CN103183722A - 一种乙二醛酶ⅰ抑制剂及其制备方法和医药用途 - Google Patents

一种乙二醛酶ⅰ抑制剂及其制备方法和医药用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种如式I所示的乙二醛酶I抑制剂，其中，R1和R2为H、乙基、环戊烷；X为亚甲基、硫、氧原子之任意一种；R3为由炔基、氰基、卤原子、1～3个不同数目卤原子取代的乙烯基、1～6个碳的直链烷基、1～4个不同数目卤原子取代的烷基之任意一个或任意多个同时取代的苯环或吡啶环。本发明还公开所述乙二醛酶I抑制剂的制备方法，以及其在制备治疗抑制肿瘤生长药物和治疗骨质疏松症药物中的用途。

Description

一种乙二醛酶Ⅰ抑制剂及其制备方法和医药用途
技术领域
本发明医药技术领域，涉及乙二醛酶系统的抑制剂，特别涉及一种乙二醛酶I抑制剂(GlxI抑制剂)及其制备方法和医药用途。 
背景技术
目前，临床上使用或正在研发的很多药物是通过直接或间接地抑制DNA和/或蛋白质来达到攻击肿瘤细胞的目的。这种情况下，快速分裂的正常细胞，如肠的上皮和骨髓，也同样受到不利的影响而产生强烈的副作用。 
人体糖代谢过程中不可避免地产生一种叫甲基乙二醛的有毒的化合物，它可以引起细胞的程序死亡。人体在长期进化过程中发展形成了乙二醛酶系统，由乙二醛酶I(glyoxalase I，简称GlxI)和乙二醛酶II(glyoxalase II，简称GlxII)组成，起到解毒甲基乙二醛的作用。在很多肿瘤细胞中GlxI高度表达，其抑制剂可以抑制或延缓人肿瘤细胞在裸鼠的生长，且没有明显副作用。但是，迄今开发的GlxI竞争性抑制剂的活性不够强，为了抑制小鼠肿瘤的生长，必须高剂量长期静脉注射给药。因此，如果研发出更强的竞争性抑制剂，则有望实现临床应用。 
乙二醛酶是以谷胱甘肽(GSH)为基质的酶系统，其功能是将细胞内有毒的甲基乙二醛通过GlxI和GlxII，有序地转化成无毒性的D-乳酸。 
Figure BSA00000648603800011
甲基乙二醛     硫代半缩醛      S-D-乳酰谷胱甘肽      D-乳酸 
甲基乙二醛是化学反应活性很高的α-羰醛，可以共价键的形式与蛋白质和DNA起反应，而直接影响细胞的生存。GlxI可以提高肿瘤细胞内甲基乙二醛的浓度，且快速分裂的肿瘤细胞对外来的甲基乙二醛异常敏感(Creighoton et al，Drugs of the Future，2000，25，385)，因此，有观点认为GlxI抑制剂可以作为抗肿瘤药物，但相关机理尚不十分清楚，有一种观点认为可能是甲基乙二醛与Hsp27蛋白质广泛地发生共价键修饰，导致细胞的分化和程序死亡(Vince et al，J.Med.Chem.，1971，14，35)。 
为了印证上述假说，Creightonde等人合成了一系列过度态类似物，并认为该化合物是GlxI抑制剂(Murthy et al，J.Med.Chem.，1994，37，2161)，抑制常数(Kis)达到了10-8M，其中S-(N-对氯苯基-N-羟基甲酰)谷胱甘肽(CHG)的结构式如下： 
Figure BSA00000648603800021
由于此类化合物含有两个羧基而难以透过细胞膜，所以实际应用时做成[甘氨酰，谷氨酰]二乙酯前体药物使用，前体药物进入细胞后被酯酶迅速水解游离出药物，继而起到肿瘤抑制作用。BBGC的二乙酯前体药物在100mg/Kg的剂量下有效抑制裸鼠荷前列腺DU-145细胞以及肺癌DMS-114细胞的肿瘤生长，而没有明显的毒副作用。CHG的二乙酯前体药物可以抑制猫白血病L1210和黑素瘤B16细胞的生长，IC50为数微摩尔浓度；在80mg/Kg的剂量下有效抑制C57BL/6(Es-1c)裸鼠荷前列腺PC-3，黑色素瘤B16，HT-29肠癌等肿瘤细胞的生长。实验结果证明了抑制GlxI能够杀伤肿瘤细胞，而且此类过度态类似物的抑制常数Ki与二乙酯前体药物的IC50值以及体内药效结果有很强的相关性(Sharkey et al.，Cancer Chemother Pharmacol.，2000，46，156-166)。 
表1.正常细胞与肿瘤细胞中乙二醛酶的活性比较 
Figure BSA00000648603800022
如表1中所示的肿瘤细胞中，除了脑细胞，前列腺肿瘤与膀胱癌细胞中GlxI的活性始终比大多数其他正常或肿瘤细胞高8倍或以上，但该肿瘤细胞中GlxII的活性却低。高度表达GlxI的活性可以提供补偿解毒的机理，因为肿瘤细胞旺盛的代谢所需能源严重依赖糖的分解，由此而产生额外的大量的甲基乙二醛。事实上，前列腺癌细胞对外源性的甲基乙二醛的毒性特别敏感，可能是由程序死亡的结果引起。因此，前列腺肿瘤可能对抑制乙二醛酶系统反应特别敏感。 
另一研究表明，GlxI的浓度在肺癌细胞里也类似于在前列腺肿瘤细胞中的高度表达。GlxI竞争性抑制剂(名称为BBGC)也能有效地抑制肺癌细胞的生长，对移植DMS114的小鼠在100mg/Kg的剂量下有显著的抑制效果，但没有明显毒副作用。如表2所示的7种肺癌细胞中，GlxI的表达水平越高，对其抑制剂也越敏感，即抑制所需的有效浓度也越低(Sakamoto et al，Clinical Cancer Research，2001，7，2513)。这些研究结果表明，GlxI是治疗前列腺癌、肺癌、膀胱癌等肿瘤疾病的理想的耙标，GlxI抑制剂可能成为治疗这类癌症的理想药物。 
表2.肺癌细胞中GlxI活性与对BBGC的敏感性 
Figure BSA00000648603800032
a细胞用BBGC处理48小时.BBGC的IC50值用MTS法测得。 
数值为三次不同实验的平均值±标准偏差。 
2008年，日本理化学研究所Hiroyuki Osada等证实GlxI抑制剂可以应用于骨质疏松症的治疗(PNAS，2008，vol.105，no.33，p 11691-11695)。 
本发明公开的一种独特的小分子抗肿瘤化合物，它不依赖于细胞的分裂与分化，而是作用于乙二醛酶系统从而引起肿瘤细胞的程序死亡，可大大降低毒副作用。 
发明内容
本发明解决了现有技术中抗肿瘤药物对正常细胞的DNA和/或蛋白质产生不利影响、现有的GlxI竞争性抑制剂的活性不高导致高剂量给药等缺陷，提出了一种新合成的乙二醛酶I竞争性抑制剂，即GlxI抑制剂，其作用机理是通过竞争性地抑制乙二醛酶I的活性导致肿瘤细胞内甲基乙二醛的浓度增加而导致肿瘤细胞程序死亡，是治疗癌症的理想药物。 
本发明公开了一种乙二醛酶I抑制剂，其结构通式如以下式I所示： 
式(I) 
R1和R2可以相同或不同，R1和R2为H、乙基、环戊烷； 
X为亚甲基、硫、氧原子之任意一种； 
