CN101524546A - 聚乙二醇和姜黄素衍生物缀合的缀合物 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物化学领域，具体而言，本发明涉及式1的聚乙二醇和姜黄素衍生物缀合的缀合物或其药学上可接受的盐，其中，R1和R2彼此独立地选自硝基、氨基、二低级烷基氨基和低级烷氧基；R3和R4彼此独立地选自卤素、硝基和氢；R5是低级烷基或氢；R6是氢，或是任选用低级烷基、硝基、羟基或巯基取代的低级烷基；而且n为1或2。该缀合物具有很好的水溶性，克服了姜黄素水溶性差、生物利用度低等缺点，制备成本低，并且具有较好的抗肿瘤活性。另外，本申请还涉及基于该缀合物的药物组合物、制备方法以及作为药物方面的应用。

Description

聚乙二醇和姜黄素衍生物缀合的缀合物

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体而言，本发明涉及可生物降解的姜黄素衍生物与聚乙二醇缀合的缀合物。另外，本申请还涉及基于该缀合物的药物组合物、制备方法以及作为药物方面的应用。

背景技术

姜黄素(Curcumin，下文简称为Cur)为一种多酚类衍生物，为姜科植物姜黄块根中的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗诱变、抗衰老、抗HIV病毒、降血脂、抗动脉粥样硬化、药物增敏及抗肿瘤等多种药理活性；对心血管疾病、神经性病变及癌症等疾病具有一定的预防和治疗作用。美国国立癌症研究所已将其列为第三代防癌药物，并于2000年列入美国药典；2001年国立台湾大学医学院完成了对高危或癌前病变患者一期临床实验，结果表明，姜黄素具有化学防癌作用，患者口服姜黄素具有较好耐受性，最大剂量可达8.0g/天，并无明显毒副作用(Cheng AL，Hsu CH，Lin JK，et al.Phase I clinical trial of curcumin，a chemopreventive agent，in patients with high-risk or pre-malignant lesions[J].Anticancer Res.2001，21(4B)：2895-900.)；2006年M.D.安德森癌症中心已完成姜黄素对晚期胰腺癌患者疗效二期临床评估，结果表明，姜黄素对晚期胰腺癌有生物学活性(N.Dhillon，R.A.Wolff，J.L.Abbruzzese，et al.Phase IIclinical trial of curcumin in patients with advanced pancreatic cancer[J].Journal of ClinicalOncology，2006，24(18s)：14151.)。另外，姜黄素衍生物也被开发出来了，如四氢姜黄素、四氢脱甲氧基姜黄素、四氢双脱甲氧基姜黄素等(EP1108419A；WO2003/088927A)，也保留了姜黄素的抗癌活性，并带来了诸如雄激素拮抗性等作用。

尽管姜黄素毒副作用少，并具有多种很好的药理活性，但其不稳定，在无血清的培养液中，30min内90％被降解(Wang YJ，Pan MH，Cheng AL，et al.Stability of curcumin in buffersolutions and characterization of its degradation products[J].J Pharm BiomedAnal.1997，15：1867-1876.)；另外，其水溶性差、胃肠道吸收差，因而生物利用度低，例如，口服2g纯姜黄素，1h后检测血药浓度不到10ng/ml(Shoba G，Joy D，Joseph T，et al.Influenceof piperine on the pharmacokinetics of curcumin in animals and human volunteers[J].PlantaMed，1998，64：353-356.)；还有，其体内代谢迅速，直接静脉注射5h内50％以上姜黄素经胆汁排泄(Ravindranath V，Chandrasekhara N.In vitro studies on the intestinal absorption ofcurcumin in rats[J].Toxicol，1981，20：251-257.)。

由于上述缺陷的存在，因而限制了姜黄素进一步的临床应用。为此，众多学者采用了多种方法来克服部分或全部上述缺陷。例如，有人采用改进剂型的方法，如脂质体、固体分散体、环糊精复合物、壳聚糖复合物、生物可降解微球及自微乳化制剂等，以试图改进姜黄素特性促进临床应用(如参见中国专利申请第200510042547.9号、第200610027827.7号、第CN200610026576.0号)。但是，这些方案使用大量乳化剂和助溶剂，会引起消化道刺激反应，并可能存在软胶囊中药物迁移和渗漏问题，而且都没有从根本上解决机体首关效应及姜黄素体内代谢迅速等问题；另外，以上配方复杂，所用乳化剂静注可能存在安全性问题，而且某些制备工艺繁琐，成本高。

