KR101208956B1

KR101208956B1 - 엘로티닙 다이클로로아세트산염 및 이를 포함하는 항암제 조성물

Info

Publication number: KR101208956B1
Application number: KR1020100068603A
Authority: KR
Inventors: 김경수; 박영준; 송현남; 김동연; 김준우; 조경석; 유기원; 권혁진
Original assignee: 주식회사 셀트리온제약; 주식회사 셀트리온화학연구소
Priority date: 2010-07-15
Filing date: 2010-07-15
Publication date: 2012-12-06
Also published as: WO2012008711A3; KR20120007848A; WO2012008711A2

Abstract

본 발명은 엘로티닙 다이클로로아세트산염 및 이를 포함하는 항암제 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 엘로티닙 다이클로로아세트산염은 상피세포 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor)를 억제할 뿐만 아니라 아포토시스(apoptosis)를 통해 암세포가 스스로 소멸되도록 유도함으로써 암의 성장을 억제하고 궁극적으로는 암세포를 소멸시킬 수 있으며, 엘로티닙과 다이클로로아세트산의 강력한 시너지 효과를 통해 항암효과를 현저히 증가시킬 수 있다.

Description

엘로티닙 다이클로로아세트산염 및 이를 포함하는 항암제 조성물 {Erlotinib dichloroacetate and anti-cancer agent comprising the same}

본 발명은 엘로티닙 다이클로로아세트산염 및 이를 포함하는 항암제 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 상피세포 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor)의 억제활성 뿐만 아니라 아포토시스(apoptosis)를 통해 암세포가 스스로 소멸되도록 유도함으로써 암의 성장을 억제하고 궁극적으로는 암세포를 소멸시킬 수 있으며, 엘로티닙과 다이클로로아세트산의 시너지 효과를 통해 항암효과가 현저히 증가된 엘로티닙 다이클로로아세트산염 및 이를 포함하는 항암제 조성물에 관한 것이다.

엘로티닙(Erlotinib)은 하기 화학식 (Ⅱ)로 표시되는 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민의 일반명으로 미국특허등록 제5747498호 및 대한민국특허등록 제0232335호에 개시되어 있다. 엘로티닙은 이전 화학요법에 실패한 국소진행형 또는 전이성 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)의 치료에 사용되거나, 젬시타빈과 병용하여 국소적, 제거 불가능한, 또는 전이성 췌장암의 치료에 사용되고 있다.

미국특허등록 제6900221호에는 하기 화학식 (Ⅲ)으로 표시되는 엘로티닙 염산염의 결정형 A와 결정형 B에 대해 개시되어 있으며, 결정형 B가 열역학적으로 더 안정하다고 언급되어 있다. 구체적으로, 엘로티닙은 하기 화학식 (III)으로 표시되는 엘로티닙 염산염으로 제조되어 많은 국가에서 타쎄바(TARCEVA)라는 상품명으로 시판되고 있다.

미국특허등록 제6706721호는 엘로티닙 메탄술폰산염의 무수물 및 수화물을 개시하고 있다. 또한 국제특허공개 제08122776호 및 대한민국특허출원 제2009-7022954호에는 엘로티닙 및 그의 약학적으로 허용 가능한 염의 제조방법이 개시되어 있는데, 구체적으로는 약학적으로 허용 가능한 산부가염으로서 염산, 브롬산, 황산, p-톨루엔술폰산, 벤조산, 시트르산, 타르타르산, 숙신산, 옥살산, 벤젠술폰산, 메탄술폰산, 인산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 산과의 부가염이 기술되어 있다. 그러나 상기한 특허문헌들에는 엘로티닙 산부가염의 열이나 수분에 대한 안정성이나 흡습성과 같은 물리화학적 성질에 대해서는 전혀 언급되어 있지 않고 있다.

현재까지의 연구결과들은 엘로티닙이 암환자의 생명연장을 위한 유용한 치료제이기는 하나, 엘로티닙의 단독요법으로 암의 완치를 가능하게 하지는 않는 것으로 보고하고 있다. 또한 엘로티닙은 다른 항암제들처럼 투여 중에 내성이 발생할 뿐만 아니라, 투여 중 부종, 피로, 불안, 두통, 우울, 현기증, 불면, 발진, 가려움증, 피부건조, 홍반, 설사, 식욕부진, 오심, 구토, 점막염, 설통, 구내염, 구강건조증, 통증, 변비, 소화불량, 연하장애, 체중감소, 복통, 미각장애, 고빌리루빈혈증, 관절통, 감각이상, 결막염, 건성각결막염, 호흡곤란, 기침, 감염 등이 10% 이상의 높은 빈도로 나타나는 문제점이 있다. 이러한 한계를 극복하는 한 가지 방법으로 엘로티닙과 함께 항암효과를 보완해줄 수 있는 또 다른 약물을 동시에 투여하는 병용투여 요법들이 제시되고 있다. 그러나 이러한 병용제제로도 암세포를 궁극적으로 소멸시킬 수 있는 방법을 제시하지 못하고 있으며, 두 가지의 활성성분을 복합제로 투여시 동일 투약 단위 내에 두 가지 물질을 완전히 균일하게 혼합하는 것이 어려운 문제점도 존재하고 있다.