R3为由炔基、氰基、卤原子、1～3个卤原子取代的乙烯基、1～6个碳的直链烷基、1～4个卤原子取代的烷基之任意一个取代或任意多个同时取代的苯环或吡啶环；其中，所述卤原子是F、Cl、Br、I。 
本发明提出了一种如式工所示的乙二醛酶I抑制剂，其中，R1和R2可以相同或不同，R1和R2为H、乙基、环戊烷；X为亚甲基或硫；R为炔基、氰基之任意一个取代或两个同时取代的苯环。 
本发明提出的乙二醛酶I抑制剂，是谷胱甘肽衍生物或其药学上可接受的盐，包括： 
N-((N’-乙酸基-2-(N”-羟胺-N”-(3-乙炔-苯基))丙酰胺基)-乙酰胺基)-4-氨基-4-甲酸基-丁酰胺，即化合物mAH； 
S-(N-3-炔基苯-N-羟3-((N-羟基-N-谷胱甘肽硫甲酯)氨基)苯乙炔，即化合物mAHG； 
N-((N’-乙酸基-2-(N”-羟胺-N”-(3-乙炔-苯基))丙酰胺基)-乙酰胺基)-4-氨基-4-甲酸基-丁酰胺，即化合物pAH； 
4-((N-羟基-N-谷胱甘肽硫甲酯)氨基)苯乙炔，即化合物pAHG； 
4-((N-羟基-N-谷胱甘肽硫甲酯)氨基)苯腈，即化合物CNHG。 
本发明还提出了所述乙二醛酶I抑制剂的制备方法，取代的硝基苯通过取代反应引入三甲硅炔，脱三甲硅后将硝基还原得到取代的苯羟胺，经谷胱甘肽取代或与C10缩合得到式(I)所示化合物。本发明制备方法可以选自下述方法中之任一种： 
方法一包括如下步骤，间溴硝基苯经过取代反应引入三甲硅炔，脱三甲硅后将硝基还原成羟胺，然后与化合物C10缩合后脱保护基Boc得到式(I)所示化合物； 
Figure BSA00000648603800051
方法二包括如下步骤，间溴硝基苯经过取代反应引入三甲硅炔，脱三甲硅后将硝基还原成羟胺，向羟胺氮原子引入羰硫丙基经氧化后谷胱甘肽取代反应得到式(I)所示化合物； 
Figure BSA00000648603800052
方法三包括如下步骤，对溴硝基苯经过取代反应引入三甲硅炔，脱三甲硅后将硝基还原得到对炔苯羟胺，再与C10缩合后脱保护基Boc得到式(I)所示化合物； 
Figure BSA00000648603800053
方法四包括如下步骤，对溴硝基苯经过取代反应引入三甲硅炔，脱三甲硅后将硝基还原得到对炔苯羟胺，向羟胺氮原子引入羰硫丙基经氧化后谷胱甘肽取代反应得到式(I)所示化合物； 
Figure BSA00000648603800054
方法五包括如下步骤，对氰基硝基苯经还原反应得到对氰基苯羟胺，向羟胺氮原子引入羰硫丙基经氧化后谷胱甘肽取代反应得到式(I)所示化合物。 
本发明还提出了所述乙二醛酶I抑制剂在制备通过基质竞争性的抑制作用抑制肿瘤生长的药物中的应用。 
所述抑制肿瘤生长药物包括抗前列腺癌、肺癌、肠癌、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、皮肤癌、白血病恶性肿瘤的药物。优选作为治疗前列腺癌、肺癌、膀胱癌等肿瘤疾病的药物。 
本发明还提出了所述乙二醛酶I抑制剂在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。 
本发明所述药物是注射剂、冻干粉针、片剂、胶囊剂、栓剂、纳米制剂、脂质体。
本发明还公开了一种药物组合物，其含有治疗有效量的本发明乙二醛酶I抑制剂和药学上可接受的载体。
本发明所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，稀释剂、赋形剂如水等，或粘合剂如纤维素衍生物、明胶等，或填充剂如淀粉等，崩裂剂如碳酸钙等，或其他辅助剂量如香味剂等。所述药物组合物可采用医学领域常规的方法，将本发明GlxI抑制剂作为活性成分，与药学上可接受的载体制成各种剂型。如制备成固体制剂如片剂、粉剂、胶囊等，用于口服；制成注射液，用于注射。在各种制剂中，活性成分的重量含量可以为0.1％-99.9％。药物组合物可以通过静脉注射、皮下注射、口服方式给药，剂量可依患者的年龄、病情等进行调整。 
本发明合成的一类新的乙二醛酶I抑制剂，测定了该化合物对GlxI的抑制活性与抑制机理，抑制剂的抑制常数Ki为1-200nM之间，最好的抑制剂的Ki达到了1nM。本发明抑制剂可以应用于治疗前列腺癌、肺癌、白血病、膀胱癌等各种肿瘤以及骨质疏松症等疾病的治疗。 
现有技术中的乙二醛酶I竞争性抑制剂均以对位取代苯为主，本发明首次提出并合成了苯间位炔基取代的抑制剂并显著地提高了抑制剂的抑制活性。本发明中mAH是迄今该类抑制剂最强的竞争性单倍体抑制剂，Ki达到了1nM，较文献上最强的抑制剂IHG(碘取代的CHG，Ki＝10nM)或C5(J.Med.Chem.2009，52，4650-4656，根据该文献的方法实际合成的该化合物，其Ki测定为8nM)提高了约10倍。 
附图说明
图1所示为乙二醛酶I反应初始速率与谷胱甘肽-甲基乙二醛硫代半缩醛基质浓度在不同固定浓度本发明抑制剂mAH下的双倒数曲线图。条件：50mM磷酸纳缓冲液，pH 7，25℃。 
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。 
本发明中所述试剂均为市售可得。 
实施例1：化合物mAH的合成，即N-((N’-乙酸基-2-(N”-羟胺-N”-(3-乙炔-苯基))丙酰胺基)-乙酰胺基)-4-氨基-4-甲酸基-丁酰胺的合成 
Figure BSA00000648603800071
步骤1：制备3-硝基-(2-(三甲基硅)乙炔基)苯(1) 
氮气保护下，将3-硝基-溴苯(3g，15mmol)，三甲基硅乙炔(1.8g，18mmol)，二氯三苯基磷钯(1.0g，1.5mmol)，碘化亚铜(0.5g，3mmol)和三乙胺(50ml)加入到100ml圆底烧瓶中，得黑色悬浊液，40℃下搅拌反应过夜。TLC检测至原料反应完全后，停止反应。室温减压浓缩反应液至干，得黑色固体。用二氯甲烷溶解黑色固体，过滤出不溶物，滤液在室温下减压浓缩蒸干。残余物粗品用硅胶柱层析纯化，得黄色粉末状固体3.2g即3-硝基-(2-(三甲基硅)乙炔基)苯(1)，产率98％.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.31(1H，s)，8.16(1H，d，J＝8.4Hz)，7.76(1H，d，J＝7.6Hz)，7.49(1H，t，J＝8Hz)，0.27(9H，s)。 
步骤2：制备3-硝基-苯乙炔(2) 
室温下，化合物3-硝基-(2-(三甲基硅)乙炔基)苯(1)(3.0g，13.7mmol)用100ml甲醇溶解后加入到250ml圆底烧瓶中，再加入20ml饱和氟化钾水溶液。室温搅拌3h，TLC检测至原料反应完全后，停止反应。室温减压出甲醇后，得水相悬浊液，用氯仿萃取三次并合并有机相。将有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥。在室温下减压浓缩蒸干溶剂得黄棕色固体2.0g即3-硝基-苯乙炔(2)，产率100％.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.35(1H，s)，8.22(1H，d，J＝8.4Hz)，7.81(1H，d，J＝7.6Hz)，7.54(1H，t，J＝8Hz)，3.24(1H，s)。 