近年来，聚乙二醇在配制药物中的应用也越来越引起人们的重视。聚乙二醇具有两亲性，生物相容性好。在人体内，聚乙二醇主要以完整的分子形式通过肝脏(PEG＞20kDa)和肾脏(PEG＜30kDa)排泄，毒副作用小；大分子聚乙二醇对小分子药物起保护作用，能改善其体内组织分布，减小毒副作用，并可延长药物血液循环半衰期。此外，由于正常组织血管内皮细胞排列紧密，大分子聚乙二醇难以像小分子药物透过血管。而在类似于肿瘤等病变组织，新生血管丰富，而且血管内皮细胞彼此连接疏松间隙较大；因此大分子聚乙二醇药物可以透过进入病变组织，增加药物在病变组织的分布，增强疗效。因此，人们采用聚乙二醇与姜黄素形成新的剂型、给药系统、或负载体(中国专利第03143234.4号；WO2005079856A；WO9921908A；JP6128120A；Salmaso S，et al.New cyclodextrin bioconjugates for active tumourtargeting[J].JOURNAL OF DRUG TARGETING，2007，15：379-390；袁巍.姜黄色素和聚乙二醇负载姜黄素抑制肿瘤作用的实验研究.浙江中医学院硕士论文(内部资料))。但是，这些方案仍旧会存在配方复杂，制备工艺步骤多，成本高等缺陷。

为此，本发明人经过长期研究，获得了一种姜黄素衍生物与聚乙二醇通过接头共价缀合的缀合物，它不但水溶性好，生物利用度高，生物相容性好，毒副作用小，而且能够保留姜黄素原有药理活性，使以其为活性成分的剂型稳定，易于长期保存，适合于大批量工业化生产，更能够适合目前临床应用。尽管通常在缀合物中不重视对接头的选择，但是尤其令人惊讶的是，我们发现选择含有柔性氨基酸残基的接头具有更高的抗肿瘤的活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种聚乙二醇与姜黄素衍生物通过接头共价缀合的缀合物，其水溶性高、生物相容性好并且具有姜黄素衍生物的药理活性，尤其是其中含有柔性氨基酸残基的的接头结构，能够显著提高抗肿瘤活性。本发明的目的还在于提供了包含该缀合物的药物组合物，其毒副作用小、稳定性好、疗效好，并且可生物降解的，适于静脉注射和大批量工业化生产。另外，本发明还提供了这类缀合物的药物应用以及制备方法。

具体而言，在第一方面，本发明提供了式1的聚乙二醇和姜黄素衍生物缀合的缀合物或其药学上可接受的盐：

式I

其中，R1和R2彼此独立地选自硝基、氨基、二低级烷基氨基和低级烷氧基；

R3和R4彼此独立地选自卤素、硝基和氢；

R5是低级烷基或氢；

R6是氢，或是任选用低级烷基、硝基、羟基或巯基取代的低级烷基；和

n为1或2。

在本文中，“缀合”指的是小分子(如，姜黄素)和聚合物(如，聚乙二醇)任选通过接头的共价连接。因此，“缀合物”就是这种共价连接的产物。另外在本文中，“低级烷基”指的是具有1至6个碳的烷基。因此，“低级烷氧基”指的是具有1至6个碳的烷氧基。在本文中，“药学上可接受的盐”指适于与人或动物的组织接触而且无过多的毒性、刺激或变态反应等的盐。与本发明的缀合物成的盐基本上不改缀合物的活性。例如，通常能与本发明的缀合物成盐的酸有盐酸、磷酸、硫酸、乙酸、琥珀酸、马来酸、柠檬酸等；能与本发明的缀合物成盐的碱有碱金属或碱土金属的氢氧化物、铵等。

其中，如式I所示，用于连接姜黄素衍生物和聚乙二醇的接头包括柔性氨基酸残基，其通过肽键和酯键分别与聚乙二醇和姜黄素衍生物连接，这样可以在生物体内通过水解或酶解而降解，释放出作为药物的姜黄素衍生物，发挥药效。而且，尤其令人惊讶的是，包含柔性氨基酸残基的接头而形成的缀合物药用活性明显较丁二酸为接头的缀合物高。

