CN103059005B - 白杨素酰胺衍生物及其医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物化学技术领域，具体公开了一类白杨素酰胺衍生物类化合物，以及这类化合物的制备方法和医药用途。本发明的化合物的结构式如式III所示，该化合物中的取代基R为2-(氨甲基)-1-乙基吡咯烷、哌嗪、1-（2-氨基乙基）哌啶、N,N-二甲基乙二胺、N,N-二乙基乙二胺或4-哌啶基哌啶，这些化合物可应用于制备抗肿瘤的药物中。

Description

白杨素酰胺衍生物及其医药用途

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体涉及白杨素酰胺衍生物及其医药用途。

背景技术

白杨素是一种黄酮类活性化合物，药理学研究表明，白杨素具有较好的抗肿瘤活性，但因白杨素自身结构、水溶性等原因，使得其药理活性偏低。当下对白杨素的结构改造是一个研究热点，邹晓青等发现白杨素乙酰化、卤化、三氟甲基化衍生物对体外培养人胃癌（SGC-7901）细胞、人急性粒细胞性白血病（HL-60）细胞和人结肠癌（HT-29）细胞具有抑制增殖作用，且以6,8-二-三氟甲基-5-羟基-7-乙酰基白杨素作用最强（邹晓青等.中国药理学通报，2004；20（4）：453～457）。李娇玲等研究表明，5-烯丙基-7-二氟亚甲基白杨素具有比白杨素更强的亲脂性和膜通透性，从而提高其在生物体内的吸收和跨膜转运，可望成为治疗卵巢肿瘤的新药之一（李娇玲等.美国中华临床医学杂志，2005；7（4）：323～326）。尚思异等以白杨素为原料，通过甲基化、溴化等多步化学反应得到8-溴-7-甲氧基白杨素，应用MTT法证明其对人急性粒细胞性白血病（HL-60）细胞具有抑制作用，呈浓度依赖性，采用HL-60细胞小鼠肾囊膜下移植模型实验表明其对该移植瘤具有抑制作用，呈浓度依赖性（尚思异等.美国中华临床医学杂志，2004；6（2）：87～89）。曾源等应用MTT法、软琼脂培养克隆形成法、AO/EB荧光染色法和DNA凝胶电泳法证明了8-硝基白杨素具有抑制人宫颈癌Hela细胞增殖和诱导细胞凋亡作用（曾源等，美国中华临床医学杂志，2004；6（2）：87～89）。Sheng-Ming Peng等人同样是在白杨素的7位羟基上采用一系列的化学合成改造，最后抗细胞增殖的活性实验得到了很好的结果（Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters.2009,191264–1266;Bioorganic&MedicinalChemistry.2010,18,3020–3025）。Haeil Park等在白杨素的6位或者8位链接甲氧基或将5位和7位的羟基进行甲氧基化，合成出的一系列化合物在抗PGE2产生的试验中取得了可喜的结果（European Journal of Medicinal Chemistry.2005,40,943-948）。Peng-Cheng Lv等人在白杨素的7位羟基上链接一系列单胺，获得一系列化合物，在抗癌活性实验中得到了不错的结果（Bioorganic&Medicinal Chemistry.2010,18,1117-1123）。尽管现有技术中已经对白杨素衍生物做了大量研究，但白杨素酰胺衍生物的研究尚未见报道。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供了一类白杨素酰胺衍生物抗肿瘤化合物，同时本发明还提供了这类新化合物的医药用途，这种新的化合物具有良好的水溶性，稳定性及抗肿瘤活性的特点。

本发明提供了一类结构式如式III所示的化合物。

式III中的取代基R代表含两个以上氮原子的胺基类化合物。

进一步，R为2-(氨甲基)-1-乙基吡咯烷、哌嗪、1-（2-氨基乙基）哌啶、N,N-二甲基乙二胺、N,N-二乙基乙二胺或4-哌啶基哌啶。

式III所示的化合物的制备方法如下：将白杨素的7位羟基上连接溴乙酸乙酯，然后将其水解，最后分别与一系列胺化合物发生酰胺缩合反应，获得一系列的白杨素类化合物，体内体外实验结果表明这类化合物与白杨素相比，具有更好的细胞毒活性、稳定性、适当的油水分配系数与低毒性，是一类具有开发为新型抗肿瘤药物前景的化合物；在制备方法上，本发明通过简单的方法，高效地合成了关键中间体及目标化合物。

