CN102336904B

CN102336904B - 一种喜树碱及其衍生物的多价peg修饰物及其用途

Info

Publication number: CN102336904B
Application number: CN 201110302196
Authority: CN
Inventors: 梁远军; 余晓军; 刘克良; 贾启燕; 冯思良; 李晋峰; 杨强; 张祖兵
Original assignee: Chengdu Yiping Medical Technology Dev Co ltd; Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Yiping Medicine Science & Tech. Development Co., Ltd., Chengdu
Priority date: 2011-09-29
Filing date: 2011-09-29
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2031-09-29
Also published as: CN102336904A

Abstract

本发明涉及通式(I)的一种喜树碱及其衍生物的多价PEG修饰物及其用途，式中：POLY表示聚乙二醇(PEG)残基，分子量为200至100000Da；X表示氨基或氧；Y表示含有双氨基的氨基酸结构化合物，其羧基与X成酰胺键或酯键，向远端引出多胺基功能基；n和m表示Y的聚合度，为1至12的任一整数，r和t表示连接臂亚甲基的个数，为1至12的任一整数，D为喜树碱类化合物被酯化后的残基。

Description

一种喜树碱及其衍生物的多价PEG修饰物及其用途

发明领域

本发明涉及喜树碱及其衍生物的多价PEG的耦合物，及其在制备抗肿瘤等相关作用药物中的用途。

背景技术

喜树碱（Comptothecin，CPT）是从珙桐科植物喜树（Camptothecaacuminata）中分离得到的一种天然产物，是唯一一类有选择性抑制DNA拓扑异构酶I（Topo I）作用的植物抗癌药物。自从Wall等在1966年报道了这个化合物之后，70年代初即由于其优异的抗癌活性被引入临床，但因其药物本身的特性使其临床应用受到极大限制。首先喜树碱水溶性和脂溶性都很差，上世纪70年代曾将其制成水溶性的钠盐，后因临床疗效低、毒性大而终止；其次，喜树碱及其衍生物的内酯环很不稳定，在体内容易开环分解为羧酸形式，与血浆白蛋白结合后进一步驱动开环，极大影响生物利用度。目前上市的喜树碱衍生物，如伊立替康（Irinotecan，CP-11）、拓扑替康（Topotacan）和10-羟基喜树碱等也未能完全克服上述两方面问题。

但由于抑制肿瘤细胞拓扑异构酶I的独特作用机制，因此喜树碱及其衍生物仍然是抗肿瘤药物开发的重点，尤其是水溶性好、代谢稳定的喜树碱衍生物引起了广泛的关注。

聚乙二醇是一类生物相容性优良、水溶性极好，已成功应用于蛋白、多肽以及小分子药物修饰的人工合成共分子。偶联聚乙二醇的喜树碱或其衍生物，除水溶性以及内酯环稳定性得到极大改善外，更重要的是还达到一种称为“被动靶向”（Passive targeting）给药的目的。美国Nektar therapeutics 公司发明的多臂PEG修饰伊立替康（NKTR-102，US 2009/0074704）证明了上述效果，目前已获得FDA批准为卵巢癌治疗的孤儿药。

但目前PEG修饰的结构选择上，多采用单功能或双功能线性分子，实际上，这类传统的修饰剂适用于蛋白、多肽药物的修饰，而用于小分子药物的修饰时，明显的缺点在于有效载药小，无效分子的比例高。因此发展多价，即多功能PEG分子修饰喜树碱或其衍生物仍然存在必要。

发明内容

本发明人经研究现已发现喜树碱及其衍生物尤其是伊立替康经多价聚乙二醇共价修饰后，和现有技术相比活性保持相当，毒副作用降低，且显著增加其水溶性及稳定性，延长了其在体内的半衰期。