在优选的情况下，接头中的R6可以是氢，或可以是低级烷基。例如，在本发明中，接头中的柔性氨基酸残基可选自如下任一种氨基酸的残基：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、丝氨酸和苏氨酸，更优选所述氨基酸残基是L-型氨基酸的残基，更优选是甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的残基。在本发明的一个具体实施方式中，R6是氢，即接头中包含的是甘氨酸(下文简称为Gly)的残基。

如式I所示，接头共价连接在姜黄素衍生物的酚羟基上。在本文中，“姜黄素衍生物”是姜黄素或其衍生物，它可以是现有技术中已经公开的姜黄素衍生物，包括但不限于如EP1108419A、WO2003/088927A中所述的那些。优选式I中姜黄素衍生物上的R1和R2彼此独立地是低级烷氧基；R3和R4彼此独立地是氢；和/或，R5是低级烷基或氢。在本发明的一个具体实施方式中，姜黄素衍生物是姜黄素，即R1和R2是甲氧基；R3和R4是氢；和，R5是氢。

在式I中，接头共价连接在聚乙二醇(下文简称为PEG)的末端羟基上。在本文中，如果没有其他的指示，聚乙二醇(PEG)指的是具有末端羟基基团的乙二醇结构重复连接而成的聚合物。完全由乙二醇结构重复连接而成的聚乙二醇具有两个末端羟基基团，因此这样一分子的聚乙二醇可以结合两分子的接头和姜黄素衍生物；而只有一个末端羟基基团的聚乙二醇(如单甲氧基聚乙二醇(mPEG)，其一个末端羟基的氢被取代)，这样的聚乙二醇仅可以一分子结合一分子接头和姜黄素衍生物。在本发明的具体实施方式中，当PEG表示具有两个末端羟基的聚乙二醇时，式I中的n为2；而PEG表示只有一个末端羟基基团的聚乙二醇(如，单甲氧基聚乙二醇(mPEG))时，n为1。在本发明中，PEG的分子量为1000至30000Da，优选为1500至10000Da，更优选为2000至6000Da。在本发明的具体实施方式中，分别使用了分子量为2000Da和5000Da的单甲氧基聚乙二醇(即mPEG_2k和mPEG_5k)、以及分子量为6000Da的聚乙二醇(即PEG_6k)。

在第二方面，本发明提供了药物组合物，其包括本发明第一方面所述的缀合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。在本文中，“药学上可接受的载体”指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、缓冲剂、保护剂、防腐剂、包裹材料或其他制剂辅料。根据本领域的公知技术，可以根据治疗目的、给药途径的需要将药物组合物制成各种剂型，优选该组合物为单位剂量形式，如固体制剂有片剂、膜剂、丸剂、胶囊、粉剂、粉针剂、或颗粒剂等，而液体制剂有糖浆剂和乳液剂、注射用溶液或悬浮液、气雾剂或液体喷剂、滴剂、或针剂等。本发明的药物组合物优选是注射剂，更优选为静脉注射剂。例如，可以用生理盐水或其他生理等渗液溶解本发明第一方面所述的缀合物，配制成静脉注射剂。

本发明的药物组合物可用于姜黄素衍生物所能治疗的病况中，如用于抗炎、抗氧化、抗诱变、抗衰老、抗HIV病毒、降血脂、抗动脉粥样硬化、药物增敏、或抗肿瘤等，尤其可用于抗肿瘤。因此，在第三方面，本发明提供了本发明第一方面所述的缀合物或其药学上可接受的盐或本发明第二方面所述的药物组合物在制备抗肿瘤的药物中的应用。根据剂型，本发明的药物组合物可通过所属领域技术人员所熟知的给药方式来进行给药，例如口服、直肠、舌下、肺部、透皮、离子透入、阴道及鼻内给药。本发明的药物组合物优选胃肠道外给药，如静脉注射。给药剂量根据制剂形式和期望的作用时间以及治疗对象的情况而有所变化，实际治疗所需的量可以由医师根据实际情况(如，病人的病情、体重等)而方便地确定。对于一般的成人，本发明的药物组合物的剂量，以式I所示的缀合物计，可以是每kg成人体重1ng-10g，优选是每kg体重100μg-100mg，最优选的是每kg 1mg-10mg。

