CN101920019B - 亲水性聚合物-葛根素特异性缀合的非溶血性缀合物 - Google Patents
亲水性聚合物-葛根素特异性缀合的非溶血性缀合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101920019B CN101920019B CN2009100994891A CN200910099489A CN101920019B CN 101920019 B CN101920019 B CN 101920019B CN 2009100994891 A CN2009100994891 A CN 2009100994891A CN 200910099489 A CN200910099489 A CN 200910099489A CN 101920019 B CN101920019 B CN 101920019B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- puerarin
- conjugate
- group
- formula
- pharmaceutical composition
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Abstract
本发明涉及如式1所示的缀合物或其药学上可接受的盐。该缀合物具有很好的水溶性,克服了葛根素水溶性差、生物利用度低等缺点,并且极大减少了或消除了葛根素溶血性等不良反应,而且合成方法简单,制备成本低,适合工业化生产。另外,本申请还涉及基于该缀合物的药物组合物、制备方法以及作为药物方面的应用。
Description
技术领域
本发明属于药物化学领域,具体而言,本发明涉及可生物降解的葛根素及其衍生物通过7位酚羟基特异地与聚乙二醇缀合而形成的缀合物。另外,本申请还涉及基于该缀合物的药物组合物、制备方法以及作为药物等方面的应用。
背景技术
葛根素(Puerarin,下文简称为Pur,化学名为7,4′-二羟基-β-C-D-葡萄糖基异黄酮)是由豆科植物野葛(Pueraria lobata)和甘葛藤(Puerarin thomsonii)根中提取的一种异黄酮苷,其在心肌保护、肾保护、脑组织保护、抗氧化、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗心律失常、抗缺血再灌注损伤、抗酒精中枢抑制、抗癌、调控骨代谢、改善微循环、提高运动能力、改善学习记忆力等方面具有重要的药理活性;并于1993年经卫生部批准将葛根素注射液作为改善心脑血管循环的新药用于临床,至今已广泛用于心脑血管疾病、视网膜血管病、眼底病及突发性耳聋等方面治疗,且疗效显著(黄筑艳,赵延涛,李焱.葛根药理及临床研究进展[J].光明中医,2007,22(6):63-66.)。
但由于结构关系,葛根素水溶性差(仅为0.011mol/L),脂溶性也不好,且口服生物利用度不高,因此,目前临床用的最多的葛根素制剂为注射剂。而这些注射剂中往往需要加入高浓度的丙二醇等助溶剂,不仅增加了成本,而且造成药液粘度过大,给生产带来了麻烦。随着近年来用药范围的不断扩展,其不良反应报道也日渐增多,主要表现为:发热、过敏反应、头晕头痛、血管性水肿、腰胀及疼痛、转氨酶升高、过敏性休克及急性血管内溶血等;其中急性血管内溶血严重者往往导致死亡,并已有多个例案报道,如超敏反应导致的溶血性反应(覃开羽,吴敏.葛根素的药理作用及不良反应分析[J].中国药业,2007,16(7):60-61.)。鉴于此,国家食品药品监督管理局特于2004年11月下发了《关于修订葛根素注射剂说明书的通知》,加强规范管理,局限了葛根素的市场应用。此外,高浓度葛根素对红细胞细胞膜的稳定性也有影响,从而导致溶血(侯少贞,李耿,赖小平,叶木荣,陈建南,苏子仁.葛根素注射液引起急性溶血机制的实验研究[J].药物不良反应杂志,2008,10(1):1-6.),这进一步提醒应注意避免应用葛根素导致的溶血问题。
基于葛根素水溶性及胃肠道吸收差等问题,已有众多学者采用多种剂型方法进行改进,如CN1513467A和CN1424041A分别公开了葛根素滴丸制剂及其制备方法;CN1385155A和CN1394609A分别公开了葛根素口服胶囊、口服液及其制备方法;CN101006988A公开了葛根素缓释制剂及其制备方法;CN1476841A和CN1403090A分别公开了分散片组合物和葛根素磷脂固体分散体及其制备方法;CN1457795A、CN1449765A和CN1430965A分别公开了葛根素软胶囊及其制备方法;CN1977975A公开了一种葛根素/环糊精组合物及其制备方法等;上述方法所得葛根素制剂基本上是通过胃肠道方式给药,以避免注射存在的问题,但口服制剂提高生物利用度往往有限,大部分药物仍然随粪便排泄。而现有的几个葛根素注射剂专利CN1389211A和CN101288677A等也基本上只是采用改变助溶剂、辅料等传统方式制备所得,无法从本质上避免应用葛根素导致的溶血问题。
聚乙二醇(Polyethylene glycol,本文简称为PEG)等亲水性聚合物是一个常用药剂辅料,安全无毒,无免疫原性,生物相融性好,尤其在蛋白质缀合物中已经得到广泛应用,可以改善水溶性、延长体内半衰期(从而降低用药剂量)、降低免疫原性。PEG化的小分子化合物(如紫杉醇、阿霉素等)也有报道(如US7495099B2、US7479483B2、CN1629150A等)。其中,中国专利CN1259314C公开了一种亲水性聚合物(包括PEG)和黄酮类物质(包括葛根素)的缀合物。但是该专利不但叙述笼统,没有对最终产物疗效以及水溶性、溶血性等方面进行科学评估,更严重的是,其中的PEG与葛根素的缀合没有特异性,要么通过PEG过量而缀合掉葛根素上所有的羟基,要么对黄酮糖环上的羧基进行缀合。前者由于各种不完全缀合的副产物多,使得制备、纯化困难,最终产品质量不易控制,而且由于最终产物中PEG比例过高,而极大降低了有效成分(黄酮类物质)的活性效价,增大了最终的给药剂量;后者由于葛根素恰恰没有糖环上的羧基,而无法适用。尤其是前者,对黄酮类药物的缀合无选择性,这种过度的缀合会丧失或降低药物活性。