本发明的目的在于提供一类靶向好，高效、低毒的喜树碱及其衍生物的多价聚乙二醇修饰物。

本发明的第二个目的在于提供上述修饰物的制备方法。

本发明的第三个目的在于将这类修饰物方便地用于各种药物制剂的制造，更有效地应用于肿瘤患者的治疗。

具体地说，本发明通过如下技术方案而实施：

本发明提供了通式（I）的喜树碱及其衍生物的多价聚乙二醇修饰物

式中：POLY表示聚乙二醇（PEG）残基，分子量为200至100000Da；

X表示氨基或氧；

Y表示含有双氨基的氨基酸结构化合物，如L-赖氨酸，L-鸟氨酸，2，3-二胺基丙酸，2，4-二胺基丁酸，等，其羧基与X成酰胺键或酯键，向远端引出多胺基功能基；

n和m表示Y的聚合度，为1至12的任一整数，优选地为1、2、或3；

r和t表示连接臂亚甲基的个数，为1至12的任一整数，优选地为1、2、或3；

O表示氧；

D为式（II）所表示的化合物被酯化后的残基；

其中：

式（II）化合物可选自10-羟基喜树碱（即R₁、R₂和R₄分别为H，而R₃为OH的式（II）化合物）、11-羟基喜树碱（即R₁、R₂和R₃分别为H，而R₄为OH的式（II）化合物）、10-羟基-9-硝基喜树碱（即R₁和R₄分别H，而R₃为OH、R₂为硝基的式（II）化合物）、10-羟基-7-乙基喜树碱（即R₂、R₄分别为H，而R₁为乙基，R₃为羟基的式（II）化合物）、伊立替康（Irinotecan，CP-11）、拓扑替康（Topotacan，即R₁和R₄分别为H，而R₂为-CH₂N（CH₃）₂-、R₃为羟基的（II）化合物）、DB67、BNP1350、Exatecan、Lurtotecan、ST1481、CKD602；上述化合物结构如下：

优选地，式（II）化合物为伊立替康、10-羟基喜树碱、或拓扑替康；上述式（II）含有羟基化合物的酯化均指其单酯，酯化位点可以是10、11或20位羟基，优选地为20位羟基。

优选地，本发明提供了通式（III）的喜树碱及其衍生物的多价聚乙二醇修饰物

其中，POLY、r、t、O和D如上所定义。

特别优选地，本发明提供了如式（IV）聚乙二醇修饰物

IV【缩写为[(D-O-CO-CH₂CH₂-CO-)₂-Lys-]₂-PEG_20k】

其中D优选地为伊立替康、或羟基喜树碱，z为PEG的聚合度，使得PEG分子量为20 kD，

本发明最优选的聚乙二醇修饰物为：

化合物1：[(Irinotecan-O-CO-CH₂CH₂-CO-)₂-Lys-]₂-PEG_20k

化合物2：[(Camptothecin -O-CO-CH₂CH₂-CO-)₂-Lys-]₂-PEG_20k

此外，本发明还提供了制备上述通式（I）聚乙二醇修饰物的方法，包括下述步骤：

1.提供如式（II）所示母体化合物，其羟基与酸酐，优选丁二酸酐，反应，通过连接臂引出游离羧基；提供多价聚乙二醇修饰剂，如下所列聚乙二醇修饰剂特别优选：[Lys-]₂-PEG_20k，含有游离胺基。

2.将步骤1选好的两种物质置于惰性溶剂中，在偶联剂和有机碱催化作用下，羧基和胺基进行偶联反应。反应产物经常规的纯化、干燥等步骤，即可获得通式I化合物。用于偶联反应的溶剂可以是非极性溶剂如二氯甲烷、氯仿、甲苯或它们的混合溶剂，也可以为极性溶剂，如二甲基甲酰胺（DMF），而所用的偶联试剂包括N-乙基-N’-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC），1,3二异丙基碳二亚胺（DIC），N,N-二环己基碳二亚胺（DCC）等。反应温度通常控制在0～25℃。

对于某些喜树碱衍生物，例如10-羟基喜树碱，其分子中除20位羟基外，10位还含有芳香羟基，而且反应活性更高。为选择性制备20位修饰的化合物，10位羟基先用适当基团保护，如叔丁氧羰酰基（Boc）进行保护，偶联完成后，最终用三氟乙酸脱去而重新释放出羟基。

