), 4.62(1H, d, J= 14.8Hz, H-9), 3.71(1H, d, J= 14.8Hz, H-9), 3.45(1H, m, H-10), 3.39(1H, m, H-10), 2.98(1H, m, H-14), 2.57(1H, m, H-l 3 a), 2.53(1H, m, H-10), 2.24(1H, m, H-12), 2.04(1H, m, H-11), 1.93(1H, m, H-11), 1.78(1H, m, H-12)。 13C- MR(100 MHz, CDC13): 125.11(C-1), 114.83(C-2), 157.61(C-3), 104.55(C-4), 103.92(C-5), 149.42(C-6), 148.30(C-7), 103.02(C-8), 53.46(C-9), 54.91(C-10), 21.53(C-11), 31.03(C-12), 60.15(C13a), 33.03(C-14), 55.48(C3-OMe), 55.96(C6-OMe), 55.90(C7-OMe)以及环 B 碳: 123.34, 125.41, 125.42, 126.78, 130.39 (重叠一个碳信号)。 HRMS (ESI) calcd for [M]+ C23H26N03 363.1834, found 363.1852
实施例 1 : (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁 L-酒石酸盐 ( C AT- 1 Tartrate) 的合成
将反应物 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁 20mg和 L-酒石酸 8.26mg加至 5mL乙醇 中, 将反应液加热至回流, 搅拌 10分钟, 放冷至室温, 将反应液浓缩至 2mL, 放置, 可见有类白色的沉淀析出, 滤出得到固体 22mg, mp: 216~218°C , 产物 溶于水。 实施例 2: (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁马来酸盐 (CAT-l Maleate) 的合成
将反应物 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁 50mg和马来酸 16mg加至 10mL乙醇中, 将反应液加热至回流, 搅拌 10分钟, 可见溶液变澄明, 放冷至室温, 将反应液 浓缩至 5mL, 放置, 可见有浅黄色的沉淀析出, 滤出得到固体 45mg, mp : 126~128°C , 产物溶于水。 实施例 3: (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁枸橼酸盐 ( CAT- 1 citrate) 的合成
将反应物 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁 50mg和枸橼酸 29mg加至 10mL乙醇中, 将反应液加热至回流, 搅拌 10分钟, 可见溶液变澄明, 放冷至室温, 将反应液 浓缩至 5mL, 放置, 可见有浅黄色的沉淀析出, 滤出得到固体 60mg, mp : 142 144 °C, 产物溶于水。
实施例 4: (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁乳酸盐 ( CAT- 1 lactate) 的合成
将反应物 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁 50mg和乳酸 14mg加至 10mL乙醇中, 将反应液加热至回流, 搅拌 10分钟, 可见溶液变澄明, 放冷至室温, 将反应液 浓缩至 5mL, 放置, 可见有浅黄色的沉淀析出, 滤出得到固体 45mg, mp : 115~117°C, 产物溶于水。 实施例 5: (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁盐酸盐 (CAT-l hydrochlonde) 的合成
将 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁 20mg溶于二氯甲烷 5mL中,在搅拌下向溶液中 通入干燥的 HC1气体,可见溶液变成淡黄色,继续通 HC1气体,反应 30分钟后, 反应液蒸干, 得到白色固体 20mg, mp: 225~227°C。 实施例 6: (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁硫酸盐 ( CAT- 1 sulfate) 的合成