具体地，结构式如式III所示的化合物的制备方法的步骤如下：

步骤1首先将白杨素(2.54g;0.01mol)和无水碳酸钾(1.66g;0.011mol)一同加入至100ml搅拌的丙酮中，然后将溴乙酸乙酯（1.84g，0.011mol）加入溶液中，在50~60℃的条件下加热回流4~6h。反应结束后，冷却。将溶液抽滤，抽滤后将滤液浓缩至原体积的40%，滤液浓缩物依次用石油醚，1wt%的NaOH溶液和水冲洗，然后真空干燥得化合物I。

步骤2将化合物I（1.70g;5.0mmol)溶于120ml甲醇中，往溶液中加入KOH(1.68g;3mmol)在加热搅拌下回流8小时，直到溶液中出现不溶于甲醇的黄色固体。抽滤，过滤物用甲醇洗涤，干燥。将干燥物溶于水中（1g干燥物溶于150ml水中），然后加稀HCl（0.30~0.40wt%）调节溶液PH至PH<2。将溶液抽滤，将所得固体真空干燥，得化合物Ⅱ。

步骤3将二环己基碳二亚胺(DCC,0.75g；3.372mmol)和20ml无水二氯甲烷的混合物滴入化合物Ⅱ（0.96g；3.06mmol)的40ml无水二氯甲烷溶液中，整个过程在冰浴中进行，滴加完毕后，在冰浴下反应12小时。将冰浴撤去，加入化合物2-(氨甲基)-1-乙基吡咯烷、哌嗪、1-（2-氨基乙基）哌啶、N,N-二甲基乙二胺、N,N-二乙基乙二胺或4-哌啶基哌啶3.373mmol和三乙胺TEA(0.341g；3.372mmol)，在常温下搅拌12小时后，抽滤，将滤液浓缩至干，然后加入50~150ml乙酸乙酯，抽滤，滤液用稀碳酸钾溶液（浓度1wt％），饱和NaCl溶液分别洗涤2~5次，将有机相用稀HCl（0.30~0.40wt％）洗2~5次，合并水相，然后用碳酸钾调节溶液PH至7~8，接着用氯仿萃取水层2~5次，合并有机相后，正相硅胶分离，洗脱剂为环己烷：乙酸乙酯体积比=6：1的混合溶液，目标产物干燥后为褐色粉末。

上述制备方法中，反应溶媒可以为丙酮、甲醇、无水二氯甲烷；反应温度为冰浴、常温、50~60℃；反应的催化剂为DCC，碳酸钾等。

实验结果表明，本发明制备的六种结构式如式III的化合物对EC109、HepG2、SW480与Hela等肿瘤细胞生长有显著的抑制作用，而且其中的部分化合物对这些肿瘤细胞增殖的抑制作用明显强于白杨素，与一线抗癌药物顺铂相当；另外，本申请中的化合物4通过对荷S180肉瘤小鼠体内抗肿瘤及毒性研究表明，其能显著抑制肉瘤大小，药效与顺铂相当，且对免疫器官、造血系统及肝肾等无明显毒副作用。具备了一个高效低毒的优秀抗肿瘤药物的特性。另外，本发明的化合物制备方法具有简单，原料廉价易得，反应条件温和，收率较高，对环境友好的特点。

具体实施方式

接下来申请人将通过以下各具体实施例进一步详细说明本发明，但应理解，本发明的保护范围并不受这些实施例的任何限制。

实施例1

N-(1-乙基吡咯烷-2-甲基)-2-(5-羟基-4-氧-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧基)乙酰胺制备（1）、2-（5-羟基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮基-7-氧）乙酸乙酯的制备

