CN101486744B - 聚乙二醇修饰的灯盏花乙素化合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种聚乙二醇修饰的灯盏花乙素化合物及其制备方法，聚乙二醇修饰的灯盏花乙素化合物如式(IV)所示，本发明的聚乙二醇修饰的灯盏花乙素化合物可应用于制备治疗脑血栓、脑梗塞、脑中风、脑中风所致后遗症、冠心病或心绞痛药物。本发明所得到的灯盏花乙素前药较之原药灯盏花乙素的水溶性显著增加；同时，小鼠脑缺血再灌注模型药效学实验表明，与原药相比，灯盏花乙素前药的生物活性明显增强。
Description
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及一种PEG修饰的前药及其制备方法和应用。
背景技术
灯盏花乙素(Scutellarin)，即4’，5，6-三羟基黄酮-7-葡糖醛酸苷，具有清除活性氧，扩张血管、增加心脏冠脉流量、增加脑血流量、降低脑血管阻力、提高血脑屏障通透性以及对抗血小板凝集等作用，故可用于心脑血管疾病，如脑梗塞、中风后偏瘫，冠心病心绞痛等，疗效较好。而且应用于临床20余年来，没有发现其严重的副作用。其现有制剂有普通片剂、注射剂和注射用粉针。
虽然灯盏花乙素具有重大的应用价值和经济效益，但是它的广泛应用存在着明显的缺点：灯盏花乙素的水中溶解度低(0.056mg/ml)，半衰期较短(3-4分钟)，口服生物利用度差(0.4％)，同时，活性也有待进一步提高。利用化学方法修饰灯盏花乙素，克服其缺点并提高其活性是一个期待解决的问题。
前药的设计可有效地解决某些药物的水溶性和稳定性问题，增加药物的血液存留时间，改变药物体内分布，提高生物利用度和降低毒副作用。近年来，高分子前药更是引起了研究者极大的关注。聚乙二醇以其良好的水溶性、无毒、良好的生物相容性和无免疫原性等其他高分子无法比拟的优点，在前药的合成和制备中占有重要地位。当将聚乙二醇分子偶联到药物分子时，由于引入了亲水基团，可改善它们在水溶液中的溶解性；由于PEG分子很长，在其修饰的药物周围产生空间屏障，可减少药物的酶解提高半衰期；同时也可避免在肾脏的代谢中很快消除提高生物利用度。
CN101095955、CN101095956分别采用聚天冬氨酸衍生物和羧甲基壳聚糖作为原料合成了一系列灯盏花乙素前药，得到的灯盏花乙素前药的溶解度在25℃水中的溶解度分别为63～85mg/ml、23～45mg/ml，对溶解度的改善程度较小。
四川大学周庆颂等(中国药学杂志，2006，41(5)，375)用聚乙二醇(PEG)对灯盏花乙素的羧基进行了修饰，得到不同分子量的灯盏花乙素PEG酯，并进行了药代动力学研究。得到的灯盏花乙素PEG酯在25℃水中的溶解度为18.7mg/ml，溶解度改善程度较小，而且合成过程中使用的PEG的量为灯盏花乙素的100倍，分离非常困难，同时，没有进行药效研究。
中国药科大学张灿等(中国天然药物，2006，4(4)，283)报道了灯盏花乙素酚羟基用2000分子量的mPEG-SS修饰的化合物，其中灯盏花乙素羧基没有保护。作者提供的NMR谱上看不到灯盏花乙素的信号，琥珀酸的亚甲基信号也不清楚；质谱信号非常复杂，没有明确的单一产物质谱图。因此，产物是否已经合成尚有疑问。虽然作者测定了修饰后产物的溶解度(800mg/mL)，但作者没有进行进一步的药代动力学和药效学研究。
因此，对灯盏花乙素的羧基和酚羟基进行系统修饰，开发出水溶性好，药效高的药物仍然是一个没有解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供聚乙二醇修饰的灯盏花乙素前药及其制备方法，改善灯盏花乙素的水溶性，增强其生物活性。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
一种聚乙二醇修饰的灯盏花乙素化合物，如式(IV)所示，
其中，
X为O或NH；
R1为C1～10的烷基或
优选为C1～6的烷基或
R2为H或
且当R1为C1～10的烷基时R2不为H；
R3或R4分别为C1～4的烷基；
n为6～200，优选为6～150，进一步优选6～70，换一种说法，即聚乙二醇修饰起始物聚乙二醇(PEG)的分子量范围为400～10000，优选400～8200，进一步优选400～4000。
本发明的聚乙二醇修饰的灯盏花乙素化合物，进一步优选如下式(I)、式(II)或式(III)化合物，
灯盏花乙素的羧基与聚乙二醇单甲醚反应成的灯盏花乙素-聚乙二醇单甲醚-6”-酯
灯盏花乙素的羧基与甲氧基聚乙二醇胺反应成的灯盏花乙素-聚乙二醇(400)单甲醚-6”-酰胺
灯盏花乙素烷基酯的酚羟基与聚乙二醇单甲醚琥珀酸单酯反应生成的灯盏花乙素-聚乙二醇单甲醚琥珀酸单酯-4’-酯
在式I、II和III中，各基团进一步优选为：
R1为C1～4的烷基，最优选为甲基；R3或R4分别为C1～4的烷基，最优选为甲基；n为6～150，最优选为6～70。
本发明的聚乙二醇修饰的灯盏花乙素化合物，以灯盏花乙素为主要原料，先将灯盏花乙素的羧基与聚乙二醇单烷醚反应成的酯类灯盏花乙素，或者将灯盏花乙素的羧基与烷氧基聚乙二醇胺反应成酰胺类灯盏花乙素，或者将灯盏花乙素的羧基与烷基醇反应生成烷基酯类灯盏花乙素；对于灯盏花乙素的酚羟基，可以在前面已制备的化合物的基础上，或者直接在灯盏花乙素的基础上，将酚羟基与聚乙二醇单烷醚琥珀酸单酯反应生成酯类灯盏花乙素，几类典型化合物的制备方法如下：
A、将聚乙二醇单烷醚与灯盏花乙素在偶联体系和溶剂中反应，反应式为：
或者B、将烷氧基聚乙二醇胺与灯盏花乙素在偶联体系和溶剂中反应，反应式为：
或者C、将灯盏花乙素脂化后与聚乙二醇单烷醚琥珀酸单酯在偶联体系和溶剂中反应，反应式为：
其中偶联体系为HOBt和DCC、DMAP和DCC、DMAP和EDC、DMAP和DIPC、HOBt和EDC、或HOBt和DIPC，最佳偶联体系为HOBt和DCC。
溶剂为吡啶、DMF或DMSO，最佳溶剂为DMF。
灯盏花乙素或其酯与聚乙二醇类化合物反应时的温度为10～100℃，最佳温度为40-60℃；反应时间为2～48小时，最佳反应时间为5-10小时。
上述各方法得到的粗产品可以采用硅胶柱色谱分离，如使用CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶1∶0.1的洗脱剂分离提纯等。
以下以化合物I、II、III(其中R1、R3和R4均为甲基)为例进一步说明各化合物的制备方法。
(1)化合物I的制备方法