为了克服现有技术中的缺陷,本发明人经过长期艰苦的研究工作,通过控制反应条件及物料比例,令人惊讶地开发出了聚乙二醇和葛根素衍生物选择性缀合的缀合物,该缀合物的化学结构明确,产品质量易于控制,更令人惊讶的是:1)体内药理活性研究表明,该缀合物不但仍旧具有抗心肌缺血及抗心律失常等药理活性,而且活性还优于葛根素注射液;2)该缀合物的水溶性得到了极大提高(相比葛根素水溶性提高40多倍);3)体外水解释放实验结果表明,该缀合物可以缓慢水解释放出葛根素,大大改善了药物的体内半衰期;4)体外溶血性实验结果表明,该缀合物没有发生一个溶血事件,极大地减少或消除了葛根素的不良反应,而含有相同葛根素浓度的葛根素注射液于37℃处理32h后则会使30%以上的随机体检人员血液样本发生不同程度的溶血,而处理48h后则90%以上的样品都会发生溶血。此外,本发明人还研究出了该缀合物的制备方法,该(合成)方法简单,合成率高,产物可以静脉注射也可以口服给药,适合工业化生产,具有非常好的开发应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种亲水性聚合物与葛根素或其衍生物通过接头特异性缀合的缀合物,使其水溶性提高、生物相容性改善并且具有保持甚至提高葛根素衍生物的药理活性,并克服溶血等不良反应。本发明的目的还在于提供了包含该缀合物的药物组合物,其毒副作用小、稳定性好、疗效好,并且可生物降解的,适于静脉注射和大批量工业化生产。另外,本发明还提供了这类缀合物的药物应用以及制备方法。
具体而言,在第一方面,本发明提供了如式1所示的缀合物或其药学上可接受的盐:
式1
其中,P为亲水性聚合物;
m为1-10的整数;
L为连接基团;以及
R2、R3、R4、R5、R6分别彼此相互独立地为H、酰基或烃基。
在本文中,“缀合”指的是小分子(如,葛根素)和聚合物(如,聚乙二醇等亲水性聚合物)任选通过接头的共价连接。因此,“缀合物”就是这种共价连接的产物。本文中所用的“亲水性聚合物”具有本领域技术人员所能理解的意义,优选选自聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯醇、聚丙烯吗啉或它们的共聚物,在本发明的具体实施方式中,优选为PEG。在式1的优选方面中,P的分子量优选为200至35000Da,也优选为1500至20000Da,更优选为2000至10000Da。
另外,在本文中,“低级”在用于限定化学基团时,指的是所限定的化学基团具有不超过10个碳原子。例如,“低级烷基”指的是具有不超过10个碳原子的烷基;而“低级酰基”指的是具有不超过10个碳原子的酰基。优选本发明中的“低级”基团具有不超过6个碳原子,更优选不超过3个碳原子。
还有,在本文中,“药学上可接受的盐”指适于与人或动物的组织接触而且无过多的毒性、刺激或变态反应等的盐。与本发明的缀合物成的盐基本上不改变缀合物的活性。例如,通常能与本发明的缀合物成盐的酸有盐酸、磷酸、硫酸、乙酸、琥珀酸、马来酸、柠檬酸等;能与本发明的缀合物成盐的碱有碱金属或碱土金属的氢氧化物、铵等。
在本发明的第一方面中,亲水性聚合物P通过连接基团L连接在葛根素或其衍生物的7-位酚羟基上。其中,L是可以与7-位酚羟基共价相连的基团,优选是酯基或醚基,更优选所述基团为大小较小的基团,如,L中碳原子数不超过30个,优选不超过20个。L可以包括一个或几个氨基酸残基,如α-、β-、γ-氨基酸的残基或D-、L-氨基酸的残基,优选是α-氨基酸的残基或L-氨基酸的残基,更优选是天然α-氨基酸的残基。当L包括几个氨基酸残基时,优选L包括的是寡肽残基。在本文中,寡肽为由2-9个氨基酸通过肽键相连而形成的肽。所述氨基酸或寡肽的残基可以通过C-端形成的酯键与葛根素或其衍生物的7-OH共价连接,通过N-端形成的肽键与L中其他部分连接进而连接亲水性聚合物。这样形成的本发明的缀合物可以在生物体内通过水解或酶解而降解,释放出作为药物的葛根素或其衍生物,发挥药效。而且,尤其令人惊讶的是,包含天然α-氨基酸残基的L所形成的缀合物释药速率要比传统丁二酸作为连接基团的缀合物快,活性也更高。另外,在一个亲水性聚合物P上可以连接有m个L进而连接m个葛根素或其衍生物,优选m为1-7的整数,更优选m为1-3的整数,最优选m为1或2。当m大于1时,m个L、葛根素或其衍生物可以是相同或不同的,优选是相同的。
在本文中,“葛根素或其衍生物”指的是式3所示的化合物:
式3
其中,R2、R3、R4、R5、R6分别彼此相互独立地为H、酰基或烃基,优选R2、R3、R4、R5、R6分别彼此相互独立地为H、低级酰基或低级烃基,如乙酰基、丙酰基、低级烷基等。本发明具体实施方式所优选的葛根素或其衍生物是葛根素,即R2、R3、R4、R5、R6均为氢。但是,葛根素或其衍生物也可以是现有技术中已经公开的葛根素衍生物,包括但不限于如CN101288677A、CN1944448A、CN1763030A、CN1800196A、CN1634912A、CN101353346A等中所述的那些。
在本发明的第一方面中,本发明优选提供如式2所示的缀合物或其药学上可接受的盐:
式2
其中,n为1或2;
X为O、OCOCH2CH2、NHCH2、或NHCOCH2CH2;
R1为化学单键、氨基酸残基或寡肽残基;以及
R2、R3、R4、R5、R6分别彼此相互独立地为H、低级酰基或低级烷基。
式2中,优选R1为化学单键,即葛根素或其衍生物上7-OH的氧原子直接与羰基连接;也优选R1为氨基酸残基或寡肽残基,这样R1通过C-端形成的酯键与葛根素或其衍生物的7-OH共价连接,通过N-端形成的肽键与式2中所示的羰基连接,进而连接PEG。这样,在生物体内通过水解或酶解作用下,可以更有效地释放出药用活性物质。其中,R1可以是α-氨基酸残基,如侧链是氢、或是任选用低级烷基、硝基、羟基、苯基或巯基取代的低级烷基的α-氨基酸残基,或者R1可以是L-氨基酸残基,更优选是天然α-氨基酸残基,如选自如下任一种氨基酸的残基:甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸和苏氨酸。在本发明的具体实施方式中,R1为甘氨酸(下文简称为Gly)的残基或苯丙氨酸(下文简称为Phe)的残基。
在式2中,X共价连接在聚乙二醇的末端羟基位上,取代聚乙二醇的末端羟基。优选X为O或OCOCH2CH2,更优选为O。最优选式2中,X为O;R1为甘氨酸残基或为苯丙氨酸残基;R2、R3、R4、R5、R6分别彼此相互独立地为氢或乙酰基。