将白杨素(2.54g;0.01mol)和无水碳酸钾(1.66g;0.011mol)一同加入至100ml搅拌的丙酮中，然后将溴乙酸乙酯（1.84g，0.011mol）加入溶液中，反应在一边加热（50~60℃）一边搅拌的条件下进行加热回流，反应时间为6小时。反应结束后，冷却。将溶液抽滤，抽滤后将滤液浓缩至原体积的40%，滤液浓缩物依次用石油醚，1wt%的NaOH溶液和水冲洗，然后真空干燥。产物为淡黄色固体，产品得率91%，mp:242-244℃，¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):1.25(t,J=6.9Hz,3H);4.19(m,2H);4.96(S,2H);6.43(m,1H);6.85(m,1H),7.01(s,1H),7.01(s,1H),7.60(m,3H),8.10(m,2H),12.81(s,1H).MS(ESI):340.3(C₁₉H₁₆O₆,（M+H⁺）)。

（2）、2-（5-羟基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮基-7-氧）乙酸制备

将（1）所得产物2-（5-羟基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮基-7-氧）乙酸乙酯（1.70g；5.0mmol)溶于120ml甲醇中，往溶液中加入KOH(1.68g;3mmol)在加热搅拌下回流8小时，直到溶液中出现不溶于甲醇的黄色固体。抽滤，过滤后的固体用甲醇洗涤，干燥。将干燥物溶于水中（1g干燥物溶于150ml水中），然后用稀HCl（0.30~0.40wt％）调节溶液PH，直至PH<2。将溶液抽滤，抽滤所得固体物真空干燥，得到黄色固体目标化合物。产率89%，mp:316-317℃;¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):2.51(s,3H);4.85(s,2H);6.41(m,1H),6.82(m,1H);7.04(s,1H);7.61(m,3H),8.11(m,2H),12.80(s,1H),13.20(s,1H).MS(ESI):312.2(C₁₇H₁₂O₆,[M+H]⁺)。

（3）、N-(1-乙基吡咯烷-2-甲基)-2-(5-羟基-4-氧-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7氧基)乙酰胺制备

将二环己基碳二亚胺(DCC,0.75g；3.372mmol)和20ml无水二氯甲烷的混合物滴入步骤（2）所得化合物（0.96g；3.06mmol)的40ml无水二氯甲烷溶液中，整个过程在冰浴中进行，滴加完毕后，在冰浴下反应12小时。将冰浴撤去，加入化合物2-(氨甲基)-1-乙基吡咯烷3.373mmol和三乙胺TEA(0.341g;3.372mmol)，在常温下搅拌12小时后，抽滤，将滤液浓缩至干，然后加入100ml乙酸乙酯，抽滤，滤液用稀碳酸钾溶液（浓度1wt％），饱和NaCl溶液分别洗涤3次，将有机相用稀HCl（0.30~0.40wt％）洗4次，合并水相，然后用碳酸钾调节溶液PH至7~8，接着用氯仿萃取水层4次，合并有机相后，正相硅胶分离，洗脱剂为环己烷：乙酸乙酯体积比=6：1的混合溶液，分离纯化目标化合物，得化合物1。¹HNMR(400MHz,CDCl₃-d₆)δ(ppm):1.02(3H);1.64(4H);2.23(4H);2.87(1H);3.38(2H);4.993(s,2H);6.393(d,J=2.2Hz,1H);6.707(d,J=2.2Hz,1H);6.997(s,1H);7.58(m,3H);8.05(m,2H);12.791(s,1H).¹³C NMR(400MHz,CDCl₃-d₆)δ(ppm):182.46,168.1,164.2,163.7,161.2,157.1,132.0,131.1,129.7,126.4,105.8,104.9,98.7,94.2,67.5,67.0,55.1,49.2,42.5,26.2,22.3,13.6.MS(ESI):422.21[M+H]⁺.