将聚乙二醇单甲醚(mPEG)与灯盏花乙素，在HOBt/DCC偶联体系和DMF溶剂中反应，制得化合物I，不同分子量mPEG与灯盏花乙素反应所得化合物以I-PEG分子量命名，如：I-PEG400代表以400分子量的mPEG修饰得到的I类化合物。
(2)化合物II的制备方法：
A、邻苯二甲酰亚胺钾盐的制备
将氢氧化钾的甲醇溶液滴加到邻苯二甲酰亚胺的乙醇溶液中，滴加完毕后反应4小时。
B、单甲氧基聚乙二醇对甲苯磺酸酯(mPEG-OTs)的制备
将mPEG加适量溶剂溶解，与对甲苯磺酰氯反应制备。
C、甲氧基聚乙二醇胺(mPEG-NH2)的制备
将上述步骤B制得的mPEG-OTs溶于适当的溶剂中，和步骤A制备的邻苯二甲酰亚胺钾盐，在氮气保护下，120℃下反应4小时。然后将反应所得聚合物与水合肼回流反应4小时，得到端基为胺基的聚乙二醇单甲醚。
D、药物分子的引入
将步骤C制得的mPEG-NH2与灯盏花乙素，在溶剂和偶联体系下，加热至40℃反应10小时，制得化合物II，不同分子量PEG与灯盏花乙素反应所得化合物以II-PEG分子量命名，如：如：II-PEG400代表以400分子量的mPEG修饰得到的II类化合物。
在本发明的实施实例中，选取1-羟基苯并三唑(HOBt)和N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)作为偶联体系，干燥的DMF作为溶剂。上述制备方法的合成路线如下所示：
(3)化合物III的制备方法：
A、聚乙二醇单甲醚琥珀酸单酯(ss-PEG)的合成
将干燥的mPEG溶于氯仿中，加入琥珀酸酐和吡啶，加热回流反应48h制得。
B、灯盏花乙素甲酯的合成
甲醇的盐酸溶液的制备：在冰盐浴下，将SOCl2滴加到干燥的甲醇中制得。
在冰盐浴下将甲醇的盐酸溶液滴加到灯盏花乙素的DMF溶液中，升温至40℃反应制得灯盏花乙素甲酯。其它的酯可用同样方法制得。
C、药物分子的引入
将步骤B制得的灯盏花乙素甲酯与步骤A制得的ss-PEG，在一定的偶联体系下反应制得化合物(III)，不同分子量PEG与灯盏花乙素反应所得化合物以III-PEG分子量命名，如：III-PEG400代表以400分子量的mPEG修饰得到的III类化合物。
在本发明的实施实例中，选取1-羟基苯并三唑(HOBt)和N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)作为偶联体系，干燥的DMF作为溶剂。上述制备方法的合成路线如下所示：
本发明的化合物能够明显改善灯盏花乙素的水溶性，增强其生物活性，可以应用于制备治疗脑血栓、脑梗塞、脑中风、脑中风所致后遗症、冠心病或心绞痛药物。
溶解度及药药实验
溶解度测试
(1)UV吸收波长的选择
化合物(I)、(II)和(III)测定波长为335nm。
(2)标准曲线的制备：
配置各化合物的一系列标准溶液，用紫外分光光度计在335nm处测定吸光度，将吸收度与对照品溶液浓度进行线性回归，得各化合物的标准曲线方程。
(3)化合物溶解度测定
配置各化合物的过饱和溶液，用紫外分光光度法测定吸收度，由标准曲线计算各化合物在水中的溶解度。
药效实验
采用颈内动脉线栓法制备大脑中动脉阻塞(Middle cerebral artery，MCAO)脑缺血再灌注模型，造成脑缺血。于脑缺血后立即给药1次，以后每2小时给药一次，共给药3次。脑缺血后48小时观察神经缺陷症状，活杀动物取脑，测定脑梗死面积，确定PEG修饰的灯盏花乙素系列物的药效学活性。
1、受试药物
阳性对照药尼莫地平，注射液，规格：10mg/50ml，为市售注射液，25℃以下保存，由于用5％葡萄糖溶液稀释后有析出，固采用原液注射。
对照药灯盏花乙素，黄色粉末，4℃保存，临用前用灭菌的5％葡萄糖溶液(含0.2％NaHCO3)配置成所需浓度。
PEG修饰物，4℃保存，临用前用灭菌的5％葡萄糖溶液配置成所需浓度。
2、试验动物
Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，体重250-300g，SPF级，由浙江省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(浙)2003-0001。IVC独立送风隔离笼具(SPF级，苏州市冯氏实验动物设备有限公司产品)饲养，温度22-25℃，湿度70±10％，每笼饲养3只，使用SPF级专用大鼠颗粒饲料，由南京安立默科技有限公司提供，SPF级消毒垫料，由南京安立默科技有限公司提供。6:00AM-18:00PM 12小时明暗周期，自由进食水。所有接触动物的操作器械和材料均经紫外消毒灭菌，实验动物操作人员经专门培训，有实验动物使用上岗合格证，试验用液体的配制在医用净化工作台中进行。动物抵达实验室后，适应性饲养一周后开始试验。动物活杀或处死均在麻醉条件下进行。
3、给药途径及方法
尾静脉注射给药，注射体积为4.0ml/kg体重(尼莫地平除外，为2.0ml/kg体重)。将大鼠固定在大鼠尾静脉注射固定器中，用酒精棉球轻擦尾尖部，使血管扩张，待皮肤表面酒精挥发干净后用一次性注射器快速注射受试药物，拔出注射器后，用消毒棉球压迫注射点防止出血，2-3分钟后，将动物取出，放回饲养笼中。
4、剂量组设置
根据前期灯盏花乙素量效关系研究结果，以灯盏花乙素60mg/kg作为药效筛选剂量，阳性对照药选用尼莫地平注射液，文献报道大鼠的有效剂量为1.2mg/kg。为确保在同等有效剂量下进行比较，不同聚合度PEG修饰的灯盏花乙素，采用与对照药灯盏花乙素给药剂量相同摩尔数给药。
5、对照组设置
模型组：给大鼠尾静脉注射等体积的5％葡萄糖溶液溶液。
假手术组：给大鼠尾静脉注射等体积的5％葡萄糖溶液溶液。除特别强调外，假手术组的所有处理与其余各组相同。
阳性对照组：莫地平注射液作为阳性对照，采用文献报道的剂量1.2mg/kg，共给药三次，单次给药剂量为0.4mg/kg。
灯盏花乙素对照组：根据前期灯盏花乙素量效关系研究结果，以灯盏花乙素60mg/kg作为药效筛选剂量，共给药三次，单次给药剂量为20mg/kg。
6、试验程序设计
按照上述剂量组设置原则，设模型组、假手术组、阳性对照尼莫地平、对照灯盏花乙素组、7个PEG修饰灯盏花乙素组，共11组，每组12只动物。在手术过程中，凡麻醉、手术等出现异常情况的动物均被剔除。制备脑缺血模型后，将动物按机率均等单盲分配至各组。于脑缺血后立即给药1次，以后每2小时给药一次，共给药3次，于脑缺血后48小时评价神经缺陷症状，而后处死动物，取脑，染色，拍照测定脑梗死面积。在整个试验过程中，每12小时进行1次一般情况观察，主要内容包括：死亡、昏迷、呼吸、大小便性状、毛色、精神状况、呕吐及呕吐物、出血、惊厥、抽搐等。
