CN108084177A

CN108084177A - 一种小檗碱9-位吡唑衍生物及其制备和应用

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Publication number: CN108084177A
Application number: CN201810067393.6A
Authority: CN
Inventors: 刘艳飞; 肖代鹏; 刘珍宝; 贺芬; 彭东明
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2018-01-23
Filing date: 2018-01-23
Publication date: 2018-05-29
Anticipated expiration: 2038-01-23
Also published as: CN108084177B

Abstract

本发明通过对小檗碱(berberine)进行结构修饰合成出了新型的小檗碱衍生物，其结构是通式(I)所表示的化合物。本发明涉及到了该小檗碱衍生物的制备、抗氧化活性及抗癌效果。实验证明，本发明的小檗碱衍生物具有较好的抗氧化性，诱导癌细胞产生活性氧ROS使癌细胞死亡，对多种癌细胞株具有明显的抑制作用，可用于制备抗肿瘤药物。

Description

一种小檗碱9-位吡唑衍生物及其制备和应用

技术领域：

本发明属于有机化合物制备领域，具体涉及一种小檗碱9-位吡唑衍生物的制备。

技术背景：

“氧化压力”是一种不平衡的亲氧化状态它是导致一些非常重要的生物成分比如必不可少的蛋白质负责因子、脂类和核酸的损伤，从而提供过量的活性氧 (ROS)（活性氧包括超氧阴离子(O₂-·)、羟基自由基(OH·)、过氧化氢(H₂O₂))。 ROS与DNA的相互作用导致细胞损伤和稳态破坏，导致各种病，如心血管疾病、糖尿病、癌症、肝硬化。抗氧化剂可以清除活性氧(ROS)通过供电子给ROS 使其形成不稳定的ROS使其失效不再影响重要的生物成分，从而减少氧化压力 (oxidative stress)。寻找一种高效、毒性小的的具有抗氧化性同时又具有抗癌性效果的药物对预防及治疗癌症具有重要意义。

小檗碱(berberine)又名黄连素，是存在于黄连中的主要生物碱类成分。小檗碱属于季铵型生物碱，为两个异喹啉稠和而成，分子式为C₂₀H₁₉O₅N其盐酸盐为黄色结晶性粉末、无臭、味极苦。

小檗碱具有多种药理活性，在临床上主要用于治疗细菌性痢疾和肠炎，具有副作用小的特点。近年来，小檗碱抗肿瘤作用受到越来越多的重视。研究显示，小檗碱对许多肿瘤细胞有抑制作用如人白血病细胞、骨髓瘤细胞、肝癌细胞等。小檗碱能够抑制细胞呼吸链的黄酶，而癌细胞中的黄酶较正常细胞要少得多，对小檗碱更加敏感；抑制癌细胞对羧胺的利用，从而抑制嘌呤及核酸的合成，从而抑制癌细胞的增殖。小檗碱也可诱导肿瘤细胞的凋亡。

小檗碱生物利用度低。据报道，据报道，小檗碱的绝对生物利用度口服给药后大鼠低于1％。小檗碱的口服生物利用度低，可能是由于其吸收差(56％)和首过效应在小肠(43.5％)和肝脏(0.14％)。此外，小檗碱吸收差可能是由于自聚集，渗透性差，P-糖蛋白(P-gp)介导的外排，和肝胆再排泄。药物通常被认为是很好地吸收在大鼠体内有效渗透系数(P_eff)需大于0.2×10^-4厘米/秒，而小檗碱P_eff(0.178×10^-4厘米/秒)在大鼠肠粘膜证实其低渗透。此外，小檗碱的辛醇-水分配系数约-1.5，其水溶液中的溶解度约为2毫克/毫升，根据生物药剂学分类系统(BCS)，小檗碱可以分为III类药物，这意味着它具有溶解度高、低渗透。