将反应物 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁 lg加至 5mL乙醇中, 在搅拌下向此反应 液中加入 20% (V/V) 硫酸的乙醇溶液 3mL, 将反应液加热至回流, 可见溶液 变澄明,放冷至室温,有浅白色的沉淀析出,滤出得到固体 l . lg, mp: 175~177°C。
溶解度 (水):
实验例 1: 体外抗肿瘤活性的测定 (MTT法)
为了测定 13a-(S)去氧娃儿藤宁的盐的体外抗肿瘤活性, 对本发明实施例中 制备的化合物进行了测定, 其实验步骤为:
1. 培养正常生长的肿瘤细胞, 以 lxl04cell/mL接种到 96孔板中(每孔 100μί), 在 37 °C, 5% C02培养箱中培养 24小时。
2. 分别添加被试化合物, 在 5%C02、 完全湿度培养箱中培养 5天。
3. 弃除培养液, 每孔加入 0.04%ΜΤΤ100μί, 同样条件下培养 4个小时。
4. 弃除培养液, 加入 DMSO (每孔 150μί), 混合后于测定波长 570nm, 参比 波长 450nm, 比色记录光吸收度, 计算化合物对肿瘤细胞生长的抑制率。 实验的结果如表 1所示:
表 1 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁有机酸盐的 MTT筛选结果:
IC50 (M)
样 品
A549 Bel7402 U251 BT325 A2780 Bgc823 Hct8
6.30X 6.00 X 1.30X 5. OX 8. IX 6.3 X 7.9 X 酒石酸盐
10-08 10-08 10-07 10-07 lo-08 lo-07 lo-08
1.40X 3.20X 6.30X 5.9X 5. OX 8.9X 5.8X 马来酸盐
10-07 10-08 10-08 10-07 lo-08 lo-07 lo-08
1.40X 4.00 X 9.50X 7.6 X 1.8X 1.3X 7.9 X 乳酸盐
10-07 10-08 10-08 10-07 lo-07 lo-06 lo-08
1.30X 3.70X 6.90 X 4.1X 4.9 X 4.0X 4.1X 枸橼酸盐
10-07 10-08 10-08 lo-07 lo-08 lo-07 lo-08
(+)-13a-(S)-
^ 4.00 X 3.80 X 7.10 X 5.4 X 5.4 X 5. I X 5.5 X 去氧娃儿藤 lo-08 lo-08 lo- 08 10-07 10- 08 10-07 10- 08 宁
注: A549: 人肺腺癌细胞; Bel-7402: 人肝癌细胞; U251 : 人脑胶质母细胞瘤细胞; BT325 : 人脑胶质母细胞瘤细胞; A2780: 人卵巢癌细胞; BGC-823 : 人胃癌细胞; HCT-8 : 人结 肠癌细胞。
从以上结果可以看出:
(+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁的有机酸盐与 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁一样具有 显著的体外抗肿瘤活性。 实验例 2 : (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁及其有机酸盐的体内药效学实验
为了测定 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁及其有机酸盐的药效学特征, 观察了 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁及其 3种有机酸盐对 H22荷瘤小鼠肿瘤生长的影响。
1、 实验动物
KM种清洁级小鼠, 雄性, 体重 18〜22g, 购自中国人民解放军军事医学科 学院实验动物中心, 动物合格证号: SCXK- (军) 2007-004。 每实验组设动物 6 只, 共计 10组, 60只动物。
2、 药物及剂量
(1), 受试样品
+)-13a-CS)-去氧娃儿藤宁 (+CAT )、 C+)-13a-CS)-去氧娃儿藤宁的酒石酸盐 ( Tartrate ) (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁的马来酸盐 (Malate) 和 (+)-13a-(S)-去氧 娃儿藤宁的枸橼酸盐 (Citrate), 均由中国医学科学院药物研究所植化室庾石山 研究员课题组提供; 阳性对照药环磷酰胺 (CTX) 购自北京友谊医院。
(+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁 (+CAT) MW: 363.45