한편, 다이클로로아세트산은 아세트산의 유도체로 메틸기의 세 개의 수소원자 중 2개가 염소원자로 치환된 구조를 가지고 있으며, 유산증(lactic acidosis)과 암의 치료에 효능이 있는 물질이다. 그러나 다이클로로아세트산 자체는 강한 부식성을 가지고 있으며 점막과 상기도 조직에 손상을 주기 때문에 다이클로로아세트산 나트륨염이나 다이클로로아세트산 칼륨염과 같은 염의 형태로 사용되고 있다.

구체적으로 다이클로로아세트산염은 피루베이트 데하이드로게나제 카이나제(pyruvate dehydrogenase kinase)를 저해하여 피루베이트 데하이드로게나제를 활성화시킴으로써 유산증을 치료하는 약물로 사용되고 있다(Ann Intern Med 108 (1): 5863. (1988)). 또한 최근에 발표된 연구에 따르면 시험관내에서의 암세포 효능시험(in vitro cancer cell line assay)과 쥐를 이용한 실험에서 다이클로로아세트산이 미토콘드리아의 기능을 회복시킴으로써 아포토시스(apoptosis)를 유발할 뿐만 아니라 시험관내에서(in vitro) 암세포를 죽이고 쥐에서 암을 억제한다고 보고되어 있다(Cancer Cell 11 (1): 3751. (2007)).

본 발명자들은 엘로티닙의 항암효과를 개선하고 부작용을 감소시키기 위해 예의 연구 검토한 결과, 엘로티닙과 독성이 낮으면서도 아포토시스(apoptosis)를 통해 암세포가 스스로 소멸되도록 유도할 수 있는 물질인 다이클로로아세트산으로부터 제조되는 엘로티닙 다이클로로아세트산염이 놀랍게도 탁월한 시너지 효과를 통해 더욱 강력한 항암효과를 나타낼 뿐만 아니라, 복합제로 투여시 동일 투약 단위 내에 두 가지 물질을 완전히 균일하게 혼합하는 것이 어려웠던 문제점을 극복할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 우수한 항암효과를 나타내는 신규 산부가염인 엘로티닙 다이클로로아세트산염을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 엘로티닙 다이클로로아세트산염을 포함하는 항암제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 하기 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 엘로티닙 다이클로로아세트산염에 관한 것이다.

본 발명의 엘로티닙 다이클로로아세트산염은 바람직하게는 결정성 엘로티닙 다이클로로아세트산염이며, 보다 바람직하게는 X-선 회절분석에서 I/I₀ (I: 각 회절각에서의 피크의 강도, I₀: 가장 큰 피크의 강도)가 10% 이상인 회절각(2θ)의 값이 6.6±0.2, 9.3±0.2, 13.1±0.2, 14.9±0.2, 18.5±0.2, 19.2±0.2, 20.1±0.2, 20.7±0.2, 21.1±0.2, 22.6±0.2, 22.9±0.2, 26.2±0.2, 26.4±0.2, 27.0±0.2, 28.2±0.2, 28.5±0.2 인 것을 특징으로 하는 결정성 엘로티닙 다이클로로아세트산염(이하, ‘결정형 Ⅰ’로 명명함)이다.

대안적으로, 본 발명의 엘로티닙 다이클로로아세트산염은 바람직하게는 X-선 회절분석에서 I/I₀ (I: 각 회절각에서의 피크의 강도, I₀: 가장 큰 피크의 강도)가 10% 이상인 회절각(2θ)의 값이 6.6±0.2, 8.0±0.2, 13.0±0.2, 16.0±0.2, 16.8±0.2, 20.4±0.2, 20.8±0.2, 21.6±0.2, 22.9±0.2, 23.4±0.2, 26.0±0.2, 26.5±0.2, 27.0±0.2, 31.1±0.2 인 것을 특징으로 하는 결정성 엘로티닙 다이클로로아세트산염(이하, ‘결정형 Ⅱ’로 명명함)이다.

또 다른 대안적으로, 본 발명의 엘로티닙 다이클로로아세트산염은 바람직하게는 X-선 회절분석에서 I/I₀ (I: 각 회절각에서의 피크의 강도, I₀: 가장 큰 피크의 강도)가 10% 이상인 회절각(2θ)의 값이 7.6±0.2, 17.7±0.2, 18.2±0.2, 18.5±0.2, 21.7±0.2, 22.7±0.2, 23.2±0.2, 23.8±0.2, 26.6±0.2, 29.1±0.2 인 것을 특징으로 하는 결정성 엘로티닙 다이클로로아세트산염(이하, ‘결정형 Ⅲ’으로 명명함)이다.

또 다른 대안적으로, 본 발명의 엘로티닙 다이클로로아세트산염은 바람직하게는 X-선 회절분석에서 I/I₀ (I: 각 회절각에서의 피크의 강도, I₀: 가장 큰 피크의 강도)가 10% 이상인 회절각(2θ)의 값이 7.2±0.2, 9.1±0.2, 14.6±0.2, 17.0±0.2, 18.0±0.2, 20.1±0.2, 20.9±0.2, 23.7±0.2, 25.9±0.2, 27.0±0.2, 28.0±0.2, 29.0±0.2, 32.0±0.2, 32.9±0.2 인 것을 특징으로 하는 결정성 엘로티닙 다이클로로아세트산염 수화물(이하, ‘결정형 Ⅳ’로 명명함)이다.

본 발명에 따른 상기 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 엘로티닙 다이클로로아세트산염은 하기 화학식 (Ⅱ)로 표시되는 엘로티닙과 하기 화학식 (Ⅳ)로 표시되는 다이클로로아세트산을 반응시켜 제조할 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 엘로티닙 다이클로로아세산염의 제조방법을 더욱 상세히 설명한다.