实施例2

5-羟基-7-(2-氧-2-哌嗪基乙氧基)-2-苯基-4H-苯并吡喃酮

将二环己基碳二亚胺(DCC,0.75g；3.372mmol)和20ml无水二氯甲烷的混合物滴入实施例1中步骤（2）所得化合物（0.96g；3.06mmol)的40ml无水二氯甲烷溶液中，整个过程在冰浴中进行，滴加完毕后，在冰浴下反应12小时。将冰浴撤去，加入化合物哌嗪3.373mmol和三乙胺TEA(0.341g;3.372mmol)，在常温下搅拌12小时后，抽滤，将滤液浓缩至干，然后加入80ml乙酸乙酯，抽滤，滤液用稀碳酸钾溶液（浓度1wt％），饱和NaCl溶液分别洗涤3次，将有机相用稀HCl（0.30~0.40wt％）洗3次，合并水相，然后用碳酸钾调节溶液PH至7~8，接着用氯仿萃取水层3次，合并有机相后，正相硅胶分离，洗脱剂为环己烷：乙酸乙酯体积比=6：1的混合溶液，分离纯化目标化合物，得化合物2。¹H NMR(300MHz,DMSO-d6,σppm):1.72(1H);2.91(4H);3.59(4H);4.81(s,2H);6.41(d,J=2.2Hz,1H);6.64(d,J=2.2Hz,1H);6.70(s,1H);7.28(m,2H);7.56(m,3H);7.90(m,2H);12.77(s,1H).¹³C NMR(DMSO-d6,σppm):182.5,165.3,164.2,163.7,162.3,157.8,132.0,131.1,129.1,126.4,106.4,106.0,98.9,93.4,67.5,67.6,46.6,46.4,45.943.3.MS(ESI):380.14[M+H]⁺

实施例3

2-(5-羟基-4-氧-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧基)-N-(2-哌啶基乙基)乙酰胺

将二环己基碳二亚胺(DCC,0.75g；3.372mmol)和20ml无水二氯甲烷的混合物滴入实施例1中步骤（2）所得化合物（0.96g；3.06mmol)的40ml无水二氯甲烷溶液中，整个过程在冰浴中进行，滴加完毕后，在冰浴下反应12小时。将冰浴撤去，加入化合物1-（2-氨基乙基）哌啶3.373mmol和三乙胺TEA(0.341g；3.372mmol)，在常温下搅拌12小时后，抽滤，将滤液浓缩至干，然后加入100ml乙酸乙酯，抽滤，滤液用稀碳酸钾溶液（浓度1wt％），饱和NaCl溶液分别洗涤3次，将有机相用稀HCl（0.30~0.40wt％）洗3次，合并水相，然后用碳酸钾调节溶液PH至7~8，接着用氯仿萃取水层3次，合并有机相后，正相硅胶分离，洗脱剂为环己烷：乙酸乙酯体积比=6：1的混合溶液，分离纯化目标化合物，得化合物3。¹HNMR（400MHz,CDCl₃-d₆）δ(ppm):1.69~1.23(m,6H,CH₂)2.48~2.38(m,6H,CH₂);3.43(m,2H,CH₂);5.32(s,2H,CH₂);6.44(s,1H,ArH);6.55(s,1H,ArH);6.72(s,1H,CH);7.57(m,3H,ArH);7.92(m,2H,ArH),12.78(s,1H,OH).MS(ESI):423.2[M+H]⁺

实施例4

N-(2-二甲氨基)-2-(5-羟基-4-氧-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧基)乙酰胺

