CN109602694B - 喜树碱前药凝胶及其制备方法和用途 - Google Patents

喜树碱前药凝胶及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及喜树碱前药凝胶及其制备方法和用途，属于医药领域。本发明提供了喜树碱前药凝胶，它是包含喜树碱前药、甲基丙烯酸、交联剂和引发剂的原料通过聚合制备得到的，其中，所述喜树碱前药的结构如式Ⅰ所示。本发明提供的基于PMAA的pH/氧化还原双响应性喜树碱前药凝胶，其粒径能够达到纳米级水平，具有良好的pH响应性能以及谷胱甘肽响应性能，能够在癌细胞中快速释放出活性成分喜树碱，实现靶向杀灭肿瘤细胞的作用。生物学实验证明，本发明喜树碱前药凝胶能够被肿瘤细胞成功摄取，对肿瘤细胞具有显著的抑制作用，在体内也显示出明显的抗肿瘤活性，具有广阔的临床应用前景。
Figure DDA0001954746270000011

Description

喜树碱前药凝胶及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及喜树碱前药凝胶及其制备方法和用途，属于医药领域。
背景技术
作为全球主要的恶性疾病之一，癌症严重威胁着人类的健康，并导致全球医疗负担逐年大幅增加。化疗是最常用和最有效的治疗方法之一，但目前尚未开发出对肿瘤组织具有良好治疗效果且对正常组织毒性低的理想化疗药物。喜树碱(CPT)是一种五环喹啉类生物碱药物，具有优越的抗肿瘤作用，在结肠癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，黑色素瘤和其他癌症中展现出优异的治疗效果。CPT主要抑制核内酶拓扑异构酶I(DNA复制和转录过程所必需的)的活性，从而打破DNA链的连接，最终诱导癌细胞死亡。然而，因其固有的高毒性、水溶性差和结构不稳定的缺陷，CPT的应用受到极大限制。
为满足临床应用的要求，技术人员已经在结构修饰、制备纳米制剂、合成前药等多个方面做出了努力，以期改善CPT的性质。对于结构修饰，伊立替康和拓扑替康可能是最成功的CPT衍生物，目前仍然是临床上使用的重要抗癌药物，但在体内缺乏靶向性，存在循环不良和副作用严重的缺陷。此外，也开发了许多微米级或纳米级CPT制剂，如微球纳米粒子，脂质体，纳米胶束等。纳米级CPT可以通过高渗透长保留(EPR)效应被动地靶向肿瘤组织，但是由于简单物理封装的不稳定性，CPT容易从体内循环的载体中泄漏，导致严重的副作用和较低的治疗效果。此外，由于水溶性非常差，CPT在纳米制剂中的包封率非常低，这也严重限制了其应用。为了解决这个问题，技术人员采用了前药策略，通过前体药物修饰，可以极大地改善CPT的物理化学性质。此后，CPT不仅可以有效地传递到靶向组织而不会在其他组织中渗漏，而且还可以在某些微环境中释放母体CPT以起到抗肿瘤活性的作用。此外，纳米级前药可以通过EPR效应实现被动靶向肿瘤组织。
纳米凝胶在药物递送的应用中具有多种优势，如长循环性，良好的柔韧性，较高的溶解度，较大的药物负载效率，增强的生物利用度，制备方法简单，易于修饰，具有被动靶向能力等。因此，开发喜树碱的纳米凝胶，将其应用于肿瘤的治疗，具有重要意义。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供喜树碱前药凝胶，本发明的目的还在于提供该喜树碱前药凝胶的制备方法和用途。
本发明提供了喜树碱前药凝胶，它是包含喜树碱前药、甲基丙烯酸、交联剂和引发剂的原料通过聚合制备得到的，其中，所述喜树碱前药的结构如式Ⅰ所示：
Figure BDA0001954746250000021
进一步地，所述的喜树碱前药凝胶满足以下至少一项：
所述原料的重量配比为：喜树碱前药25～100份、甲基丙烯酸400～475份、交联剂26.3～125份、引发剂11.2～22.2份；