在本文中,如果没有其他的指示,聚乙二醇(PEG)指的是具有末端羟基基团的乙二醇结构重复连接而成的聚合物。完全由乙二醇结构重复连接而成的聚乙二醇具有两个末端羟基基团,因此这样一分子的聚乙二醇可以结合两分子的连接基团和葛根素或其衍生物;而只有一个末端羟基基团的聚乙二醇(如单甲氧基聚乙二醇(mPEG),其一个末端羟基的氢被取代),这样的聚乙二醇仅可以一分子结合一分子的连接基团和葛根素或其衍生物。在本发明的具体实施方式中,当PEG表示具有两个末端羟基的聚乙二醇时,式2中的n为2;而PEG表示只有一个末端羟基基团的聚乙二醇(如,单甲氧基聚乙二醇(mPEG))时,n为1。在式2的优选方面中,PEG的分子量为200至35000Da,优选为1500至20000Da,更优选为2000至10000Da,最优选为5000至6000Da。在本发明的具体实施方式中,分别使用了分子量为5000Da的单甲氧基聚乙二醇(即mPEG5k)以及分子量为6000Da的聚乙二醇(即PEG6k)。有许多种类的PEG可以通过市场渠道购买,这对于本领域技术人员来说是显而易见的。
在第二方面,本发明提供了药物组合物,其包括本发明第一方面所述的缀合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。在本文中,“药学上可接受的载体”指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、缓冲剂、保护剂、防腐剂、包裹材料或其他制剂辅料。根据本领域的公知技术,可以根据治疗目的、给药途径的需要将药物组合物制成各种剂型,优选该组合物为单位剂量形式,如固体制剂有片剂、膜剂、丸剂、胶囊、粉剂、粉针剂、或颗粒剂等,而液体制剂有糖浆剂和乳液剂、注射用溶液或悬浮液、气雾剂或液体喷剂、滴剂、或针剂等。本发明的药物组合物优选是片剂、胶囊、吸入剂或注射剂,更优选为注射剂,最优选为静脉注射剂。例如,可以用生理盐水或其他生理等渗液溶解本发明第一方面所述的缀合物,配制成静脉注射剂。
本发明的药物组合物可用于治疗或预防可用葛根素治疗或预防的疾病中,如用于治疗或预防糖尿病、糖尿病足、高血压病合并冠心病心绞痛、冠心病并高粘血症、突发性耳聋、脑梗死、强直性脊柱炎、慢性阻塞性肺病和帕金森病等,优选用于治疗或预防心脑血管疾病、糖尿病并发症、视网膜动静脉阻塞或突发性耳聋,最优选用于治疗或预防心脑血管疾病。因此,在第三方面,本发明提供了本发明第一方面所述的缀合物或其药学上可接受的盐或本发明第二方面所述的药物组合物在制备用于治疗或预防可用葛根素治疗或预防的疾病的药物中的应用,所述疾病优选为心脑血管疾病、糖尿病并发症、视网膜动静脉阻塞或突发性耳聋,最优选为心脑血管疾病。根据剂型,本发明的药物组合物可通过所属领域技术人员所熟知的给药方式来进行给药,例如口服、直肠、舌下、肺部、透皮、离子透入、阴道及鼻内给药。本发明的药物组合物优选胃肠道外给药,如静脉注射。给药剂量根据制剂形式和期望的作用时间以及治疗对象的情况而有所变化,实际治疗所需的量可以由医师根据实际情况(如,病人的病情、体重等)而方便地确定。对于一般的成人,本发明的药物组合物的剂量,以式1所示的缀合物计,可以是每kg成人体重1ng-10g,优选是每kg体重100mg-6g,最优选的是每kg0.5g-2g。尤其是本发明的缀合物克服了现有技术中溶血性等不良反应,因此可以更安全地加大剂量使用。
在第四方面,本发明提供了本发明第一方面所述的缀合物的制备方法,其包括以下步骤:
(a)连接P与L;和
(b)将步骤(a)所得的连接产物与式3所示的葛根素或其衍生物的7-OH连接:
式3
其中,R2、R3、R4、R5、R6分别彼此相互独立地为H、酰基或烃基。
在第四方面,本发明还优选提供本发明第一方面优选的缀合物的制备方法,其包括:(1)聚乙二醇活化;(2)氨基酸连接;和(3)葛根素或其衍生物特异性连接。该制备方法包括三个合成步骤,具有收率高、方法简单而经济、适合工业化生产等优点。具体而言,该制备方法包括以下步骤:
(1)用氯甲酸对硝基苯酯活化聚乙二醇末端羟基,得到活化产物;
(2)将步骤(1)所得的活化产物与氨基酸或寡肽的N端氨基连接,得到连接产物;
(3)将步骤(2)所得的连接产物与式3所示的葛根素或其衍生物的7-OH连接:
式3
其中,R2、R3、R4、R5、R6分别彼此相互独立地为H、酰基或烃基。
更优选地,其中所述步骤(2)为将步骤(1)所得的活化产物与式4所示的氨基酸连接,得到连接产物:
式4
其中,R7是甘氨酸或苯丙氨酸的侧链基团。
在上述优选的制备方法中,在步骤(1)、(2)和/或(3)中还进一步包括结晶步骤。具体而言,在步骤(1)的聚乙二醇活化中,用氯甲酸对硝基苯酯(下文简称为pNPC)在碱性条件下,在溶剂中,活化聚乙二醇末端羟基;然后,在无水条件下、室温避光反应6~12h,减压浓缩,无水乙醚析晶;产物用干燥二氯甲烷溶解,无水乙醚重结晶,室温真空干燥得PEG-(pNP)n;其中n为1或2。
优选在步骤(1)中用氯甲酸对硝基苯酯活化聚乙二醇末端羟基时,所使用的溶剂选自无水的N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、氯仿和二氯甲烷,优选为干燥的二氯甲烷;氯甲酸对硝基苯酯和聚乙二醇的投料摩尔比大于1.5n∶1,优选为3n∶1,其中n为1或2;和/或优选在氯甲酸对硝基苯酯活化聚乙二醇末端羟基时,在碱性条件下进行,其中所用pH调节剂为干燥的三乙胺或吡啶(下文简称为Py),优选为干燥的吡啶。
在步骤(2)的氨基酸连接中,将PEG-(pNP)n与式4所示的氨基酸以小于1∶4n的摩尔比(优选为1∶8n)溶于蒸馏水,用三乙胺或碳酸氢钠调节pH至8~9,在室温下搅拌反应6~12h,用浓盐酸调节pH至2,用乙醚或乙酸乙酯萃取,然后水相再用氯仿萃取,收集氯仿层,无水硫酸镁干燥,抽滤,收集氯仿层,减压浓缩,无水乙醚析晶,得PEG-(OCO-氨基酸)n;其中n为1或2。
在步骤(3)的葛根素连接中,将PEG-(OCO-氨基酸)n与式3所示的葛根素或其衍生物混合,其摩尔比1∶1.5n至1∶5n,优选1∶3n;将反应物溶于干燥的DMF或DMSO或Py,其中优选为干燥的Py;然后再加入4-二甲基氨基吡啶(下文简称为DMAP)做催化剂(投药摩尔数比DMAP∶PEG≥2n,n同前),并加入N,N′-二异丙基碳酰亚胺(下文简称DIC)或N,N-二环己基碳二亚胺(下文简称为DCC)或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(下文简称EDCI)为缩合剂,优选为EDCI(投药摩尔数比EDCI∶PEG≥3n,n同前);于冰浴反应12~24h,减压浓缩,用干燥异丙醇于4℃析晶,抽滤,产物重新用干燥二氯甲烷溶解,干燥异丙醇重结晶,得产物PEG-(OCO-氨基酸-葛根素)n;其中n为1或2。
