CN105131066A - 一种嘧啶衍生物及其制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

一种嘧啶衍生物及其制备方法与用途。本发明公开了式Ⅰ所示的化合物或其晶型、盐：其中，R₁选自氢、卤素、C₁～C₆烷基、C₁～C₆烷氧基、氨基或取代的氨基，R₂～R₄分别或同时选自氢、碱金属、C₁～C₆烷基。本发明化合物1的SNNP作为药物载体，显著提高了单体类核苷类药物和/或寡聚核苷酸类药物的治疗效果，具有良好的缓释作用，增强药物的治疗效果，降低药物用量和给药频次，提高药物的生物利用度，减轻药物的毒副作用，具有良好的临床应用价值；同时，本发明的制备方法，具有收率高、纯度高、能耗低、步骤少、操作简便、成本低、环保、安全等优点，非常适合产业上的应用。

Description

一种嘧啶衍生物及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及一种嘧啶衍生物及其制备方法与用途。

背景技术

5-氟尿嘧啶(5-fluoro-2,4(1H,3H)pyrimidinedione，5-FU)是一种传统、经典的化疗药物，广泛应用于头颈部肿瘤、消化系统肿瘤及乳腺癌等肿瘤的化疗；然而，作为一种单体类核苷类药物，5-氟尿嘧啶存在代谢快、毒副作用大、半衰期短等缺点，往往需要加大药物用量和/或增加给药频次，才能达到较为理想的治疗效果。

目前，已报道的5-氟尿嘧啶的载体材料主要有：脂肪族聚酯类聚合物、壳聚糖、氰基丙烯酸正丁酯、卟啉类化合物、磺胺嘧啶、葡萄糖醛酸类糖苷、半乳糖、偕二磷酸等(1、马宝花王少华王宏张娜.5-氟尿嘧啶纳米级给药系统研究进展.药学专论，2009年，第18卷，第17期.2、李楠陈曦梁蓉梅江婉雍小兰.5-氟尿嘧啶靶向衍生物的研究进展.现代生物医学进展，2011年，第11卷第13期.)

目前，未见有本发明式Ⅰ所示的化合物或其晶型、盐作为药物载体的相关报道，特别是，未见有本发明式Ⅰ所示的化合物或其晶型、盐作为5-氟尿嘧啶等单体类核苷类药物或载体的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种作为药物载体的嘧啶衍生物。

本发明提供的式Ⅰ所示的化合物或其晶型、盐：

其中，R₁选自氢、卤素、C₁～C₆烷基、C₁～C₆烷氧基、氨基或取代的氨基，R₂～R₄分别或同时选自氢、碱金属、C₁～C₆烷基。

进一步的，R₁选自氨基或C₁～C₆烷基取代的氨基，R₂～R₄分别或同时选自氢、锂、钠、钾。

进一步的，所述的化合物为：

进一步的，所述的化合物为1-(β-L-呋喃核糖)-5-氨基-嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。

本发明还提供了上述式Ⅰ所示化合物的制备方法。

本发明提供的一种式Ⅰ所示化合物的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：

a、1-(2’，3’，5’-O-乙酰基-β-L-呋喃核糖)-5-氨基-嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮与MOR₅/R₅OH溶液，于70℃～80℃反应20分钟～30分钟，得到反应液；

其中，M选自锂、钠、钾、铷、铯或钫；R₅选自甲基、乙基、丙基、丁基或戊基；

1-(2’，3’，5’-O-乙酰基-β-L-呋喃核糖)-5-氨基-嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮与MOR₅的摩尔比1：3～5；MOR₅/R₅OH溶液的浓度为0.1M～0.5M；

b、对步骤a所得反应液进行分离、纯化，得到1-(β-L-呋喃核糖)-5-氨基-嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。

进一步的，步骤b中，对步骤a所得反应液进行分离、纯化的方法为：将步骤a所得反应液冷却至室温，加入冰醋酸，过滤，得到固体，洗涤，干燥，即得1-(β-L-呋喃核糖)-5-氨基-嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。

上述的化合物或其晶型、盐作为药物载体的应用。

进一步的，所述的药物为单体类核苷类药物或寡聚核苷酸类药物。

进一步的，所述的单体类核苷类药物选自5-氟尿嘧啶、硫鸟嘌呤、奈拉滨、氯法他滨、替加氟、阿糖胞苷、地西他滨、齐多夫定、扎西他滨、阿昔洛韦、阿德福韦酯中的任意一种或两种以上；所述的寡聚核苷酸类药物选自siRNA、反义寡聚核苷酸中的任意一种或两种。

