CN101385860B - 喜树碱及其衍生物的非线性聚乙二醇前药 - Google Patents

Abstract

本发明公开一类喜树碱或其衍生物与非线性构型聚乙二醇偶联形成的如通式(I)的前体药物，其中，各个基团定义详见说明书。裸鼠体内过程研究揭示，该类前体药物具有延时的血药浓度-时间曲线，静脉给药72小时后，血药浓度仍可维持在100ng/ml以上。体内药效评价显示，该类前体药物对裸鼠接种的人结肠癌HCT116细胞株移植瘤具有强烈的生长抑制作用；对裸鼠接种的人肺癌H460细胞株移植瘤也有明显的生长抑制活性，其抑制强度优于阳性对照药物伊立替康，且无明显系统毒性。

Description

喜树碱及其衍生物的非线性聚乙二醇前药

技术领域

本发明涉及抗肿瘤药物的前药，更具体地说，涉及喜树碱及其衍生物的非线性聚乙二醇前体药物，其制备方法以及它们在肿瘤治疗中的应用。

背景技术

喜树碱(Camptothecin，CPT)是从珙桐科植物喜树(Camptothecaacuminata)中分离提取的五环类生物碱，是唯一有选择性抑制DNA拓扑异构酶I(Topo I)作用的植物抗癌药。尽管喜树碱及其衍生物具有显著的抗肿瘤活性，但因其药物本身的特性，其临床应用受到极大限制。首先，喜树碱水溶性和脂溶性都很差，由此，上世纪七十年代曾将其制成水溶性钠盐形式试用于临床，后因疗效低，毒性大而告失败。其次，研究发现喜树碱类药物的内酯环很不稳定，在体内极易水解开环成羧酸形式，并与血浆中丰富的白蛋白结合，进一步驱使水解平衡向开环方向移动，从而极大地降低活性喜树碱的生物利用度。即使已获批准上市的喜树碱衍生物伊立替康(Irinotecan，CP-11)拓扑替康(Topotecan)和10-羟基喜树碱也仍然未能完全克服上述问题困扰。因此，为进一步提高该类药物的临床治疗价值，围绕改善溶解性，稳定内酯环，提高靶向性提出了众多的解决方案。其中，尤以近年研究开发的聚乙二醇-喜树碱前体药物战略格外引人关注。

聚乙二醇是一类生物兼容性优良，水溶性极好，已成功应用于蛋白多肽药物修饰的人工合成高分子。喜树碱或其衍生物通过易解离共价键与之偶联后，形成前体药物，丧失其药理活性，可是，进入机体或到达靶组织后，因体内的代谢或水解作用，结合状态的喜树碱又被释放出来，而发挥抗癌作用。偶联有聚乙二醇的喜树碱或其衍生物，除水溶性以及内酯环稳定性得到极大的改善外，更重要的还达到一种称为“被动靶向”(Passive targeting)给药的目的。

肿瘤生物学的研究揭示，由于肿瘤血管内皮及淋巴管路的缺陷，肿瘤组织对循环血流中的分子具有“增强的渗透性和保留作用”(EnhancedPermeability and Retention effect，EPR)。与大分子聚乙二醇结合的喜树碱前药可以保留于血液中，循环比较长的时间，仅可从有渗漏性的肿瘤血管壁连续不断地溢出，并逐步累积解离，释放出活性喜树碱分子，从而靶向性地杀伤癌细胞。被动靶向作用的机制在于大分子前体药物在肿瘤组织的有效渗透。其渗透能力将明显与聚乙二醇载体分子的大小及其空间结构类型等因素密切相关。可是，以前公开的相关发明并没有对这些因素给予仔细充分地考虑，也没有意识到聚乙二醇构型对前体药物的分布可能产生的影响。如以前的设计者选用的聚乙二醇分子往往不是偏小就是偏大，难以实现被动靶向的目标；而在聚乙二醇的构型选择上，则多采用单功能或双功能线性构型分子。实际上，这类传统的线性聚乙二醇仅适合用于蛋白质、多肽药物的修饰，而用于小分子药物的修饰时，明显的缺点在于有效载药量少(每个分子至多仅能携带两个小分子药物)，无效分子的比例太大。在人体内大量、不合理地使用高分子载体将可能导致代谢、清除和生物降解等方面的问题。