(+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁的酒石酸盐 (Tartrate) MW: 513.54
(+;>-13a-(;s;)-去氧娃儿藤宁的马来酸盐 (Malate) MW: 479.52
(+;>-13a-(;s;)-去氧娃儿藤宁的枸橼酸盐 (Citrate) MW: 573.59
(2), 给药剂量
(+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁按高剂量 5mg/kg和低剂量 2.5mg/kg给予, 3 种 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁的盐按与 5mg/kg和 2.5mg/kg的 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤 宁同摩尔数折算后的量给予 (酒石酸盐 Tartrate为: 7.05mg/kg和 3.53mg/kg; 马
来酸盐 Malate为 6.60mg/kg禾 P 3.30mg/kg; 枸橼酸盐 Citrate为 7.90mg/kg和 3.95mg/kg), 于 H22接种 24小时候口服给药, 每日一次, 共 7次。 CTX腹腔注 射 100mg/kg, 于 H22接种 24小时给予一次。
3、 方法
实验动物进入 SPF级环境中饲养观察 24小时后, 无异常方可进入实验。 将 预先在 KM种小鼠腹腔复苏的 H22瘤液, 以无菌的生理盐水按 1: 3比例稀释。 将稀释液接种于实验小鼠左前肢皮下, 每只注射稀释后瘤液 0.2mL。所有动物注 射完毕后, 按实验要求随机分为 12组, 每组 6只。
于接种 24小时后开始给药, 4种受试药每日一次, 灌胃。 阳性对照药 CTX 腹腔注射, 一次。 每日记录动物体重。
4、 结果
表 2 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁及其盐对 H22移植瘤生长的影响
剂量 (mg/kg 动物数量 体重 (g) 肿瘤重量
组 抑制率(%)
Xd) (开始 /结束) (开始 /结束) (g, mean士 SD)
Control 6/6 21.83±1.47 1·15±0.35
/25.35±2.76
CTX (i.p.) 100X1 6/6 21.33±1.63 0·59±0.26 48.47*
/23.77±1.38
(+)-13a-(S)- 5.0X7 6/4 23.50±2.51 0·30±0.12 74.02** 去氧娃儿藤 /15.63±2.16
宁 -1
(+)-13a-(S)- 2.5X7 6/6 23.00±1.55 0·66±0.21 42.79* 去氧娃儿藤 /23.31±2.14
宁 -2
酒石酸盐 -1 7.05X7 6/6 22.00±1.55 0·23±0.15 80.35**
/13.55±1.87
酒石酸盐 -2 3.53X7 6/6 21.50±0.84 0·78±0.48 31.88
/19.76±2.34
马来酸盐 -1 6.60X7 6/4 21.17±0.98 0·30±0.24 73.58**
/13.62±2.08
马来酸盐 -2 3.30X7 6/6 22.50±1.05 0·62±0.31 45.56
/23.79±0.52
枸櫞酸盐 -1 7.90X7 6/5 22.00±1.55 0·22±0.13 80.44**
/14.27±2.61
枸櫞酸盐 -2 3.95X7 6/6 21.83 + 0.75 0·61±0.35 46.87*
/21.01±2.04
*ρ<0.05, ** ρ<0.01 与对照组比较
5、 结论
从以上结果可以看出:
(+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁的有机酸盐在高剂量用药时对实验动物肿瘤生长 的抑制率与原型药相比相当或者略高,在低剂量用药时对实验动物肿瘤生长的抑 制率与原型药相比略低, 但均大于对照药环磷酰胺 (CTX), 这说明 (+)-13a-(S)- 去氧娃儿藤宁与相应的有机酸成盐后, 其抗肿瘤活性得到保持。 实验例 2 : (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁及其硫酸盐的体内药效学实验 一、 目的
观察去氧娃儿藤宁的硫酸盐 (Sulfate) 对 H22荷瘤小鼠肿瘤生长的影响。 二、 实验动物
KM种清洁级小鼠, 雄性, 体重 18〜22g, 购自中国人民解放军军事医学科 学院实验动物中心, 动物合格证号: SCXK- (军) 2007-004。
三、 药物及剂量
1, 受试样品
受试样品由中国医学科学院药物研究所植化室庾石山研究员课题组提供;阳 性对照药环磷酰胺 (CTX) 购自北京友谊医院。
2, 给药剂量及给药方式