本发明还提供了一种药物组合物，所述的药物组合物是以上述的化合物或其晶型、盐为载体，加上药物、药学上常用的辅料或辅助性成分制备得到的制剂。

进一步的，所述的药物为单体类核苷类药物或寡聚核苷酸类药物。

进一步的，所述的单体类核苷类药物选自5-氟尿嘧啶、硫鸟嘌呤、奈拉滨、氯法他滨、替加氟、阿糖胞苷、地西他滨、齐多夫定、扎西他滨、阿昔洛韦、阿德福韦酯中的任意一种或两种以上；所述的寡聚核苷酸类药物选自siRNA、反义寡聚核苷酸中的任意一种或两种。

进一步的，所述的单体类核苷类药物为5-氟尿嘧啶。

本发明化合物1自组装形成粒径均一的纳米颗粒SNNP，具有良好的药物包裹能力，体内外毒性低，具有良好的生物相容性及安全性，非常适合用作药物载体；本发明化合物1的SNNP作为药物载体，显著提高了单体类核苷类药物和/或寡聚核苷酸类药物的治疗效果，具有良好的缓释作用，增强药物的治疗效果，降低药物用量和给药频次，提高药物的生物利用度，减轻药物的毒副作用，具有良好的临床应用价值；同时，本发明的制备方法，具有收率高、纯度高、能耗低、步骤少、操作简便、成本低、环保、安全等优点，非常适合产业上的应用。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为本发明化合物1自组装单核苷纳米颗粒的SEM和DLS图。

图2为本发明化合物1自组装单核苷纳米颗粒包裹5-氟尿嘧啶后的SEM和DLS图。

图3为MTT法检测SNNP对正常细胞NOK-SI、HOK和口腔鳞癌细胞HSC-3、SCC-9的毒性作用；SNNP浓度：0μg·ml^-1、100μg·ml^-1、200μg·ml^-1、300μg·ml^-1、400μg·ml^-1、500μg·ml^-1，实验均重复三次，结果表示为均数±标准差。

图4为对不同器官通过腹腔注射不同浓度的化合物1自组装单核苷纳米颗粒后的苏木精和伊红染色测定图(H&E)。

图5为5-氟尿嘧啶瘤内给药与化合物1自组装单核苷纳米颗粒装载5-氟尿嘧啶瘤内给药对肿瘤的治疗效果对比：A、B、C为不同浓度用药后的肿瘤生长曲线；D为小鼠体重变化曲线；E为肿瘤平均重量；F为肿瘤直观图。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

1-(2’，3’，5’-O-乙酰基-β-L-呋喃核糖)-5-氨基-嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮通过市购获得，或者采用以下方法制备得到：

将AT碱基(5-氨基-嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，参考文献：M.Pan,W.Hang,X.Zhao,H.Zhao,P.Deng,Z.Xing,Y.QingandY.He,Org.Biomol.Chem.,2011,9,5692.)加入60mlHMDS中，在140℃下搅拌大约2-3分钟，随后加入1.2mlTMSCl，回流状态下反应48小时，直到反应变为澄清透明状态。然后，减压下旋蒸得到硅烷化碱基中间产物。在常温下加入糖基供体(1，2，3，5-O-四乙酰基-β-L-呋喃核糖)，在冰浴条件下加入1ml催化剂三氟甲磺酸三甲基硅酯，使用薄层层析监测，反应完全后加入饱和NaHCO₃水溶液终止反应；加入二氯甲烷萃取有机相(80ml×3)，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，旋干后用柱层析进行分离，得到白色的粉末状化合物。将化合物再次溶于六甲基二硅烷胺中，加入催化剂二甲苯，然后在140℃下回流反应直至变澄清，旋蒸除去多余的HMDS和二甲苯。将硅烷化后的产物溶于无水乙腈，在室温下加入催化剂TMSOTf，然后回流反应两小时左右。待反应完后，用饱和NaHCO₃终止反应，然后用二氯甲烷萃取，合并有机相后用无水Na₂SO₄干燥，旋干后用硅胶柱分离即可得到1-(2’，3’，5’-O-乙酰基-β-L-呋喃核糖)-5-氨基-嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(产率为80％，纯度为99％)。