상기 본 발명의 엘로티닙 다이클로로아세트산염은 엘로티닙과 다이클로로아세트산을 유기용매에 용해시키고 교반하여 제조하는 것이 바람직하다. 엘로티닙을 유기용매에 현탁시킨 후 다이클로로아세트산을 첨가하여 용해시키고 교반하거나, 엘로티닙과 다이클로로아세트산을 유기용매에 함께 용해시키고 교반하여 제조할 수 있다. 사용하는 다이클로로아세트산의 양은 엘로티닙에 대해 약 1 당량이 바람직하다.

본 발명에 따른 엘로티닙 다이클로로아세트산염의 제조방법은 상기 화학식 (Ⅱ)로 표시되는 엘로티닙과 상기 화학식 (Ⅳ)로 표시되는 다이클로로아세트산을 유기용매에서 반응시키는 단계 다음에,

(i) 반응용액을 교반하여 얻어진 고체를 여과하거나;

(ii) 반응용액의 온도를 낮추어 교반하고, 얻어진 고체를 여과하거나;

(iii) 반응용액에 석출용매를 가하여 교반하고, 얻어진 고체를 여과하거나;

(iv) 반응용액을 감압농축하고 얻어진 잔사에 석출용매를 가하여 교반한 다음, 얻어진 고체를 여과하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 유기용매로는 메탄올, 에탄올, 아이소프로판올, 1-뷰탄올, 1-헥산올 등의 알코올류, 테트라하이드로퓨란, 디옥산, 다이에틸에테르, 다이아이소프로필에테르 등의 에테르류, 아세토나이트릴 등의 나이트릴류, 아세톤, 2-뷰탄온 등의 케톤류, 에틸아세테이트, 아이소프로필아세테이트 등의 에스터류 및 다이클로로메탄, 클로로폼, 1,2-다이클로로에탄 등의 염화 탄화수소류로부터 선택된 1 종 이상이 사용될 수 있다.

상기 석출용매로는 에탄올, 아이소프로판올, 1-뷰탄올, 1-헥산올 등의 알코올류, 테트라하이드로퓨란, 디옥산, 다이에틸에테르, 다이아이소프로필에테르 등의 에테르류, 아세토나이트릴 등의 나이트릴류, 아세톤, 2-뷰탄온 등의 케톤류, n-펜탄, n-헥산 등의 탄화수소류, 벤젠, 톨루엔, 자일렌 등의 방향족 탄화수소류, 에틸아세테이트, 아이소프로필아세테이트 등의 에스터류 및 다이클로로메탄, 클로로폼, 1,2-다이클로로에탄 등의 염화 탄화수소류로부터 선택된 1 종 이상이 사용될 수 있다.

반응시간은 1 내지 5 시간이 바람직하며, 반응온도는 20 내지 60 ℃가 바람직하다.

본 발명의 엘로티닙 다이클로로아세트산염의 제조방법은 상기 얻어진 고체를 여과하는 단계 다음에, 세척하고 건조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 한편으로, 본 발명은 엘로티닙 다이클로로아세트산염을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 항암제 조성물, 특히 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC) 또는 췌장암의 치료를 위한 항암제 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 항암제 조성물은 엘로티닙 다이클로로아세트산염 이외에 또 다른 생리활성물질을 함께 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 항암제 조성물은 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 유탁액제, 현탁액제, 시럽제 등 여러 형태로 제형화될 수 있다. 상기 여러 형태의 항암제 조성물은 부형제, 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제(disintegrator), 윤활제, 방부제, 항산화제, 등장제(isotonic agent), 완충제, 피막제, 감미제, 용해제, 기제(base), 분산제, 습윤제, 현탁제, 안정제, 착색제, 방향제 등 각 제형에 통상적으로 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체(carrier)를 사용하여 공지 기술에 의해 제조될 수 있다.

상기 약제의 제조에 있어서 본 발명의 엘로티닙 다이클로로아세트산염의 함량은 약제의 형태에 따라 다르지만, 바람직하게는 1 내지 90 중량%의 농도, 보다 바람직하게는 3 내지 50 중량%의 농도이다.

본 발명의 항암제 조성물의 투여량은 치료되는 사람을 포함한 포유동물의 종류, 투여경로, 체중, 성별, 나이, 질환의 정도, 의사의 판단 등에 따라 넓은 범위에서 다양하게 변화된다. 일반적으로 경구투여의 경우에는 체중 1 kg당 하루에 활성성분 0.5 내지 10 mg이 투여될 수 있다. 상술한 일일 투여량은 질환의 정도, 의사의 판단 등에 따라 한번에 또는 나누어서 사용될 수 있다.

본 발명의 엘로티닙 다이클로로아세트산염은 상피세포 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor)를 억제할 뿐만 아니라 아포토시스(apoptosis)를 통해 암세포가 스스로 소멸되도록 유도함으로써 암의 성장을 억제하고 궁극적으로는 암세포를 소멸시킬 수 있으며, 엘로티닙과 다이클로로아세트산의 탁월한 시너지 효과를 통해 항암효과를 높일 수 있다. 이러한 시너지 효과는 유효성분의 사용량을 낮추고도 동일 또는 동일 이상의 효과를 낼 수 있기 때문에 항암제의 부작용을 크게 낮출 수 있는 장점이 있다.

또한 본 발명의 엘로티닙 다이클로로아세트산염은 엘로티닙과 다이클로로아세트산을 동일 투약 단위에 포함시키는 과정에서 균질하게 혼합하여 제제화하는데 어려운 문제를 해결한 장점을 갖는다.