为了便于理解,以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是,具体实例和附图仅是为了说明,并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明,在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变,这些修正和改变也纳入本发明的范围内。另外,本发明引用了公开文献,这些文献也是为了更清楚地描述本发明,它们的全文内容均纳入本发明进行参考,就好像它们的全文已经在本发明说明书中重复叙述过一样。
附图说明
图1:本发明实施例中得到的mPEG5K-OCO-Gly的1H-NMR谱图(DMSO为溶剂)。
图2:本发明实施例中得到的mPEG5K-OCO-Gly-Pur的1H-NMR谱图(DMSO为溶剂)。
图3:本发明实施例中得到的mPEG5K-OCO-Phe的1H-NMR谱图(DMSO为溶剂)。
图4:本发明实施例中得到的mPEG5K-OCO-Phe-Pur的1H-NMR谱图(DMSO为溶剂)。
图5:为mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur的液相色谱图,其中出峰时间为4.1min;
图6:为葛根素的液相色谱图,其中出峰时间为17.1min;
图7:为葛根素含量测定标准曲线图。
图8:不同缓冲液中mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur的释放特性,其中“◆”为PBS;“▲”为H2O;“×”为生理盐水。
图9:葛根素及其缀合物体外溶血实验结果。其中,图a为混合后静置处理2h的照片记录;图b为混合42h处理后的照片记录。其中,标记的数字1、2、3、4为mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur处理组,其中以葛根素计的浓度依次为2、3、4、5mg/ml;标记的数字5、6、7、8为葛根素注射液处理组,其中以葛根素计的浓度依次为2、3、4、5mg/ml;9为蒸馏水阳性对照组;10为生理盐水阴性对照组。
图10:葛根素及其缀合物对不同健康个体体外溶血性实验结果,其中图a为生理盐水组;图b为葛根素组;图c为mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur组。
图11:葛根素及其缀合物抗氯仿所致心律失常实验结果。α=0.05,“*”表示c组与a组相比有显著性差异,P<0.05;“#”表示e组与a组比较有显著性差异,P<0.01。
具体实施方案
以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处,可根据本领域技术人员所熟悉的《有机合成试剂制备手册》(科学出版社,北京,2005年)、《实用精细有机合成手册》(化学工业出版社,北京,2000年)、《PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHES》(AWILEY-INTERSCIENCE PUBLICATION,New York,1999)等手册以及本文所引用的参考文献中所列的方法来实施。另外,实施例中所使用的材料除有特别说明外,均可通过商业途径从市场上购买。
实施例1:单甲氧基聚乙二醇5k-OCO-甘氨酸-7-葛根素(mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur)的合成
1、mPEG5K-pNP的合成:称取mPEG5K(购自Fluka公司)40.0g(8.0mmol),加入200ml左右甲苯溶解,60℃减压蒸除;加入300ml临时干燥的CH2Cl2溶解,然后称取pNPC 7.257g(36.0mmol)加入上述体系,搅拌加入6ml临时干燥Py,室温避光搅拌反应12h;得产物39.86g,收率96.47%。
准确称取上述产物适量,用0.1M NaOH溶解,于402nm测定吸光度值,根据摩尔吸光系数18400cm-1M-1计算释放的对硝基苯酚量,推算得产物纯度大于95.64%。
2、mPEG5K-OCO-Gly合成:称取甘氨酸(下文简称为Gly)2.402g(32.0mmol),用150ml蒸馏水溶解,加入100ml乙腈(H2O/CH3CN=3/2)和20.66g(4.0mmol)mPEG5k-pNP,用三乙胺调节体系pH值在8.5,室温搅拌反应6~12h左右;TLC检测反应完全后,体系用浓盐酸调节pH至2左右,用乙酸乙酯或乙醚萃取三次,水层再用氯仿萃取三次后,收集氯仿层,无水硫酸镁干燥后,减压浓缩,无水乙醚析晶,真空干燥得产物19.56g,收率95.88%。
准确称取上述产物适量,用0.01M NaOH滴定羧基含量,推算得产物纯度大于89.87%。所得产物1H-NMR见图1。
3、mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur合成:称取mPEG5K-OCO-Gly 10.0g(1.960mmol),用30ml临时干燥的CH2Cl2溶解,加入EDCI 1.13g(5.881mmol)、DMAP 0.240g(1.960mmol)室温搅拌反应30min后逐滴滴加到溶有3.26g(7.84mmol)葛根素(购自安康禾烨麦迪森植物药业有限公司,批号:2006110;)的干燥Py中,室温搅拌反应8h;TLC检测反应完全后减压除去大部分溶剂,残余物用适量氯仿溶解,过滤除去不溶物,滤液减压浓缩,加入大量异丙醇4℃析晶2h,抽滤,异丙醇洗涤,氯仿重新溶解,重结晶后无水乙醚洗涤,真空干燥得产物10.25g,收率95.35%;紫外分光光度法测得载药量为7.38%。所得产物1H-NMR见图2。
准确称取上述终产物500.0mg于洁净的玻璃试管中,每隔5min加入20μl双蒸水并摇晃促使产物溶解,加至200μl时全部溶解,澄清透明,计算得产物溶解度≥0.443mol/L,比游离葛根素0.011mol/L增加了40多倍。
实施例2:聚乙二醇6k-(OCO-甘氨酸-7-葛根素)2[PEG6K-(OCO-Gly-7-Pur)2]的合成