步骤3：制备N-羟基-3乙炔基-苯胺(3) 
冰浴下，将化合物3-硝基-苯乙炔(2)(2.0g，13.6mmol)加入到100ml圆底烧瓶中，用40ml丙酮溶解至澄清。加入3ml饱和氯化铵水溶液，有白色颗粒固体析出，加纯净水至反应液再次澄清。还原性锌粉(3.5g，54.4mmol)分三批次加入到圆底烧瓶中。冰浴下搅拌20min，TLC检测至原料反应完全后，停止反应。将反应液过滤，滤液在室温下减压蒸出丙酮，得水相悬浊液。水相用乙醚萃取三次，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，有机相用无水硫酸镁干燥。室温减压蒸出乙醚得红色粗品。粗品用二氯甲烷/石油醚体系重结晶。得纯品1.1g即N-羟基-3乙炔基-苯胺(3)，产率61％.1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.21(1H，t，J＝8.0Hz)，7.10(1H，s)6.98(2H，d，J＝7.2Hz)，3.43(H，s)。 
步骤4：制备N-((N’-乙酸叔丁酯-2-(N”-羟胺N”-(3-乙炔-苯基))丙酰胺基)-乙酰胺基)-4-(Boc-氨基)-4-叔丁氧羰基-丁酰胺(4) 
冰浴下，将化合物C-10(0.4g，1.1mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)(0.9g，4.7mmol)和10ml无水二氯甲烷加入到50ml圆底烧瓶中，搅拌5-10min。再将化合物N-羟基-3乙炔基-苯胺(3)(0.4g，3.8mmol)加至反应瓶中，搅拌5h。分析型HPLC检测原料基本反应完全后，停止反应。室温下，将反应液在室温下减压出二氯甲烷，得粗品。粗品用制备型HPLC分离制备，得白色纯品233.5mg即N-((N’-乙酸叔丁酯-2-(N”-羟胺-N”-(3-乙炔-苯基))丙酰胺基)-乙酰胺基)-4-(Boc-氨基)-4-叔丁氧羰基-丁酰胺(4)，产率48.5％.1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.77(1H，s)，7.67(1H，d，J＝6.4Hz)，7.37(1H，t，J＝7.6Hz)，7.30(1H，d，J＝6.4Hz)，4.50(1H，m)，3.99(1H，m)，3.90(1H，d，J＝17.2Hz)，3.82(1H，d，J＝17.6Hz)，3.54(1H，s)，2.83(2H，m)，2.38(2H，t，J＝7.2Hz)，2.23(1H，m)，2.12(1H，m)，2.02(1H，m)，1.89(1H，m)，1.48(18H，s)，1.46(9H，s)。 
步骤5：制备化合物mAH：N-((N’-乙酸基-2-(N”-羟胺-N”-(3-乙炔-苯基))丙酰胺基)-乙酰胺基)-4-氨基-4-甲酸基-丁酰胺(5) 
氮气保护冰浴下，化合物N-((N’-乙酸叔丁酯-2-(N”-羟胺-N”-(3-乙炔-苯基))丙 酰胺基)-乙酰胺基)-4-(Boc-氨基)-4-叔丁氧羰基-丁酰胺(4)(223mg，0.34mmol)、12ml二氯甲烷溶解、6ml三氟乙酸加至50ml圆底烧瓶中，搅拌120min，分析型HPLC检测原料基本反应完全后，停止反应。将反应液在室温下减压浓缩蒸干得粗品，粗品用制备型HPLC分离制备，得白色纯品130.2mg即化合物mAH，即N-((N’-乙酸基-2-(N”-羟胺-N”-(3-乙炔-苯基))丙酰胺基)-乙酰胺基)-4-氨基-4-甲酸基-丁酰胺，产率86％.1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.34(1H，s)，7.64(1H，d，J＝6.4Hz)，7.34(1H，t，J＝8Hz)，7.29(1H，s)，4.47(1H，t，J＝7.6Hz)，4.02(1H，t，J＝6.4Hz)，3.97(1H，d，J＝17.6Hz)，3.88(1H，d，J＝17.6Hz)，3.51(1H，s)，2.81(2H，broad s)，2.56(2H，t，J＝6.8Hz).2.18(3H，m)，2.02(1H，m)。 
实施例2：化合物mAHG的合成，即S-(N-3-炔基苯-N-羟3-((N-羟基-N-谷胱甘肽硫甲酯)氨基)苯乙炔的合成 
步骤1：制备3-硝基-(2-(三甲基硅)乙炔基)苯(1) 
氮气保护下，3-溴硝基苯(3g，15mmol)，三甲基硅乙炔(1.8g，18mmol)，二氯三苯基磷钯(1.0g，1.5mmol)，碘化亚铜(0.5g，3mmol)和三乙胺(50ml)加入到圆底烧瓶中，得黑色悬浊液。40℃下搅拌反应过夜，TLC检测至原料反应完全后停止反应。将反应液在室温下减压浓缩至干，得黑色固体。用二氯甲烷溶解黑色固体，过滤，滤液在室温下真空减压浓缩蒸出溶剂，残余物粗品用硅胶柱层析纯化，得灰白色固体3.1g即3-硝基-(2-(三甲基硅)乙炔基)苯(1)，产率96％.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.31(1H，s)，8.16(1H，d，J＝8.4Hz)，7.76(1H，d，J＝7.6Hz)，7.49(1H，t，J＝8Hz)，0.27(9H，s)。 
步骤2：制备3-硝基-苯乙炔(2) 
在室温下，向250ml圆底烧瓶中，加入化合物3-硝基-(2-(三甲基硅)乙炔基)苯(1)(3.0g，13.7mmol)、100ml甲醇搅拌溶解后，加入25ml饱和氟化钾水溶液。室温搅拌3h，TLC检测至原料反应完全后，停止反应。反应液在室温下减压出甲醇后，得水相悬浊液，用氯仿萃取三次，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，有机相无水硫酸镁干燥。在室温下减压浓缩蒸出溶剂得黄棕色固体2.1g即3-硝基-苯乙炔(2)，产率100％.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.35(1H，s)，8.22(1H，d，J＝8.4Hz)，7.81(1H，d，J＝7.6Hz)，7.54(1H，t，J＝8Hz)，3.24(1H，s)。 
步骤3：制备N-羟基-3-乙炔基-苯胺(3) 