发明内容：

为解决现有技术存在的技术问题，本发明第一目的在于，提供了一种小檗碱 9-位吡唑衍生物，旨在提升化合物的应用性能。

本发明的第二目的在于，提供了所述的小檗碱9-位吡唑衍生物的制备方法。

本发明第三目的在于，提供了所述的小檗碱9-位吡唑衍生物在制备抗癌、抗氧化等药物的应用。

本发明第四目的在于，还提供了采用本发明所述的小檗碱9-位吡唑衍生物的药物制剂。

一种小檗碱9-位吡唑衍生物，为具有式1所述结构化合物中的至少一种；

所述的n为1～4的整数；

R₁、R₃独自为H、C₁～C₃的烷烃基；苯基或C₁～C₃的烷氧基。

所述的R₂为H、卤素或-NO₂；

Z为Cl或Br。

本发明提供了一种全新结构的小檗碱9-位吡唑衍生物，通过在9位采用吡唑片段进行结构修饰，可出人意料地明显提升抗癌、抗氧化方面的作用，此外，还可提升物料的脂溶性，拓宽化合物给药途径，改善化合物的生物利用度。

作为优选，n为2。

本发明人还研究发现，对吡唑环上的R₁、R₂、R₃的基团进行构效修饰，可进一步改善得到的化合物的抗氧化、抗肿瘤性能。

所述的R₁、R₃中，所述的C₁～C₃的烷烃基例如为碳数为1～3的直链或者支链烷基，例如为甲基、乙基、异丙基等基团；所述的C₁～C₃的烷氧基例如为碳数为1～3的直链或者支链烷基氧基，例如为甲氧基、乙氧基、异丙氧基等基团。

作为优选，所述的R₁、R₃为H或C₁～C₃的烷烃基；最优选为H或甲基。

最优选，所述的R₁、R₃选取相同取代基。

本发明人意外发现，R₂为卤素取代时，相较于H或者硝基取代，可以显著地提升抗氧化、抗癌效果；此外，将R₁、R₃进一步优选为烷烃基，可进一步提升抗氧化、抗癌效果。

作为优选，所述的R₂为Br或Cl；最优选为Br。

作为优选，Z为Br。

本发明所述的小檗碱9-位吡唑衍生物，R₂为Br或Cl；R₁、R₃为H、C₁～C₃的烷烃基；最优选，所述的R₂为Cl，R₁、R₃为甲基。

本发明所述的小檗碱9-位吡唑衍生物，优选具有以下结构的化合物：

本发明还公开了所述的小檗碱9-位吡唑衍生物的制备方法，小檗红碱与式2 所述结构化合物反应，制得所述的小檗碱9-位吡唑衍生物；

Z为Cl或Br；

所述的n为1～4的整数；

R₁、R₃独自为H、C₁～C₃的烷烃基、苯基或C₁～C₃的烷氧基；

所述的R₂为H、卤素或-NO₂。

所述的式2中的n、R₁、R₂、R₃、Z的选取范围同式1化合物。

小檗红碱在碱作用下与式2化合物反应，制得所述的小檗碱9-位吡唑衍生物。所述的碱可为现有常规物料，例如碱金属氢氧化物、碳酸盐等；进一步优选为碳酸钠和/或碳酸钾。

作为优选，式2化合物相对于小檗红碱过量。

小檗红碱与式2化合物的摩尔比为1∶1.1～1.3；优选为1∶1.2。

反应过程的温度为65～70℃；反应时间优选为10～12h。

小檗红碱和式2化合物反应完成后，纯化得到所述的小檗碱9-位吡唑衍生物。纯化的方法例如为柱色谱层析，层析的洗脱液例如为二氯甲烷/乙醇。

本发明得到的小檗碱9-位吡唑衍生物，可选择性地进行阴离子转化，制得其他可生理上可接受的盐的小檗碱9-位吡唑衍生物。

所述的小檗红碱可为外购的商用产品，或者为采用现有方法制得。

作为优选，所述的小檗红碱以小檗碱为原料，在180～200℃（优选为190℃)、 18～22mmHg(优选为20mmHg)压力下反应15～30min制得。反应完成后，可采用现有方法，纯化得到所述的小檗红碱。