试验程序如下：
7、脑缺血模型的制备
采用颈内动脉线栓法制备大脑中动脉阻塞(Middle cerebral artery，MCAO)脑缺血再灌注模型。动物用10％水合三氯乙醛(3.5ml/kg)麻醉后，俯卧位固定于手术台上，消毒皮肤，颈部正中切开，分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，轻轻剥离迷走神经，结扎并剪断颈外动脉，循颈内动脉向前，结扎翼腭动脉。夹闭颈总动脉近心端，从颈外动脉的结扎线的远端作一切口，插入外径为0.285mm的尼龙线，进过颈总动脉分叉进入颈内动脉，然后徐徐插入至有轻微阻力为止(自分叉处约20mm)，阻断大脑中动脉的所有血供，用激光多普勒脑血流仪监测脑血流，右侧脑缺血1.5h后，轻轻拔出尼龙线，恢复血供进行再灌注，缝合头皮，消毒。假手术组仅分离血管，不插入尼龙线。整个手术使用大鼠加热板和60W的台灯维持大鼠的体温37.0±0.5℃。
8、神经缺陷症状评价
采用改良Bederson 5分制法进行神经缺陷症状评价。采用单盲法评价脑外伤后大鼠的神经缺陷症状，即由试验设计者将动物按组标记，对神经缺陷症状进行评分的试验者不知道动物的分组情况，评分结束后，评分者将各种标记的评分结果呈交设计者，由设计者揭盲，获得各试验组每只动物的评分。
神经缺陷症状评分Bederson 5分制法
0：提尾悬空时，动物的两前肢均伸向地板方向，且无其他行为缺陷
1：提尾悬空时，动物的手术对(左)侧前肢表现为腕肘屈曲、肩内旋、肘外展、紧贴胸壁
2：将动物置于光滑平板上，推手术侧肩向对侧移动时阻力降低
3：动物自由行走时，向手术对侧环行或转圈
4：肢体软瘫，肢体无自发活动
9、脑梗死面积的测定
动物用10％的水合氯醛麻醉，断头取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，用生理盐水冲洗大脑表面血迹，吸去表面残留水迹，于-80℃放置7min，取出后立即于视线交叉平面垂直向下作冠状切面，并向后每隔2mm切一片，将脑片置于用0.2mol/L pH7.4～7.8PBS新鲜配制的20g/L TTC染液中水浴(37℃90min)，正常脑组织染成深红色，缺血脑组织则呈苍白色，用生理盐水冲洗后，迅速将脑片从前向后按顺序排成一排，吸干表面残留水迹，拍照。用图像分析软件对照片进行统计，圈定右侧缺血面积(白色区域)和右侧总面积，用如下公式计算脑梗死面积的百分比。
10、统计学分析
定量资料表示为均值±标准差。脑梗死面积、神经缺陷症状评分采用单因素方差分析，Scheffe`s检验测定两组间的差异显著性。动物死亡率的组间比较采用X2检验，将差异P＜0.05定义为差异显著。
各结果分别见表1，表2和表3。
具体实施方式
实施例1：灯盏花乙素-聚乙二醇(400)单甲醚-6”-酯(化合物I-400)的合成
将灯盏花乙素9.24g，mPEG(400)12g，HOBt4.05g，DCC6.18g(摩尔比1∶1.5∶1.5∶1.5)加入到80mL的DMF中溶解，通氮气保护反应体系，加热至40℃反应6小时，TLC检测反应终点(CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶1∶0.2)，待反应完成后，加水终止反应，过滤出部分固体，减压浓缩滤液蒸除DMF和水，粘稠状物质粗产品经CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶1∶0.1的洗脱剂过硅胶柱三次分离提纯，得浅黄色粉状固体7.65g，产率45.3％。
1H NMR(DMSO-d6，300MHz)：δH 6.81(1H，S，C3-H)，7.00(1H，S，C8-H)，7.93(2H，d，J＝8.9Hz，C2’，6’-H)，6.96(2H，d，J＝8.9Hz，C3’，5’-H)，5.20(1H，d，J＝6.8，C1”-H)，4.21(1H，d，J＝8.9，C5”-H)，3.37～3.46(3H，2”，3”，5”)，3.35(3H，S，a)，3.40～3.68(b，c)。
ESI-MS：(M+Na)+m/z(％)：287.2(糖苷元)，749.4，783.4，837.4，881.4，925.4，969.4，1009.5，1057.3，分子量之间相差44的为(CH2CH2O)n结构单元。其中881.4为正态分布最高峰。
实施例2：灯盏花乙素-聚乙二醇(600)单甲醚-6”-酯(化合物I-600)的合成
将灯盏花乙素13.86g，mPEG(600)27g，HOBt6.07g，DCC9.27g(摩尔比1∶1.5∶1.5∶1.5)加入到120mL的DMF中溶解，通氮气保护反应体系，加热至45℃反应8小时，TLC检测反应终点(CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶1∶0.2)，待反应完成后，加水终止反应，过滤出部分固体，减压浓缩滤液蒸除DMF和水，将粘稠状物质粗产品经CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶1∶0.1的洗脱剂过硅胶柱三次分离提纯，得浅黄色粉状固体12.62g，产率40.3％。
1H NMR(DMSO-d6，300MHz)：δH 6.81(1H，S，C3-H)，7.00(1H，S，C8-H)，7.93(2H，d，J＝8.9Hz，C2’，6’-H)，6.96(2H，d，J＝8.9Hz，C3’，5’-H)，5.20(1H，d，J＝6.8，C1”-H)，4.21(1H，d，J＝8.9，C5”-H)，3.37～3.46(3H，2”，3”，5”)，3.35(3H，S，a)，3.40～3.68(b，c)
ESI-MS：(M+Na)+m/z(％)：287.0(糖苷元)，724.4，768.6，812.7，856.6，900.3，944.2，988.1，1031.9，1075.8，1119.8。分子量之间相差44为(CH2CH2O)n结构单元。其中1031.9为正态分布最高峰。
实施例3：灯盏花乙素-聚乙二醇(1000)单甲醚-6”-酯(化合物I-1000)的合成