冰浴下，化合物3-硝基-苯乙炔(2)(2.0g，13.6mmol)加入到100ml圆底烧瓶中，用50ml丙酮溶解至澄清。加入3ml饱和氯化铵水溶液，有白色颗粒固体析出，加纯净水至反应液再次澄清。还原性锌粉(3.5g，54.4mmol)分三批次加入到反应液中。冰浴下搅拌20min，TLC检测至原料反应完全后，停止反应。过滤，将滤液室温减压蒸出丙酮，得水相悬浊液。水相用乙醚萃取三次，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，有机相无水硫酸镁干燥。在室温下减压浓缩蒸出乙醚得红色粗品。粗品用二氯甲烷/石油醚体系重结晶。得纯品1.1g即N-羟基-3-乙炔基-苯胺(3)，产率61％.1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.21(1H，t，J＝8.0Hz)，7.10(1H，s)6.98(2H，d，J＝7.2Hz)，3.43(H，s)。 
步骤4：制备N-羟基-N-(3-乙炔苯基)-丙硫酰胺(4) 
冰浴下，将N-羟基-3-乙炔基-苯胺(3)(0.6g，4.5mmol)加入到圆底烧瓶中，用30ml二氯甲烷溶清。碳酸钾加入反应瓶后，加入少量纯净水至碳酸钾溶解。丙硫酰氯(0.75g，4.95mmol)用5ml二氯甲烷溶解后滴加到反应瓶中，滴加时间超过5mim。冰浴下搅拌30min，直至TLC检测原料基本反应完全。停止反应，加入15ml水，萃取分层，保留二氯甲烷层。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，有机相用无水硫酸镁干燥，在室温下减压浓缩蒸出溶剂，残余物用硅胶柱层析纯化，得黄色固体0.54g即N-羟基-N-(3-乙炔苯基)-丙硫酰胺(4)，产率51％.1HNMR(400MHz，CD3OD)δ7.64(1H，s)，7.56(1H，d，J＝8.4Hz)，7.24(1H，t，J＝7.6Hz)，7.13(1H，d，J＝7.6Hz)，3.41(1H，s)，2.72(2H，t，J＝7.2Hz)，1.57(2H，sext，J＝7.2Hz)，0.93(3H，t，J＝7.2Hz)。 
步骤5：制备N-羟基-N-(3-乙炔苯基)-硫氧代丙硫酰胺(5) 
冰浴下，将化合物N-羟基-N-(3-乙炔苯基)-丙硫酰胺(4)(0.4g，1.7mmol)加入到圆底烧瓶中，用5ml乙醚溶解澄清。间氯过氧苯甲酸(0.35g，1.9mmol)用5ml乙醚溶解后，滴加至反应瓶中，滴加时间超过2min。冰浴下搅拌10min，直至TLC检测原料反应完全。停止反应，将反应液在室温下真空浓缩蒸出乙醚，得0.4g粗品即N-羟基-N-(3-乙炔苯基)-硫氧代丙硫酰胺(5)，不用进一步纯化，直接用于下一步反应。 
步骤6：制备化合物mAHG：S-(N-3-乙炔苯基N-羟基甲酰)谷胱甘肽(6) 
在室温下，将化合物N-羟基-N-(3-乙炔苯基)-硫氧代丙硫酰胺(5)(0.4g，1.5mmol)加入到圆底烧瓶中，用20ml甲醇∶水(1∶1)的溶液溶解澄清。谷胱甘肽(0.93g，3.0mmol)用20ml水溶解后，加至反应瓶中。用碳酸氢钠调节pH至8-9。室温下搅拌2h，ESI-MS检测反应。反应完全后停止反应，用三氟乙酸调节反应液的pH至3-4，粗品用制备型HPLC分离，冷冻干燥后得0.27g化合物mAHG，产率38.6％.1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.75(1H，s)，7.67(1H，m)，7.34(1H，t，J＝8Hz)，7.25(1H，m)，4.66(1H，dd，J＝8.8，4.8Hz)，4.02(1H，t，J＝6.4Hz)，3.94(2H，s)，3.50(1H，s)，3.41(1H，dd，J＝14.4，4.8Hz)，3.11(1H，dd，J＝14，4Hz)，2.55(2H，t，J＝7.2Hz)，2.22(1H，m)，2.15(1H，m)。 
实施例3：pAH的合成，即N-((N’-乙酸基-2-(N”-羟胺-N”-(3-乙炔-苯基))丙酰胺基)-乙酰胺基)-4-氨基-4-甲酸基-丁酰胺的合成 
Figure BSA00000648603800111
步骤1：制备对位硝基-(2-(三甲基硅)乙炔基)苯(1) 
氮气保护下，对溴硝基苯(3g，15mmol)，三甲基硅乙炔(1.8g，18mmol)，二氯三苯基磷钯(1.0g，1.5mmol)，碘化亚铜(0.5g，3mmol)和三乙胺(50ml)加入到圆底烧瓶中，得黑色悬浊液。室温下搅拌6h，TLC检测至原料反应完全后停止反应。将反应液室温减压浓缩至干，得黑色固体。用二氯甲烷溶解黑色固体，过滤，滤液在室温下减压浓缩蒸干溶剂。残余物用硅胶柱层析纯化，得灰白色固体3.2g即对位硝基-(2-(三甲基硅)乙炔基)苯(1)，产率98％.1HNMR(400MHz，CDCl3)δ8.17(2H，d，J＝8Hz)，7.60(2H，d，J＝7.6Hz)，0.28(9H，s)。 
步骤2：制备对硝基-苯乙炔(2) 
在室温下，化合物对位硝基-(2-(三甲基硅)乙炔基)苯(1)(3.0g，13.7mmol)用30ml甲醇溶解后，加入10ml饱和氟化钾溶液。室温搅拌3h，TLC检测至原料反应完全后停止反 应。反应液在室温下真空浓缩蒸出甲醇后，得水相，用氯仿萃取三次，合并有机相。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，有机相用无水硫酸镁干燥。有机相在室温下真空浓缩蒸干溶剂得2.0g产品即对硝基-苯乙炔(2)，产率100％.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.21(2H，d，J＝7.6Hz)，7.65(2H，d，J＝7.6Hz)，3.36(1H，s)。 
步骤3：制备N-羟基-4-乙炔基-苯胺(3) 
在冰浴下，化合物对硝基-苯乙炔(2)(2.0g，13.6mmol)加入到圆底烧瓶中，用40ml丙酮溶解至澄清。加入3ml饱和氯化铵溶液，有白色颗粒固体析出，加纯净水至反应液再次澄清。锌粉(3.5g，54.4mmol)分三次加入到圆底烧瓶中。冰浴下搅拌20min，TLC检测至原料反应完全后停止反应。将反应液过滤，滤液在室温下真空浓缩蒸出丙酮，得水相悬浊液。水相用乙醚萃取三次，合并有机相。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，有机相用无水硫酸镁干燥。室温下真空浓缩蒸出乙醚得红色粗品。粗品用二氯甲烷/石油醚体系重结晶。得纯品1.1g即N-羟基-4-乙炔基-苯胺(3)，产率61％.1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.31(2H，d，J＝8.4Hz)，6.90(2H，d，J＝8.4Hz)，3.28(H，s)。 