将二环己基碳二亚胺(DCC,0.75g；3.372mmol)和20ml无水二氯甲烷的混合物滴入实施例1中步骤（2）所得化合物（0.96g；3.06mmol)的40ml无水二氯甲烷溶液中，整个过程在冰浴中进行，滴加完毕后，在冰浴下反应12小时。将冰浴撤去，加入化合物N,N-二甲基乙二胺3.373mmol和三乙胺TEA(0.341g;3.372mmol)，在常温下搅拌12小时后，抽滤，将滤液浓缩至干，然后加入100ml乙酸乙酯，抽滤，滤液用稀碳酸钾溶液（浓度1wt％），饱和NaCl溶液分别洗涤3次，将有机相用稀HCl（0.30~0.40wt％）洗3次，合并水相，然后用碳酸钾调节溶液PH至7~8，接着用氯仿萃取水层3次，合并有机相后，正相硅胶分离，洗脱剂为环己烷：乙酸乙酯体积比=6：1的混合溶液，分离纯化目标化合物，得化合物4。¹HNMR（400MHz,CDCl₃-d₆）δ(ppm):2.24(s,6H,CH₃);3.44(m,2H,CH₂);4.57(s,2H,CH₂);6.42(s,1H,ArH);6.53(s,1H,ArH);6.69(s,1H,ArH);7.55(m,3H,ArH);7.89(m,2H,ArH);12.73(s,1H,OH).MS(ESI):383.2[M+H]⁺

实施例5

N-(2-二乙氨基)-2-(5-羟基-4-氧-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧基)乙酰胺

将二环己基碳二亚胺(DCC,0.75g；3.372mmol)和20ml无水二氯甲烷的混合物滴入实施例1中步骤（2）所得化合物（0.96g；3.06mmol)的40ml无水二氯甲烷溶液中，整个过程在冰浴中进行，滴加完毕后，在冰浴下反应12小时。将冰浴撤去，加入化合物N,N-二乙基乙二胺3.373mmol和三乙胺TEA(0.341g;3.372mmol)，在常温下搅拌12小时后，抽滤，将滤液浓缩至干，然后加入100ml乙酸乙酯，抽滤，滤液用稀碳酸钾溶液（浓度1wt％），饱和NaCl溶液分别洗涤3次，将有机相用稀HCl（0.30~0.40wt％）洗3次，合并水相，然后用碳酸钾调节溶液PH至7~8，接着用氯仿萃取水层3次，合并有机相后，正相硅胶分离，洗脱剂为环己烷：乙酸乙酯体积比=6：1的混合溶液，分离纯化目标化合物，得化合物5。¹HNMR（400MHz,CDCl₃-d₆）δ(ppm):0.87~1.06(m,6H,CH₂);2.50~2.59(m,6H,CH₂);3.39(m,2H,CH₂);4.60(s,2H,CH₂);6.42(s,1H,ArH);6.53(s,1H,ArH);6.71(s,1H,CH);7.55(m,3H,ArH);7.90(m,2H,ArH),12.75(s,1H,OH)。¹³C NMR(400MHz,CDCl₃-d₆):182.5,167.0,164.3,163.0,162.4,157.8,132.0,131.0,129.1,126.3,106.5,106.0,99.1,93.0,67.5,53.7,49.6,39.6,13.3.MS(ESI):410.15[M+H]⁺

实施例6

7-[2-(1,4'-吡啶基)-2-氧乙氧基]-5羟基-2-苯基-4H-苯并吡喃-4-酮

将二环己基碳二亚胺(DCC,0.75g；3.372mmol)和20ml无水二氯甲烷的混合物滴入实施例1中步骤（2）所得化合物（0.96g；3.06mmol)的40ml无水二氯甲烷溶液中，整个过程在冰浴中进行，滴加完毕后，在冰浴下反应12小时。将冰浴撤去，加入化合物4-哌啶基哌啶3.373mmol和三乙胺TEA(0.341g;3.372mmol)，在常温下搅拌12小时后，抽滤，将滤液浓缩至干，然后加入100ml乙酸乙酯，抽滤，滤液用稀碳酸钾溶液（浓度1wt％），饱和NaCl溶液分别洗涤3次，将有机相用稀HCl（0.30~0.40wt％）洗3次，合并水相，然后用碳酸钾调节溶液PH至7~8，接着用氯仿萃取水层3次，合并有机相后，正相硅胶分离，洗脱剂为环己烷：乙酸乙酯体积比=6：1的混合溶液，分离纯化目标化合物，得化合物6。¹HNMR（400MHz,CDCl₃-d₆）δ(ppm):1.45~2.01(m,10H,CH₂);2.50(m,5H,CH₂,CH);2.65(m,1H,CH₂);2.63~4.64(4×m,4H,CH₂);4.79(s,2H,CH₂);6.41(s,1H,ArH);6.62(s,1H,ArH);6.69(s,1H,ArH);7.54(m,3H,ArH);7.91(m,2H,ArH);12.74(s,1H,OH)。ESI-MS m/z：463[M+H]⁺