优选地，所述原料的重量配比为：喜树碱前药50～100份、甲基丙烯酸400～475份、交联剂26.3～125份、引发剂11.2～22.2份；
进一步优选地，所述原料的重量配比为：喜树碱前药50份、甲基丙烯酸450份、交联剂55.6份、引发剂16.8份；
喜树碱前药：甲基丙烯酸的质量比为1：(4～19)；
喜树碱前药：交联剂的质量比为50：(26.3～125)；
喜树碱前药：引发剂的质量比为50：(8.4～33.6)。
进一步地，所述交联剂选自甲叉双丙烯酰胺、N,N'-双(丙烯酰)胱胺中一种或两种。
进一步地，所述引发剂选自偶氮类引发剂。
优选地，所述引发剂为偶氮二异丁腈。
进一步地，所述的喜树碱前药凝胶满足以下至少一项：
喜树碱前药的接枝率为75.5～95.4％；
所述喜树碱前药凝胶的粒径为331～1205nm；
所述喜树碱前药凝胶的电位为-21.5～-17.4mV。
进一步地，所述的喜树碱前药凝胶由下述方法制备得到：取喜树碱前药、甲基丙烯酸、交联剂和引发剂，分散于反应溶剂中，于保护气氛下反应，即得。
进一步地，所述的喜树碱前药凝胶满足以下至少一项：
所述反应溶剂为乙腈；
所述保护气氛为氮气氛；
将反应混合物加热至沸腾状态进行反应；
反应时间为2小时；
待反应结束后，收集所有反应混合物，离心，即得喜树碱前药凝胶；
优选地，以1×104转/分钟的转速离心10分钟；
还包含如下纯化步骤：取喜树碱前药凝胶，加入乙腈，超声分散均匀，离心；
优选地，重复所述纯化步骤三次。
本发明提供了所述喜树碱前药凝胶的制备方法，包括如下步骤：取喜树碱前药、甲基丙烯酸、交联剂和引发剂，分散于反应溶剂中，于保护气氛下反应，即得。
本发明提供了所述喜树碱前药凝胶在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途。
优选地，所述的癌症为肝癌。
优选地，所述的药物为注射制剂或口服制剂。
本发明提供了治疗和/或预防癌症的药物组合物，它是以所述的喜树碱前药凝胶为活性成分，加入或不加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
优选地，所述的制剂为注射制剂或口服制剂。
优选地，所述的癌症为肝癌。
本发明提供了基于PMAA的pH/氧化还原双响应性喜树碱前药凝胶，该凝胶的粒径能够达到纳米级水平，具有良好的pH响应性能以及谷胱甘肽响应性能，能够在癌细胞中快速释放出活性成分喜树碱，实现靶向杀灭肿瘤细胞的作用。生物学实验证明，本发明喜树碱前药凝胶能够被肿瘤细胞成功摄取，对肿瘤细胞具有显著的抑制作用，在体内也显示出明显的抗肿瘤活性，具有广阔的临床应用前景。
附图说明
图1为实施例2制备的CPT-ss-M的1H-NMR图；
图2为实施例6制备的还原响应性P(CPT-MAA)纳米凝胶-1的扫描电镜、透射电镜和紫外光谱图；
图3为实施例6制备的还原响应性P(CPT-MAA)纳米凝胶-1的pH响应性能图；
图4为实施例6制备的还原响应性P(CPT-MAA)纳米凝胶-1的谷胱甘肽响应性能图；
图5为实施例7制备的还原响应性P(CPT-MAA)纳米凝胶-2的扫描电镜图；
图6为试验例1中药物释放实验结果图；
图7为试验例2中体外细胞毒性实验结果图；
图8为试验例3中癌细胞摄取实验结果图；
图9为试验例4中癌细胞凋亡实验结果图；
图10为试验例5中体内抗肿瘤实验结果图；
图11为本发明喜树碱前药凝胶的制备路径、体内作用机制及pH/还原作用机制示意图。
具体实施方式
本发明提供了喜树碱前药凝胶，它是包含喜树碱前药、甲基丙烯酸、交联剂和引发剂的原料通过聚合制备得到，其中，所述喜树碱前药的结构如式Ⅰ所示：
Figure BDA0001954746250000041
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