步骤4：制备N-((N’-乙酸叔丁酯-2-(N”-羟胺-N”-(4-乙炔-苯基))丙酰胺基)-乙酰胺基)-4-(Boc-氨基)-4-叔丁氧羰基-丁酰胺(4) 
在冰浴下，化合物N-羟基-4-乙炔基-苯胺(3)(0.4g，3.25mmol)加入到圆底烧瓶中，用10ml无水二氯甲烷溶清。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)(0.7g，3.9mmol)加至反应瓶中，搅拌10min。化合物C10(0.7g，1.3mmol)加至反应瓶中，搅拌5h。TLC检测至原料反应完全后，停止反应。反应液在室温下，真空浓缩蒸干二氯甲烷，残余物用制备型HPLC分离制备，得白色纯品0.24g即N-((N’-乙酸叔丁酯-2-(N”-羟胺-N”-(4-乙炔-苯基))丙酰胺基)-乙酰胺基)-4-(Boc-氨基)-4-叔丁氧羰基-丁酰胺(4)，产率30％.H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.67(2H，d，J＝8Hz)，7.47(2H，d，J＝8.8Hz)，4.49(1H，m)，3.98(1H，m)，3.90(1H，d，J＝17.2Hz)，3.82(1H，d，J＝17.2Hz)，3.50(1H，s)，2.83(2H，m)，2.38(2H，t，J＝7.2Hz)，2.23(1H，m)，2.13(1H，m)，2.02(1H，m)，1.87(1H，m)，1.48(18H，s)，1.46(9H，s)。 
步骤5：制备化合物pAH：N-((N’-乙酸基-2-(N”-羟胺-N”-(3-乙炔-苯基))丙酰胺基)-乙酰胺基)-4-氨基-4-甲酸基-丁酰胺(5) 
氮气保护冰浴下，化合物N-((N’-乙酸叔丁酯-2-(N”-羟胺-N”-(4-乙炔-苯基))丙酰胺基)-乙酰胺基)-4-(Boc-氨基)-4-叔丁氧羰基-丁酰胺(4)(220mg，0.34mmol)用12ml二氯甲烷溶解，加入6ml三氟乙酸，冰浴下搅拌120min，分析型HPLC检测至原料基本反应完全后，停止反应。将反应液在室温下减压浓缩蒸干，残余物粗品用制备型HPLC分离制备，得白色纯品30mg即化合物pAH，即N-((N’-乙酸基-2-(N”-羟胺-N”-(3-乙炔-苯基))丙 酰胺基)-乙酰胺基)-4-氨基-4-甲酸基-丁酰胺，产率20％.1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.67(2H，d，J＝7.2Hz)，7.48(2H，d，J＝8.4Hz)，4.49(1H，t，J＝7.2Hz，)，4.04(1H，t，J＝6.4Hz)，4.00(1H，d，J＝19.2Hz)，3.90(1H，d，J＝17.6Hz)，3.50(1H，s)，2.83(2H，s broad)，2.58(2H，t，J＝7.2Hz)，2.24(3H，m)，2.05(1H，m)。 
实施例4：pAHG的合成，即4-((N-羟基-N-谷胱甘肽硫甲酯)氨基)苯乙炔的合成 
Figure BSA00000648603800131
步骤1：制备对硝基-(2-(三甲基硅)乙炔基)苯(1) 
氮气保护下，对溴硝基苯(10g，49.5mmol)，三甲基硅乙炔(5.83g，59.4mmol)，二氯三苯基磷钯(3.48g，4.95mmol)，碘化亚铜(1.88g，9.2mmol)和三乙胺(80ml)加入到250ml圆底烧瓶中，得黑色悬浊液。室温下搅拌反应6h，TLC检测至原料反应完全后停止反应。将反应液室温减压浓缩至干，得黑色固体。用二氯甲烷溶解黑色固体，过滤，滤液在室温下减压浓缩蒸出溶剂。残余物粗品用硅胶柱层析纯化，得灰白色固体9.2g即对硝基-(2-(三甲基硅)乙炔基)苯(1)，产率85％.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.17(2H，d，J＝8Hz)，7.60(2H，d，J＝7.6Hz)，0.28(9H，s)。 
步骤2：制备对硝基苯乙炔(2) 
在室温下，化合物对硝基-(2-(三甲基硅)乙炔基)苯(1)(9.0g，41.1mmol)用300ml甲醇溶解后，加入75ml饱和氟化钾溶液。室温搅拌30-50min，TLC检测至原料反应完全后停止反应。将反应液室温减压出甲醇后，得水相，用氯仿萃取三次，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，有机相用无水硫酸镁干燥，在室温下减压浓缩蒸干溶剂得5.86g产品即对硝基苯乙炔(2)，产率97％.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.21(2H，d，J＝7.6Hz)，7.65(2H，d，J＝7.6Hz)，3.36(1H，s)。 
步骤3：制备N-羟基-4-乙炔基-苯胺(3) 
在冰浴下，化合物对硝基苯乙炔(2)(5.0g，34mmol)加入到250ml圆底烧瓶中，用150ml丙酮溶解至澄清。加入15ml饱和氯化铵水溶液，有白色颗粒固体析出，加纯净水至反应液再次澄清。锌粉(10g，0.15mol)分三次加入到圆底烧瓶中。冰浴下搅拌40-60min，TLC检测至原料反应完全后停止反应。经反应液过滤，滤液室温减压蒸出丙酮，得水相悬浊液。水相用乙醚萃取三次，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，有机相用无水硫酸镁干燥，减压蒸出乙醚得红色粗品。残余物粗品用二氯甲烷/石油醚体系重结晶。得纯品2.8g即N-羟基-4-乙炔基-苯胺(3)，产率61％.1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.31(2H，d，J＝8.4Hz)，6.90(2H，d，J＝8.4Hz)，3.28(H，s)。 
步骤4：制备N-羟基-N-(4-乙炔苯基)-丙硫酰胺(4) 
在冰浴下，化合物N-羟基-4-乙炔基-苯胺(3)(2.0g，15mmol)加入到100ml圆底烧瓶中，用30ml无水二氯甲烷溶清。碳酸钾(1.0，7.5mmol)加入反应瓶后，加入少量纯净水至碳酸钾溶解。丙硫酰氯(1.7g，16.5mmol)用10ml二氯甲烷溶解后滴加到反应瓶中，滴加时间超过10mim。冰浴下搅拌40-60min，直至TLC检测原料反应完全。停止反应，向反应液用15ml水洗涤，再用饱和氯化钠水溶液洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥。有机相在室温下真空浓缩蒸干溶剂得粗品，再用硅胶柱层析纯化，得黄色固体1.5g即N-羟基-N-(4-乙炔苯基)-丙硫酰胺(4)，产率42％.1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.64(2H，d，J＝8.4Hz)，7.43(2H，d，J＝8.4Hz)，3.44(H，s).2.81(2H，t，J＝7.6Hz)，1.65(2H，m)，1.01(3H，t，J＝7.6Hz)。 