아울러 본 발명에 따른 결정성 엘로티닙 다이클로로아세트산염은 수분 및 열에 대한 안정성이 뛰어나고 흡습성이 매우 낮아 약제학적 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 엘로티닙 다이클로로아세트산염은 항암제 조성물, 특히 이전 화학요법에 실패한 국소진행형 또는 전이성 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)의 치료 또는 젬시타빈과 병용하여 국소적, 제거 불가능한, 또는 전이성 췌장암의 치료를 위한 항암제 조성물에 사용될 수 있다.

도 1은 실시예 1에서 수득한 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅰ)의 X선 회절 분광도를 나타낸 도이다.
도 2는 실시예 1에서 수득한 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅰ)의 시차주사열량 분석도(Differential Scanning Calorimeter Thermogram)를 나타낸 도이다.
도 3은 실시예 6에서 수득한 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅱ)의 X선 회절 분광도를 나타낸 도이다.
도 4는 실시예 6에서 수득한 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅱ)의 시차주사열량 분석도(Differential Scanning Calorimeter Thermogram)를 나타낸 도이다.
도 5는 실시예 7에서 수득한 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅲ)의 X선 회절 분광도를 나타낸 도이다.
도 6은 실시예 7에서 수득한 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅲ)의 시차주사열량 분석도(Differential Scanning Calorimeter Thermogram)를 나타낸 도이다.
도 7은 실시예 8에서 수득한 엘로티닙 다이클로로아세트산염 수화물(결정형 Ⅳ)의 X선 회절 분광도를 나타낸 도이다.
도 8은 실시예 8에서 수득한 엘로티닙 다이클로로아세트산염 수화물(결정형 Ⅳ)의 시차주사열량 분석도(Differential Scanning Calorimeter Thermogram)를 나타낸 도이다.
도 9는 시험예 4에서 약물을 처리하지 않은 대조군(control)의 흡광도 값을 100%로 하였을 때, 실시예 1에서 수득한 엘로티닙 다이클로로아세트산염, 엘로티닙 염산염 및 다이클로로아세트산을 3 μM, 1 μM, 0.3 μM 및 0.1 μM의 농도로 인체 폐암 세포인 NCI-H460 세포에 투여하여 얻어진 흡광도 값을 %로 나타낸 도이다.
도 10은 시험예 4에서 약물을 처리하지 않은 대조군(control)의 흡광도 값을 100%로 하였을 때, 실시예 1에서 수득한 엘로티닙 다이클로로아세트산염, 엘로티닙 염산염 및 다이클로로아세트산을 3 μM, 1 μM, 0.3 μM 및 0.1 μM 의 농도로 대장암 세포인 SW620 세포에 투여하여 얻어진 흡광도 값을 %로 나타낸 도이다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오직 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업자에게 있어서 자명하다.

실시예 1: 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 I)의 제조

엘로티닙 7.87 g (20.00 mmol)을 에틸아세테이트 40 ㎖에 현탁시키고 다이클로로아세트산 1.66 ㎖ (20.00 mmol)를 서서히 적가하여 20 내지 25 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응용액 내에서 화합물이 완전히 용해된 후 고체가 서서히 생성되면 20 내지 25 ℃에서 2 시간 동안 추가로 교반하였다. 생성된 엷은 황색의 결정성 고체를 여과하고 에틸아세테이트 10 ㎖로 세척한 후, 60 ℃의 진공 하에서 20 시간 동안 건조하여 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 I) 9.90 g을 수득하였다. 수율은 94.76%였다. 수득된 결정성 엘로티닙 다이클로로아세트산염의 X-선 회절분석 및 시차주사열량분석을 수행하여 그 결과를 각각 도 1 및 도 2에 나타내었다.

융점 : 144 ~ 145 ℃

¹H NMR (400MHz, DMSO-d₆) :δ= 9.82 (brs, 1 H), 8.54 (s, 1 H), 7.92 (s, 1 H), 7.87 (s, 1 H), 7.83 (d, 1 H, J = 7.6 Hz), 7.39 (t, 1 H, J = 8.0 Hz), 7.23 (d, 1 H, J = 7.2 Hz), 7.22 (s, 1 H), 6.51 (s, 1 H), 4.27 ~ 4.24 (m, 4 H), 4.18(s, 1 H), 3.76 ~ 3.71 (m, 4 H), 3.34 (s, 3 H), 3.32(s, 3 H)

실시예 2: 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 I)의 제조

엘로티닙 3.94 g (10.01 mmol)을 클로로폼 50 ㎖에 현탁시키고 다이클로로아세트산 0.83 ㎖ (10.01 mmol)를 서서히 적가하여 20 내지 25 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응용액 내에서 화합물이 완전히 용해된 후 다이아이소프로필에테르 65 ㎖을 서서히 적가하고 20 내지 25 ℃에서 1 시간 동안 추가로 교반하였다. 생성된 엷은 황색의 결정성 고체를 여과하고 다이아이소프로필에테르 10 ㎖로 세척한 후, 60 ℃의 진공 하에서 20 시간 동안 건조하여 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 I) 4.77 g을 수득하였다. 수율은 91.22%였다.