所有样品均采用口服给药方式, 每天一次, 给药体积 0.2ml/10g。
去氧娃儿藤宁的硫酸盐 (Sulfate) 采用 5个不同剂量组: 3mg/kg, 4mg/kg, 5mg/kg, 6mg/kg禾口 8mg/kg。
四、 方法
实验动物进入 SPF级环境中饲养观察 24小时后, 无异常方可进入实验。 将 预先在 KM种小鼠腹腔复苏的 H22瘤液, 以无菌的生理盐水按 1 : 3比例稀释。 将稀释液接种于实验小鼠左前肢皮下, 每只注射稀释后瘤液 0.2mL。所有动物注 射完毕后, 按实验要求随机分为 13组。 于接种 24小时后开始给药。
结果
表 1去氧娃儿藤宁的硫酸盐对 H22移植瘤生长的影响
Animal
Dose Tumor
No. Body Weight(g) Inhibition
Group (mg/k Weight
(Initial/Fi (Initial/Final) (%) g xd) (g, mean±SD)
nal)
Control 6/6 19.67±1 .21 1 .26±0.22
/26.17±5.38
CTX (i.p.) 100mg/kgx 6/6 20.67±2.07 0.07±0.04 94.76**
1 /25.00±2.37
Sulfate 3mg/kg 6/6 20.67±0.52 0.98±0.21 22.49*
■)
Sulfate 4mg/kg 6/6 20.00±1 .26 0.60±0.32 52.51 *
Sulfate 5mg/kg 6/6 19.83±1 .72 0.73±0.39 41 .75*
■)
Sulfate 6mg/kg 6/3 19.83±1 .72 0.40±0.24 68.52**
Sulfate 8mg/kg 6/0 20.67±1 .03 0.15+0.04 88.49**
1
wmmm m mmmm immmi 注: CAT的硫酸盐口服给药 6mg/kg剂量组给药第六•天死亡 1只,第七天死 2只, 停药。
CAT的硫酸盐口服给药 8mg/kg剂量组给药第 天死亡 3只,第七天死 3只, 停药。 本组瘤重和抑制率为给药第 7天剖解取得的瘤重数据。
*p<0.05, ** ρ<0.0 \ 与对照组比较 实验例 3 : (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁及其有机酸盐的后血浆药代动力学及脑组织 药物分布研究实验
为了观察 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁及其有机酸盐的药代动力学学特征,研究 了 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁及其 3 种有机酸盐后血浆药代动力学及脑组织药物 分布特性。
1、 试验动物
雄性 ICR小鼠, 体重为 20〜22g, 由北京维通利华实验动物技术有限公司提 供。 动物许可证编号: SCXK (京) 2007— 0001。
2、 试验药品
(+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁酒石酸盐, (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁马来酸盐, (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁枸橼酸盐由中国医学科学院药物研究所庾石山课题组 提供, 实验时用双蒸水配制成浓度 0.6 mg/ml溶液。
3、 试验方法
小鼠 72只, 分 3组, 每组 24只。 实验前禁食 16 h, 自由饮水。 小鼠口服不 同娃儿藤宁盐 (6 mg/kg) 后分别于 5、 15、 30 min、 1、 2、 3、 4、 6h取血, 离 心分离血浆。 另于小鼠口服娃儿藤宁盐后 5、 15 min、 2h取脑组织, 加入生理盐 水制成 25 %组织匀浆。 组织匀浆液和血浆样品 200 μΐ以等体积乙腈沉淀蛋白, 取上清液 5 μΐ进行 LC/MS/MS分析。
4、 试验结果
(1). 血浆标准曲线
(+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁以 DMSO溶解后再用甲醇稀释, 浓度分别为 10、 50、 100、 500、 1000、 2500 ng/ml。 在空白血浆 200 μΐ 中依次加入不同浓度 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁标准溶液 10 μ1,使 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁终浓度分别 为 0.5、 2.5、 5、 25、 50、 125 ng/ml, 加入 190μ1乙腈沉淀蛋白, 取上清液 5 μΐ 进行 LC/MS/MS 分析。 根据各样品图谱, 以 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁峰面积为 纵坐标,其浓度(ng/ml)为横坐标,进行线性回归, 结果见表 3, 图 4。在 0.5-125 ng/ml浓度范围内, 血浆样品中娃儿藤宁浓度与谱图峰面积线性关系良好, 相关 系数为 0.999。