本发明一种优选的所述小檗碱9-位吡唑衍生物的制备方法，制备路线如(方程式1)：

在190℃，20mmHg真空条件下将小檗碱1转换成小檗红碱2，小檗红碱在与1-溴乙基吡唑衍生物反应，经过柱层析法得到小檗碱9-位吡唑衍生物3。

本发明还提供了一种所述的小檗碱9-位吡唑衍生物在制备抗癌药物和/或抗氧化药物中的应用。

本发明所述的应用，采用所述的小檗碱9-位吡唑衍生物作为活性成分，配合药学上可接受的赋形剂，制得用于抗癌和/或抗氧化的医学上可接受的药物制剂。

作为优选，所述的药物制剂为注射液、粉针剂口服用片剂、胶囊剂和颗粒剂中的至少一种。

有益效果

本发明提供了一种全新结构的小檗碱9-位吡唑衍生物，在9位上引入吡唑结构修饰，可明显提升化合物的抗氧化、抗癌方面的活性。

此外，本发明还发现，在R₂为卤素下，可提升抗氧化、抗癌方面的活性；特别是在R₁、R₃为烷烃基时，可进一步协同提升抗氧化、抗癌方面的活性。

本发明所述的化合物，改善了化合物的脂溶性，改善了化合物的生物利用度，拓宽了给用途径。

附图说明：

图1小檗碱9-位吡唑衍生物及小檗碱（berberine)的诱导癌细胞A549产生活性氧ROS；

图2小檗碱9-位吡唑衍生物及小檗碱（berberine)的诱导癌细胞HeLa产生活性氧ROS。

具体实施方式：

实施例1：化合物3a的合成：

将0.1mol的小檗碱在190℃，20mmHg条件下于真空干燥箱中反应45min，得暗红色粉末固体，再用二氯甲烷/乙醇(V/V＝12∶1)氧化铝柱层析洗脱。得鲜红色粉末固体2。

将0.001mol小檗红碱2于5ml的乙腈中，加入制备好的1-溴乙基吡唑 0.012mol，碳酸钾0.015mol，在70-75℃条件下磁力搅拌6h，冷却，用二氯甲烷 /乙醇(V/V＝12∶1)氧化铝柱层析洗脱，得黄色固体粉末3a。

产率：45％；¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ9.31(s，1H)，8.91(s，1H)，8.18(d， J＝9.3Hz，1H)，7.97(d，J＝9.1Hz，1H)，7.88(s，1H)，7.79(s，1H)，7.49(s，1H)，7.12 (s，1H)，6.28(s，1H)，6.18(s，2H)，4.82(t，J＝5.5Hz，2H)，4.72(t，J＝4.0Hz，2H)， 4.62(t，J＝4.5Hz，2H)，4.05(s，3H)，3.21(t，J＝6.0Hz， 2H).IR(cm-1)：υmax3441.69，2921.15，1603.13，1505.01，1479.86，1400.54，1363.30，1336. 97，1272.75，1231.90，1104.67，1042.79，930.30，766.52

实施例2：化合物3b的合成：

方法同实施例1，所不同的是用3，5-二甲基-1-溴乙基-吡唑代替1-溴乙基吡唑，产物为黄色固体3b。

产率：52％；¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ9.37(s，1H)，8.92(s，1H)，8.19(d， J＝9.1Hz，1H)，7.98(d，J＝9.2Hz，1H)，7.80(s，1H)，7.10(s，1H)，6.18(s，2H)，5.83 (s，0H)，4.81(t，J＝6.0Hz，1H)，4.65(t，J＝5.2Hz，1H)，4.41(t，J＝5.2Hz，1H)，4.07 (s，3H)，3.22(t，J＝5.5Hz，2H)，2.21(s，3H)，2.02(s，3H).