在第四方面，本发明提供了本发明第一方面所述的缀合物的制备方法，其包括(1)聚乙二醇活化；(2)氨基酸连接；和(3)姜黄素衍生物连接。该制备方法包括三步合成步骤，具有收率高、方法简单而经济、适合工业化生产等优点。具体而言，该制备方法包括以下步骤：

(1)用氯甲酸对硝基苯酯活化聚乙二醇末端羟基，得到活化产物；

(2)将步骤(1)所得的活化产物与式II所示的氨基酸连接，得到连接产物：

式II

其中，R6是氢，或是任选用低级烷基、硝基、羟基或巯基取代的低级烷基；

(3)将步骤(2)所得的连接产物与式III所示的姜黄素衍生物连接：

式III

其中，R1和R2彼此独立地选自硝基、氨基、二低级烷基氨基和低级烷氧基；

R3和R4彼此独立地选自卤素、硝基和氢；和

R5是低级烷基或氢。

在上述制备方法中，在步骤(1)、(2)和/或(3)中还进一步包括结晶步骤。具体而言，在步骤(1)的聚乙二醇活化中，用氯甲酸对硝基苯酯(下文简称为pNPC)在碱性条件下，在溶剂中，活化聚乙二醇末端羟基；然后，在无水条件下、室温避光反应6～12h，减压浓缩，无水乙醚析晶；产物用干燥二氯甲烷溶解，无水乙醚重结晶，室温真空干燥得PEG-(pNP)_n；其中n为1或2。

优选在步骤(1)中用氯甲酸对硝基苯酯活化聚乙二醇末端羟基时，所使用的溶剂选自无水的N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、氯仿和二氯甲烷，优选为干燥的二氯甲烷；氯甲酸对硝基苯酯和聚乙二醇的投料摩尔比大于1.5n∶1，优选为3n∶1，其中n为1或2；和/或优选在氯甲酸对硝基苯酯活化聚乙二醇末端羟基时，在碱性条件下进行，其中所用pH调节剂为干燥的三乙胺或吡啶(下文简称为Py)，优选为干燥的吡啶。

在步骤(2)的氨基酸连接中，将PEG-(pNP)_n与式II所示的氨基酸以小于1∶4n的摩尔比(优选为1∶8n)溶于蒸馏水，用三乙胺或碳酸氢钠调节pH至8～9，在室温下搅拌反应6～12h，用浓盐酸调节pH至2，用乙醚萃取，然后水相再用氯仿萃取，收集氯仿层，无水硫酸镁干燥，抽滤，收集氯仿层，减压浓缩，无水乙醚析晶，得PEG-(OCO-氨基酸)_n；其中n为1或2。

在步骤(3)的姜黄素连接中，将PEG-(OCO-氨基酸)_n与式II所示的姜黄素衍生物混合，其摩尔比1∶1.5n至1∶3.5n，优选1∶2n；将反应物溶于干燥二氯甲烷，加入4-二甲基氨基吡啶(下文简称为DMAP)做催化剂，并加入N，N-二环己基碳二亚胺(下文简称为DCC)为缩合剂，于冰浴反应12～24h；过滤除去二环己基脲(下文简称为DCU)，滤液减压浓缩，用干燥异丙醇于4℃析晶，抽滤，产物重新用干燥二氯甲烷溶解，干燥异丙醇重结晶，得产物PEG-(OCO-氨基酸-姜黄素衍生物)_n；其中n为1或2。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。另外，本发明引用了公开文献，这些文献也是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本发明进行参考，就好像它们的全文已经在本发明说明书中重复叙述过一样。

附图说明

图1：mPEG_2K-OCO-Gly ¹H-NMR谱图。

图2：mPEG_2K-OCO-Gly-Cur ¹H-NMR谱图。

图3：mPEG_2K-Suc ¹H-NMR谱图。

图4：mPEG_2K-Suc-Cur ¹H-NMR谱图。

具体实施方案

以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《有机合成试剂制备手册》(科学出版社，北京，2005年)、《实用精细有机合成手册》(化学工业出版社，北京，2000年)、《PROTECTIVE GROUPS IN ORGANICSYNTHESIS，》(A WILEY-INTERSCIENCE PUBLICATION，New York，1999)等手册以及本文所引用的参考文献中所列的方法来实施。另外，实施例中所使用的材料除有特别说明外，均可通过商业途径从市场上购买。