将灯盏花乙素9.24g，mPEG(1000)30g，HOBt4.05g，DCC6.18g(摩尔比1∶1.5∶1.5∶1.5)加入到150mL的DMF中溶解，通氮气保护反应体系，加热至50℃反应10小时，TLC检测反应终点(CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶1∶0.2)，待反应完成后，加水终止反应，过滤出部分固体，减压浓缩滤液蒸除DMF和水，将粘稠状粗产品经CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶1∶0.1的洗脱剂过硅胶柱三次分离提纯，得浅黄色粉状固体10.54g，产率36.5％。
1H NMR(DMSO-d6，300MHz)：δH 6.82(1H，S，C3-H)，7.03(1H，S，C8-H)，7.94(2H，d，J＝8.9Hz，C2’，6’-H)，6.95(2H，d，J＝8.9Hz，C3’，5’-H)，5.27(1H，d，J＝6.8，Cl”-H)，4.21(1H，d，J＝8.9，C5”-H)，3.33～3.78(3H，2”，3”，5”)，3.23(3H，S，a)，3.36～3.68(b，c)。
ESI-MS：(M+Na)+m/z(％)：287.0(糖苷元)，1138，1182，1226，1270，1314，1358，1402，1446，1490，1534。分子量之间相差44为(CH2CH2O)n结构单元。其中1358为正态分布最高峰。
实施例4：灯盏花乙素-聚乙二醇(2000)单甲醚-6”-酯(化合物I-2000)的合成
将灯盏花乙素9.24g，mPEG(2000)60g，HOBt4.05g，DCC6.18g(摩尔比1∶1.5∶1.5∶1.5)加入180mL的DMF中溶解，通氮气保护反应体系，加热至55℃反应11小时，TLC检测反应终点(CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶1∶0.2)，待反应完成后，加水终止反应，过滤出固体，减压浓缩滤液蒸除DMF和水，粘稠状粗产品经CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶1∶0.1的洗脱剂过硅胶柱三次分离提纯，得浅黄色粉状固体16.64g，产率33.8％。
1H NMR(DMSO-d6，300MHz)：δH 6.80(1H，S，C3-H)，6.99(1H，S，C8-H)，7.93(2H，d，J＝8.6Hz，C2’，6’-H)，6.94(2H，d，J＝8.6Hz，C3’，5’-H)，5.26(1H，d，J＝6.8，C1”-H)，4.19(1H，d，J＝9.3，C5”-H)，3.33～3.72(3H，2”，3”，5”)，3.23(3H，S，a)，3.36～3.72(b，c).
ESI-MS：(M+Na)+m/z(％)：287.0(糖苷元)，2261，2305，2349，2393，2437，2481，2525，2569，2613，2657。分子量之间相差44为(CH2CH2O)n结构单元。其中2437为正态分布最高峰。
实施例5：灯盏花乙素-聚乙二醇(3000)单甲醚-6”-酯(化合物I-3000)的合成
将灯盏花乙素13.86g，mPEG(3000)135g，HOBt6.07g，DCC9.27g(摩尔比1∶1.5∶1.5∶1.5)加入120mL的DMF中溶解，通氮气保护反应体系，加热至60℃反应12小时，TLC检测反应终点(CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶1∶0.2)，待反应完成后，加水终止反应，过滤出固体，减压浓缩滤液蒸除DMF和水，将粘稠状粗产品经CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶1∶0.1的洗脱剂过硅胶柱三次分离提纯，得浅黄色粉状固体30.53g，产率29.55％。
1H NMR(DMSO-d6，300MHz)：δH 6.80(1H，S，C3-H)，6.99(1H，S，C8-H)，7.92(2H，d，J＝6.8Hz，C2’，6’-H)，6.94(2H，d，J＝8.6Hz，C3’，5’-H)，5.26(1H，d，J＝6.8，C1”-H)，4.19(1H，d，J＝8.6，C5”-H)，3.33～3.68(3H，2”，3”，5”)，3.38(3H，S，a)，3.36～3.68(b，c)。
ESI-MS：(M+Na)+m/z(％)：287.1(糖苷元)，3100，3144，3188，3232，3276，3320，3364，3408，3512。分子量之间相差44为(CH2CH2O)n结构单元。其中3276为正态分布最高峰。
实施例6：灯盏花乙素-聚乙二醇(400)单甲醚-6”-酰胺(II-400)的合成
(1)邻苯二甲酰亚胺钾盐的制备
取100g的邻苯二甲酰亚胺加入到三颈烧瓶中，再向其中加入600mL的无水乙醇，用恒压滴液漏斗滴入配置好氢氧化钾的甲醇溶液(80g/L)1200mL，在室温下滴加完毕继续反应4小时，反应完过滤出固体，并用无水乙醇洗涤固体三次，再真空干燥得到白色粉状产品122g，产率97％。
(2)甲氧基聚乙二醇对甲苯磺酸酯(mPEG-OTs)的制备
称取mPEG(400)40g，加入200mL二氯甲烷，6毫升吡啶和95g的对甲苯磺酰氯，在室温下反应24小时，待反应完全，向反应物中加入3mol/L稀盐酸调节至pH＝3～4，用二氯甲烷多次萃取洗涤，在真空下减压旋去溶剂，加无水乙醚沉淀，洗涤固体，再把所得到固体用饱和碳酸氢钠洗涤，水洗三次，最后浓缩干燥最后得粘稠状液体47.56，产率86％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δH 3.37(3H，S，a)，3.57～3.92(36H，b)，4.16(2H，t，J＝9.6，c)，7.79(2H，Jed＝8.2，d)，7.34(2H，Jde＝7.9，e)，2.49(3H，Me)。
(3)甲氧基聚乙二醇胺(mPEG-NH2)的制备
称取mPEG400-OTs 55g溶于100mL的DMF中，加入邻苯二甲酰亚胺钾盐57g，在氮气保护下，120℃下反应8小时。减压除去溶剂，将残留物溶于200mL的无水乙醇中，再加入10mL的水合肼回流反应12小时，旋转蒸发除去溶剂，将残留物溶于50mL的二氯甲烷，过滤除去不溶物，再将滤液旋转蒸发除去溶剂，用无水乙醚沉淀，得白色固体，纯化处理，得到产品31.2g，产率78％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δH 3.37(3H，S，a)，3.50～3.94(38H，b，c)，2.94(2H，S，d)。