¹HNMR(DMSO-d₆,400MHz):δ2.01-2.10(9H,t,3OAc),4.30-4.42(3H,m,4′-H,5′-H2),5.54-5.56(1H，3′-H),5.65-5.67(1H,2′-H),6.25-6.29(1H,1′-H),8.60(s,1H,CH),9.05-9.08(1H,d,NH),9.13-9.16(1H,NH),10.85(s,1H,NH)。

¹³CNMR(DMSO-d₆,400MHz):δ20.71,20.80,20.91，63.28,66.40,68.06,69.89,73.01,78.56，157.86,162.19,162.60，162.91，163.26，169.53，169.75,170.34。

HRMS(ESI)calculatedfor(M-H)/z:436.1103,found:436.1102。

实施例1、1-(β-L-呋喃核糖)-5-氨基-嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(化合物1)

其中，Ac表示乙酰基。

将1-(2’，3’，5’-O-乙酰基-β-L-呋喃核糖)-5-氨基-嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮120mg溶于10mL0.1MNaOMe/MeOH，在75℃条件下反应20分钟，待冷却至室温(25℃)后，用稀释后的冰醋酸中和，有沉淀物产生，过滤，沉淀物用甲醇洗三次，水洗一次，真空干燥后得到白色粉末1-(β-L-呋喃核糖)-5-氨基-嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(70mg，产率为82％，纯度为99％)。

1-(β-L-呋喃核糖)-5-氨基-嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮：

¹HNMR(DMSO-d₆,600MHz):δ3.55-3.63(1H,m,5′-H),3.76-3.79(1H,m,5’-H_β),3.92-3.96(1H,m,4′-H),4.07-4.09(1H,3’-H),4.13-4.15(1H,2′-H),5.09-5.11(1H,5′-OH),5.26-5.30(t,1H,3′-OH),5.55-5.58(1H,d,2′-OH),6.14-6.16(1H,1′-H),8.85(1H,s,CH),8.91(1H,s,NH),8.98(1H,s,NH),10.82(s,1H,NH)。

¹³CNMR(DMSO-d₆,600MHz):δ59.96,68.98,74.96,85.01,87.48,90.29,151.85,157.08,158.18,161.99,165.46。

UV(H₂O):λ_max(ε):227(10398)；289(1817)。

HRMS(ESI)calculatedfor(M+Na⁺)/z:334.0764，found:334.0766。

实施例2、化合物1通过自组装形成纳米颗粒结构

将一定量的化合物1溶于水中，加热至沸腾，冷却，在室温下静置24h；扫描电镜(SEM)、动态激光光散射(DLS)结果表明，化合物1在水溶液中能够通过自组装形成粒径均一(～150nm)的颗粒状纳米结构，如图1所示。

实施例3、化合物1自组装形成的纳米颗粒用于包裹药物5-氟尿嘧啶

将一定量的化合物1溶于PBS中，加热至100℃左右，冷却至室温，静置24h，加入一定量5-氟尿嘧啶，然后再静置24h；药物包裹后的扫描电镜、动态激光光散射结果表明，本发明化合物1能够有效的包裹5-氟尿嘧啶，形成粒径均一的颗粒状结构，如图2所示。

为了说明本发明的有益效果，本发明提供以下试验例。

试验例1、MTT细胞毒性实验和动物试验

1、MTT细胞毒性实验：

通过检测HSC-3、SCC-9、HOK及NOK-SI四株细胞的细胞生存率评价SNNP(Self-assembledNucleosideNanoparticle，化合物1自组装单核苷纳米颗粒)材料在体外对肿瘤细胞及正常细胞的细胞毒性。分别收集生长良好的细胞，配制成细胞悬液，同时调整其细胞密度接种于96孔板中，等待4～6h细胞贴壁后加入100μl不同浓度的SNNP材料(100、200、300、400、500μg·ml^-1)，37℃孵育24h、48h、72h后加入20μlMTT，孵育4h加入DMSO(二甲基亚砜)150μl，检测570nm波长的吸光度值。

在体外检测SNNP对细胞的毒性，结果如图3所示；SNNP对正常细胞HOK、NOK-SI和鳞癌细胞HSC-3、SCC-9的毒性很小，具有良好的生物安全性，特别是，SNNP浓度为100μg·ml^-1孵育72h后细胞生存率基本不受SNNP药载系统的影响。