实施例1：单甲氧基聚乙二醇 _2k -OCO-甘氨酸-姜黄素(mPEG _2K -OCO-Gly-Cur)的合成

1、mPEG_2K-pNC的合成：称取mPEG_2K(购自Fluka公司)20.0g(10.0mmol)，加入100ml甲苯溶解，60℃减压蒸除；加入200ml临时干燥的CH₂Cl₂溶解，然后称取pNPC6.465g(30.0mmol)加入上述体系，搅拌加入6ml临时干燥Py，室温(20℃左右)避光搅拌反应约12h；35℃左右减压浓缩，用1000ml无水乙醚4℃析晶2h；抽滤，无水乙醚润洗，无水乙醚重结晶一次，真空干燥的白色产物20.85g，收率96.32％。

准确称取上述产物适量，用0.1M NaOH溶解，于402nm测定吸光度值，根据摩尔吸光系数18400cm^-1M^-1计算释放的对硝基苯酚量，推算得产物纯度大于93.5％。

2、mPEG_2K-OCO-Gly的合成：称取甘氨酸3.028g(40.0mmol)，用90ml蒸馏水溶解，加入60ml乙腈(H₂O/CH₃CN＝3/2)和10.825g(5.0mmol)mPEG_2k-pNC，用三乙胺调节体系pH值在8.5，室温搅拌反应12h左右；反应完毕后，体系用浓盐酸调节pH至2左右，500ml乙醚萃取，然后水相再用500ml氯仿萃取，合并氯仿层，加入大量无水MgSO₄干燥过夜；抽滤，浓缩，500ml无水乙醚析晶，真空干燥得产物9.696g，收率92.3％。

准确称取上述产物适量，用0.01M NaOH滴定羧基含量，推算得产物纯度大于88.69％。所得产物¹H-NMR见图1。

3、mPEG_2K-OCO-Gly-Cur的合成：称取姜黄素(购自上海三爱思试剂有限公司)2.104g(5.711mmol)、DCC1.756g(8.567mmol)、DMAP 0.334g(2.856mmol)，用150ml临时干燥的CH₂Cl₂溶解，冰浴15min；然后称取mPEG_2K-OCO-Gly 6.0g(2.856mmol)，用30ml临时干燥的CH₂Cl₂溶解，并加入到上述体系，冰浴搅拌反应24h左右；反应完毕，减压浓缩，4℃冷藏析晶，抽滤除去DCU；滤液减压浓缩，趁热加入500ml临时干燥的异丙醇，体系呈浑浊，并置于-20℃冷藏过夜。抽滤，滤饼用异丙醇润洗数次，滤饼用适量干燥CH₂Cl₂重新溶解，加入干燥异丙醇-20℃重结晶，抽滤，异丙醇润洗，无水乙醚润洗，真空干燥，得产物6.71g，收率95.86％。

所得产物¹H-NMR见图2。

准确称取上述终产物50.0mg于洁净的玻璃试管中，每隔5min加入20μl双蒸水并摇晃促使产物溶解，加至80μl时全部溶解，澄清透明，计算得产物溶解度≥0.25μmol/μl，相对而言，姜黄素的溶解度仅为1.63×10^-6μmol/μl，增溶效果显著，这表明该法所制备的姜黄素缀合衍生物具有极大的水溶性，很好地解决了姜黄素水溶性问题。

实施例2：单甲氧基聚乙二醇 _5k -OCO-甘氨酸-姜黄素(mPEG _5K -OCO-Gly-Cur)的合成

其制备方法与实施例1基本相同，各步骤主要不同点为：

1、mPEG_5K-pNC的合成：称取mPEG_5K(购自Fluka公司)40.0g(8.0mmol)，加入200ml左右甲苯溶解，60℃减压蒸除；加入300ml临时干燥的CH₂Cl₂溶解，然后称取pNPC 7.257g(36.0mmol)加入上述体系，搅拌加入6ml临时干燥Py，室温避光搅拌反应12h；得产物39.86g，收率96.47％，纯度大于95.64％。