实体肿瘤组织的微环境与正常组织的微环境显著不同，归因于实体肿瘤组织特殊的来源、营养供应、生长形式、代谢途径等。具体而言，谷胱甘肽(GSH～2-10mM)的浓度在细胞质中显著高于细胞外(～2-20μM)和血液(～1～2μM)；与正常组织和血液循环的pH相比(～7.4)，肿瘤组织中存在较低的pH(～5.7-6.8)，这归因于肿瘤组织的高糖酵解速率；此外，晚期内体和溶酶体(pH～4.5-5.5)在肿瘤细胞中具有最低的pH。
本发明提供的喜树碱前药凝胶是以喜树碱前药和甲基丙烯酸为单体，在交联剂作用下通过交联聚合反应制备得到的PMAA纳米凝胶。PMAA纳米凝胶中存在大量羧基，可抵抗由于负电荷引起的非特异性蛋白质吸附，这使它在正常的生理环境中保持稳定。但其在肿瘤组织或肿瘤细胞的低pH环境中可以迅速缩小至较小的体积，从而容易穿透至深部肿瘤组织并导致药物快速释放。基于此，本发明喜树碱前药凝胶具有良好的pH响应性能。
另一方面，通过向喜树碱的结构中引入二硫键形成前药，并进一步作为单体制备PMAA纳米凝胶，不仅提高了药物的稳定性，避免出现药物泄漏的情况，而且还使得纳米凝胶具备了氧化还原响应性，赋予其生物降解性和更快的药物释放能力。
本发明中，喜树碱前药单体是药物成分，具有还原响应性释放喜树碱单体的作用，在肿瘤细胞内高含量谷胱甘肽的作用下释放喜树碱；甲基丙烯酸是凝胶的基本骨架，具有pH响应性能，在肿瘤组织低的pH值条件下，凝胶收缩，可加速喜树碱的释放；交联剂的作用是将喜树碱前药单体和甲基丙烯酸连接起来；引发剂是促进聚合反应进行的主要物质。本发明喜树碱前药凝胶的制备路径、体内作用机制及pH/还原作用机制如图11所示。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1 2-((2-羟乙基)二硫烷基)乙基甲基丙烯酸酯(HSEMA)的制备
Figure BDA0001954746250000051
将2,2'-二硫二乙醇(1.54g，10mmol)和三乙胺(1.52g，15mmol)溶解于50ml无水四氢呋喃中，冰水浴条件下冷却至0℃。将甲基丙烯酰氯(1.05,10mmol)溶于25mL无水四氢呋喃，剧烈搅拌下逐滴缓慢加入上述反应液中。室温下反应过夜，过滤除不溶性盐；然后，旋转蒸发以除去所有溶剂。将得到的粗产品用50mL乙酸乙酯稀释，并用水、饱和氯化钠溶液分别洗涤三次，以除去未反应的原料中杂质。分离收集有机相，用无水硫酸镁干燥。旋转蒸发浓缩溶液，然后通过二氧化硅柱分离纯化，流动相为乙酸乙酯/石油醚(1/3，v/v)，得到纯的2-((2-羟乙基)二硫烷基)乙基甲基丙烯酸酯(HSEMA)。1H-NMR(CDCl3，δ，ppm，TMS)：6.14(s，1H)，5.60(s，1H)，4.43(t，2H)，3.90(t，2H)，2.98(t，2H)，2.89(t,2H)，1.95(s，3H)。
实施例2CPT-ss-M的制备
Figure BDA0001954746250000052
在氮气气氛下，将喜树碱(0.70g，2mmol)和三光气(0.2g，0.66mmol)共混于50mL无水二氯甲烷中，随后加入4-二甲氨基吡啶(0.73g，6mmol)，搅拌反应1小时。接着将HSEMA(0.55g，2.5mmol)溶于10ml无水四氢呋喃中，逐滴加入到上述反应液中。室温下反应24小时后，过滤反应混合物，以除去不溶性盐；旋转蒸发除去所有溶剂。将残余物重新溶解在二氯甲烷中，分别用稀盐酸(100mmol/L)、水、饱和氯化钠溶液分别洗涤两次。收集有机层，并用无水硫酸镁干燥。浓缩上清液，以二氯甲烷/甲醇(200/1，v/v)作为洗脱液，通过二氧化硅硅胶柱分离纯化，获得淡黄色的供聚合用的喜树碱单体(CPT-ss-M)。1H NMR(CDCl3，δ，ppm，TMS)：8.41(s，1H)，8.24(d，1H)，7.95(d，1H)，7.83-7.86(m，1H)，7.67-7.70(m，1H)，7.36(s，1H)，6.08(s，1H)，5.55(s，1H)，5.40(d，2H)，5.31(d，2H)，4.42-4.33(m，4H)，3.07-2.80(m，4H)，2.33-2.12(m，2H)，1.91(s，3H)，1.01(m，3H)。ESI-MS m/z：计算值为597.13；实测值为597.14[M+H]+。图1为CPT-ss-M的1H-NMR图谱，证明了该化合物成功制备。