실시예 3: 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 I)의 제조

엘로티닙 3.94 g (10.01 mmol)을 메탄올 50 ㎖에 현탁시키고 다이클로로아세트산 0.83 ㎖ (10.01 mmol)를 서서히 적가하여 20 내지 25 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응용액을 완전히 농축시킨 후, 잔사에 아세톤 50 ㎖을 가하여 용해시킨 후 다이아이소프로필에테르 100 ㎖을 서서히 적가하였다. 고체가 생성되면 0 내지 5 ℃로 냉각하고 2 시간 동안 추가로 교반하였다. 생성된 엷은 황색의 결정성 고체를 여과하고 다이아이소프로필에테르 10 ㎖로 세척한 후, 60 ℃의 진공 하에서 20 시간 동안 건조하여 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 I) 4.91 g을 수득하였다. 수율은 93.90%였다.

실시예 4: 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 I)의 제조

엘로티닙 3.94 g (10.01 mmol)을 테트라하이드로퓨란 10 ㎖에 현탁시키고 다이클로로아세트산 0.83 ㎖ (10.01 mmol)를 서서히 적가하여 20 내지 25 ℃에서 3 시간 동안 교반하였다. 생성된 엷은 황색의 결정성 고체를 여과하고 테트라하이드로퓨란 5 ㎖로 세척한 후, 60 ℃의 진공 하에서 20 시간 동안 건조하여 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 I) 4.43 g을 얻었다. 수율은 84.72%였다.

실시예 5: 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 I)의 제조

엘로티닙 3.94 g (10.01 mmol)을 아세토나이트릴 10 ㎖에 현탁시키고 다이클로로아세트산 0.83 ㎖ (10.01 mmol)를 서서히 적가하여 20 내지 25 ℃에서 3 시간 동안 교반하였다. 생성된 엷은 황색의 결정성 고체를 여과하고 아세토나이트릴 5 ㎖로 세척한 후, 60 ℃의 진공 하에서 20 시간 동안 건조하여 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 I) 4.76 g을 수득하였다. 수율은 91.03%였다.

실시예 6: 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅱ)의 제조

엘로티닙 3.94 g (10.01 mmol)을 아이소프로판올 10 ㎖에 현탁시키고 다이클로로아세트산 0.83 ㎖ (10.01 mmol)를 서서히 적가하였다. 반응용액 내에서 화합물이 완전히 용해되고 결정이 생성되기 시작하면 아이소프로판올 65 ㎖을 가한 후, 20 내지 25 ℃에서 2 시간 동안 추가로 교반하였다. 생성된 엷은 황색의 결정성 고체를 여과하고 아이소프로판올 10 ㎖로 세척한 후, 60 ℃의 진공 하에서 20 시간 동안 건조하여 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅱ) 4.99 g을 수득하였다. 수율은 95.43%였다. 수득된 결정성 엘로티닙 다이클로로아세트산염의 X-선 회절분석 및 시차주사열량분석을 수행하여 그 결과를 각각 도 3 및 도 4에 나타내었다.

융점 : 140 ~ 142 ℃

실시예 7: 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅲ)의 제조

엘로티닙 7.87 g (20.00 mmol)을 에탄올 60 ㎖에 현탁시키고 다이클로로아세트산 1.66 ㎖ (20.00 mmol)를 서서히 적가하였다. 반응용액 내에서 화합물이 완전히 용해되고 결정이 생성되기 시작하면 에탄올 20 ㎖을 가한 후, 20 내지 25 ℃에서 3 시간 동안 추가로 교반하였다. 생성된 엷은 황색의 결정성 고체를 여과하고 에탄올 10 ㎖로 세척한 후, 60 ℃의 진공 하에서 20 시간 동안 건조하여 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅲ) 9.21 g을 수득하였다. 수율은 88.15%였다. 수득된 결정성 엘로티닙 다이클로로아세트산염의 X-선 회절분석 및 시차주사열량분석을 수행하여 그 결과를 각각 도 5 및 도 6에 나타내었다.

융점 : 142 ~ 144 ℃

실시예 8: 엘로티닙 다이클로로아세트산염 수화물(결정형 Ⅳ)의 제조

엘로티닙 3.94 g (10.01 mmol)을 증류수 20 ㎖에 현탁시키고 다이클로로아세트산 0.83 ㎖ (10.01 mmol)을 서서히 적가하였다. 반응용액에 메탄올 50 ㎖을 가하고 50 내지 55 ℃로 가열하여 1 내지 2 시간 동안 교반하였다. 반응용액 내에서 화합물이 완전히 용해되면 20 내지 25 ℃로 서서히 냉각하여 2 시간 동안 교반하였다. 생성된 엷은 황색의 결정성 고체를 여과하고 메탄올 10 ㎖로 세척한 후, 60 ℃의 진공 하에서 20 시간 동안 건조하여 엘로티닙 다이클로로아세트산염 수화물(결정형 Ⅳ) 3.81 g을 수득하였다. 수율은 72.86%였다. 수득된 결정성 엘로티닙 다이클로로아세트산염의 X-선 회절분석 및 시차주사열량분석을 수행하여 그 결과를 각각 도 7 및 도 8에 나타내었다.

융점 : 126 ~ 128 ℃

비교예 1: 엘로티닙 염산염(결정형 B)의 제조

미국특허공개 제2009-0131665호에 기재된 방법에 따라 엘로티닙 염산염(결정형 B)을 다음과 같이 제조하였다.

엘로티닙 20.00 g (50.83 mmol)을 메틸에틸케톤과 증류수가 10 : 1의 부피비로 혼합된 용매 440 ㎖에 가하고 30 내지 35 ℃로 가열하여 완전히 용해시켰다. 반응용액에 진한 염산 5.15 ㎖ (61.00 mmol)를 서서히 적가하고 강하게 교반하였다. 생성된 엷은 황색의 결정성 고체를 여과하고, 60 ℃의 진공 하에서 20 시간 동안 건조하여 엘로티닙 염산염(결정형 B) 20.35 g을 수득하였다. 수율은 93.13%였다.