发明内容

本发明采用喜树碱及其衍生物的非线性结构聚乙二醇前体药物，克服了以前发明的缺点，而且，因构型差异所赋予的有异于线性构型聚乙二醇的药代动力学特征，获得了意想不到的效果。

本发明的目的在于提供一类靶向好，高效、低毒的喜树碱及其衍生物的非线性聚乙二醇前体药物。

本发明另一个目的在于提供上述前体药物的制备方法。

本发明再一个目的在于将这类前体药物方便地用于各种药物制剂的制造，更有效地应用于肿瘤患者的治疗。

具体地说，本发明是通过如下的技术方案而实施的：

本发明提供了通式(I)的喜树碱及其衍生物的非线性构型聚乙二醇前体药

式中:A表示一种核心分子，为还原糖、季戊四醇、或甘油缩合物组成的多醇残基；

O表示氧；

POLY表示聚乙二醇(PEG)残基，分子量为200至10,000Da；

X为吸电子基团，可选自下列原子或基团之一：O、OC(O)CH₂-、-N(R)C(O)-、-C(O)-N(R)、C(O)、N(R)、CH₂C(O)N(R)-、S、SO和SO₂，这里，R可以选自H、1-6个碳直链或支链烷基、C3-C8的环烷基，芳香烃基等，优选地为甲基或乙基。上述原子或基团可由源自POLY或其活化物末端残存的原子或基团充当。X优选地为O，-N(H)C(O)或CH₂C(O)NH-。

n为0或1至12的任一整数，优选地为1、2、或3；

Y表示氧或硫；

D为式(II)所示的化合物被酯化后的残基；

式(II)化合物可选自10-羟基喜树碱(即R₁、R₂和R₄分别为H，而R₃为OH的式(II)化合物)、11-羟基喜树碱(即R₁、R₂和R₃分别为H，而R₄为OH的式(II)化合物)、10-羟基-9-硝基喜树碱(即R₁和R₄分别为H，而R₃为OH、R₂为硝基的式(II)化合物)、10-羟基-7-乙基喜树碱(即R₂、R₄分别为H，而R₁为乙基、R₃为OH的式(II)化合物)、伊立替康(Irinotecan，CP-11)、拓扑替康(Topotecan，即R₁、R₄分别为H，而R₂为-CH₂N(CH₃)₂、R₃为OH的式(II)化合物)、DB 67、BNP 1350、Exatecan、Lurtotecan、ST 1481、CKD 602；上述化合物的具体化学结构如下：

优选地，式(II)化合物为10-羟基喜树碱、11-羟基喜树碱、10-羟基-9-硝基喜树碱、10-羟基-7-乙基喜树碱、伊立替康、或拓扑替康；上述式(II)含羟基化合物的酯化均指其单酯。酯化位点可以是10、11或20位羟基，优选地为20位羟基。

q为4至10的自然数，优选地为4或8。

优选地，本发明提供了通式(III)的喜树碱及其衍生物的非线性构型聚乙二醇前体药

其中，X、Y、POLY、n和D如上所定义。

优选地，本发明提供了通式(IV)的喜树碱及其衍生物的非线性构型聚乙二醇前体药

其中，X、Y、POLY、D和n如上所定义；m为0-8的正整数，优选地为4。

特别优选地，本发明提供了如下化合物：

20-^20k4arm-PEG-OCH₂-C(O)CPT(化合物3)；

10-OH-20-^20k8armPEG-OCH₂-C(O)-CPT(化合物4)；

10-^20k4armPEG-OCH₂-C(O)-CPT(化合物5)

20-^20k4arm-PEG-OCH₂C(O)NHCH₂CH₂C(O)-CPT(化合物6)。

在上述的化合物3、4、5、6中，z是聚合度，使得PEG的分子量为20,000Da。

此外，本发明还提供了制备上述通式(I)化合物的方法，包括下述步骤：

1.提供如式(II)所示母体化合物；提供活化的非线性聚乙二醇。如下

所列非线性聚乙二醇特别优选：^20k4arm-PEG-OCH₂COOH

^20k8armPEG-OCH₂COOH；^20k4arm-PEG-OCH₂CH₂NH₂.