2、mPEG_5K-OCO-Gly合成：称取甘氨酸(下文简称为Gly)2.402g(32.0mmol)，用150ml蒸馏水溶解，加入100ml乙腈(H₂O/CH₃CN＝3/2)和20.66g(4.0mmol)mPEG_5k-pNC，用三乙胺调节体系pH值在8.5，室温搅拌反应12h左右；得产物19.56g，收率95.88％，纯度大于87.58％。

3、mPEG_5K-OCO-Gly-Cur合成：称取取姜黄素(购自上海三爱思试剂有限公司)1.449g(3.923mmol)、DCC 1.213g(5.881mmol)和DMAP 0.240g(1.960mmol)，用200ml临时干燥的CH₂Cl₂溶解，冰浴15min；然后称取mPEG_5K-OCO-Gly 10.0g(1.960mmol)，用30ml临时干燥的CH₂Cl₂溶解，并加入到上述体系，冰浴搅拌反应24h；得产物10.376g，收率97.04％。

准确称取上述终产物50.0mg于洁净的玻璃试管中，每隔5min加入20μl双蒸水并摇晃促使产物溶解，加至100μl时全部溶解，澄清透明，计算得产物溶解度≥0.09μmol/μl，相对而言，姜黄素的溶解度仅为1.63×10^-6μmol/μl，增溶效果显著；但稍比mPEG_2k为载体的缀合物溶解性差，这与PEG溶解度随分子量增大而降低一致。

实施例3：聚乙二醇 _6k -(OCO-甘氨酸-姜黄素) ₂ [PEG _6K -(OCO-Gly-Cur) ₂ ]的合成

制备方法与实施例1基本相同，各步骤主要不同点为：

1、PEG_6K-(pNC)₂合成：称取PEG_6K(购自Fluka公司)20.0g(3.33mmol)，加入150ml甲苯溶解，60℃减压蒸除；加入350ml临时干燥的CH₂Cl₂溶解，然后称取pNPC 4.031g(20.00mmol)加入上述体系，搅拌加入6ml临时干燥Py，室温避光搅拌反应约12h；得产物19.99g，收率94.84％，纯度大于93.12％。

2、PEG_6K-(OCO-Gly)₂合成：称取甘氨酸2.40g(32.0mmol)，用150ml蒸馏水溶解，加入100ml乙腈(H₂O/CH₃CN＝3/2)和12.66g(2.0mmol)PEG_6k-(pNC)₂，用三乙胺调节体系pH值在8.5，室温搅拌反应12h；得产物11.19g，收率90.21％，纯度大于86.92％。

3、PEG_6K-(OCO-Gly-Cur)₂合成：称取姜黄素2.21g(6.0mmol)、DCC 1.86g(6.0mmol)和DMAP 0.37g(3.0mmol)，用300ml临时干燥的CH₂Cl₂溶解，冰浴15min；然后称取PEG_6K-(OCO-Gly)₂9.30g(1.5mmol)，用50ml临时干燥的CH₂Cl₂溶解，并加入到上述体系，冰浴搅拌反应24h左右；得产物9.55g，收率92.27％。

实施例4(比较例1)：单甲氧基聚乙二醇 _2k -丁二酸-姜黄素(mPEG _2K -Suc-Cur)的合成

1、mPEG_2K-Suc合成：称取mPEG_2k 10.0g(5.0mmol)于圆底烧瓶中，加入50ml甲苯溶解，60℃减压除去甲苯；加入10ml临时干燥CHCl₃溶解，加入丁二酸(下文简称为Suc)2.0g(20.0mmol)和干燥的吡啶2.0ml，于60℃搅拌回流反应24h。反应完全后，取下圆底烧瓶于旋转蒸发仪60℃蒸发除去氯仿，冷却后用饱和碳酸氢钠冰浴溶解，浓盐酸调pH2，用氯仿萃取，合并氯仿层，加入无水硫酸镁干燥过夜。过滤，浓缩，无水乙醚析晶得产物9.5g，收率90.48％。

准确称取上述产物适量，用0.01M NaOH滴定羧基含量，推算得产物纯度大于97.5％。所得产物¹H-NMR见图3。

2、mPEG_2K-Suc-Cur合成：称取姜黄素1.47g(4.0mmol)和DMAP0.24g(2.0mmol)，用20ml临时干燥二氯甲烷溶解，然后加入上述产物mPEG_2K-Suc-Pro 4.2g(2.28mmol)，冰浴冷却后加入DCC 1.24g(6.0mmol)，冰浴搅拌反应24h；反应完毕后浓缩，4℃析晶，过滤除去DCU，浓缩，干燥异丙醇析晶；产物用二氯甲烷溶解，干燥异丙醇重结晶，真空干燥得产物4.51g，收率92.04％。