13C-NMR(CDCl3，300MHz)：δC 58.33(a)，69.63～72.33(b)，41.05(c)。
用类似的方法可制备甲氧基聚乙二醇胺mPEG(400-10000)-NH2
(4)化合物II-400的合成
将灯盏花乙素9.24g，mPEG400-NH212g，HOBt4.05g，DCC6.18g(摩尔比1∶1.5∶1.5∶1.5)加入DMF60mL中溶解，在氮气氛围下加热至40℃反应6小时，TLC检测反应终点(CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝7∶1∶0.1)，待反应完成后，加水终止反应，过滤出过量的DCC和生成的固体脲，减压浓缩滤液蒸除DMF和水，将粘稠状粗产品经CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶1∶0.1的洗脱剂过硅胶柱三次分离提纯，得浅黄色粉状固体9.67g，产率57.3％。
1H NMR(DMSO-d6，300MHz)：δ6.81(1H，S，C3-H)，6.96(1H，S，C8-H)，7.94(2H，d，J＝8.9Hz，C2’，6’-H)，6.92(2H，d，J＝8.9Hz，C3’，5’-H)，5.06(1H，d，J＝7.5，C1”-H)，3.96(1H，d，J＝9.6，C5”-H)，3.38～3.60(3H，2”，3”，5”)，3.22(3H，S，a)，3.40～3.60(b，c).
ESI-MS：(M+Na)+m/z(％)：287.2(糖苷元)，704，748，792，836，880，924，968，1012，1056。分子量之间相差44为(CH2CH2O)n结构单元。其中880为正态分布最高峰。
实施例7：灯盏花乙素-聚乙二醇(600)单甲醚-6”-酰胺(化合物II-600)的合成
将灯盏花乙素13.86g，mPEG600-NH227g，HOBt6.07g，DCC9.27g(摩尔比1∶1.5∶1.5∶1.5)加入到70mL的DMF中溶解，在氮气氛围下加热至45℃反应7小时，TLC检测反应终点(CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝7∶1∶0.1)，待反应完成后，加水终止反应，过滤出过量的DCC和生成的固体脲，减压浓缩滤液蒸除DMF和水，将减压后粘稠状粗产品经CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶1∶0.1的洗脱剂过硅胶柱三次分离提纯，得浅黄色粉状固体15.06g，产率48.3％。
1H NMR(DMSO-d6，300MHz)：δ6.82(1H，S，C3-H)，6.97(1H，S，C8-H)，7.95(2H，d，J＝8.6Hz，C2’，6’-H)，6.93(2H，d，J＝8.6Hz，C3’，5’-H)，5.05(1H，d，J＝6.88，C1”-H)，3.96(1H，d，J＝9.29，C5”-H)，3.33～3.72(3H，2”，3”，5”)，3.25(3H，S，a)，3.40～3.72(b，c).
ESI-MS：(M+Na)+m/z(％)：287.1(糖苷元)，1005.7，1049.7，1093.5，1137.5，1181.5分子量之间相差44的(CH2CH2O)n结构单元。其中1093.5为正态分布最高峰。
实施例8：灯盏花乙素-聚乙二醇(1000)单甲醚-6”-酰胺(化合物II-1000)的合成
将灯盏花乙素13.86g，mPEG1000-NH245g，HOBt6.07g，DCC9.27g(摩尔比1∶1.5∶1.5∶1.5)加入到70mL的DMF中溶解，在氮气氛围下加热至55℃反应8小时，TLC检测反应终点(CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝7∶1∶0.1)，待反应完成后，加水终止反应，过滤出过量的DCC和生成的固体脲，减压浓缩滤液蒸除DMF和水，将减压后粘稠状粗产品经CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶1∶0.1的洗脱剂过硅胶柱三次分离提纯，得浅黄色粉状固体19.50g，产率45％。
1H NMR(DMSO-d6，300MHz)：δ6.83(1H，S，C3-H)，6.96(1H，S，C8-H)，7.94(2H，d，J＝8.6Hz，C2’，6’-H)，6.93(2H，d，J＝8.6Hz，C3’，5’-H)，5.03(1H，d，J＝6.88，C1”-H)，3.96(1H，d，J＝9.29，C5”-H)，3.33～3.72(3H，2”，3”，5”)，3.25(3H，S，a)，3.40～3.72(b，c).
ESI-MS：(M+Na)+m/z(％)：287.1(糖苷元)，1252，1296，1340，1384，1428，1472分子量之间相差44的(CH2CH2O)n结构单元。其中1384为正态分布最高峰。
实施例9：灯盏花乙素-聚乙二醇(1300)单甲醚-6”-酰胺(化合物II-1300)的合成
将灯盏花乙素13.86g，mPEG1000-NH245g，HOBt6.07g，DCC9.27g(摩尔比1∶1.5∶1.5∶1.5)加入到70mL的DMF中溶解，在氮气氛围下加热至55℃反应8小时，TLC检测反应终点(CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝7∶1∶0.1)，待反应完成后，加水终止反应，过滤出过量的DCC和生成的固体脲，减压浓缩滤液蒸除DMF和水，将粘稠状粗产品经CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶1∶0.1的洗脱剂过硅胶柱三次分离提纯，得浅黄色粉状固体22.50g，产率43％。
1H NMR(DMSO-d6，300MHz)：δ6.81(1H，S，C3-H)，6.94(1H，S，C8-H)，7.93(2H，d，J＝8.6Hz，C2’，6’-H)，6.93(2H，d，J＝8.6Hz，C3’，5’-H)，5.02(1H，d，J＝6.88，C1”-H)，3.96(1H，d，J＝9.29，C5”-H)，3.33～3.72(3H，2”，3”，5”)，3.25(3H，S，a)，3.40～3.72(b，c).