시험예 1: 결정성 엘로티닙 다이클로로아세트산염 구조의 정성적 확인

도 1, 도 3, 도 5 및 도 7로부터 상기 실시예 1, 실시예 6, 실시예 7 및 실시예 8에서 각각 제조된 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅰ), 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅱ), 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅲ) 및 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅳ)은 분말 X-선 회절분석에서 각기 특징적인 결정형태를 갖는 것을 확인할 수 있었다. 도 1, 도 3, 도 5 및 도 7의 분말 X-선 회절분광도에 나타난 특징적인 피크(peak)를 각각 하기 표 1, 표 2, 표 3 및 표 4에 나타내었으며, 여기서 ‘2θ’는 회절각을, ‘d’는 결정면간의 거리를, ‘I/I₀'는 피크(peak)의 상대강도를 의미한다.

엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅰ)의 X-선 회절분석

2θ	d	I/I₀	2θ	d	I/I₀
6.6120	13.36837	100	23.8402	3.73249	8.94
9.2866	9.52336	11.50	25.0289	3.55786	6.55
13.1025	6.75718	13.70	26.1716	3.40505	60.18
13.5029	6.55766	6.94	26.4245	3.37303	42.80
14.9108	5.94152	12.62	26.9752	3.30541	20.37
16.6186	5.33459	8.38	28.1519	3.16987	15.92
17.6684	5.01991	7.92	28.5382	3.12784	10.93
18.5228	4.79025	29.90	29.3902	3.03907	5.72
19.1765	4.62841	16.39	29.8875	2.98963	6.84
20.0659	4.42521	14.91	31.3903	2.84984	4.44
20.6721	4.29680	25.87	32.6335	2.74406	5.58
21.0734	4.21587	23.26	34.4562	2.60297	4.18
22.5931	3.93563	37.41	35.5362	2.52629	8.14
22.9363	3.87750	12.02	36.6405	2.45265	3.40

엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅱ)의 X-선 회절분석

2θ	d	I/I₀	2θ	d	I/I₀
6.5723	13.44905	100	21.6049	4.11334	20.44
7.9780	11.08229	22.71	22.8776	3.88732	19.63
12.9565	6.83295	22.60	23.3969	3.80220	16.84
14.7426	6.00891	4.80	25.9535	3.43316	35.75
15.9316	5.56305	20.73	26.4644	3.36804	19.30
16.7804	5.28352	32.21	27.0396	3.29768	18.11
20.4133	4.35069	14.88	31.0649	2.87895	12.50
20.8314	4.26430	15.54

엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅲ)의 X-선 회절분석

2θ	d	I/I₀	2θ	d	I/I₀
7.6210	11.60061	100	26.6368	3.34663	17.19
8.9437	9.88775	9.05	27.8625	3.20213	6.21
11.8985	7.43805	2.95	28.3160	3.15187	7.79
15.0768	5.87648	6.93	29.0865	3.07011	12.44
16.7493	5.29325	8.94	29.6563	3.01241	4.61
17.7167	5.00633	15.77	31.3090	2.85706	3.08
18.1769	4.88061	19.45	32.0511	2.79258	3.81
18.5364	4.78676	22.28	33.1538	2.70218	4.45
21.7141	4.09291	32.39	35.8578	2.50437	3.21
22.6546	3.92507	39.94	36.5906	2.45588	1.50
23.1850	3.83647	31.59	37.2175	2.41594	2.34
23.7956	3.73938	12.70	38.4084	2.34373	2.21
25.0373	3.55668	8.74	39.0321	2.30770	1.73
25.6646	3.47115	4.98

엘로티닙 다이클로로아세트산염 수화물(결정형 Ⅳ)의 X-선 회절분석

2θ	d	I/I₀	2θ	d	I/I₀
7.1663	12.33567	100	25.8875	3.44177	11.6
9.0533	9.76826	30.49	26.2819	3.39101	7.38
11.0797	7.98584	4.46	27.0126	3.30092	25.58
11.7158	7.55364	4.38	27.9333	3.19417	13.27
14.5691	6.08006	21.25	29.0344	3.07549	17.48
15.7063	5.64232	8.19	30.4149	2.93898	6.71
16.2238	5.46351	9.28	31.1529	2.87102	8.95
16.9713	5.2245	11.35	31.5744	2.83365	5.58
17.9656	4.93754	31.02	32.0424	2.79332	12.11
18.4106	4.81918	4.88	32.8977	2.72262	12.58
20.0913	4.41967	19.03	34.1307	2.62704	5.99
20.9354	4.24335	28.81	34.8104	2.57729	7.06
21.72	4.09181	8.09	35.608	2.52136	5.94
23.6511	3.7619	28.27	36.2294	2.47953	5.75
24.6313	3.61438	5.65	38.571	2.33422	0.25