1、PEG6K-(pNP)2合成:称取PEG6K(购自Fluka公司)20.0g(3.33mmol),加入150ml甲苯溶解,60℃减压蒸除;加入350ml临时干燥的CH2Cl2溶解,然后称取pNPC 4.031g(20.00mmol)加入上述体系,搅拌加入6ml临时干燥Py,室温避光搅拌反应约12h;得产物19.99g,收率94.84%,纯度大于93.12%。
2、PEG6K-(OCO-Gly)2合成:称取甘氨酸2.40g(32.0mmol),用150ml蒸馏水溶解,加入100ml乙腈(H2O/CH3CN=3/2)和12.66g(2.0mmol)PEG6k-(pNP)2,用三乙胺调节体系pH值在8.5,室温搅拌反应12h;TLC检测反应完全,用浓盐酸调节pH至2左右,用乙酸乙酯或乙醚萃取三次,水层再用氯仿萃取三次,收集氯仿层,无水硫酸镁干燥,浓缩,乙醚析晶得产物11.19g,收率90.21%,纯度大于86.92%。
3、PEG6K-(OCO-Gly-7-Pur)2合成:称取PEG6K-(OCO-Gly)29.30g(1.5mmol),EDCI 1.15g(6.0mmol)和DMAP 0.37g(3.0mmol),用300ml临时干燥的CH2Cl2溶解,室温搅拌反应40min后逐滴滴加到含有5.0g(12.0mmol)葛根素的干燥Py中,室温搅拌反应10h左右,TLC检测反应完全;减压浓缩后用适量氯仿溶解,过滤回收不溶物,滤液继续浓缩后加入大量异丙醇,并于4℃析晶2h,抽滤,异丙醇洗涤,氯仿重新溶解,重结晶后无水乙醚洗涤,真空干燥得产物9.82g,收率93.01%,载药量达10.5%。
准确称取上述终产物500.0mg于洁净的玻璃试管中,每隔5min加入20μl双蒸水并摇晃促使产物溶解,加至240μl时全部溶解,澄清透明,计算得产物溶解度≥0.525mol/L,比游离葛根素0.011mol/L增加了约48倍。
实施例3(比较例1):单甲氧基聚乙二醇5k-OCO-苯丙氨酸-7-葛根素(mPEG5K-OCO-Phe-7-Pur)的合成
制备方法与实施例1基本相同,各步骤主要不同点为:
1、mPEG5K-pNP的合成:称取mPEG5K(购自Fluka公司)40.0g(8.0mmol),加入200ml左右甲苯溶解,60℃减压蒸除;加入300ml临时干燥的CH2Cl2溶解,然后称取pNPC 7.257g(36.0mmol)加入上述体系,搅拌加入6ml临时干燥Py,室温避光搅拌反应12h;得产物39.86g,收率96.47%,纯度大于95.64%。
2、mPEG5K-OCO-Phe合成:称取苯丙氨酸(下文简称为Phe)5.29g(32.0mmol),用150ml蒸馏水溶解,加入100ml乙腈(H2O/CH3CN=3/2)和20.66g(4.0mmol)mPEG5k-pNP,用三乙胺调节体系pH值在8.5,室温搅拌反应6~12h左右;TLC检测反应完全后,体系用浓盐酸调节pH至2左右,用乙酸乙酯或乙醚萃取三次,水层再用氯仿萃取三次后,收集氯仿层,无水硫酸镁干燥后,减压浓缩,无水乙醚析晶,真空干燥得产物19.42g,收率93.83%,纯度大于91.65%。所得产物1H-NMR见图3。
3、mPEG5K-OCO-Phe-7-Pur合成:称取mPEG5K-OCO-Phe 7.76g(1.50mmol),用20ml临时干燥的CH2Cl2溶解,加入EDCI 0.86g(4.50mmol)、DMAP 0.18g(1.50mmol)室温搅拌反应30min后逐滴滴加到溶有1.66g(6.0mmol)葛根素(购自安康禾烨麦迪森植物药业有限公司,批号:2006110;)的干燥Py中,室温搅拌反应8h;TLC检测反应完全后减压除去大部分溶剂,残余物用适量氯仿溶解,过滤除去不溶物,滤液减压浓缩,加入大量异丙醇4℃析晶2h,抽滤,异丙醇洗涤,氯仿重新溶解,重结晶后无水乙醚洗涤,真空干燥得产物7.95g,收率95.10%;紫外分光光度法测得载药量为7.28%。所得产物1H-NMR见图4。
准确称取上述终产物500.0mg于洁净的玻璃试管中,每隔5min加入20μl双蒸水并摇晃促使产物溶解,加至200μl时全部溶解,澄清透明,计算得产物溶解度≥0.437mol/L,比游离葛根素0.011mol/L增加了约40倍。
实施例4(比较例2):聚乙二醇6k-(OCO-苯丙氨酸-7-葛根素)2[PEG6K-(OCO-Phe-7-Pur)2]的合成
制备方法与实施例2基本相同,各步骤主要不同点为:
1、PEG6K-(pNP)2合成:称取PEG6K(购自Fluka公司)20.0g(3.33mmol),加入150ml甲苯溶解,60℃减压蒸除;加入350ml临时干燥的CH2Cl2溶解,然后称取pNPC 4.031g(20.00mmol)加入上述体系,搅拌加入6ml临时干燥Py,室温避光搅拌反应约12h;得产物19.99g,收率94.84%,纯度大于93.12%。
2、PEG6K-(OCO-Phe)2合成:称取苯丙氨酸5.29g(32.0mmol),用150ml蒸馏水溶解,加入100ml乙腈(H2O/CH3CN=3/2)和12.66g(2.0mmol)PEG6k-(pNP)2,用三乙胺调节体系pH值在8.5,室温搅拌反应12h;TLC检测反应完全,用浓盐酸调节pH至2左右,用乙酸乙酯或乙醚萃取三次,水层再用氯仿萃取三次,收集氯仿层,无水硫酸镁干燥,浓缩,乙醚析晶得产物11.42g,收率89.94%,纯度大于88.95%。
3、PEG6K-(OCO-Phe-7-Pur)2合成:称取PEG6K-(OCO-Phe)29.5g(1.5mmol),EDCI 1.15g(6.0mmol)和DMAP 0.37g(3.0mmol),用300ml临时干燥的CH2Cl2溶解,室温搅拌反应40min后逐滴滴加到含有5.0g(12.0mmol)葛根素的干燥Py中,室温搅拌反应10h左右,TLC检测反应完全;减压浓缩后用适量氯仿溶解,过滤回收不溶物,滤液继续浓缩后加入大量异丙醇,并于4℃析晶2h,抽滤,异丙醇洗涤,氯仿重新溶解,重结晶后无水乙醚洗涤,真空干燥得产物9.59g,收率89.5%,载药量达10.8%。
准确称取上述终产物500.0mg于洁净的玻璃试管中,每隔5min加入20μl双蒸水并摇晃促使产物溶解,加至240μl时全部溶解,澄清透明,计算得产物溶解度≥0.540mol/L,比游离葛根素0.011mol/L增加了约49倍。
实施例5:葛根素缀合物的体外水解释放特性的测量
以mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur为例,使用美国安玛西亚 explorer(P900泵、UV900检测器、pHC900检测器、Frac 950自动收集器)进行测量,并比较与葛根素的差别。色谱条件:自制普通玻璃柱(10mm×15cm),填料为sephadex G15(Pharmacia),流动相:1M NaCl,流速2.0mL/min,测定波长250nm,室温25℃。
准确称取葛根素1.0mg,用少量甲醇溶解后用1M NaCl稀释定容至10ml,配成0.1mg/ml的葛根素标准液,然后用1M NaCl做系列对倍稀释,并在前述色谱条件下每个稀释倍数各进样0.5ml,用时间和250nm电信号值进行积分计算各曲线下面积,并以浓度为横坐标,曲线下面积为纵坐标拟合标准曲线。另外准确称取mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur三等份,分别用PBS(pH=7.4)、蒸馏水和生理盐水溶解并稀释至1mg/ml,然后置于37℃水浴中,于不同时间取样,进样500μl,测定不同水解时间处理游离葛根素含量,分析它们在体外的释放特性。
从图5与图6可以看出,前药保留时间约为4.1min,而葛根素保留时间约为17.1min,在上述色谱条件下能够完全分离,同时也间接表明葛根素以成功得到负载。而图7表明,该色谱条件下线性良好,可以用于准确测定游离葛根素含量。从图8结果可以看出,mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur在水和生理盐水中比较稳定,而在pH7.4的PBS中释放相对较快,具有较好缓释功能。
实施例6:葛根素缀合物的体外溶血性评价
按照缀合物中葛根素含量进行换算,将mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur用医用生理盐水配成以其中葛根素计的浓度为4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml和10mg/ml四个浓度备用;葛根素注射剂(浙江震元制药有限公司,批号:081006)也同样用医用生理盐水稀释成上述四个浓度备用。取健康人血5ml加入到25ml无菌阿氏液中立即混匀,2000rpm离心10min,弃去上清,细胞沉淀用医用生理盐水离心洗涤数次,直至上清澄清透明,然后用医用生理盐水把血细胞稀释成4%浓度备用。各取上述四个浓度的mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur及葛根素注射液1ml于无菌的试管中,然后加入1ml 4%血细胞悬液,致使各管中葛根素的浓度分别为2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml和5mg/ml,血细胞浓度均为2%。另外,以蒸馏水作为溶血阳性对照,生理盐水为阴性对照。将上述各试管封口后置于37℃,5%CO2培养箱中,每隔6h摇晃一次,同时观察溶血现象,并做拍照记录。
结果如图9所示,药物混合静置处理2h后观察发现第5、6、7、8及第10号管红细胞均沉在管底;而第1、2、3号管中,其中尤其是第1、2号中大部分血细胞呈絮状分散在试管中、底部,这可能和PEG絮凝作用有关;阳性对照管9号试管明显发生完全溶血;从上述结果可以看出,药物处理2h后基本没有发生溶血反应(图9-a)。而药物处理42h左右离心发现6-8管已明显发生溶血反应,第8管已经全部溶血,而第5管上清也有些变黄,表明也开始发生溶血;相反,mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur组从低浓度到高浓度均未发生明显溶血现象(见图9-b)。上述结果表明,葛根素缀合物可以降低葛根素的溶血性反应。
通过上述实验发现,当葛根素含量大于3mg/ml时均发生了溶血反应,因此,我们以葛根素浓度分别为4mg/ml的葛根素注射液和mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur对50个不同健康个体血液样本进行了溶血性评价。
结果表明,经37℃共孵育24h后,各组均未见明显溶血;而32h观察,除生理盐水和mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur组没有变化外,葛根素处理组有30%的样本发生不同程度溶血;48h处理后,葛根素处理组几乎全部样本发生溶血反应,而mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur处理组未见一个样本溶血(见图10)。上述结果表明,葛根素注射液对细胞稳定性有干扰,并且不同个体红细胞对起敏感性不同,而mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur则几乎完全没有溶血性不良反应。
实施例7:mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur抗垂体后叶素所致小鼠心肌缺血保护作用评价
取雄性昆明小鼠60只,体重(20±2)g,随机平均分成A~F6个组,每组10只;其中A组为正常组,静脉注射生理盐水0.2ml/只;B组为模型组,静脉注射生理盐水0.2ml/只;C组为葛根素低剂量组,静脉注射葛根素注射液0.2ml/只,相当给与葛根素0.5mg/只;D组为葛根素高剂量组,静脉注射葛根素注射液0.2ml/只,相当给与葛根素2.0mg/只;E组为mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur低剂量组,静脉注射0.2ml/只,相当给与葛根素0.5mg/只;F组为mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur高剂量组,静脉注射0.2ml/只,相当给与葛根素2.0mg/只;连续给药6天,并于最后一次给药后10min腹腔注射垂体后叶素0.3U每10g体重,2h后摘眼球取血,37℃水浴放置20min后1500rpm离心6min,吸取血清,并立即按照相关试剂盒说明书测定其中谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)(上述试剂盒均购自南京建成生物工程研究所)活性;结果如表所示:
表1