实施例3 2-(2-羟乙基)乙基甲基丙烯酸酯(HDOMA)的制备
Figure BDA0001954746250000061
将1,6-己二醇(1.18g，10mmol)和三乙胺(1.52g，15mmol)溶解于50ml无水四氢呋喃中，冰水浴条件下冷却至0℃。将甲基丙烯酰氯(1.05,10mmol)溶于25mL无水四氢呋喃，剧烈搅拌下逐滴缓慢加入上述反应液中。室温下反应过夜，过滤除不溶性盐；然后，旋转蒸发以除去所有溶剂。将得到的粗产品用50mL乙酸乙酯稀释，并用水、饱和氯化钠溶液分别洗涤三次，以除去未反应的原料中杂质。分离收集有机相，用无水硫酸镁干燥。旋转蒸发浓缩溶液，然后通过二氧化硅柱分离纯化，流动相为乙酸乙酯/石油醚(1/3，v/v)，得到纯的2-(2-羟乙基)乙基甲基丙烯酸酯(HDOMA)。
实施例4CPT-cc-M的制备
Figure BDA0001954746250000062
在氮气气氛下，将喜树碱(0.70g，2mmol)和三光气(0.2g，0.66mmol)共混于50mL无水二氯甲烷中，随后加入4-二甲氨基吡啶(0.73g，6mmol)，搅拌反应1小时。接着将HDOMA(0.47g，2.5mmol)溶于10ml无水四氢呋喃中，逐滴加入到上述反应液中。室温下反应24小时后，过滤反应混合物，以除去不溶性盐；旋转蒸发除去所有溶剂。将残余物重新溶解在二氯甲烷中，分别用稀盐酸(100mmol/L)、水、饱和氯化钠溶液分别洗涤两次。收集有机层，并用无水硫酸镁干燥。浓缩上清液，以二氯甲烷/甲醇(200/1，v/v)作为洗脱液，通过二氧化硅硅胶柱分离纯化，获得淡黄色的供聚合用的喜树碱单体(CPT-cc-M)。1H NMR(CDCl3，δ，ppm，TMS)：8.41(s，1H)，8.24(d，1H)，7.95(d，1H)，7.84(m，1H)，7.68(m，1H)，7.36(s，1H)，6.08(s，1H)，5.31(d，2H)，4.42-4.33(m，4H)，3.07-2.80(m，4H)，2.33-2.12(m，2H)，1.91(s，3H)，1.01(m，3H)。ESI-MS m/z：计算值为561.60；实测值为561.60[M+H]+。
实施例5非还原响应性P(CPT-MAA)纳米凝胶的制备
将CPT-cc-M(50mg)，甲基丙烯酸(450mg)，甲叉双丙烯酰胺(55.6mg)和偶氮二异丁腈(16.8mg)，加入到干燥的50mL单颈圆底烧瓶中，接着加入40mL无水乙腈，超声使完全溶解。通氮气0.5小时以除去反应体系中的空气，接着将反应混合物加热至沸腾状态并保持2小时。待反应结束后，收集所有反应混合物，以1×104转/分钟的转速离心10分钟，得P(CPT-MAA)纳米凝胶。接着，加入20mL乙腈，超声分散均匀，离心，重复此操作三次，获得较纯的黄色的P(CPT-MAA)前药纳米凝胶。该方法下CPT-cc-M的接枝率为90.4±0.8％，马尔文粒度仪测得的该纳米凝胶的粒径为450±6nm，电位为-20.1±1.2mV。
实施例6还原响应性P(CPT-MAA)纳米凝胶-1的制备