시험예 2: 수분 및 열에 대한 안정성 시험

약제학적 조성물에 사용되는 활성성분의 수분 및 열에 대한 안정성은 조성물의 제조공정은 물론 조성물의 장기간 보관에 있어서 중요한 요소이므로, 상기 실시예 1, 실시예 6, 실시예 7 및 실시예 8에서 각각 제조된 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅰ), 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅱ), 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅲ) 및 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅳ)에 대한 수분 및 열에 대한 안정성을 측정하였다. 구체적으로, 상기한 결정성 엘로티닙 다이클로로아세트산염과 공지의 엘로티닙 염산염(결정형 B) 각각을 40 ℃의 온도 및 75%의 상대습도인 가속조건에서 밀봉상태로 보관하면서 각각 0 일, 3 일, 7 일, 14 일 및 28 일이 지난 후의 시료에 대해서 초기 활성성분 값에 대한 잔사율을 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

수분 및 열에 대한 안정성 시험

염	초기	3일	7일	14일	28일
엘로티닙 염산염(결정형 B)	100	100.1	100.1	100.0	100.0
엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅰ형)	100	100.1	100.0	100.0	100.1
엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅱ형)	100	100.0	100.0	100.0	100.0
엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅲ형)	100	100.1	100.0	100.0	100.0
엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅳ형)	100	100.0	100.0	100.0	99.9

상기 표 5에서 보는 바와 같이, 결정형 Ⅰ, 결정형 Ⅱ, 결정형 Ⅲ 및 결정형 Ⅳ의 엘로티닙 다이클로로아세트산염은 28 일 동안의 가속조건 실험에서 공지의 엘로티닙 염산염과 대등하게 우수한 안정성을 보여주었다. 이 결과로부터 본 발명의 결정성 엘로티닙 다이클로로아세트산염은 항암치료를 위한 약제학적 조성물의 활성성분으로 유용하게 사용될 수 있는 화학적 안정성을 가지고 있다는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 3: 비흡습성 시험

실시예 1, 실시예 6, 실시예 7 및 실시예 8에서 각각 제조된 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅰ), 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅱ), 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅲ) 및 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅳ)에 대한 흡습성을 공지의 엘로티닙 염산염(결정형 B)의 흡습성과 비교하였다. 각각의 화합물을 40 ℃의 온도 및 75%의 상대습도 조건에서 2 시간, 8 시간, 24 시간 및 3 일 동안 지속적으로 노출시킨 후, 수분함량을 칼-피셔(Karl-Fisher) 수분측정기로 측정하였다. 활성성분에 함유된 수분의 함량을 함수율(중량%)로 나타낸 측정수치를 하기 표 6에 나타내었다.

비흡습성 시험

염	초기	2 시간	8 시간	24 시간	3 일
엘로티닙 염산염(결정형 B)	0.27	0.38	0.27	0.33	0.33
엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅰ형)	0.50	0.35	0.63	0.81	0.87
엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅱ형)	2.13	1.37	1.24	0.95	0.70
엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅲ형)	0.42	0.32	0.26	0.28	0.39
엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅳ형)	3.09	7.64	7.55	7.73	7.61

상기 표 6에서 보는 바와 같이, 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅰ), 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅱ) 및 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅲ)은 다습조건에서도 공지의 엘로티닙 염산염과 대등하게 수분을 흡수하지 않는 비조해성임을 확인하였다. 이러한 결과로부터 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅰ), 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅱ) 및 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 Ⅲ)은 수분에 매우 안정하여 항암치료를 위한 약제학적 조성물의 활성성분으로 유용하게 이용될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 4: 세포독성 시험(MTT Assay)

인체 폐암 세포인 NCI-H460 세포와 대장암 세포인 SW620 세포를 각기 94 웰의 플레이트에 2.5 x 10⁴ cells/mL의 농도가 되도록 접종하고 24 시간 동안 배양하였다. 이때 각 샘플 당 4 개의 웰에 접종하여 배양하였다(n = 4). 24 시간이 경과한 후 엘로티닙 다이클로로아세트산염(결정형 I), 엘로티닙 염산염(결정형 B) 및 다이클로로아세트산을 각기 다이메틸술폭사이드(DMSO)에 녹인 용액(10 mM)을 제조하고, 무혈청 배지(serum free media)를 이용하여 3 μM, 1 μM, 0.3 μM 및 0.1 μM의 용액을 각기 제조하였다. 이를 웰에 100 ㎕씩 각기 주입하고 37 ℃의 인큐베이터에서 48 시간 동안 다시 배양하였다.

각각의 샘플에 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide: MTT)시약을 20 μl씩 첨가하여 2 시간 동안 다시 배양하고, ELISA 분석기를 이용하여 510 nm에서의 흡광도를 측정하였다. MTT 시약은 5 mg/㎖이 되도록 PBS(fetal bovine serum)에 녹인 후 여과하여 사용하였다.

대조군(control)은 약물을 포함하지 않은 무혈청 배지에서 측정된 MTT 흡광도 값을 나타내었다. 엘로티닙 다이클로로아세트산염, 엘로티닙 염산염 및 다이클로로아세트산을 각기 처리한 4 개의 결과치의 평균값을 구한 후, %값을 계산하여 그 결과를 도 9 및 도 10에 나타내었다.