2、动物试验：

40只雌性BALB/c小鼠被随机分为5组，随后腹腔注射100μl生理盐水、不同浓度SNNP(0.5mg·kg^-1、2.5mg·kg^-1、5mg·kg^-1)，每周1次，每隔3～4天测量动物体重，2周后终止实验，小鼠眼球取血，进行血常规及生化指标的分析，并取其心、肝、脾、肺、肾等重要器官，运用HE染色进行组织学分析。

图4表示动物实验取出的小鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器运用HE染色进行的组织学分析，用以评价该SNNP药载系统在体内对组织的损伤作用；横标分别代表空白对照、生理盐水对照，以及SNNP不同浓度实验组(0.5mg·kg^-1、2.5mg·kg^-1、5mg·kg^-1)。

结果表明，本发明不同浓度(0.5mg·kg^-1、2.5mg·kg^-1、5mg·kg^-1)的SNNP药物载体系统对小鼠的心、肝、脾、肺、肾脏器无明显的损伤作用，其染色结果与空白对照组及生理盐水对照组是一致的；本发明化合物1的SNNP在体外和体内生物安全浓度分别为100μg·ml^-1和5mg·kg^-1，表现出低毒性，具有良好的生物安全性，非常适合用作药物载体。

试验例2、

收集对数生长期的口腔鳞状细胞癌HSC-3细胞，无血清培养基DMEM洗涤3次后重悬，按2×10⁶cell/只的细胞量，皮下接种于裸鼠的右侧胁肋部，构建口腔鳞癌细胞HSC-3移植瘤模型。接种5天后可以扪及肿瘤结节，将其裸鼠随机分组(n>＝6只/组)，包括生理盐水组、SNNP组(0.5mg·kg^-1)、5-FU组及5-FU-SNNP组，并且通过瘤内注射及腹腔注射给予相应的治疗；每隔3～4天测量肿瘤体积，如图5所示，A：75mg·kg^-15-FU与SNNP包裹75mg·kg^-15-FU对小鼠瘤内用药后小鼠肿瘤随时间变化比较；B：150mg·kg^-15-FU与SNNP包裹150mg·kg^-15-FU对小鼠瘤内用药后小鼠肿瘤随时间变化比较；C：300mg·kg^-15-FU与SNNP包裹300mg·kg^-15-FU对小鼠瘤内用药后小鼠肿瘤随时间变化比较；D：不同浓度5-FU与SNNP包裹不同浓度5-FU对小鼠瘤内给药后小鼠体重随时间变化比较，观察动物的毛发、体重及行为等有无异常。肿瘤的体积计算公式为：肿瘤体积(V)＝π/6×最大径×(最小径)²。2～3周后终止实验，取肿瘤组织，称重(如图5中E所示)并进行相关的组织学分析；F表示取出肿瘤组织的直观图。

以生理盐水组及SNNP(0.5mg·kg^-1)组为对照，治疗口腔鳞癌移植瘤的5-FU浓度为75mg·kg^-1、150mg·kg^-1、300mg·kg^-1，在瘤内注射的给药方式下，比较了SNNP包裹不同浓度的5-FU和游离的5-FU对HSC-3口腔鳞癌移植瘤皮下模型的治疗效果。

如图5中A-C、F所示，在体内，与生理盐水组类似，SNNP组对皮下HSC-3口腔鳞癌没有治疗效果，表明SNNP本身并没有抗肿瘤的效果；本发明化合物1的SNNP作为5-氟尿嘧啶的载体，显著提高了5-氟尿嘧啶的治疗效果：与游离的5-FU相比，SNNP包裹的5-FU能够更有效的抑制皮下HSC-3口腔鳞癌的生长，肿瘤的体积明显减小，且随着浓度的增大，其肿瘤生长抑制更明显(P<0.05)，肿瘤的重量也明显减小，如图5中E所示。