将CPT-ss-M(50mg)，甲基丙烯酸(450mg)，甲叉双丙烯酰胺(55.6mg)和偶氮二异丁腈(16.8mg)，加入到干燥的50mL单颈圆底烧瓶中，接着加入40mL无水乙腈，超声使完全溶解。通氮气0.5小时以除去反应体系中的空气，接着将反应混合物加热至沸腾状态并保持2小时。待反应结束后，收集所有反应混合物，以1×104转/分钟的转速离心10分钟，得P(CPT-MAA)纳米凝胶。接着，加入20mL乙腈，超声分散均匀，离心，重复此操作三次，获得较纯的黄色的P(CPT-MAA)前药纳米凝胶。该纳米凝胶的扫描电镜、透射电镜、紫外吸收结果如图2所示。该方法下CPT-ss-M的接枝率为92.4±0.9％，马尔文粒度仪测得的该纳米凝胶的粒径为471±3nm，电位为-21.2±1.0mV。
其中，CPT-ss-M接枝率的计算方法如下：收集纯化过程中的乙腈溶液，通过HPLC测定其中CPT-ss-M的含量，则接枝率为(起始投料CPT-ss-M的量-测得CPT-ss-M的量差值)×100％/起始投料CPT-ss-M的量。
HPLC测定条件为：
仪器：Agilent 1260,Agilent,USA；
色谱柱：C18，4.6mm×150mm,5μm,Agilent,USA；
测定波长：370nm，柱温：30℃；
流动相：甲醇/水，80/20，v/v；流速：1ml/min。
此外，对该纳米凝胶的pH表征结果如图3所示。可以看出，随着酸度的增加，纳米凝胶的粒径减小。在高pH条件下，羧基被离子化为羧酸根离子，这增强了分子之间的静电排斥，因此导致直径增加。当pH值高于8.0时，直径保持恒定约550nm。相反，羧酸基团的质子化和低pH值的分子内氢键的形成导致直径减小。然而，过度的质子化将导致系统不稳定并容易形成沉淀。当pH值从4.5到3.5时，直径急剧增加到5400nm，溶液变浑浊并且相应地观察到一些沉淀。考虑到肿瘤细胞中较低的pH值，P(CPT-MAA)前药纳米凝胶的这种pH响应性质有利于加速纳米凝胶中负载的药物释放。
该纳米凝胶的谷胱甘肽还原响应性能的表征结果如图4所示。可以发现，用10mMGSH处理48h后，P(CPT-MAA)前药纳米凝胶的蓝色荧光消失，表明CPT可以被GSH完全刺激释放。而非还原响应的P(CPT-MAA)纳米凝胶相同处理后，蓝色荧光没有消失。此外，通过HPLC分析与10mM GSH孵育后的P(CPT-MAA)前药纳米凝胶的介质，可以发现与游离CPT相同保留时间的峰出现，表明从P(CPT-MAA)前药纳米凝胶中释放出CPT。这与CPT-ss-M与10mM GSH孵育时的现象相同。表明了该P(CPT-MAA)前药纳米凝胶具有良好的谷胱甘肽还原性能。
实施例7还原响应性P(CPT-MAA)纳米凝胶-2的制备
将CPT-ss-M(50mg)，甲基丙烯酸(450mg)，N,N'-双(丙烯酰)胱胺(BACy，55.6mg)和偶氮二异丁腈(16.8mg)，加入到干燥的50mL单颈圆底烧瓶中，接着加入40mL无水乙腈，超声使完全溶解。通氮气0.5小时以除去反应体系中的空气，接着将反应混合物加热至沸腾状态并保持2小时。待反应结束后，收集所有反应混合物，以1×104转/分钟的转速离心10分钟，得P(CPT-MAA)纳米凝胶。接着，加入20mL乙腈，超声分散均匀，离心，重复此操作三次，获得较纯的黄色的P(CPT-MAA)前药纳米凝胶。该方法下CPT-ss-M的接枝率为90.8±0.6％，马尔文粒度仪测得的该纳米凝胶的粒径为1146±189nm，PDI为0.735，粒径均匀度较还原响应性P(CPT-MAA)纳米凝胶-1有所降低，其电位为-20.0±1.0mV。该纳米凝胶的扫描电镜结果如图5所示。
实施例8还原响应性P(CPT-MAA)纳米凝胶-3的制备