步骤5：制备N-羟基-N-(4-乙炔苯基)-硫氧代丙硫酰胺(5) 
在冰浴下，化合物N-羟基-N-(4-乙炔苯基)-丙硫酰胺(4)(80mg，0.34mmol)加入到圆底烧瓶中，用5ml乙醚溶解澄清。间氯过氧苯甲酸(117mg，0.51mmol)用5ml乙醚溶解后，滴加至反应瓶中，滴加时间超过2min。冰浴下搅拌10min，直至TLC检测原料反应完全。停止反应，反应液在室温下真空浓缩蒸出乙醚，得85mg粗品即N-羟基-N-(4-乙炔苯基)-硫氧代丙硫酰胺(5)，不用进一步纯化，直接用于下一步反应。 
步骤6：制备化合物pAHG：S-(N-4-乙炔苯基N-羟基甲酰)谷胱甘肽(6) 
在室温下，将化合物N-羟基-N-(4-乙炔苯基)-硫氧代丙硫酰胺(5)(85mg，0.34mmol)加入到圆底烧瓶中，用20ml甲醇∶水(1∶1)的溶液溶解澄清。谷胱甘肽(209mg，0.68mmol)用5ml水溶解后，加至反应瓶中。用碳酸氢钠调节pH至8-9。室温下搅拌2h，ESI-MS检测反应。反应完全后停止反应，用三氟乙酸调节pH至3-4，粗品用制备型HPLC分离，冷冻干燥后得1.5mg化合物pAHHG.1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.65(2H，d，J＝8.8Hz)，7.45(2H，d，J＝8.8Hz)，4.65(1H，dd，J＝8.4，4.8Hz)，4.01(2H，t，J＝6.4Hz)，3.47(1H，s)，3.40(1H，dd，J＝14，4.8Hz)， 3，10(1H，dd，J＝14，4.8Hz)，2.54(2H，t，J＝7.2Hz).2.18(2H，m)。ESI-MS m/z 467(M+H)+。 
实施例5：化合物CNHG的合成，即4-((N-羟基N-谷胱甘肽硫甲酯)氨基)苯腈的合成 
步骤1：制备对羟胺苯腈(1) 
冰浴氮气保护下，反应瓶中加入4-硝基苯腈(2.96g，20mmol)，用50ml丙酮溶解澄清。加入9ml饱和氯化铵水溶液，有白色颗粒固体析出，加纯净水至固体溶解，反应液再次澄清。锌粉(3.9g，60mmol)分三次加入，冰浴下搅拌20min，TLC检测反应完全。过滤，滤液室温减压浓缩除丙酮，补加30ml水后，用乙醚萃取三次，合并有机相，有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥有机相。室温减压浓缩除乙醚后，得谈黄色固体1.8g即对羟胺苯腈(1)，产率68％，产品直接用于下一步。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.52(2H，d，J＝8.4Hz)，6.98(2H，d，J＝8.4Hz)。 
步骤2：制备N-羟基N-对腈基苯-丙硫酰胺(2) 
冰浴下，化合物对羟胺苯腈(1)(2.5g，18.7mmol)加入到250ml圆底烧瓶中，用100ml二氯甲烷溶解澄清。将碳酸钾加入反应瓶后，加入少量纯净水至碳酸钾溶解。丙硫酰氯(3.1g，20.5mmol)用30ml二氯甲烷溶解后滴加到反应瓶中，滴加时间超过15mim。冰浴下搅拌60-100min，直至TLC检测原料反应完全。停止反应，向反应瓶中加入50ml水，萃取分层，保留二氯甲烷层。有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥有机相。室温减压浓缩除乙醚后，残余物粗品用硅胶柱层析纯化，得黄色固体2.7g即N-羟基N-对腈基苯-丙硫酰胺(2)，产率62％.1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.87(2H，d，J＝7.6Hz)，7.7(2H，d，J＝7.6Hz)，2.83(2H，t，J＝6.8Hz)，1.66(2H，sext，J＝7.2Hz)，1.02(3H，t，J＝7.6Hz)。 
步骤3：制备N-羟基N-对腈基苯-硫氧代丙硫酰胺(3) 
冰浴下，化合物N-羟基N-对腈基苯-丙硫酰胺(2)(0.5g，2.1mmol)加入到250ml圆底烧瓶中，用50ml乙醚溶解澄清。将间氯过氧苯甲酸(0.44g，2.5mmol)用30ml乙醚溶解后，滴加至反应瓶中，滴加时间超过10min。冰浴下搅拌30min，直至TLC检测原料反应完全。停止反应，室温减压蒸干乙醚，得0.6g粗品即N-羟基-N-对腈基苯-硫氧代丙硫酰胺(3)直接用于下一步。 
步骤4：制备化合物CNHG：S-(N-对腈基苯-N-羟基甲酰)谷胱甘肽(4) 
室温下，将化合物N-羟基N-对腈基苯-硫氧代丙硫酰胺(3)(0.6g，2.2mmol)加入到250ml圆底烧瓶中，用50ml甲醇∶水(1∶1)的溶液溶解澄清。谷胱甘肽(2.3g，6.6mmol)用40ml水溶解后，加至反应瓶中。用碳酸氢钠调节pH至8-9。室温下搅拌2h，ESI-MS检测反应。反应完全后停止反应，用三氟乙酸调节pH至3-4，粗品用制备型HPLC分离，冷冻干燥后得0.5g即化合物CNHG，产率48％。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.87(2H，d，J＝9.2Hz)，7.74(2H，d，J＝9.2Hz)，4.68(1H，dd，J＝8.4，5.2Hz)，3.40(1H，t，J＝6.4Hz)，3.94(2H，s)，3.43(1H，dd，J＝14，4.8Hz)，3.12(1H，dd，J＝14.4，8.4Hz)，2.55(2H，t，J＝7.6Hz)，2.19(2H，m)。 
实施例6：乙二醛酶I抑制剂的抑制常数测定与抑制机理研究 
在抑制剂存在或不存在的情况下，对本发明乙二醛酶I抑制剂对人乙二醛酶I的竞争抑制常数(Ki)根据产物产生的初始速率的变化进行测定。检测方法如下：在比色皿中含有2mlpH 7，50mM磷酸钠缓冲液，25℃下，在固定硫代半缩醛含有浓度0.18mM(Km)下，本发明GlxI抑制剂的溶液中加入约0.02uL人乙二醛酶酶I。根据240nm波长下吸光度的增加测定产物生成的初始速率。得到的初始速率数据根据竞争性抑制方程算出抑制常数(Organic Letters，2003，5，4855-4858)。 
经计算，本发明合成的乙二醛酶I抑制剂与抑制常数Ki如下表3所示。 
表3.本发明新合成的乙二醛酶I抑制剂与乙二醛酶I抑制活性 