本发明再一方面涉及含至少一种式（I）聚乙二醇修饰物及药用载体或赋形剂的药物组合物。

本发明还涉及至少一种式（I）聚乙二醇修饰物在制备抗肿瘤等相关的药物中用途。

用裸鼠为实验动物，测定药物的体内过程。结果显示，通过尾静脉单剂量注射化合物2（相当于游离喜树碱4mg/kg），可获得延长的药时曲线，即使在给药72小时后，喜树碱的血药浓度还得以较高水平维持，不低于100ng/ml。

对本发明化合物1和化合物2进行细胞实验，结果显示：该类化合物对人胃癌细胞BGC-823、人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞HepG2和人大肠癌细胞HT29具有非常显著的生长抑制作用，抑制强度与伊立替康相当。

附图说明

图1为化合物2在裸鼠体内的药时曲线。

具体实施方式

本发明合成的药物的获得以及实验样品制备各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制造，下面的实施例可使本专业技术人员更全面理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

二胺基聚乙二醇为自制产品，1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）与二甲胺基吡啶（DMAP）均为国产分析纯试剂。伊立替康、喜树碱为市购原料。

实施例1：

化合物1：[(Irinotecan-O-CO-CH₂CH₂-CO-)₂-Lys-]₂-PEG_20k的合成

（1）伊立替康-20-琥珀酸单酯（AA1）的合成

伊立替康（5.86g，10mmol）、琥珀酸酐（3g，30mmol）以及N,N-二甲基-4-氨基吡啶（DMAP，300mg，2.46mmol）置于100ml两颈瓶中，在氮气保护下，加入50ml无水吡啶。常温搅拌反应12小时，薄层色谱监测反应进程至反应完全。减压浓缩，残留物倒入冰水中，放置，过滤得到淡黄色固体（5.28 g），收率77%。

ESI-MS m/z：687.38 (M+H)⁺

¹H-NMR(DMSO)：δ 0.92（t， 3H，CH₂-CH₃），2.13（m, 7H），2.49(m, 2H)，2.7-2.8（m, 13H），5.27（s, 2H），5.47（s,2H），7.05（s, 1H），7.50（m, 2H），8.07（d, 1H），8.55(s, 1H)，12.26（s, broad, 1H）。

（2）双-赖氨酰-聚乙二醇（AA2）的合成

双-胺基聚乙二醇（20kD）（30g，1.5mmol）和双-叔丁氧羰-L-赖氨酸（1.38g，4mmol）溶于100ml 二氯甲烷中，冰峪冷却，加入二环己基碳二亚胺（DCC，1.03g，5mmol），自然升温，搅拌反应过夜，薄层色谱监测反应进程至反应完全。滤除不溶物，滤液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤一次，二氯甲烷层用饱和氯化钠洗一次，无水硫酸钠干燥过夜。减压浓缩至10ml，加入100ml乙醚，得到白色固体（29.3g g），收率93.7%。¹H-NMR(DMSO) δ ppm：δ1.24（s，C(CH₃)₃）叔丁氧羰基的特征氢

将上述产物20克，溶于100ml二氯甲烷中，加入35ml三氟乙酸和7ml三异丙基硅烷，室温搅拌反应1小时，减压浓缩，加入无水乙醚，固化得到白色固体AA2约20克。¹H-NMR(DMSO)分析中表明，无叔丁氧羰基的特征氢，说明保护基已完全脱除。

（3）[(Irinotecan-O-CO-CH₂CH₂-CO-)₂-Lys-]₂-PEG_20k的合成

将AA1（1.4 g，2mmol）和AA2（10g，0.5mmol）溶于100ml无水二氯甲烷中，冰浴冷却，加入DCC（1g，4.8mmol），然后加入DIEA（1ml），自然升温至室温，反应监测，24小时后终止，过滤，滤液浓缩，加入异丙醇：乙酸乙酯＝4：1，析出无色固体，滤集固体，得到化合物1，9.7g，收率约90%。