IR(cm-1)：υmax3393.90，3025.99，2920.65，1603.15，1507.52，1404.02，1362.02，133 6.23，1278.06，1234.73，1106.00，1036.06，927.27.

实施例3：化合物3c的合成：

方法同实施例1，所不同的是用4-溴-3，5-二甲基-1-溴乙基-吡唑代替1-溴乙基吡唑，产物为黄色固体3c。

产率：54％；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ9.54(s，1H)，8.92(s，1H)，8.17(d， J＝9.2Hz，1H)，7.98(d，J＝9.1Hz，1H)，7.79(s，1H)，7.10(s，1H)，6.18(s，2H)，4.84 (t，J＝8.0Hz，2H)，4.65(t，J＝5.1Hz，2H)，4.51(t，J＝5.2Hz，2H)，4.02(s，3H)，3.22 (t，J＝7.5Hz，2H)，2.25(s，3H)，2.03(s，3H).

IR(cm-1)：υmax3410.06，3027.92，2919.69，1602.59，1507.00，1397.38，1364.78，134 1.54，1276.13，1234.40，1103.22，1038.25，927.71，875.77，832.79，661.10.

实施例4：化合物3d的合成：

方法同实施例1，所不同的是用4-氯-3，5-二甲基-1-溴乙基-吡唑代替1-溴乙基吡唑，产物为黄色固体3d。

产率：48％；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ9.56(s，1H)，8.92(s，1H)，8.17(d， J＝8.9Hz，1H)，7.98(d，J＝9.1Hz，1H)，7.79(s，1H)，7.10(s，1H)，6.18(s，2H)，4.84 (t，J＝6.0Hz，2H)，4.64(t，J＝6.0Hz，2H)，4.49(t，J＝5.5Hz，2H)，4.02(s，2H)，3.22 (t，J＝6.5Hz，2H)，2.26(s，J＝8.2Hz，3H)，2.04(s，3H).

IR(cm-1)：υmax3398.82，3044.78，2923.96，1603.33，1568.70，1507.63，1481.23，139 5.90，1367.10，1336.92，1278.73，1234.18，1104.94，1036.84，928.98，816.59，662.05.

实施例5：化合物3e的合成：

方法同实施例1，所不同的是用4-硝基-3，5-二甲基-1-溴乙基-吡唑代替1-溴乙基吡唑，产物为黄色固体3e。

产率：46％；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ9.70(s，1H)，8.93(s，1H)，8.16(d， J＝9.2Hz，1H)，7.98(d，J＝9.2Hz，1H)，7.79(s，1H)，7.10(s，1H)，6.18(s，2H)，4.87 (t，J＝8.0Hz，2H)，4.71-4.60(m，J＝11.0，4.5Hz，4H)，3.98(s，3H)，3.21(t，J＝7.5 Hz，2H)，2.66(s，3H)，2.39(s，3H).

IR(cm-1)：υmax3402.25，3033.54，2952.06，1606.15，1562.65，1507.18，1402.10，135 6.08，1277.58，1233.27，1102.75，1037.68，931.79.

实施例6：化合物3f的合成：

方法同实施例1，所不同的是用4-溴-1-溴乙基-吡唑代替1-溴乙基吡唑，产物为黄色固体3f。

产率：53％；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ9.45(s，1H)，8.91(s，1H)，8.17(d， J＝9.2Hz，1H)，8.10(s，1H)，7.97(d，J＝9.1Hz，1H)，7.79(s，1H)，7.58(s，1H)，7.11 (s，1H)，6.18(s，2H)，4.85(t，J＝7.5Hz，2H)，4.72(t，J＝6.0Hz，2H)，4.61(t，J＝6.5 Hz，2H)，4.04(s，3H)，3.23(t，J＝7.5Hz，2H).

IR(cm-1)：υmax3443.78，3039.16，2921.71，2853.71，1602.64，1505.94，1400.89，136 1.59，1339.64，1276.65，1232.82，1272.55，1104.27，1062.37，1037.93，953.77，830.64.