Figure BSA00000648603800171
a数值为二次不同实验的平均值。 
从表3结果可见，本发明乙二醛酶I抑制剂中mAH的抑制活性最强，达到了Ki＝1nM，说明炔基在间位和式(1)X为亚甲基时，GlxI抑制剂的抑制效果最好。而X为硫时，炔基取代的GlxI抑制剂活性与X为亚甲基时的抑制活性相比较降低10-20倍左右。CNHG活性的降低可能与其水溶性基团氰基与活性中心疏水性集团相排斥导致与酶的亲和性降低有关。 
抑制机理研究：如图1所示，在50mM磷酸纳缓冲液，pH 7，25℃的反应条件下，在不同固定浓度本发明抑制剂mAH存在情况下，获得的乙二醛酶I反应初始速率与谷胱甘肽-甲基乙二醛硫代半缩醛基质浓度的双倒数曲线图。图1表明，mAH是通过与基质谷胱甘肽竞争而达到抑制乙二醛酶I的作用。 
实施例7：乙二醛酶I抑制剂体外肿瘤细胞增殖抑制试验 
首先，用ATP法测定本发明乙二醛酶I抑制剂的细胞毒性。将前列腺癌NCI-H660细胞调整合适的细胞密度，以每孔140ul细胞悬液接种96孔板，每种细胞的接种密度为：2000-6000个。放置上述细胞24小时使其附着在孔壁上，24小时后将10μl本发明GlxI抑制剂加入到培养板中。GlxI抑制剂采用三倍稀释法使其在孔中的最终浓度达到：100μM、33.3μM、11.1μM、3.70μM、1.23μM、0.41μM、0.14μM、0.046μM、0.015μM。每个浓度加入三复孔。37℃培养箱中孵育72小时后，每孔加入75μLCellTiter Glo裂解液，然后再振板机上混匀2分钟，诱导细胞溶解，将96孔板在室温中避光放置10分钟，使其发光信号稳定，将每孔100μL的混合液转移至新的96孔白板，使用EnVision读取luminescence信号。使用Excel计算每个药物浓度对细胞增殖的抑制率，然后使用Excel的插件XLFit软件进行拟合做出抑制曲线图并计算相应参数，如最高和最低抑制率、绝对和相对IC50。 
本实施例中所用的本发明乙二醛酶I抑制剂分别为：化合物mAH、mAHG、pAH、pAHG、CNHG。实验结果所测得的IC50范围均在0.01μM-3000μM之间，其中mAH二乙酯化合物对 NCI-H660细胞的IC50为8.7μM，mAHG的IC50为12.6μM、pAH的IC50为51.6μM、pAHG的IC50为15.6μM、CNHG的IC50为98.8μM，此时阳性对照CHG二乙酯化合物的IC50为90.5μM。 
以上检测结果表明，本发明乙二醛酶I抑制剂具有肿瘤细胞生长抑制作用。 
实施例8：乙二醛酶I抑制剂体内前列腺癌皮下异种移植增殖抑制试验 
根据实施例7体外增殖抑制试验的结果，在乙二醛酶I抑制剂(GlxI抑制剂)中选择显示较低IC50的乙二醛酶I抑制剂化合物mAH，评估其在C57BL/6(Es-1c)裸鼠皮下移植人源前列腺癌NCI-H660细胞的生长抑制效果。 
检测方法如下：首先，静脉注射最大耐受剂量药物测定其血浆药代动力学特性，组织分布试验可以同时完成，包括测定在肝、肾、胰腺、心、肺、肿瘤细胞与骨髓等中抑制剂的浓度与代谢产物。给药方式一般采用静脉注射的方式，除非生物利用度试验结果显示其他给药方式(如腹腔注射)也可以达到良好的吸收效果。药代动力学结果显示，在肿瘤细胞中抑制剂的浓度可以达到满意的浓度时，抑制剂的抑制试验开始进行。即使肿瘤的体积保持在％T/C50％或以下的药物剂量组。 
实验指标：实验指标是考察肿瘤生长是否可以被抑制、延缓或治愈。每周两次或隔天用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。乙二醛酶I抑制剂的抑瘤疗效(TGI)用T-C(天)和T/C(％)评价。T-C(天)反映肿瘤生长延迟指标，T表示用药组肿瘤达到预先设定体积(如1,000mm3)所用的平均天数，C表示对照组肿瘤达到相同体积所用的平均天数。T/C(％)的百分比值反映肿瘤生长抑制率，T和C分别表示给药组和对照组的瘤重(瘤体积)。T/C％≤42％，认为此药有效；T/C％≤10％，认为此药极有效。 
数据分析：T检验用于两组间比较。三组或多组间比较用one-way ANOVA。如果F值有显著性差异，应在ANOVA分析之后再进行多重比较。two-way ANOVA用于分析联合给药组潜在的协同作用。用SPSS 17.0进行所有数据分析。p＜0.05认为有显著性差异。 
乙二醛酶I抑制剂的给药剂量为0.1mg/Kg-100mg/Kg之间，mAH二乙酯化合物在5mg/Kg的情况下，每日给药一次，连续给药两个星期后，检测肿瘤的体积。检测结果表明，T/C(％)为6.0％。 
本实施例中分别用mAHG、pAH、pAHG、CNHG的二乙酯化合物在5mg/Kg的情况下进行实验，检测结果显示T/C(％)分别为8.1％，7.1％，9.8％，20.7％。 
以上结果表明，本发明乙二醛酶I抑制剂确有体内肿瘤抑制效果，可作为抗肿瘤药物应用。 
实施例9：乙二醛酶I抑制剂初步药代动力学研究 
雌性C57BL/6(Es-1c)裸鼠单剂量静脉受试乙二醛酶I抑制剂后，用液相色谱串联质谱法定量测定其在主要组织中的浓度及血药浓度，考察受试药物在雌性C57BL/6(Es-1c)裸鼠体内血液与主要组织中的分布差异。 
实验方法与过程如下：雌性C57BL/6(Es-1c)裸鼠，体重18-25g，6-8周龄，另外，3只雌性C57BL/6(Es-1c)裸鼠用于采集空白样品，配制分析所需的标准曲线。静脉注射GlxI抑制剂给药剂量为1mg/kg，给药体积均为5mL/kg。静脉注射给药溶媒：DMSO∶Solutol HS15∶Saline＝5∶5∶90，v/v/v。建立LC-MS/MS方法，用内标法定量测定受试药物血药浓度及组织浓度，线性范围1-1000ng/mL，定量下限范围一般为1ng/mL。雌性C57BL/6(Es-1c)裸鼠经静脉注射GlxI抑制剂给药后在0.25，2，8和24hr单次从小鼠尾静脉采集全血约20μL，用K2EDTA抗凝，按照体积比加入3倍的重蒸水得到稀释后的血样，保存于-70℃中直至分析。同时采集心，肝，脾，肺，肾，胃，小肠，胰腺等组织样品，用生理盐水洗净，滤纸吸干后称重并记录，然后保存于-70℃中直至分析。将称重过的脏器组织解冻后，心，肝，脾，肺，肾，胃，小肠，胰腺加入3倍PBS缓冲盐用Beadbeater匀浆；骨髓样品采集时采用0.3mL的PBS缓冲盐冲洗，然后12000转离心5分钟，移去0.25mL上清液，剩余的细胞样品加入150μL PBS缓冲盐匀浆。 
数据分析：采用WinNonlin(版本6.2)软件，按非房室模型计算药动学参数(CL，Vss，t1/2，AUC，MRTINF等)。 
经测试，本实施例测得的t1/2范围在0.1-3000分钟之间，mAH二乙酯化合物的t1/2为180分钟。 