对实施例1-6所获得化合物1－6进行了肿瘤细胞增殖抑制试验研究，相关的药理实验方法及结果如下：

实施例7

本发明的药理实验采用四氮唑盐还原法（MTT分析法）。实验是基于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原成水不溶性的紫蓝色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在λ570nm处测定其吸光值，可间接反映活细胞的数量。在一定的细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

实验方法：取处于对数生长期的肿瘤细胞，接种96孔板中（细胞密度6×10⁴cell/ml），每孔100μl。将96孔板按列分组，每组6个复孔。分为模型对照组（NS）；药物组（每种药物设6个浓度梯度，终浓度为：5，12.5，25，50，75，100μmol/L）。在细胞贴壁并生长融合至60~70%加药处理48h后，每孔加入MTT（1g/L）10μl，平面混合后，置于培养箱中继续孵育4h，然后弃去各孔中的上清液，再加入100μl DMSO，平面震荡混匀10min，待其各孔中的紫色结晶完全溶解后，置于酶标仪下测定各孔中的OD值（λ570nm）。按下面公式计算细胞增殖抑制率（IR）：IR(％)＝（1－平均ODtreated group）/平均ODtreated group×100％。

表1评价了6个化合物（1-6）及白杨素分别对体外培养的4种肿瘤细胞EC109（食管癌）、HepG2（肝癌）、SW480（结肠癌）、Hela（宫颈癌）的抑制活性。采用MTT法，作用时间48h，根据抑制进行线性回归，求得药物的半数抑制浓度（IC₅₀）。实验结果见表1。

表1各化合物对各瘤株的IC₅₀(48h)

从表1中可以看出，对于EC109、HepG2、SW480、Hela四种瘤细胞，化合物1-6的IC₅₀均低于白杨素的IC₅₀值，证明结构改造后的白杨素活性均有提高，其中化合物4表现出的活性作用尤为突出。

实施例8

实施例7表明化合物4具有很强的抑制肿瘤细胞作用，因此我们又研究了其对荷S180肉瘤小鼠体内抗肿瘤及毒性研究，实验方法与结果如下：

1材料

1.1实验材料

化合物4为本实验室制备，纯度大于99%。

顺铂（Cisplatin,CDDP）注射粉针剂(齐鲁制药有限公司，批号809021CE)，氯化钠注射液（武汉滨湖双鹤药业有限责任公司，批号090325505）。

1.2实验动物及瘤株

昆明种小鼠，雌雄各半，体重18～20克，由湖北省疾病预防控制中心提供S₁₈₀腹水瘤细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。

1.3实验仪器

超净工作台，电子天平，酶标仪等。

2方法

2.1药液的配制

化合物4溶液的配制：分别取实施例4制得的化合物4 30、60、120mg，加入生理盐水并用0.1mol/L的NaOH调pH为7～9，配成40ml的溶液，得化合物4的低、中、高三种药液。

空白组与模型组药液的配制：取生理盐水50ml，用0.1mol/L的NaOH调pH在7～9，即得。

顺铂组药液的配制：30mg CDDP溶于40ml氯化钠注射液中，即得。

2.2 S₁₈₀腹水瘤细胞悬液的制备

无菌条件下操作，取接种6d的S₁₈₀腹水型荷瘤小鼠，处死，将其浸泡于75%酒精中1min，用5ml一次性无菌注射器穿入腹腔，吸取肿瘤细胞生长良好的腹水6ml，用灭菌生理盐水溶液按1:4的比例稀释。