ESI-MS：(M+Na)+m/z(％)：287.1(糖苷元)，1472，1516，1560，1604，1648，1692分子量之间相差44的(CH2CH2O)n结构单元。其中1604为正态分布最高峰。
实施例10：灯盏花乙素-聚乙二醇(2000)单甲醚-6”-酰胺(化合物II-2000)的合成
将灯盏花乙素9.24g，mPEG2000-NH260g，HOBt4.05g，DCC6.18g(摩尔比1∶1.5∶1.5∶1.5)加入到90mL的DMF中溶解，在氮气氛围下加热至60℃反应10小时，TLC检测反应终点(CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝7∶1∶0.1)，待反应完成后，加水终止反应，过滤出过量的DCC和生成的固体脲，减压浓缩滤液蒸除DMF和水，将粘稠状粗产品经CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶1∶0.1的洗脱剂过硅胶柱三次分离提纯，得浅黄色粉状固体19.55g，产率40％。
1H NMR(DMSO-d6，300MHz)：δ6.83(1H，S，C3-H)，6.94(1H，S，C8-H)，7.93(2H，d，J＝8.6Hz，C2’，6’-H)，6.93(2H，d，J＝8.6Hz，C3’，5’-H)，5.02(1H，d，J＝6.88，C1”-H)，3.98(1H，d，J＝9.29，C5”-H)，3.33～3.72(3H，2”，3”，5”)，3.23(3H，S，a)，3.40～3.69(b，c).
ESI-MS：(M+Na)+m/z(％)：287.1(糖苷元)，2268，2312，2356，2400，2444，2488分子量之间相差44的(CH2CH2O)n结构单元。其中2400为正态分布最高峰。
实施例11：灯盏花乙素-聚乙二醇(3000)单甲醚-6”-酰胺(化合物II-3000)的合成
将灯盏花乙素18.48g，mPEG3000-NH2180g，HOBt9.10g，DCC12.36g(摩尔比1∶1.5∶1.5∶1.5)加入到90mL的DMF中溶解，在氮气氛围下加热至60℃反应10小时，TLC检测反应终点(CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝7∶1∶0.1)，待反应完成后，加水终止反应，过滤出过量的DCC和生成的固体脲，减压浓缩滤液蒸除DMF和水，将粘稠状粗产品经CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶1∶0.1的洗脱剂过硅胶柱三次分离提纯，得浅黄色粉状固体19.55g，产率40％。
1H NMR(DMSO-d6，300MHz)：δH 6.82(1H，S，C3-H)，6.97(1H，S，C8-H)，7.94(2H，d，J＝8.9Hz，C2’，6’-H)，6.92(2H，d，J＝8.9Hz，C3’，5’-H)，5.08(1H，d，J＝7.5，C1”-H)，3.95(1H，d，J＝9.6，C5”-H)，3.38～3.60(3H，2”，3”，5”)，3.22(3H，S，a)，3.40～3.60(b，c)。
ESI-MS：(M+Na)+m/z(％)：287.1(糖苷元)，2268，2312，2356，3420，3464，3510分子量之间相差44的(CH2CH2O)n结构单元。其中3420为正态分布最高峰。
实施例12：灯盏花乙素-聚乙二醇(400)单甲醚琥珀酸单酯-4’-酯(III-400)的合成
(1)聚乙二醇单甲醚400琥珀酸单酯(mPEG400-A)的合成
称取干燥的mPEG400(40g，100mmol)溶于250mL氯仿中，加入丁二酸酐(12.5g，125mmol)和10mL吡啶，加热至回流反应48h，减压回收溶剂，向残余物中加入50mL饱和NaHCO3溶液溶解，过滤，用30mL乙酸乙酯萃取2次，水相冷却至0℃，后用2mol/L的盐酸酸化至pH2左右。用氯仿60mL分3次萃取，合并氯仿层，无水Na2SO4干燥过夜。浓缩溶剂，加入200ml无水乙醚沉淀产物，干燥后得白色沉淀45g，产率90％。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：δH 3.30(3H，S，a)，3.60～3.92(40H，b)，4.26(2H，J＝9.30，t，c)，2.63(4H，S，d)。
用类似的方法可制备单甲氧基聚乙二醇琥珀酸单酯mPEG(400-10000)-A
(2)灯盏花乙素的纯化
1取50克90％灯盏花乙素，加水500克。
2加饱和的碳酸氢钠溶液加至全部溶解，此时pH＝7～8左右。
3过滤，滤液在25℃且在机械搅拌下加入丙酮使之沉淀完全，然后在室温下让其静置18小时。
4过滤，固体用丙酮洗涤三次，再将固体放入2L 35％丙酮中，直至加入丙酮的量使固体全部溶解为宜。
5加入25％的稀盐酸调节pH＝1～2左右，继续搅拌2小时，再静置12小时使之沉淀完全。
6过滤，所得固体用丙酮洗涤三次，再用水洗涤至pH＝7左右，最后用乙醚洗涤三次。
7在60℃下真空干燥，经NMR和HPLC检测，纯度在98％以上。
1H NMR(DMSO-d6，300MHz)：δ6.74(1H，S，C3-H)，6.96(1H，S，C8-H)，7.89(2H，d，J＝8.9Hz，C2’，6’-H)，6.92(2H，d，J＝8.9Hz，C3’，5’-H)，5.20(1H，d，J＝6.8，C1”-H)，4.04(1H，d，J＝8.9，C5”-H)，3.37～3.46(3H，2”，3”，5”)
13C-NMR(DMSO-d6，300MHz)：δC 164.19(C2)，102.60(C3)，182.42(C4)，149.07(C5)，130.52(C6)，151.03(C7)，93.65(C8)，105.93(C9)，146.92(C10)
ESI-MS：(M-H)m/z(％)：287.2(糖苷元)，461.4
(3)灯盏花乙素甲酯的合成
甲醇的盐酸溶液的制备：在100mL的圆底烧瓶中加入干燥的甲醇50mL，在冰盐浴冷却到-10℃，将13mL的SOCl2缓慢滴加到干燥的甲醇中。并维持在温度0℃以下，继续搅拌10分钟，留待后用。
将灯盏花乙素4.62g溶于35mL干燥的DMF中，在冰盐浴下将已经制备好的甲醇的盐酸溶液缓慢滴加到上述溶液中，滴加过程中维持在0℃以下，继续搅拌15分钟，撤去冰浴，升温至40℃反应，高效液相色谱检测反应进度。反应程度达到99％，停止反应，用饱和NaHCO3溶液将反应液调至中性，向反应液中加水析出沉淀，水洗，真空干燥。产率97％。
1HNMR(DMSO-d6，300MHz)：δH 6.81(1H，S，C3-H)，6.99(1H，S，C8-H)，7.89(2H，d，J＝7.9Hz，C2’，6’-H)，6.92(2H，d，J＝7.9Hz，C3’，5’-H)，5.26(1H，d，J＝6.2，C1”-H)，4.20(1H，d，J＝8.9，C5”-H)，3.36～3.38(3H，2”，3”，5”)，3.67(3H，S，C6”-H).