实施例6：小檗碱9-位吡唑衍生物的抗氧化活性

DPPH法：DPPH法被广泛的用于评定化合物体外的自由基清除能力。1，1- 二苯基-2-三硝基苯肼(1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH)，是一种稳定的氮中心的自由基。DPPH的醇溶液显深紫色，在517nm处有一强吸收。而当自由基清除剂作用时，DPPH可捕捉一单电子，形成淡黄色的非自由基形式 (DPPH-H)，其在517nm处无吸收。通过测定DPPH在化合物作用前后在517nm 处吸收减弱程度，测定化合物的自由基清除能力。

操作：将DPPH溶于乙醇中，配制成0.5mg/mL的DPPH溶液，备用。小檗碱及小檗碱衍生物用DMSO溶解，并用DMSO稀释成不同浓度梯度的样品溶液，备用。取105μL的样品溶液与195μL DPPH溶液混合，震荡摇匀，遮光放置于 30℃恒温水浴锅中30min，用紫外分光光度计UV-2450测定其在517nm处的吸光度(A)，计算样品溶液对DPPH的清除率的IC₅₀。IC₅₀值越小，抗氧化能力越强。

DPPH

ABTS法：ABTS法是一种常用的测定化合物体外总抗氧化能力的方法。2，2- 联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐 (2′-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS)在氧化剂作用下可被氧化成绿色的ABTS自由基(ABTS·⁺)形式，其在734nm或者405nm处具有强吸收峰。而在抗氧化剂的作用下，ABTS·⁺的生成会被抑制，从而在734nm或者405nm处的吸光度降低。ABTS及ABTS·⁺。通过检测ABTS·⁺溶液在化合物作用前后，于734nm或者405nm处的吸光度的变化程度，评价化合物的总抗氧化能力。精密量取200μL7mM的ABTS溶液以及200μL2.45mM的过硫酸钾溶液，混合成400μL的ABTS·⁺工作母液，备用。小檗碱及其衍生物溶于DMSO 中，并稀释成不同浓度的样品液，备用。使用前，将ABTS·⁺工作母液用乙醇溶液稀释成ABTS·⁺工作液，使其在753nm处的吸光度落在0.7±0.05范围内，不同浓度的样品溶液540μL与60μLABTS·⁺工作液避光反应10min后，用紫外分光光度计UV-2450其在753nm处的吸光度(A)，计算样品对于ABTS·⁺的清除率的 IC₅₀。IC₅₀值越小，抗氧化能力越强。

表一化合物3a-3b及小檗碱对DPPH与ABTS清除率的IC₅₀

结果表明：无论从DPPH还是ABTS实验，小檗碱9-位吡唑衍生物3a-3f具有比小檗碱更小得多的IC₅₀，说明小檗碱9-位吡唑衍生物具有比小檗碱明显的抗氧化能力。从构效关系中可以看出在R₂引入卤素比引入硝基具有更好的抗氧化性。

实施例7：小檗碱9-位吡唑衍生物的抗癌活性

细胞HeLa和A549经细胞复苏、细胞传代培养，待细胞生长到细胞对数生长期，用于实验。分组情况：空白组、阳性对照组、溶剂(阴性对照)组、药物组。根据细胞计数结果，用完全培养基将细胞稀释至10万个/mL，每组以每孔不种(空白组)或种1万(100μL)个细胞，将96孔板放入细胞培养箱中培养 24h，弃去原培养基，按分组加入不含(阴性对照组)或含不同浓度(128、64、 32、16、8、4、2μM)药物(药物组)或含5％DMSO(阳性对照组)、1％DMSO(溶剂组)的不完全培养基。继续培养48h后，弃去培养液，以每孔100μL加入MTT(0.5mg/m1)使用液，放入细胞培养箱中培养4h后，出现紫色结晶，弃去MTT溶液，以每孔150μL加入DMSO溶液，继续培养10分钟至结晶溶解，用酶标仪在490nm处检测其OD值。根据公式1计算细胞存活率，再根据存活率计算IC₅₀。IC₅₀值越小，抗癌能力越强。