将CPT-ss-M(50mg)，甲基丙烯酸(450mg)，甲叉双丙烯酰胺(55.6mg)和偶氮二异丁腈(11.2mg)，加入到干燥的50mL单颈圆底烧瓶中，接着加入40mL无水乙腈，超声使完全溶解。通氮气0.5小时以除去反应体系中的空气，接着将反应混合物加热至沸腾状态并保持2小时。待反应结束后，收集所有反应混合物，以1×104转/分钟的转速离心10分钟，得P(CPT-MAA)纳米凝胶。接着，加入20mL乙腈，超声分散均匀，离心，重复此操作三次，获得较纯的黄色的P(CPT-MAA)前药纳米凝胶。该方法下CPT-ss-M的接枝率为91.4±0.5％，马尔文粒度仪测得的该纳米凝胶的粒径为331±2nm，电位为-20.0±1.0mV。
实施例9还原响应性P(CPT-MAA)纳米凝胶-4的制备
将CPT-ss-M(50mg)，甲基丙烯酸(450mg)，甲叉双丙烯酰胺(55.6mg)和偶氮二异丁腈(22.2mg)，加入到干燥的50mL单颈圆底烧瓶中，接着加入40mL无水乙腈，超声使完全溶解。通氮气0.5小时以除去反应体系中的空气，接着将反应混合物加热至沸腾状态并保持2小时。待反应结束后，收集所有反应混合物，以1×104转/分钟的转速离心10分钟，得P(CPT-MAA)纳米凝胶。接着，加入20mL乙腈，超声分散均匀，离心，重复此操作三次，获得较纯的黄色的P(CPT-MAA)前药纳米凝胶。该方法下CPT-ss-M的接枝率为94.1±0.8％，马尔文粒度仪测得的该纳米凝胶的粒径为537±3nm，电位为-20.7±1.9mV。
实施例6～9中引发剂的用量分别占原料总质量的3％、3％、2％、4％。经比较可以看出，随着引发剂用量的增加，制备得到P(CPT-MAA)纳米凝胶的粒径随之增大，接枝率也有所提升。
实施例10还原响应性P(CPT-MAA)纳米凝胶-5的制备
将CPT-ss-M(50mg)，甲基丙烯酸(450mg)，甲叉双丙烯酰胺(26.3mg)和偶氮二异丁腈(15.8mg)，加入到干燥的50mL单颈圆底烧瓶中，接着加入40mL无水乙腈，超声使完全溶解。通氮气0.5小时以除去反应体系中的空气，接着将反应混合物加热至沸腾状态并保持2小时。待反应结束后，收集所有反应混合物，以1×104转/分钟的转速离心10分钟，得P(CPT-MAA)纳米凝胶。接着，加入20mL乙腈，超声分散均匀，离心，重复此操作三次，获得较纯的黄色的P(CPT-MAA)前药纳米凝胶。该方法下CPT-ss-M的接枝率为90.2±0.6％，马尔文粒度仪测得的该纳米凝胶的粒径为385±6nm，电位为-19.5±0.9mV。
实施例11还原响应性P(CPT-MAA)纳米凝胶-6的制备
将CPT-ss-M(50mg)，甲基丙烯酸(450mg)，甲叉双丙烯酰胺(88.2mg)和偶氮二异丁腈(17.6mg)，加入到干燥的50mL单颈圆底烧瓶中，接着加入40mL无水乙腈，超声使完全溶解。通氮气0.5小时以除去反应体系中的空气，接着将反应混合物加热至沸腾状态并保持2小时。待反应结束后，收集所有反应混合物，以1×104转/分钟的转速离心10分钟，得P(CPT-MAA)纳米凝胶。接着，加入20mL乙腈，超声分散均匀，离心，重复此操作三次，获得较纯的黄色的P(CPT-MAA)前药纳米凝胶。该方法下CPT-ss-M的接枝率为95.3±0.6％，马尔文粒度仪测得的该纳米凝胶的粒径为601±2nm，电位为-19.8±2.3mV。
实施例12还原响应性P(CPT-MAA)纳米凝胶-7的制备
将CPT-ss-M(50mg)，甲基丙烯酸(450mg)，甲叉双丙烯酰胺(125mg)和偶氮二异丁腈(18.8mg)，加入到干燥的50mL单颈圆底烧瓶中，接着加入40mL无水乙腈，超声使完全溶解。通氮气0.5小时以除去反应体系中的空气，接着将反应混合物加热至沸腾状态并保持2小时。待反应结束后，收集所有反应混合物，以1×104转/分钟的转速离心10分钟，得P(CPT-MAA)纳米凝胶。接着，加入20mL乙腈，超声分散均匀，离心，重复此操作三次，获得较纯的黄色的P(CPT-MAA)前药纳米凝胶。该方法下CPT-ss-M的接枝率为95.4±0.9％，马尔文粒度仪测得的该纳米凝胶的粒径为765±3nm，电位为-20.0±1.3mV。