表 3 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁小鼠血浆标准曲线
血浆样品
浓度 (ng/ml) 峰面积
0.5 2707
2.5 16732
5 34240
25 169854
50 310165
125 785030
(2). 小鼠口服 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁三种盐 (6 mg/kg) 后血浆药代动力学研 fl
小鼠口服 (+)- 13 a-(S)-去氧娃 J L藤宁酒石酸盐、马来酸盐及枸橼酸盐( 6mg/kg ) 后血浆药物浓度一时间数据见表 4〜6, 图 5。 小鼠口服 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁 三种盐后,吸收较快,给药后 5 min血中即可测到原形药,酒石酸盐 15min达峰, 达峰浓度为 34.2 ± 3.1 ng/ml,马来酸盐为 5min达峰,达峰浓度为 35.4 ± 3. 5ng/ml, 枸橼酸盐 15min达峰, 达峰浓度为 20.1 ± 12. 2ng/ml。药物在小鼠体内消除较快, 给药后 6h血药浓度均接近最低检测限。 根据小鼠口服 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁 盐的药时曲线, 应用 DAS程序采用非房室模型进行拟合, 药代动力学参数见表 7, C+)-13a-CS)-去氧娃儿藤宁三种盐在小鼠体内 MRTC0-∞)为 1.63~2.29h, 明显长 于原型药 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁 (0.8h)。 酒石酸盐、 马来酸盐、 枸橼酸盐的 AUC(0-∞)分别为 37.85, 49.91禾口 33.08 ug/L*h, 而原型药 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤 宁 AUC(0-∞)为 33.67ug/L*h。 马来酸盐的 AUC(0-∞)明显高于其它三种盐及原型 药 (+)-13a-(;s;)-去氧娃儿藤宁, 酒石酸盐和枸橼酸盐的 AUC(0-∞)和原型药接近。 表 4 小鼠口服 C+)-13a-CS)-去氧娃儿藤宁酒石酸盐 (6 mg/kg, 11.7uM) 血浆药物 浓度
娃儿藤宁血药浓度 (ng/ml)
frJ |0J i. mm )
1 2 3 Mean士 SD
0.08 18.4 11.7 42.0 24.0±15.9
0.25 30.6 36.1 35.7 34.2±3.1
0.5 16.5 9.0 7.8 11.1±4.7
1 6.2 10.0 丢失 8.1±2.7
2 2.5 12.4 8.7 7.9±5.0
3 3.0 5.0 5.3 4.5±1.2
4 3.3 4.2 1.1 2.8±1.6
6 0.0 0.2 0.8 0.4±0.4
小鼠口服 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁马来酸盐(6 mg/kg, 12.5uM)血浆药物浓 娃儿藤宁血药浓度 (ng/ml)
H、J | 0J min
1 2 3 Mean士 SD
0.08 丢失 33.0 37.9 35.4±3.5
0.25 24.2 23.5 34.6 27.4±6.2
0.5 15.7 13.0 7.9 12.2±4.0
1 12.5 6.2 8.7 9.2±3.2
2 2.0 15.9 15.7 11.2±8.0
3 3.6 16.1 6.3 8.6±6.6
4 2.6 2.0 3.8 2.8±0.9
6 2.3 1.0 0.4 1.2±1.0 表 6 小鼠口服 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁枸橼酸盐(6 mg/kg, 10.5uM)血浆药物浓 度
娃儿藤宁血药浓度 (ng/ml)
H、J | 0J min
1 2 3 Mean士 SD
0.08 30.5 18.0 4.6 17.7±13.0
0.25 25.5 28.7 6.1 20.1±12.2
0.5 20.1 8.4 9.3 12.6±6.5
1 11.2 5.4 8.5 8.4±2.9