细胞存活率＝OD(实验组)-空白组/OD(阴性对照组)-空白组 (1)

表2化合物对HeLa和A549的IC₅₀

结果表明：化合物小檗碱9-位吡唑衍生物3a-3f具有比小檗碱更小的IC₅₀，说明化合物小檗碱9-位吡唑衍生物3a-3f具有比小檗碱对癌细胞HeLa和A549 明显的抑制增殖作用，可以治疗用于对癌症的治疗。从构效关系中可以看出在 R₂引入卤素比引入硝基具有更好的抗癌效果。

实施例8：

DCFH-DA（2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐)是非标记性的氧化敏感的荧光探针，DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF 的荧光以判定细胞内活性氧的水平。DCF荧光值越大，产生的活性氧越多。活性氧(reactive oxygen species，ROS)是是肿瘤发生、发展和复发的重要因素。 ROS的产生可以通过加速肿瘤细胞死亡而达到治疗的目的。可以增加肿瘤细胞内ROS水平为目的的药物渐渐应用于临床。小檗碱9-位吡唑衍生物及小檗碱（berberine)的诱导癌细胞HeLa和A549产生活性氧ROS。控制组不加药物。

结果表明：与控制组相比小檗碱9-位吡唑衍生物3a-3f的诱导癌细胞HeLa 和A549产生活性氧ROS，且比小檗碱具具有更好的诱导作用，其中3c作用最好，具有抑制癌细胞凋亡的作用。从构效关系中可以看出在R₂引入卤素比引入硝基具有更好的产生ROS效果。

Claims

1.一种小檗碱9-位吡唑衍生物，其特征在于，为具有式1所述结构化合物中的至少一种；

所述的n为1～4的整数；

所述的R₂为H、卤素或-NO₂；

Z为Cl或Br。

2.如权利要求1所述的小檗碱9-位吡唑衍生物，其特征在于，所述的R₁、R₃独自为H或甲基。

3.如权利要求1或2所述的小檗碱9-位吡唑衍生物，其特征在于，所述的R₂为Br或Cl。

4.如权利要求1所述的小檗碱9-位吡唑衍生物，其特征在于，n为2。

5.如权利要求1所述的小檗碱9-位吡唑衍生物，其特征在于，Z为Br。

6.如权利要求1～5任一项所述的小檗碱9-位吡唑衍生物的制备方法，其特征在于，小檗红碱与式2所述结构化合物反应，制得所述的小檗碱9-位吡唑衍生物；

Z为Cl或Br；

所述的n为1～4的整数；

所述的R₂为H、卤素或-NO₂。

7.如权利要求6所述的小檗碱9-位吡唑衍生物的制备方法，其特征在于，小檗红碱在碱作用下与式2化合物反应，制得所述的小檗碱9-位吡唑衍生物；

所述的碱为碱金属氢氧化物或者碳酸盐；

小檗红碱与式2化合物的摩尔比为1∶1.1～1.3；

反应过程的温度优选为65～70℃；反应时间优选为10～12h；

优选地，将得到的小檗碱9-位吡唑衍生物进行阴离子转化，制得其他可生理上可接受的盐的小檗碱9-位吡唑衍生物。

8.如权利要求6所述的小檗碱9-位吡唑衍生物的制备方法，其特征在于，所述的小檗红碱以小檗碱为原料，在180～200℃、18～22mmHg压力下反应15～30min制得。

9.一种权利要求1～5任一项所述的小檗碱9-位吡唑衍生物在制备抗癌药物和/或抗氧化药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，采用所述的小檗碱9-位吡唑衍生物作为活性成分，配合药学上可接受的赋形剂，制得用于抗癌和/或抗氧化的医学上可接受的药物制剂；