2.3昆明种小鼠移植S₁₈₀肉瘤模型的建立

取体重20g左右的昆明种小鼠，随机分成6组，每组10只，分别为空白组、模型组、顺铂组、化合物4低、中、高剂量组。其中模型组、顺铂组、化合物4低、中、高剂量组每只0.2ml悬液接种于右前肢腋窝皮下，空白组不做任何处理。

2.4给药方法

空白组与模型组：每日1次，腹腔注射0.2ml/10g的生理盐水；顺铂组与化合物4低剂量组腹腔注射15mg/kg的给药剂量、化合物4中剂量组腹腔注射30mg/kg的给药剂量、化合物4高剂量组腹腔注射60mg/kg的给药剂量，每日1次，连续10d。

2.5指标检测

给药10d后停止给药，在末次给药24h后，先眼眶取血1ml，放入抗凝EP管中保存。再将小鼠颈椎脱臼处死，迅速解剖剥取瘤块、脾脏和胸腺并称重。血样标本进行血常规及肝肾功能检测。抑瘤率、脾脏指数、胸腺指数按下式计算：

抑瘤率（%）=（对照组平均瘤重（g）-实验组平均瘤重（g））/对照组平均瘤重（g）×100%

脾脏指数（%）=10×脾脏重（mg）/小鼠体重（g）

胸腺指数（%）=10×胸腺重（mg）/小鼠体重（g）

2.6统计学方法

各组数据以表示，组间差异用t检验。

3结果

3.1小鼠的一般状况

化合物4各剂量组小鼠饮食、活动、毛发、粪便均正常，未见药物引起的病变和中毒现象，与模型组比较，化合物4各剂量组小鼠体重无显著变化。但顺铂组体重明显减轻，与模型组相比有显著性差异（P<0.01），结果见表2。

表2化合物4对S180荷瘤小鼠的体重的影响

体重：＊P<0.05，＊＊P<0.01vs模型组。

3.2不同剂量化合物4对S₁₈₀荷瘤小鼠抑瘤率的影响

小鼠和瘤体的外观变化：各组小鼠接种后3d内，外观无明显变化，活动饮食正常。随后4、5天可在右侧腋下触及如米粒样肿块，以后肿瘤逐日增大，模型组肿瘤生长较快，其它各组肿瘤生长相对缓慢，顺铂组小鼠生长活动状况最差。

对荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用：接种后，小鼠成瘤率100%。且整个实验过程中小鼠无一例死亡。模型组小鼠肿瘤重量基本上在1g左右，说明S180荷瘤小鼠模型成功。实验显示，化合物4低、中、高剂量组对荷瘤小鼠的肿瘤生长具有明显的抑制作用，抑制率分别为60.9%、63.3%和73.4%。与顺铂组相比，无显著性差异。结果见表3。.

3.3不同剂量化合物4对S₁₈₀荷瘤小鼠免疫器官重量及其指数的影响

对荷瘤小鼠免疫器官指数的影响：顺铂组胸腺指数与模型组相比明显下降（＊＊P<0.01），低剂量（15mg/kg）给药组与模型组相比无显著性差异，化合物4中剂量组（30mg/kg）小于模型组（＊P<0.05），化合物4高剂量组（60mg/kg）明显小于模型组（＊＊P<0.01），顺铂组脾脏指数与模型组比较明显下降（＊＊P<0.01），化合物4低、中、高剂量给药组与模型组相比均无显著性差异，结果如表3。

表3化合物4对荷S180肉瘤小鼠肿瘤抑制作用及对免疫器官的影响

瘤重、脾脏、胸腺指数＊P<0.05，＊＊P<0.01VS模型组

3.4不同剂量化合物4对荷瘤小鼠血常规的影响

15mg/kg的顺铂可明显降低S180荷瘤小鼠的白细胞数，而化合物4在15mg/kg、30mg/kg的剂量时对S180小鼠没有明显抑制骨髓造血功能而使白细胞减少（P>0.05），60mg/kg的剂量时有抑制作用（＊＊P<0.01）。对于血小板指标，反而给药组在中、高剂量时有显著提升血小板数的作用，说明化合物4对其造血系统和免疫系统没有明显抑制作用，反而可能有促进其功能的作用，结果见表4。