2.将步骤1选好两种取代物置于惰性溶剂中，在偶联剂和有机碱催化作用下进行偶联反应。反应产物经常规的提纯、干燥等步骤，即可获得通式I化合物。用于偶联反应的溶剂可以是非极性溶剂如二氯甲烷、氯仿、甲苯或它们的混合物，也可以为极性溶剂，如二甲基甲酰胺(DMF)，而所用的偶联试剂包括N-乙基-N`-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐[N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride EDC]，1，3-二异丙基碳二亚胺(DIPC)，N，N’-二环己基碳二亚胺(N，N’-Dicyclohexylcarbodiimide，DCC)等。为加速反应进程可加入适量有机碱如二甲胺基吡啶(DMAP)吡啶，三乙基胺。反应温度通常控制在0-25℃.

对于某些喜树碱衍生物，例如10-羟基喜树碱，其分子中除E环上20位羟基外，A环的10位也有羟基存在，而且该羟基更为活跃。为选择性制备10-羟基-20-聚乙二醇-喜树碱前体药物，10位羟基先用叔丁氧羰酰基(t-butylcarbonyl，BOC)进行保护，即将10-羟基喜树碱与焦碳酸二叔丁基酯(di-tert-buty dicarbonate)反应，制得10号位羟基受到保护衍生物(10-BOC-CPT)再与相应的聚乙二醇进行上述的偶联反应。偶联完成后，用三氟乙酸脱去保护基团，即得。而另一方面，为选择性制备10-聚乙二醇-喜树碱前体药物，偶联反应则改用在极性的溶剂DMF中进行，并控制10-羟基喜树碱与聚乙二醇酸的分子比在1:1。

按上述工艺制得的各种相应前体药物，其偶联的母体小分子喜树碱或它的衍生物可用紫外吸收法测定，结果显示：依据所用非线性聚乙二醇构型差异，本发明的前体药活性小分子偶联量可达5.4％-12％(W/W)，明显优于文献报导的，以线性双功能聚乙二醇为载体的前药偶联量：1.7％，达到了高荷载量设计目标。与此同时，用反相高效液相色谱方法测定游离状态母体小分子化合物，结果显示其含量低于总偶联量的0.06％。

用裸鼠为实验动物，测定前体药物的体内过程。结果显示：通过尾静脉单剂量注射化合物3(相当于游离喜树碱4mg/kg，)，可获得一伸长的药-时曲线。即使在给药后72小时，喜树碱的血药浓度仍然可以维持在100ng/ml以上。

对部分通式I化合物进行整体动物抗肿瘤活性实验，结果显示，该类化合物对裸鼠接种的人结肠癌细胞株HCT116移植瘤具有非常显著的生长抑制作用；对裸鼠接种的人肺癌细胞株H460移植瘤也有明显的生长抑制活性，其抑制强度甚至优于阳性对照药物伊立替康，同时，裸鼠体重无明显减失，表明该类化合物无明显系统毒性。

附图说明

图1化合物3在裸鼠体内血药浓度随时间曲线

图2化合物3、化合物5对人结肠癌细胞株(HCT116)移植瘤生长抑制作用

图3化合物3、化合物5对荷瘤(HCT116)裸鼠体重影响

图4化合物3、伊立替康对人肺癌细胞株(H460)移植瘤生长抑制作用

图5化合物3、伊立替康对荷瘤(H460)裸鼠体重影响

具体实施方式

本发明合成的前体药物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制造。下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1.化合物1(聚乙二醇四羧酸，^20k4arm-PEG-OCH₂-COOH)