所有组的裸鼠体重均未见明显的变化(如图5中D所示)，也进一步表明本发明化合物1的SNNP具有良好的生物安全性，非常适合用作药物载体。

在口腔鳞癌细胞HSC-3裸鼠移植瘤模型中，游离5-FU的t_1/2z为3.64±2.2h(5-FU浓度150mg·kg^-1)，SNNP包裹的5-FU的t_1/2z为6.43±5.94h(5-FU浓度150mg·kg^-1、SNNP浓度0.5mg·kg^-1)，表明本发明化合物1的SNNP作为5-氟尿嘧啶的载体，可以在更长的时间内保持较高的药物浓度，具有良好的缓释作用，增强5-氟尿嘧啶对于肿瘤的治疗效果，降低药物用量和给药频次，减轻5-氟尿嘧啶的毒副作用。

药物消除半衰期(halflife，t_1/2z)是血浆药物浓度下降一半所需要的时间，其长短可反映体内药物消除速度。

综上所述，本发明化合物1自组装形成粒径均一的纳米颗粒SNNP，具有良好的药物包裹能力，体内外毒性低，具有良好的生物相容性及安全性，非常适合用作药物载体；本发明化合物1的SNNP作为药物载体，显著提高了单体类核苷类药物和/或寡聚核苷酸类药物的治疗效果，具有良好的缓释作用，增强药物的治疗效果，降低药物用量和给药频次，提高药物的生物利用度，减轻药物的毒副作用，具有良好的临床应用价值；同时，本发明的制备方法，具有收率高、纯度高、能耗低、步骤少、操作简便、成本低、环保、安全等优点，非常适合产业上的应用。

Claims (12)

1.式Ⅰ所示的化合物或其晶型、盐：

其中，R₁选自氢、卤素、C₁～C₆烷基、C₁～C₆烷氧基、氨基或取代的氨基，R₂～R₄分别或同时选自氢、碱金属、C₁～C₆烷基。

2.根据权利要求1所述的化合物或其晶型、盐，其特征在于：R₁选自氨基或C₁～C₆烷基取代的氨基，R₂～R₄分别或同时选自氢、锂、钠、钾。

3.根据权利要求1所述的化合物或其晶型、盐，其特征在于：所述的化合物为：

4.根据权利要求3所述的化合物或其晶型、盐，其特征在于：所述的化合物为1-(β-L-呋喃核糖)-5-氨基-嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。

5.式Ⅰ所示化合物的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤：

a、1-(2’，3’，5’-O-乙酰基-β-L-呋喃核糖)-5-氨基-嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮与MOR₅/R₅OH溶液，于70℃～80℃反应20分钟～30分钟，得到反应液；

其中，M选自锂、钠、钾、铷、铯或钫；R₅选自甲基、乙基、丙基、丁基或戊基；

1-(2’，3’，5’-O-乙酰基-β-L-呋喃核糖)-5-氨基-嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮与MOR₅的摩尔比1：3～5；MOR₅/R₅OH溶液的浓度为0.1M～0.5M；

b、对步骤a所得反应液进行分离、纯化，得到1-(β-L-呋喃核糖)-5-氨基-嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤b中，对步骤a所得反应液进行分离、纯化的方法为：将步骤a所得反应液冷却至室温，加入冰醋酸，过滤，得到固体，洗涤，干燥，即得1-(β-L-呋喃核糖)-5-氨基-嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。

7.权利要求1～4任意一项所述的化合物或其晶型、盐作为药物载体的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的药物为单体类核苷类药物或寡聚核苷酸类药物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的单体类核苷类药物选自5-氟尿嘧啶、硫鸟嘌呤、奈拉滨、氯法他滨、替加氟、阿糖胞苷、地西他滨、齐多夫定、扎西他滨、阿昔洛韦、阿德福韦酯中的任意一种或两种以上；所述的寡聚核苷酸类药物选自siRNA、反义寡聚核苷酸中的任意一种或两种。

10.一种药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物是以权利要求1～4任意一项所述的化合物或其晶型、盐为载体，加上药物、药学上常用的辅料或辅助性成分制备得到的制剂。

11.根据权利要求10所述的药物组合物，其特征在于：所述的药物为单体类核苷类药物或寡聚核苷酸类药物。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于：所述的单体类核苷类药物选自5-氟尿嘧啶、硫鸟嘌呤、奈拉滨、氯法他滨、替加氟、阿糖胞苷、地西他滨、齐多夫定、扎西他滨、阿昔洛韦、阿德福韦酯中的任意一种或两种以上；所述的寡聚核苷酸类药物选自siRNA、反义寡聚核苷酸中的任意一种或两种。