MALDI-TOF-MS：23218，呈现正态分布。

实施例2：

化合物2：[(Camptothecin -O-CO-CH₂CH₂-CO-)₂-Lys-]₂-PEG_20k的合成

（1）喜树碱-20-琥珀酸单酯（BB1）的合成

喜树碱（3.46g，10mmol）、琥珀酸酐（3g，30mmol）以及N,N-二甲基-4-氨基吡啶（DMAP，300mg，2.46mmol）置于100ml两颈瓶中，在氮气保护下，加入50ml无水吡啶。常温搅拌反应12小时，薄层色谱监测反应进程至反应完全。减压浓缩，残留物倒入冰水中，放置，过滤得到淡黄色固体（3.53 g），收率78.9%。

ESI-MS m/z：449.79 (M+H)⁺

¹H-NMR(DMSO)：2.13（m, 7H），2.50(m, 2H)，2.7-2.8（m, 2H），5.27（s, 2H），5.50（s, 2H），7.10（s, 1H），7.62（m,2H），8.07（d, 1H），8.55(s, 1H)，12.37（s, broad, 1H）。

（2）[(Camptothecin -O-CO-CH₂CH₂-CO-)₂-Lys-]₂-PEG_20k的合成

将BB1（0.9 g，2mmol）和AA2（10g，0.5mmol）溶于100ml无水二氯甲烷中，冰浴冷却，加入DCC（1g，4.8mmol），然后加入DIEA（1ml），自然升温至室温，反应监测，24小时后终止，过滤，滤液浓缩，加入异丙醇：乙酸乙酯＝4：1，析出无色固体，滤集固体，得到化合物2，9.5g，收率约90%。

MALDI-TOF-MS：22266，呈现正态分布。

实施例3：化合物2血药浓度-时间曲线测定

裸鼠（20-25克）3只，剂量为200mg/kg（相当于喜树碱约12.4mg/kg），通过尾静脉注射化合物2，在不同时间点，用反相-高效液相色谱法测定其血浆中的喜树碱浓度。结果表明，给药后72小时，血浆中喜树碱总浓度可维持在100ng/ml以上（图1），说明，多价聚乙二醇修饰的喜树碱可以获得长效作用。

实施例4：抗肿瘤活性的评价

选择人胃癌细胞BGC-823、人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞HepG2和人大肠癌细胞HT29四种细胞株，接种细胞于含10%胎牛血清的RPMI1640或DMEM细胞培养液中（补充青、链霉素各100u/ml），置于37℃含5%CO₂的细胞培养箱中，每2-3天换液一次，0.25%胰蛋白酶消化，传代和收集细胞。将对数生长期细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液配制成2.5×10⁴/ml浓度的细胞悬液，按每孔3000细胞（100μl）加入到96孔细胞培养板中，培养24小时后每孔加入含有不同浓度受试物的培养基100μl，每个浓度设3～4个平行孔。培养72小时后弃上清。每孔加入100μl新鲜配制的0.5mg/ml四氮唑蓝（MTT）的无血清培养液，37℃培养4小时后弃上清。以100μl DMSO溶解，轻度振荡15分钟后，用酶标仪检测吸光度（OD值），检测波长为570nm、参比波长为450nm。设置受试药品浓度为10.0 、5.0、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625μg/ml，另设空白对照。药物临用前，用细胞培养液溶解使用。具体结果见表1。

表1 化合物1、2抑制各种受试细胞生长的作用

由表1显示，修饰后衍生物与阳性对照对四种肿瘤细胞的抑制活性相当。

Claims

1.一种喜树碱类化合物的多价聚乙二醇修饰物，通式结构如下：

式中：POLY表示分子量为200至100000Da的聚乙二醇残基；

r和t表示连接臂亚甲基的个数，为1至12的任一整数；

D为以下化合物被酯化后的残基：10-羟基喜树碱、11-羟基喜树碱、10-羟基-9-硝基喜树碱、10-羟基-7-乙基喜树碱、伊立替康、拓扑替康、DB67、BNP1350、Exatecan、Lurtotecan、ST1481、CKD602；所述酯化均为单酯，酯化位点任选地为10、11或20位羟基。