四手臂聚乙二醇(^20k4arm-PEG-OH，8.0g，0.4mmol)溶于甲苯(80ml)，减压蒸除甲苯/水共沸物(20ml)。溶液冷至30-35℃，加入叔丁醇钾(0.538g，4.8mmol)，。混合物回流1小时后，冷却至40℃，加入溴代乙酸乙酯(1.18g，6.4mmol)，40℃搅拌过夜。反应物冷却至室温后，缓慢加进入乙醚以沉淀产物。将混悬溶液抽滤，沉淀物用乙醚洗涤两次，固体溶解于1N氢氧化钠(50ml)，室温下搅拌2小时，得水解液。该水解物经盐酸酸化后，用二氯甲烷(DCM)萃取三次(25mlX3)。合并萃取液，减压浓缩，浓缩液用冷乙醚沉淀。沉淀物抽滤，乙醚洗涤，置真空下40℃干燥，得化合物1(7.2g，产率90％)。其结构经¹³CNMR(270MHz，CDCl₃)确认：C＝O，170.5ppm

实施例2.化合物2(聚乙二醇八羧酸，^20k8arm-PEG-OCH₂-COOH)

化合物2的制备过程与上述实施例1化合物1的制备过程基本相同，除加倍叔丁醇钾以及溴代乙酸乙酯与聚乙二醇的分子比外。

实施例3.化合物3(20-^20k4arm-PEG-OCH₂-C(O)CPT)

化合物1(500mg，0.025mmol)溶于甲苯(15ml)，减压蒸去甲苯/水共沸物(10ml)，冷却，加入二氯甲烷(15ml)，喜树碱(CPT，52.2mg，0.15mmol)。混合物冷至0℃，加入N-乙基-N`-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，28.7mg，0.15mmol)和二甲胺基吡啶(DMAP，18.3mg，0.15mmol)，移去冰水浴，让反应混合物逐渐升至室温，继续搅拌过夜。反应液用稀盐酸洗涤，经无水硫酸镁干燥，减压蒸去溶剂，残留物用甲醇溶解，上硅胶柱层析。合并洗脱液，蒸发浓缩。浓缩液用乙醚沉淀，沉淀物抽滤，乙醚洗涤，置真空下，40℃干燥得化合物3.(410mg，产率：82％)

结构验证：

¹³CNMR(270MHz，CDCl₃)

δ：7.04，31.18，49.55，53.37，59.79，66-73(PEG)，94.67，119.13，127.14，127.45，127.54，127.65，128.51，129.52，130.51，144.48，145.67，152.71，156.53，166.3，168.79

含量测定：用二甲亚砜(DMSO)配制喜树碱或其衍生物的标准溶液(2.5-20μg/ml)，在波长370nm处读取光吸收，绘制标准曲线。称取待测前药，依同法操作，读取光吸收，由标准曲线计算喜树碱含量。结果：化合物3中CPT偶联量为5.4％。

游离态母体小分子检查：前药合成物中痕量级游离态母体小分子物质，则用RP-HPLC检查。条件：分离柱为Supelcosil LC-18-DB column(250X4.6mm I.D.，5μm)；流动相A(醋酸-氨缓冲液20mM，pH4.6)与固定相B(乙晴)；梯度洗脱(1ml/min，0-100％B，20min.)；荧光检测(EX370nm，EM420nm)。结果显示：化合物3中，游离态CPT含量为0.057％。

实施例4.化合物4(10-OH-20-^20k8armPEG-OCH₂-C(O)-CPT)

a)化合物4a，10-叔丁氧羰酰基喜树碱(10-BOC-CPT)