本实施例中分别对mAHG、pAH、pAHG、CNHG进行实验，检测结果显示t1/2分别是190分钟、200分钟、210分钟、187分钟。 
实施例10：乙二醛酶I抑制剂对假膜组织细胞介导的骨溶解的抑制作用 
检测方法如下：采用酶消化法从假膜组织中分离细胞，应用免疫磁珠法将细胞分离成CD14+和CD14-。将CD14+细胞分为2组，其中A组培养液中加入M-CSF(30ng/ml)+RANKL(50ng/ml)，B组培养液中加入M-CSF(30ng/ml)+RANKL(50ng/ml)+GlxI抑制剂(不同浓度的GlxI抑制剂，其最终浓度达到：100μM、50μM、30μM、15μM、10μM、5μM、1μM、 0.5μM，于培养开始时加入)。细胞分别接种于玻璃盖玻片(培养10天)及皮质骨磨片(培养14天)上，培养结束后检测骨吸收陷窝的形成，以骨吸收陷窝面积为指标比较本发明GlxI抑制剂的骨吸收抑制活性(IC50)。 
检测结果显示：CD14+细胞(A组)在皮质骨磨片上形成骨吸收陷窝(面积为10.10％±1.38％)；于培养开始时加入GlxI抑制剂(B组)，根据骨吸收陷窝的面积减少，测算出GlxI抑制剂的骨吸收抑制活性(IC50)。测得的IC50范围均在0.1μM-500μM之间，其中mAH二乙酯化合物的IC50为5.7μM，其他二乙酯化合物为：mAHG的IC50为22.6μM、pAH的IC50为21.6μM、pAHG的IC50为25.6μM、CNHG的IC50为125.8μM，此时阳性对照CHG二乙酯化合物的IC50为68.5μM。 
以上检测结果表明，本发明乙二醛酶I抑制剂具有对假膜组织细胞介导的骨溶解的抑制作用，即具有骨吸收抑制活性，所以可以应用于骨质疏松症的治疗。 
实施例11.GlxI抑制剂冻干粉针剂的制备 
乙二醛酶I抑制剂(GlxI抑制剂)冻干粉针剂的制备过程包括以下步骤： 
1)添加冻干支持剂与助溶剂：调节药液pH值至4～9，添加GlxI抑制剂一半重量的冻干支持剂甘露醇。助溶剂为注射用β-羟甲基环糊精，加入量为与GlxI抑制剂等量。 
GlxI抑制剂和冻干支持剂甘露醇的重量比为6∶1～3∶1。 
冻干支持剂选自甘露醇、木糖醇、山梨醇、氯化钠和右旋糖酐中的一种或任意两种的混合；GlxI抑制剂和β-羟甲基环糊精的重量比为10∶1～1∶1。 
2)除热原：加入0.1％(W/V)针剂用活性炭，在70℃下保温20分钟，过滤，加入注射用水调整药液浓度，用无菌0.45μM滤膜过滤。 
适宜的保温温度为40℃～100℃下保温5～30分钟。合适的针剂用活性炭质量体积百分比为0.01～0.5％(W/V)。 
3)冻干：将上述样品于冷冻干燥机内预冻，于-50℃深冻，同时开启真空，在20小时内，将温度升至-5℃，再用5小时，将温度升至40℃，继续保持真空5小时，即得GlxI抑制剂冻干粉针剂。 
上述冻干过程中适用的操作条件为，于-55～-40℃深冻，开启真空后，在5～30小时内，将温度升至-25～-5℃，再用1～10小时，将温度升至10～60℃，继续保持真空1～10小时，制得GlxI抑制剂冻干粉针剂。 

Claims (10)

1.一种如式I所示的乙二醛酶I抑制剂，
式(I)
R1和R2可以相同或不同，R1和R2为H、乙基、环戊烷；
X为亚甲基、硫、氧原子之任意一种；
R3为由炔基、氰基、卤原子、1～3个卤原子取代的乙烯基、1～6个碳的直链烷基、1～4个卤原子取代的烷基之任意一个取代或任意多个同时取代的苯环或吡啶环；其中，所述卤原子是F、Cl、Br、I。
2.根据权利要求1所述的乙二醛酶I抑制剂，其特征在于，X为亚甲基或硫；R3为炔基、氰基之任意一个取代或两个同时取代的苯环。
3.根据权利要求1所述的乙二醛酶I抑制剂，其特征在于，包括：
N-((N’-乙酸基-2-(N”-羟胺-N”-(3-乙炔-苯基))丙酰胺基)-乙酰胺基)-4-氨基-4-甲酸基-丁酰胺；
S-(N-3-炔基苯-N-羟3-((N-羟基-N-谷胱甘肽硫甲酯)氨基)苯乙炔；
N-((N’-乙酸基-2-(N”-羟胺-N”-(3-乙炔-苯基))丙酰胺基)-乙酰胺基)-4-氨基-4-甲酸基-丁酰胺；
4-((N-羟基-N-谷胱甘肽硫甲酯)氨基)苯乙炔；
4-((N-羟基-N-谷胱甘肽硫甲酯)氨基)苯腈。
4.一种如权利要求1所述乙二醛酶I抑制剂的制备方法，其特征在于，取代的硝基苯通过取代反应引入三甲硅炔，脱三甲硅后将硝基还原得到取代的苯羟胺，经谷胱甘肽取代或与C10缩合得到式(I)所示化合物。
5.如权利要求4所述乙二醛酶I抑制剂的制备方法，其特征在于，其选自下述方法中的任一种：
方法一包括如下步骤，间溴硝基苯经过取代反应引入三甲硅炔，脱三甲硅后将硝基还原成羟胺，然后与化合物C10缩合后脱保护基Boc得到式(I)所示化合物；
Figure FSA00000648603700021
方法二包括如下步骤，间溴硝基苯经过取代反应引入三甲硅炔，脱三甲硅后将硝基还原成羟胺，向羟胺氮原子引入羰硫丙基经氧化后谷胱甘肽取代反应得到式(I)所示化合物；
Figure FSA00000648603700022
方法三包括如下步骤，对溴硝基苯经过取代反应引入三甲硅炔，脱三甲硅后将硝基还原得到对炔苯羟胺，再与C10缩合后脱保护基Boc得到式(I)所示化合物；
Figure FSA00000648603700023
方法四包括如下步骤，对溴硝基苯经过取代反应引入三甲硅炔，脱三甲硅后将硝基还原得到对炔苯羟胺，向羟胺氮原子引入羰硫丙基经氧化后谷胱甘肽取代反应得到式(I)所示化合物；
方法五包括如下步骤，对氰基硝基苯经还原反应得到对氰基苯羟胺，向羟胺氮原子引入羰硫丙基经氧化后谷胱甘肽取代反应得到式(I)所示化合物。
Figure FSA00000648603700031
6.根据权利要求1所述乙二醛酶I抑制剂在制备通过基质竞争性的抑制作用抑制肿瘤生长的药物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制肿瘤生长的药物包括抗前列腺癌、肺癌、肠癌、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、皮肤癌、白血病恶性肿瘤的药物。
8.根据权利要求1所述乙二醛酶I抑制剂在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。
9.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述药物是注射剂、冻干粉针、片剂、胶囊剂、栓剂、纳米制剂、脂质体。
10.一种药物组合物，其特征在于，含有治疗有效量的权利要求1所述乙二醛酶I抑制剂和药学上可接受的载体。
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