2.根据权利要求1所述聚乙二醇修饰物，为通式IV的化合物

其中D为伊立替康或羟基喜树碱，z为PEG的聚合度，PEG分子量为20kDa。

3.根据权利要求2所述聚乙二醇修饰物，选自以下化合物：

化合物1：[(Irinotecan-O-CO-CH₂CH₂-CO-)₂-Lys-]₂-PEG_20k；

化合物2：[(Camptothecin -O-CO-CH₂CH₂-CO-)₂-Lys-]₂-PEG_20k。

4.权利要求3所述聚乙二醇修饰物的制备方法，其特征在于，化合物1：[(Irinotecan-O-CO-CH₂CH₂-CO-)₂-Lys-]₂-PEG_20k的制备包括下述步骤：

（1）伊立替康-20-琥珀酸单酯AA1的合成

5.86g伊立替康、3g琥珀酸酐以及300mg N,N-二甲基-4-氨基吡啶置于100ml两颈瓶中，在氮气保护下，加入50ml无水吡啶，常温搅拌反应12小时，薄层色谱监测反应进程至反应完全，减压浓缩，残留物倒入冰水中，放置，过滤得到5.28 g淡黄色固体，收率77%，

（2）双-赖氨酰-聚乙二醇AA2的合成

30g分子量为20kDa的双-胺基聚乙二醇和1.38g双-叔丁氧羰-L-赖氨酸溶于100ml 二氯甲烷中，冰浴冷却，加入1.03g二环己基碳二亚胺，自然升温，搅拌反应过夜，薄层色谱监测反应进程至反应完全，滤除不溶物，滤液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤一次，二氯甲烷层用饱和氯化钠洗一次，无水硫酸钠干燥过夜，减压浓缩至10ml，加入100ml乙醚，得到29.3g白色固体，收率93.7%；

将上述产物20克，溶于100ml二氯甲烷中，加入35ml三氟乙酸和7ml三异丙基硅烷，室温搅拌反应1小时，减压浓缩，加入无水乙醚，固化得到白色固体AA2 20克，¹H-NMR(DMSO)分析中表明，无叔丁氧羰基的特征氢，说明保护基已完全脱除；

（3）[(Irinotecan-O-CO-CH₂CH₂-CO-)₂-Lys-]₂-PEG_20k的合成

将1.4 g AA1和10g AA2溶于100ml无水二氯甲烷中，冰浴冷却，加入1g DCC，然后加入1ml DIEA，自然升温至室温，反应监测，24小时后终止，过滤，滤液浓缩，加入异丙醇：乙酸乙酯＝4：1，析出无色固体，滤集固体，得到化合物1，9.7g，收率90%。

5.权利要求3所述聚乙二醇修饰物的制备方法，其特征在于，化合物2：[(Camptothecin -O-CO-CH₂CH₂-CO-)₂-Lys-]₂-PEG_20k的制备包括下述步骤：

（1）喜树碱-20-琥珀酸单酯BB1的合成

3.46g喜树碱、3g琥珀酸酐以及300mg N,N-二甲基-4-氨基吡啶置于100ml两颈瓶中，在氮气保护下，加入50ml无水吡啶，常温搅拌反应12小时，薄层色谱监测反应进程至反应完全，减压浓缩，残留物倒入冰水中，放置，过滤得到3.53 g淡黄色固体，收率78.9%；

（2） [(Camptothecin -O-CO-CH₂CH₂-CO-)₂-Lys-]₂-PEG_20k的合成

将0.9 g BB1和10g AA2溶于100ml无水二氯甲烷中，冰浴冷却，加入1g DCC，然后加入1ml DIEA，自然升温至室温，反应监测，24小时后终止，过滤，滤液浓缩，加入异丙醇：乙酸乙酯＝4：1，析出无色固体，滤集固体，得到化合物2，9.5g，收率90%。