(4)化合物III-400的合成
将灯盏花乙素甲酯9.56g，mPEG 400-A12g，HOBt4.05g，DCC6.18g(摩尔比1∶1.2∶1.5∶1.5)加入到100mL的DMF中溶解，在氮气氛围下加热至60℃反应6.5小时，TLC检测反应终点(CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝7∶1∶0.1)，待反应完成后，加水终止反应，过滤出过量的DCC和生成的固体脲，减压浓缩滤液蒸除DMF和水，将粘稠状粗产品经CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶1∶0.1的洗脱剂过硅胶柱三次分离提纯，得浅黄色粉状固体9.02g，产率47％。
1H NMR(DMSO-d6，300MHz)：δH 6.99(1H，S，C3-H)，7.36(1H，S，C8-H)，8.13(2H，d，J＝8.6Hz，C2’，6’-H)，6.92(2H，d，J＝8.6Hz，C3’，5’-H)，5.24(1H，d，J＝6.2，C1”-H)，4.16(1H，d，J＝5.8，C5”-H)，3.37～3.46(2”，3”，5”)。3.24(3H，S，a)，3.28～3.70(b，c)，2.70～2.90(4H，d)。
ESI-MS：(M+Na)+m/z(％)：287.0(糖苷元)，878.1，921.9，965.9，1009.7，1053.4，1097.4，1121.4，1165.4。分子量之间相差44为(CH2CH2O)n结构单元。其中1053.4为正态分布最高峰。
实施例13：灯盏花乙素-聚乙二醇(600)单甲醚琥珀酸单酯-4’-酯(化合物III-600)的合成
将灯盏花乙素甲酯19.12g，mPEG600-A28.8g，HOBT8.10g，DCC12.36g(摩尔比1∶1.2∶1.5∶1.5)加入到200mL的DMF中溶解，在氮气氛围下加热至60℃反应6.5小时，TLC检测反应终点(CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝7∶1∶0.1)，待反应完成后，加水终止反应，过滤出过量的DCC和生成的固体脲，减压浓缩滤液蒸除DMF和水，将粘稠状粗产品经CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶1∶0.1的洗脱剂过硅胶柱三次分离提纯，得浅黄色粉状固体21.7g，产率43.5％。
1H NMR(DMSO-d6，300MHz)：δH 7.02(1H，S，C3-H)，7.35(1H，S，C8-H)，8.12(2H，d，J＝8.6Hz，C2’，6’-H)，7.00(2H，d，J＝8.6Hz，C3’，5’-H)，5.26(1H，d，J＝6.9，C1”-H)，4.16(1H，d，J＝5.8，C5”-H)，3.34～3.66(2”，3”，5”)。3.24(3H，S，a)，3.34～3.66(b，c)，2.69～2.90(4H，d)。
ESI-MS：(M+Na)+m/z(％)：286.9(糖苷元)，1207.4，1251.4，1295.4，1339.4，1383.4。分子量之间相差44的(CH2CH2O)n结构单元。其中1295.4为正态分布最高峰
实施例14：灯盏花乙素-聚乙二醇(1000)单甲醚琥珀酸单酯-4’-酯(化合物III-1000)的合成
将灯盏花乙素甲酯9.56g，mPEG1000-A24g，HOBt4.05g，DCC6.18g(摩尔比1∶1.2∶1.5∶1.5)加入到100mL的DMF中溶解，在氮气氛围下加热至55℃反应8小时，TLC检测反应终点(CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝7∶1∶0.1)，待反应完成后，加水终止反应，过滤出过量的DCC和生成的固体脲，减压浓缩滤液蒸除DMF和水，将粘稠状粗产品经CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶1∶0.1的洗脱剂过硅胶柱三次分离提纯，得浅黄色粉状固体9.02g，产率47％。
1H NMR(DMSO-d6，300MHz)：δH 6.98(1H，S，C3-H)，7.34(1H，S，C8-H)，8.13(2H，d，J＝8.6Hz，C2’，6’-H)，6.91(2H，d，J＝8.6Hz，C3’，5’-H)，5.23(1H，d，J＝6.2，C1”-H)，4.16(1H，d，J＝5.8，C5”-H)，3.37～3.46(2”，3”，5”)。3.24(3H，S，a)，3.26～3.70(b，c)，2.70～2.92(4H，d)。
ESI-MS：(M+Na)+m/z(％)：287.0(糖苷元)，1339，1383，1427，1471，1515，1559，1603，1647。分子量之间相差44的(CH2CH2O)n结构单元。其中1515为正态分布最高峰。
实施例15：灯盏花乙素-聚乙二醇(1200)单甲醚琥珀酸单酯-4’-酯(化合物III-1200)的合成
将灯盏花乙素甲酯9.56g，mPEG1200-A28.8g，HOBt4.05g，DCC6.18g以摩尔比1∶1.2∶1.5∶1.5的比例投料，加入100mL的DMF溶解，在氮气氛围下加热至60℃反应6.5小时，TLC检测反应终点(CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝7∶1∶0.1)，待反应完成后，加水终止反应，过滤出过量的DCC和生成的固体脲，减压浓缩滤液蒸除DMF和水，将粘稠状粗产品经CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶1∶0.1的洗脱剂过硅胶柱三次分离提纯，得浅黄色粉状固体13.25g，产率38％。
1H NMR(DMSO-d6，300MHz)：δH 6.94(1H，S，C3-H)，7.35(1H，S，C8-H)，8.12(2H，d，J＝8.6Hz，C2’，6’-H)，6.91(2H，d，J＝8.6Hz，C3’，5’-H)，5.24(1H，d，J＝6.2，C1”-H)，4.16(1H，d，J＝5.8，C5”-H)，3.37～3.46(2”，3”，5”)。3.23(3H，S，a)，3.28～3.70(b，c)，2.70～2.92(4H，d)。
ESI-MS：(M+Na)+m/z(％)：287.0(糖苷元)1528，1572，1616，1660，1704，1748，1792。分子量之间相差44的(CH2CH2O)n结构单元。其中1660为正态分布最高峰。