表1中,A-F分别依次为正常对照组、模型组、葛根素低剂量组、葛根素高剂量组、mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur低剂量组和mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur高剂量组;α=0.05,“*”表示B组值与各自对应A组值相比有显著性差异,P<0.01;“#”表示各给药组(C、D、E、F)与对应B组值比较有显著性差异,P<0.05;“Δ”表示各高剂量给药组(D和F)值与对应低剂量给药组(C和E)值相比有显著性差异;“◇”表示F组和D组的AST值相比有显著性差异,P<0.05。
从表1数值可以得出,模型组AST、LDH和CK值均显著高于正常对照组,表明造模成功;其中,各给药剂量组的相应AST、LDH和CK值均显著低于模型组,表明葛根素及mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur对垂体后叶素所致小鼠心肌缺血有保护作用;而且,各高剂量预防组均比对应药物低剂量组疗效好,表明在上述条件下,药物疗效和计量存在一定的量效关系;此外,从AST值看,mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur高剂量组与葛根素高剂量组也存在显著性差异(α=0.05,P<0.05),但LDH和CK值间无显著性差异,在一定程度上反映缀合物mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur对心肌缺血保护作用优于葛根素注射液。
实施例8:mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur抗氯仿所致小鼠心律失常作用评价
取雄性昆明小鼠100只,体重(20±2)g,随机平均分成a~e6个组,每组20只;其中a组为模型组,静脉注射生理盐水0.2ml/只;b组为葛根素低剂量组,静脉注射葛根素注射液0.2ml/只,相当给与葛根素0.5mg/只;c组为葛根素高剂量组,静脉注射葛根素注射液0.2ml/只,相当给予葛根素2.0mg/只;d组为mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur低剂量组,静脉注射0.2ml/只,相当给予葛根素0.5mg/只;e组为mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur高剂量组,静脉注射0.2ml/只,相当给予葛根素2.0mg/只;连续给药6天,并于最后一次给药10min后用CHCl3造模,等小鼠呼吸停止后立即解剖,观察心室是否有颤动,统计分析,结果如图11所示。
从图9可以明显看出,各给药组均能降低氯仿所致小鼠室颤发生率,而且存在一定量效关系;其中,葛根素高剂量组和mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur高剂量组室颤发生率与模型组相比具有显著性差异;虽然在上述条件下,等剂量药物组间不存在显著性差异,但总体趋势看mPEG5K-OCO-Gly-7-Pur药物组相比较葛根素注射液组室颤发生率低;表明在一定程度上本申请项目所述葛根素缀合物对氯仿所致小鼠室颤抑制率优于葛根素注射液。
Claims (9)
1.如式2所示的缀合物或其药学上可接受的盐:
式2
其中,n为1;
X为O;
R1为甘氨基酸残基;
PEG为分子量为5000的单甲氧基聚乙二醇;以及
R2、R3、R4、R5、R6分别彼此相互独立地为H。
2.药物组合物,其包括权利要求1所述的缀合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。
3.权利要求2所述的药物组合物,其为片剂、胶囊、吸入剂或注射剂。
4.权利要求2所述的药物组合物,其为注射剂。
5.权利要求2所述的药物组合物,其为静脉注射剂。
6.权利要求1所述的缀合物或其药学上可接受的盐或权利要求2-5之任一所述的药物组合物在制备用于治疗或预防心脑血管疾病、糖尿病并发症、视网膜动静脉阻塞或突发性耳聋的药物中的应用。
7.权利要求1所述的缀合物或其药学上可接受的盐或权利要求2-5之任一所述的药物组合物在制备用于治疗或预防心脑血管疾病的药物中的应用。
9.权利要求8所述的制备方法,其中在步骤(1)、(2)和/或(3)中包括结晶步骤。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2009100994891A CN101920019B (zh) | 2009-06-10 | 2009-06-10 | 亲水性聚合物-葛根素特异性缀合的非溶血性缀合物 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2009100994891A CN101920019B (zh) | 2009-06-10 | 2009-06-10 | 亲水性聚合物-葛根素特异性缀合的非溶血性缀合物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101920019A CN101920019A (zh) | 2010-12-22 |
CN101920019B true CN101920019B (zh) | 2012-06-06 |
Family
ID=43335403
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2009100994891A Expired - Fee Related CN101920019B (zh) | 2009-06-10 | 2009-06-10 | 亲水性聚合物-葛根素特异性缀合的非溶血性缀合物 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101920019B (zh) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9700599B2 (en) | 2012-11-13 | 2017-07-11 | Adocia | Rapid-acting insulin formulation comprising a substituted anionic compound |