2 5.6 7.6 9.6 7.6±2.0
3 2.8 2.3 4.7 3.3±1.3
4 1.1 0.9 2.6 1.5±0.9
6 1.4 4.8 0.1 2.1±2.4
表 7 小鼠口服 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁盐 (6 mg/kg) 血浆药动学参数 参数 单位 参数值
酒石酸盐 马来酸盐 枸橼酸盐 原型药
AUC(O-t) ug/L*h 37.39 46.87 32.70 33.34
AUC(0-∞) ug/L*h 37.85
33.67
MRT(O-t) h 1.57 1.78 1.73 0.77
MRT(0-∞) h 1.63 2.18 2.29 0.80 tl/2z h 0.88 1.72 0.86 0.44
Tmax h 0.25 0.08 0.25 0.25
Cmax ug/L 34.17 m 41.53
.寸
(3). 小鼠口服 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁三种盐(6 mg/kg)后药物的脑组织分布研 fl
ο
小鼠口服 (+)- 13 a-(S)-去氧娃 J L藤宁酒石酸盐、马来酸盐 ο及枸橼酸盐( 6mg/kg ) 后脑组织药物浓度一时间数据见表 8〜10, 图 6〜8。 结果表明, 小鼠口服 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁盐后, 药物较易进入脑组织。 给药后 5 min, 脑组织中 即可测到原形药。 给药后 15min, 脑组织出现分布高峰。 给药 2h后, 脑组织中 仍能维持一定药物水平。娃儿藤宁酒石酸盐、马来酸盐 3个时间点的药物含量均 高于原型药, 枸橼酸盐的含量则低于原型药。 表 8 小鼠口服 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁酒石酸盐 (6 mg/kg) 脑组织药物含量
(+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁脑组织含量 (ng/g) 时间 (min)
1 2 3 Mean士 SD
5 32.4 38.8 72.7 48.0±21.6
15 249.3 271.0 268.5 262.9±11.9
120 24.7 28.7 83.7 45.7±33.0
表 9 小鼠口服 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁马来酸盐 (6 mg/kg) 脑组织药物含 j 时间 (min)
Mean士 SD
5 245.2 82.5 122.7 150.2±84.8
15 159.3 96.6 194.9 150.3±49.8
120 27.2 173.7 125.4 108.8±74.7
表 10 小鼠口服 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁枸橼酸盐 (6 mg/kg) 脑组织药物含量 娃儿藤宁脑组织含』齔 (ng/g)
H、J |0J min
1 2 3 Mean士 SD
5 22.0 37.1 11.8 23.6±12.7
15 84.8 138.7 38.5 87.3±50.1
120 37.0 44.8 64.4 48.7±14.1
5、 结论
小鼠口服 (+)- 13 a-(S)-去氧娃 J L藤宁酒石酸盐、马来酸盐及枸橼酸盐( 6mg/kg ) 后, 吸收较快, 达峰时间为 5〜30min, 达峰浓度为 18.0〜35.4ng/ml, (+)-13a-(S)- 去氧娃儿藤宁三种盐在小鼠体内 MRT(0-∞)为 1.63~2.29h, 明显长于原型药 +)-13a-CS)-去氧娃儿藤宁 (0.8h)。 酒石酸盐、 马来酸盐、 枸橼酸盐的 AUCCO-oo) 分别为 37.85 , 49.91和 33.08 ug/L*h,而原型药 (+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁 AUC(0-∞) 为 33.67ug/L*h, 其中马来酸盐的 AUC(0-∞)明显高于其它两种盐及原型 (+)-13a-(;s;)-去氧药娃儿藤宁, 酒石酸盐和枸橼酸盐的 AUC(0-∞)和原型药接近。
小鼠口服 (+)- 13 a-(S)-去氧娃 J L藤宁酒石酸盐、马来酸盐及枸橼酸盐( 6mg/kg ) 后 5 min, 脑组织中即可测到原形药。 给药后 15 min, 脑组织出现分布高峰。 给 药 2h后, 脑组织中仍能维持一定药物水平。(+)-13a-(S)-去氧娃儿藤宁酒石酸盐、 马来酸盐 3个时间点的药物含量均高于原型药, 枸橼酸盐的含量低于原型药。