羟基喜树碱(HCPT，1.0g，2.75mmol)溶于无水二氯甲烷(125ml)，加入焦碳酸二叔丁基酯(Di-ter-butyl dicarbonate，DIBOC；0.84g，3.85mmol)以及无水吡啶(7.2ml，8.8mmol)，反应混合物室温下搅拌过夜。产物抽滤，滤液用0.5N盐酸洗涤，然后改用饱和碳酸氢钠洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥后，抽滤。滤液减压蒸干，残留物置40℃真空下干燥，得化合物4a.(0.95g产率：95％))

b)化合物4

化合物2(500mg，0.025mmol)溶于甲苯(15ml)，减压蒸去甲苯/水恒沸物(10ml)，冷却。加入二氯甲烷，以及化合物4a(138.3mg，0.3mmol)冰水浴中搅拌。加入二甲胺基吡啶(DMAP，36.7mg，0.3mmol)，N-乙基-N`-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，57.5mg，0.3mmol)。移去冰水浴，让混合物逐渐升至室温，继续搅拌过夜。反应液抽滤，滤液减压浓缩，加入乙醚沉淀，抽滤收集沉淀物。固体用用含有30％三氟乙酸的无水二氯甲烷(20ml)溶解。室温下搅拌水解3小时，水解液减压蒸发，去除溶剂。残留物溶于甲醇，上硅胶柱层析。合并层析洗脱液，减压浓缩。浓缩液用乙醚沉淀，抽滤收集沉淀物。固体用乙醚洗涤后，置真空下40℃干燥，得化合物4(320mg，产率：64％；10-OH-CPT偶联量：12.1％游离态10-OH-CPT含量：0.045％)。

实施例5 化合物5(10-^20k4armPEG-OCH₂-C(O)-CPT)

化合物1(500mg，0.25mmol)溶于甲苯(15ml)，减压蒸去甲苯/水共沸物(10ml)，冷却。加入二甲基甲酰胺(DMF，10ml)，10-羟基喜树碱(HCPT，36.2mg，0.1mmol)冰水浴中搅拌。向混合物中加入二甲基吡啶(DMAP，12.2mg，0.1mmol)，N-乙基-N｀-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC 19.2mg，0.1mmol)，移去冰水浴，让反应混合物逐渐升至室温，继续搅拌过夜。反应液蒸干，残留物溶于二氯甲烷后，用稀盐酸洗涤。有机相以无水硫酸镁干燥，减压蒸发，残存物用甲醇溶解，上硅胶柱层析，层析洗脱溶液合并，减压蒸发，浓缩液用乙醚沉淀。抽滤收集沉淀物，继续用乙醚洗涤三次，将所得固体置真空下40℃干燥，得化合物5(405mg，产率：81％；HCPT偶联量：5.5％游离态HCPT含量：0.06％)。

实施6 化合物6(20-^20k4arm-PEG-OCH₂C(O)NHCH₂CH₂C(O)-CPT)

a)化合物6a(^20k4arm-PEG-β-Alanine)

化合物1(1.5g，0.075mmol)和二甲胺基吡啶(DMAP，54.9mg，0.45mmol)，溶于无水二氯甲烷(15ml)，冰水浴中搅拌冷至0℃。加入β-丙胺酸叔丁酯(124.1mg，0.6mmol)，1，3-二异丙基碳二亚胺(DIPC，92mg，0.6mmol)移去冰水浴，让反应混合物温度逐渐升至室温，并继续搅过夜。反应液用稀盐酸洗涤，经无水硫酸镁干燥，抽滤，减压蒸去溶剂，残留物溶解于二氯甲烷(DCM)与三氟乙酸(TFA)的混合液(20ml DCM+10ml TFA)，0℃下搅拌水解过夜，水解液减压蒸去溶剂，二氯甲烷/乙醚重结晶，得化合物6a(1.2g，产率：80％)。

¹³C NMR(270MH，CDCl₃)δ 32.9，33.6，68.1，69.8，169.2，172.1

b)化合物6

化合物6a(600mg，0.03mmol)，喜树碱(CPT，52.2mg，0.15mmol)溶于无水二氯甲烷(20ml)。混合物冷至0℃，加入N-乙基-N`-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，28.7mg，0.15mmol)和二甲胺基吡啶(DMAP，18.3mg，0.15mmol)，移去冰水浴，让反应混合物温度逐渐升至室温，继续搅拌过夜。反应液用稀盐酸洗涤，经无水硫酸镁干燥，减压蒸去溶剂，残留物用甲醇溶解，上硅胶柱层析。合并洗脱溶液，蒸发浓缩。浓缩液用乙醚沉淀，沉淀物抽滤，乙醚洗涤，置真空下，40℃干燥得化合物6(426mg，产率：71％，CPT偶联量：5.1％；游离态CPT含量：0.06％)。