所得产物¹H-NMR见图4。

实施例5(比较例2)：单甲氧基聚乙二醇 _5k -丁二酸-姜黄素(mPEG _5K -Suc-Cur)的合成

制备方法基本与实施例4基本相同，各步骤主要不同点为：

1、mPEG_5K-Suc合成：称取mPEG_5k 25.0g(5.0mmol)于圆底烧瓶中，加入80ml甲苯溶解，60℃减压除去甲苯；加入20ml临时干燥CHCl₃溶解，加入Suc 2.0g(20.0mmol)和干燥吡啶2.0ml，于60℃搅拌回流反应24h；得产物mPEG_5K-Suc 23.5g，收率92.16％，纯度大于96.5％。

2、mPEG_5K-Suc-Cur合成：称取Cur 1.47g(4.0mmol)，DMAP 0.24g(2.0mmol)，用20ml临时干燥二氯甲烷溶解，然后加入上述产物mPEG_5K-Suc 10.2g(2.0mmol)，冰浴冷却后加入DCC 1.24g(6.0mmol)，冰浴搅拌反应24h；得产物10.14g，收率93.3％。

实施例6：姜黄素缀合物的抗肿瘤作用

将以上实施例制备的姜黄素缀合物加入到96孔板的孔中，处理48h，其中每个孔分别含有相应的人源肿瘤细胞株，其细胞密度为1.0×10⁴个/孔。检测不同浓度的姜黄素缀合物对各细胞株的抑制率，得出半抑制浓度(IC₅₀)。结果如表1所示，本发明的姜黄素缀合物对多种人源肿瘤细胞具有明显的抗肿瘤活性，而且令人惊讶的是，包含柔性氨基酸的接头的缀合物的活性比丁二酸接头的明显高约1倍。

表1姜黄素缀合物人源肿瘤细胞的抑制作用

Claims (10)

1，式1的聚乙二醇和姜黄素衍生物缀合的缀合物或其药学上可接受的盐：

式I

其中，R1和R2彼此独立地选自硝基、氨基、二低级烷基氨基和低级烷氧基；

R3和R4彼此独立地选自卤素、硝基和氢；

R5是低级烷基或氢；

R6是氢，或是任选用低级烷基、硝基、羟基或巯基取代的低级烷基；而且

n为1或2。

2，权利要求1所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中，

R1和R2彼此独立地是低级烷氧基；

R3和R4彼此独立地是氢；

R5是低级烷基或氢；和

R6是氢，或是低级烷基。

3，权利要求1或2所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中，

R1和R2是甲氧基；

R3和R4是氢；

R5是氢；和

R6是氢。

4，前述权利要求之任一所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中，PEG的分子量为1000至30000Da，优选为1500至10000Da，更优选为2000至6000Da。

5，药物组合物，其包括权利要求1-4之任一所述的缀合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。

6，权利要求5所述的药物组合物，其为注射剂，优选为静脉注射剂。

7，权利要求5或6所述的药物组合物，其用于抗肿瘤。

8，权利要求1-4之任一所述的缀合物或其药学上可接受的盐或权利要求5-7之任一所述的药物组合物在制备抗肿瘤的药物中的应用。

9，权利要求1-4之任一所述的缀合物的制备方法，其包括以下步骤：

(1)用氯甲酸对硝基苯酯活化聚乙二醇末端羟基，得到活化产物；

(2)将步骤(1)所得的活化产物与式II所示的氨基酸连接，得到连接产物：

式II

其中，R6是氢，或是任选用低级烷基、硝基、羟基或巯基取代的低级烷基；

(3)将步骤(2)所得的连接产物与式III所示的姜黄素衍生物连接：

式III

其中，R1和R2彼此独立地选自硝基、氨基、二低级烷基氨基和低级烷氧基；

R3和R4彼此独立地选自卤素、硝基和氢；和

R5是低级烷基或氢。

10，权利要求9所述的制备方法，其中在步骤(1)、(2)和/或(3)中包括结晶步骤。

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