表4化合物4对荷S180肉瘤小鼠血常规的影响

＊P<0.05，＊＊P<0.01VS模型组

3.5化合物4对荷瘤小鼠肝肾功能的影响

肝功能方面，化合物4各剂量组ALT/AST水平与模型组相比基本上无显著性差异（P>0.05），说明化合物4对小鼠没有造成明显的肝功能损伤；肾功能方面，顺铂组LDH，BUN，UA与模型组相比，具有显著性差异（＊＊P<0.01），化合物4低剂量组的LDH，BUN，UA，CRE水平与空白组相比无显著性差异，表明化合物4对肾功能无明显的损伤，结果见表5。

表5化合物4对荷S180肉瘤小鼠肝肾功能的影响

＊P<0.05，＊＊P<0.01VS模型组

3.6不同剂量化合物4对荷瘤小鼠血脂的影响

化合物4各给药剂量组TCHO、LDLC水平与模型组相比无显著性差异，而TG水平与模型组相比，高剂量组具有显著性差异（＊＊P<0.01），结果见表6。

表6化合物4对荷S180肉瘤小鼠血脂的影响

＊P<0.05，＊＊P<0.01vs模型组

实施例9

采用经典的正辛醇-水体系测定各化合物的油水分配系数，结果见表7。由表可知，实施例1-6制备的6个白杨素衍生物的油水分配系数均要优于白杨素，其成药性更好。

表7各化合物的油水分配系数lgP

结论：

在对化合物4进行初步体外抗肿瘤活性评价，显示其较强的抗肿瘤活性之后，我们建立了S180荷瘤小鼠模型进行体内抗肿瘤实验，实验过程中我们发现，模型组小鼠肿瘤生长良好，随着给药天数的增加，肿瘤逐渐长大，且各给药组小鼠肿瘤明显小于模型组，肿瘤大小随着给药浓度呈现一定的量效关系；各组小鼠生长状态良好，顺铂组小鼠生长状况稍差；顺铂组与化合物4各剂量组均具有较好的抑瘤率，与模型组相比均表现出显著性差异（P<0.01），由此可见化合物4对肿瘤细胞具有一定的抑制作用。随后我们对各组小鼠胸腺、脾脏称重并计算出胸腺、脾脏指数，结果表明，化合物4各剂量组小鼠胸腺、脾脏与模型组无显著差异，由此可说明化合物4对免疫器官无明显损伤。对所取血样进行血常规、肝肾功能和血脂的检测，我们通过白细胞、红细胞、血红蛋白和血小板四项指标来观察药物对免疫器官的影响。从结果中我们可看出，化合物4各剂量组的白细胞与模型组相比，均不呈现显著性差异，指标正常，说明化合物4对免疫系统无损失作用；化合物4各剂量组的血小板与模型组相比，均无显著性差异，说明化合物4对造血系统无明显的抑制作用。在肝肾功能的检测中，谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）活性的改变是肝功能受损的两个敏感性指标，而尿素氮（BUN）是评价肾脏功能的一个重要指标。通过实验考察，化合物4没有造成明显的肝肾功能损伤。最后通过对血脂的检测，发现对心血管系统方面无明显的药物毒性，上述结果表明化合物4有显著的药理活性与良好的安全性，且油水分配系数更适合成药性，有望成为拥有我国自主知识产权的一类治疗癌症的新型药物。

Claims (5)

1.结构式为 或者的化合物。

2.结构式为的化合物。

3.权利要求1或2所述的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.权利要求1或2所述的化合物在药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.一种药物组合物，其特征在于：该组合物由权利要求1或2所述的化合物和药学上可接受的赋形剂组成。