实施例7 化合物3血药浓度-时间曲线测定

裸鼠(20-25克)3只，按相当于喜树碱4毫克/千克剂量，通过尾静脉注射化合物3，在不同时间点，用反相-HPLC方法测其血浆中的喜树碱浓度。绘制血药浓度随时间曲线(图1)。如曲线显示，给药后72小时，血浆中喜树碱总浓度仍可维持在100ng/ml以上，表明以非线性构型聚乙二醇构建的喜树碱前体药物3可以获得在血液中的长循环作用。

实施例8 部分化合物体内抗肿瘤活性及其毒性评价

将人结肠癌细胞(HCT116)接种于裸鼠背部皮下(1x10⁶个细胞每只裸鼠)。当肿瘤块达到150-200mm³时，经尾静脉按相当于喜树碱或羟基喜树碱5毫克/千克剂量，分别注射化合物3或化合物5。每周两次，总共4次。对照组以生理盐水替代。间隔2-3天称量裸鼠体重及肿瘤大小1次。肿瘤体积按公式：长径x(短径²/2)计算。结果表明，与对照组比较，化合物3和化合物5对移植瘤的生长均显示出强效抑制作用(见图2)，而对裸鼠体重无明显影响，表明无明显毒副作用(图3)。

观察化合物3及批准上市的喜树碱衍生物-伊立替康对人肺癌细胞株(H460)裸鼠移植瘤生长抑制作用，结果如图4显示，化合物3抑制活性明显高于伊立替康。两者对裸鼠体重平均无明显影响，见图5。

Claims (5)

1.喜树碱及其衍生物的非线性构型聚乙二醇前体药，其为选自下列通式(III)的化合物：

其中，POLY表示聚乙二醇残基，而且，POLY的非线性构型聚乙二醇分子量为20,000Da；

X为O，或CH₂C(O)NH-，而且，该原子或基团由源自POLY或其活化物末端残存的原子或基团充当；

n为1或2；

Y表示氧；

D为式(II)所示的化合物被酯化后的残基

所述式(II)化合物选自R₁、R₂和R₄分别为H，而R₃为OH的式(II)化合物即10-羟基喜树碱；而且，上述式(II)含羟基化合物的酯化均指其单酯，酯化位点任选地为10或20位羟基。

2.一种喜树碱及其衍生物的非线性构型聚乙二醇前体药，其选自下列任一化合物：

20-^20k4arm-PEG-OCH₂-C(O)CPT，即

10-^20k4arm-PEG-OCH₂-C(O)-CPT，即

或者，20-^20k4arm-PEG-OCH₂C(O)NHCH₂CH₂C(O)-CPT，即

这里，z是聚合度，使得PEG的分子量为20,000Da。。

3.权利要求要求1所述喜树碱及其衍生物的非线性构型聚乙二醇前体药的制备方法，其包括下述步骤：

(1).提供如式(II)所示母体化合物；提供活化的非线性聚乙二醇；

(2).将步骤(1)选好两种取代物置于惰性溶剂中，在偶联剂和有机碱催化作用下进行偶联反应。

4.权利要求要求2所述喜树碱及其衍生物的非线性构型聚乙二醇前体药的制备方法，其包括下述步骤：

(1).提供喜树碱或10-羟基喜树碱；提供活化的非线性聚乙二醇；

(2).将步骤(1)选好两种取代物置于惰性溶剂中，在偶联剂和有机碱催化作用下进行偶联反应。

5.权利要求1或2所述喜树碱及其衍生物的非线性构型聚乙二醇前体药在制备治疗结肠癌或肺癌药物中的应用。

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