인체 폐암 세포인 NCI-H460 세포에서 약물을 처리하지 않은 대조군(control)의 흡광도 값을 100%로 하였을 때, 엘로티닙 다이클로로아세트산염을 3 μM, 1 μM, 0.3 μM 및 0.1 μM의 농도로 투여하여 얻어진 흡광도 값은 각기 68.27%, 71.08%, 79.08% 및 82.12%로 확인되었다. 같은 방법으로 엘로티닙 염산염을 3 μM, 1 μM, 0.3 μM 및 0.1 μM의 농도로 투여하여 얻어진 흡광도 값은 각기 94.04%, 96.76%, 101.72% 및 102.49%로 확인되었다. 또한 같은 방법으로 다이클로로아세트산을 3 μM, 1 μM, 0.3 μM 및 0.1 μM 의 농도로 투여하여 얻어진 흡광도 값은 각기 83.99%, 85.04%, 86.76% 및 88.08%로 확인되었다. 이 실험결과로부터 본 발명에 따른 엘로티닙 다이클로로아세트산염이 엘로티닙(엘로티닙 염산염)과 다이클로로아세트산을 개별적으로 투여했을 때 보다 우수한 항암효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 더욱이 본 발명에 따른 엘로티닙 다이클로로아세트산염은 엘로티닙(엘로티닙 염산염)과 다이클로로아세트산을 각기 10배로 투여했을 때 보다도 우수한 항암효과를 나타내어, 인체 폐암 세포인 NCI-H460 세포에 대해 엘로티닙과 다이클로로아세트산의 강력한 시너지 효과를 확인할 수 있었다.

동일한 방법으로 대장암 세포인 SW620 세포에서 약물을 처리하지 않은 대조군(control)의 흡광도 값을 100%로 하였을 때, 엘로티닙 다이클로로아세트산염을 3 μM, 1 μM, 0.3 μM 및 0.1 μM의 농도로 투여하여 얻어진 흡광도 값은 각기 75.54%, 81.14%, 91.65% 및 96.26%로 확인되었다. 같은 방법으로 엘로티닙 염산염을 3 μM, 1 μM, 0.3 μM 및 0.1 μM의 농도로 투여하여 얻어진 흡광도 값은 각기 97.14%, 97.24%, 98.81% 및 103.11%로 확인되었다. 또한 같은 방법으로 다이클로로아세트산을 3 μM, 1 μM, 0.3 μM 및 0.1 μM의 농도로 투여하여 얻어진 흡광도 값은 각기 99.78%, 101.02%, 100.01% 및 104.01%로 확인되었다. 이 실험결과로부터 본 발명에 따른 엘로티닙 다이클로로아세트산염이 엘로티닙(엘로티닙 염산염)과 다이클로로아세트산을 개별적으로 투여했을 때 보다 우수한 항암효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 더욱이 본 발명에 따른 엘로티닙 다이클로로아세트산염은 엘로티닙(엘로티닙 염산염)과 다이클로로아세트산을 각기 10 배로 투여했을 때 보다도 우수한 항암효과를 나타내어, 대장암 세포인 SW620 세포에 대해서도 엘로티닙과 다이클로로아세트산의 강력한 시너지 효과를 확인할 수 있었다.

상기한 결과로부터, 엘로티닙 다이클로로아세트산염이 엘로티닙 염산염보다 더 우수한 항암효과를 나타낼 뿐만 아니라, 다이클로로아세트산의 부가에 의해 강력한 시너지 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

Claims

하기 화학식 (I)로 표시되는 엘로티닙 다이클로로아세트산염:
삭제
제1항에 있어서, X-선 회절분석에서 I/I₀ (I: 각 회절각에서의 피크의 강도, I₀: 가장 큰 피크의 강도)가 10% 이상인 회절각(2θ)의 값이 6.6±0.2, 9.3±0.2, 13.1±0.2, 14.9±0.2, 18.5±0.2, 19.2±0.2, 20.1±0.2, 20.7±0.2, 21.1±0.2, 22.6±0.2, 22.9±0.2, 26.2±0.2, 26.4±0.2, 27.0±0.2, 28.2±0.2, 28.5±0.2 인 것을 특징으로 하는 결정성 엘로티닙 다이클로로아세트산염.
제1항에 있어서, X-선 회절분석에서 I/I₀ (I: 각 회절각에서의 피크의 강도, I₀: 가장 큰 피크의 강도)가 10% 이상인 회절각(2θ)의 값이 6.6±0.2, 8.0±0.2, 13.0±0.2, 16.0±0.2, 16.8±0.2, 20.4±0.2, 20.8±0.2, 21.6±0.2, 22.9±0.2, 23.4±0.2, 26.0±0.2, 26.5±0.2, 27.0±0.2, 31.1±0.2 인 것을 특징으로 하는 결정성 엘로티닙 다이클로로아세트산염.
제1항에 있어서, X-선 회절분석에서 I/I₀ (I: 각 회절각에서의 피크의 강도, I₀: 가장 큰 피크의 강도)가 10% 이상인 회절각(2θ)의 값이 7.6±0.2, 17.7±0.2, 18.2±0.2, 18.5±0.2, 21.7±0.2, 22.7±0.2, 23.2±0.2, 23.8±0.2, 26.6±0.2, 29.1±0.2 인 것을 특징으로 하는 결정성 엘로티닙 다이클로로아세트산염.
제1항에 있어서, X-선 회절분석에서 I/I₀ (I: 각 회절각에서의 피크의 강도, I₀: 가장 큰 피크의 강도)가 10% 이상인 회절각(2θ)의 값이 7.2±0.2, 9.1±0.2, 14.6±0.2, 17.0±0.2, 18.0±0.2, 20.1±0.2, 20.9±0.2, 23.7±0.2, 25.9±0.2, 27.0±0.2, 28.0±0.2, 29.0±0.2, 32.0±0.2, 32.9±0.2 인 것을 특징으로 하는 결정성 엘로티닙 다이클로로아세트산염 수화물.
제1항 또는 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 엘로티닙 다이클로로아세트산염을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 항암제 조성물.
제7항에 있어서, 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC) 또는 췌장암의 치료를 위한 것을 특징으로 하는 항암제 조성물.