FR3020947B1 (fr) | 2014-05-14 | 2018-08-31 | Adocia | Composition aqueuse comprenant au moins une proteine et un agent solubilisant, sa preparation et ses utilisations |
US9795678B2 (en) | 2014-05-14 | 2017-10-24 | Adocia | Fast-acting insulin composition comprising a substituted anionic compound and a polyanionic compound |
FR3043557B1 (fr) | 2015-11-16 | 2019-05-31 | Adocia | Composition a action rapide d'insuline comprenant un citrate substitue |
CN108017624A (zh) * | 2016-11-01 | 2018-05-11 | 潘嘉慧 | 葛根素衍生物的结构及其合成方法 |
CN112516125B (zh) * | 2020-12-23 | 2024-03-15 | 西北农林科技大学 | 酪氨酸在制备防治葛根素注射剂诱发的血管内溶血的药物上的应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003080593A1 (fr) * | 2002-03-22 | 2003-10-02 | Beijing Jiankai Technology Co., Ltd. | Conjugues hydrophiles de polymeres-flavonoides et compositions pharmaceutiques les contenant |
-
2009
- 2009-06-10 CN CN2009100994891A patent/CN101920019B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003080593A1 (fr) * | 2002-03-22 | 2003-10-02 | Beijing Jiankai Technology Co., Ltd. | Conjugues hydrophiles de polymeres-flavonoides et compositions pharmaceutiques les contenant |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
蒋福升等.聚乙二醇前药的研究进展.《中国药学杂志》.2007,第42卷(第12期),第882-885页. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101920019A (zh) | 2010-12-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101920019B (zh) | 亲水性聚合物-葛根素特异性缀合的非溶血性缀合物 | |
CN103319479B (zh) | 大黄酸小檗碱离子对化合物、制备方法及应用 | |
CN104640540A (zh) | 与抗炎活性偶联的增强的抗流感剂 | |
CN101486744B (zh) | 聚乙二醇修饰的灯盏花乙素化合物及其制备方法 | |
CN104434894A (zh) | 使用l-鸟氨酸苯乙酸盐治疗门静脉高压和恢复肝功能 | |
CA2554588A1 (en) | Method of preparing low-crystallinity oltipraz or amorphous oltipraz | |
JP2010538621A (ja) | シクロアストラゲノールモノグルコシド、その製造方法及び医薬用組成物としての使用 | |
CN110354270B (zh) | 一种青蒿琥酯聚乙二醇衍生物及其制备方法和应用 | |
WO2013177978A1 (zh) | 青蒿琥酯聚乙二醇化衍生物、其药物组合物及其用途 | |
CN101896477B (zh) | 硝克柳胺化合物晶v型、其制法和其药物组合物与用途 | |
JP2024508128A (ja) | 注射用の新規アビラテロン誘導体の調製方法及び用途 | |
KR20220029728A (ko) | Car-t 세포 요법을 위한 지질-플루오레세인 접합체의 설계 및 효율적인 합성 | |
CN101712707A (zh) | 罗红霉素三种晶型物质、制法以及药物组合物与用途 | |
CN101524546B (zh) | 聚乙二醇和姜黄素衍生物缀合的缀合物 | |
JP2010528063A (ja) | シャジクソウ属植物、大豆属植物、イチョウ属植物からセコイトール含有抽出物を取得する方法及び用途 | |
CN103880856B (zh) | 没药烷型倍半萜类衍生物及其药物组合物和其在制药中的应用 | |
CN101899041B (zh) | 葛根素的一种优势药用晶型固体物质及制备方法与用途 | |
CN103239434A (zh) | 门冬氨酸鸟氨酸组合物 | |
CN110152013B (zh) | 一种果胶-阿霉素轭合物及其制备方法和用途 | |
CN110418653B (zh) | 一种果胶-阿霉素轭合物及其制备方法和用途 | |
CN107722089A (zh) | 一种普鲁宁及其衍生物的制备及其在止咳化痰药物中的应用 | |
CN109232297A (zh) | 芬乐胺晶b型、制备方法和其组合物与用途 | |
EP3770165B1 (en) | Posaconazole phosphate ester mono choline salt, preparation method therefor and use thereof | |
CN114980882A (zh) | 大麻素和番茄红素抗炎协同组合 | |
CN103183722A (zh) | 一种乙二醛酶ⅰ抑制剂及其制备方法和医药用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120606 Termination date: 20130610 |