实施例16：灯盏花乙素-聚乙二醇(2000)单甲醚琥珀酸单酯-4’-酯(化合物III-2000)的合成将灯盏花乙素甲酯19.12g，mPEG2000-A96g，HOBt8.10g，DCC12.36g(摩尔比1∶1.2∶1.5∶1.5)加入到160mL的DMF中溶解，在氮气氛围下加热至60℃反应6.5小时，TLC检测反应终点(CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝7∶1∶0.1)，待反应完成后，加水终止反应，过滤出过量的DCC和生成的固体脲，减压浓缩滤液蒸除DMF和水，将粘稠状粗产品经CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶1∶0.1的洗脱剂过硅胶柱三次分离提纯，得浅黄色粉状固体36.65g，产率35.8％。
1HNMR(DMSO-d6，300MHz)：δ7.02(1H，S，C3-H)，7.36(1H，S，C8-H)，8.14(2H，d，J＝8.6Hz，C2’，6’-H)，7.04(2H，d，J＝8.6Hz，C3’，5’-H)，5.24(1H，d，J＝6.9，C1”-H)，4.16(1H，d，J＝5.8，C5”-H)，3.34～3.70(2”，3”，5”)。3.24(3H，S，a)，3.34～3.68(b，c)，2.69～2.90(4H，d)。
ESI-MS：(M+Na)+m/z(％)：286.9(糖苷元)，2312，2356，2400，2444，2488。分子量之间相差44的(CH2CH2O)n结构单元。其中2400为正态分布最高峰
实施例17：灯盏花乙素-聚乙二醇(3000)单甲醚琥珀酸单酯-4’-酯(化合物III-3000)的合成
将灯盏花乙素甲酯9.56g，mPEG3000-A90g，HOBt4.05g，DCC6.18g(摩尔比1∶1.5∶1.5∶1.5)加入到200mLDMF中溶解，在氮气氛围下加热至60℃反应10小时，TLC检测反应终点(CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝7∶1∶0.1)，待反应完成后，加水终止反应，过滤出过量的DCC和生成的固体脲，减压浓缩滤液蒸除DMF和水，将粘稠状粗产品经CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶1∶0.1的洗脱剂过硅胶柱三次分离提纯，得浅黄色粉状固体20.45g，产率28.5％。
1HNMR(DMSO-d6，300MHz)：δH7.02(1H，S，C3-H)，7.36(1H，S，C8-H)，8.11(2H，d，J＝8.6Hz，C2’，6’-H)，7.03(2H，d，J＝8.6Hz，C3’，5’-H)，5.23(1H，d，J＝6.9，C1”-H)，4.17(1H，d，J＝5.8，C5”-H)，3.34～3.66(2”，3”，5”)。3.23(3H，S，a)，3.34～3.68(b，c)，2.72～2.86(4H，d)。
ESI-MS：(M+Na)+m/z(％)：286.9(糖苷元)，3316，3360，3404，3448，3492，3536，3580。分子量之间相差44的(CH2CH2O)n结构单元。其中3448为正态分布最高峰
发明的效果：
1，PEG修饰的灯盏花乙素水溶性
如表1所示，本发明所合成的化合物非常显著地提高了灯盏花乙素在水中的溶解度。其中，以第II类和第III类化合物的提高更为显著。随PEG分子量的增加，溶解度上升，II-3000的质量溶解度达到了830.3mg/ml比灯盏花乙素提高了14210.4倍，II-1000的质量溶解度达到了554.6mg/ml比灯盏花乙素摩尔溶解度提高了3305.8倍。至此，灯盏花乙素的水溶性问题彻底解决。
表1，PEG修饰灯盏花乙素化合物在水中溶解度实验总结
2，PEG修饰的灯盏花乙素药效
如表2所示，PEG修饰的灯盏花乙素与灯盏花乙素相比对神经缺陷症状有明显的改善，如II-2000由灯盏花乙素的2.7降到了1.3。同时，如表3所示，II-2000的脑梗死面积由灯盏花乙素的27.2％降到了12.2％，活性有显著的提高。
表2，PEG修饰物对神经缺陷症状的影响
表3，PEG修饰物对脑梗死面积的影响
以上数据表明，本发明解决了灯盏花乙素水溶性问题的同时，对药效也有显著的提高。综合考察，II-2000在水溶性，脑梗死面积和神经缺陷指数三方面都表现优秀，是一个在临床上有应用前景候选药物。
Claims (10)
1.一种聚乙二醇修饰的灯盏花乙素化合物，如式(IV)所示，
其中，
X为O或NH；
R1为C1-10的烷基或
R2为H或
且当R1为C1-10的烷基时R2不为H；
R3或R4分别为C1-4的烷基；
n为6～200；
当R1为
R2不为
当X为NH，R1不为C1-10的烷基。
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰的灯盏花乙素化合物，其中R1为C1-6的烷基或
3.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰的灯盏花乙素化合物，其中
n为6～150。
4.根据权利要求2或3所述的聚乙二醇修饰的灯盏花乙素化合物，如式(I)、式(II)或式(III)所示，
其中，
R1为C1-4的烷基，
R3或R4分别为C1-4的烷基，
n为6～150。
5.根据权利要求4述的聚乙二醇修饰的灯盏花乙素化合物，其中
R1、R3或R4分别为甲基，
n为6～70。
6.一种权利要求1所述的聚乙二醇修饰的灯盏花乙素化合物的制备方法，包括：
A、将聚乙二醇单烷醚与灯盏花乙素在偶联体系和溶剂中反应，反应式为：
或者B、将烷氧基聚乙二醇胺与灯盏花乙素在偶联体系和溶剂中反应，反应式为：
或者C、将灯盏花乙素酯化后与聚乙二醇单烷醚琥珀酸单酯在偶联体系和溶剂中反应，反应式为：
其中，R1为C1-10的烷基；R3为C1-4的烷基；R4为C1-4的烷基，n为6～200。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的偶联体系为HOBt和DCC、DMAP和DCC、DMAP和EDC、DMAP和DIPC、HOBt和EDC、或HOBt和DIPC。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的溶剂为吡啶、DMF或DMSO。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于灯盏花乙素或其酯与聚乙二醇类化合物反应时的温度为10～100℃，反应时间为2～48小时。
10.权利要求1～3中任一所述的聚乙二醇修饰的灯盏花乙素化合物在制备治疗脑血栓、脑梗塞、脑中风、脑中风所致后遗症、冠心病或心绞痛药物方面的应用。
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