实施例6、7、10～12中交联剂的用量分别占原料总质量的10％、5％、15％、20％。经比较可以看出，随着交联剂用量的增加，制备得到P(CPT-MAA)纳米凝胶的粒径随之增大，接枝率也有所提升。
实施例13还原响应性P(CPT-MAA)纳米凝胶-8的制备
将CPT-ss-M(25mg)，甲基丙烯酸(475mg)，甲叉双丙烯酰胺(55.6mg)和偶氮二异丁腈(16.8mg)，加入到干燥的50mL单颈圆底烧瓶中，接着加入40mL无水乙腈，超声使完全溶解。通氮气0.5小时以除去反应体系中的空气，接着将反应混合物加热至沸腾状态并保持2小时。待反应结束后，收集所有反应混合物，以1×104转/分钟的转速离心10分钟，得P(CPT-MAA)纳米凝胶。接着，加入20mL乙腈，超声分散均匀，离心，重复此操作三次，获得较纯的黄色的P(CPT-MAA)前药纳米凝胶。该方法下CPT-ss-M的接枝率为94.3±1.2％，马尔文粒度仪测得的该纳米凝胶的粒径为423±7nm，电位为-21.5±1.4mV。
实施例14还原响应性P(CPT-MAA)纳米凝胶-9的制备
将CPT-ss-M(75mg)，甲基丙烯酸(425mg)，甲叉双丙烯酰胺(55.6mg)和偶氮二异丁腈(16.8mg)，加入到干燥的50mL单颈圆底烧瓶中，接着加入40mL无水乙腈，超声使完全溶解。通氮气0.5小时以除去反应体系中的空气，接着将反应混合物加热至沸腾状态并保持2小时。待反应结束后，收集所有反应混合物，以1×104转/分钟的转速离心10分钟，得P(CPT-MAA)纳米凝胶。接着，加入20mL乙腈，超声分散均匀，离心，重复此操作三次，获得较纯的黄色的P(CPT-MAA)前药纳米凝胶。该方法下CPT-ss-M的接枝率为83.3±1.5％，马尔文粒度仪测得的该纳米凝胶的粒径为1068±12nm，电位为-18.2±1.8mV。
实施例15还原响应性P(CPT-MAA)纳米凝胶-10的制备
将CPT-ss-M(100mg)，甲基丙烯酸(400mg)，甲叉双丙烯酰胺(55.6mg)和偶氮二异丁腈(16.8mg)，加入到干燥的50mL单颈圆底烧瓶中，接着加入40mL无水乙腈，超声使完全溶解。通氮气0.5小时以除去反应体系中的空气，接着将反应混合物加热至沸腾状态并保持2小时。待反应结束后，收集所有反应混合物，以1×104转/分钟的转速离心10分钟，得P(CPT-MAA)纳米凝胶。接着，加入20mL乙腈，超声分散均匀，离心，重复此操作三次，获得较纯的黄色的P(CPT-MAA)前药纳米凝胶。该方法下CPT-ss-M的接枝率为75.5±0.7％，马尔文粒度仪测得的该纳米凝胶的粒径为1205±24nm，电位为-17.4±1.0mV。
实施例6、7、13～15中CPT-ss-M的用量分别占原料总质量的10％、5％、15％、20％。经比较可以看出，随着CPT-ss-M用量的增加，制备得到P(CPT-MAA)纳米凝胶的粒径随之增大，接枝率降低。当CPT-ss-M的用量增加至原料总质量25％时，制备得到的P(CPT-MAA)纳米凝胶在pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液中难以溶解，导致无法通过静脉注射给药。
综合实施例6～15可以看出，随着交联剂、引发剂、CPT-ss-M投料量增加，所制备的P(CPT-MAA)前药纳米凝胶的直径增加。增加交联剂的用量可以增加聚合早期初级较小核的数量，其倾向于聚集成较大的颗粒以降低其表面张力。增加引发剂的用量将显著提高聚合活性，这不仅增加了聚合早期阶段的原核数量，而且加速了核增大聚合的反应。对于CPT-ss-M，由于CPT的刚性多苯基结构，所制备的纳米凝胶几乎不能被压缩，随着CPT-ss-M的进料量增加，导致直径增加。
实施例16空白PMAA纳米凝胶的制备
将甲基丙烯酸(500mg)，甲叉双丙烯酰胺(55.6mg)和偶氮二异丁腈(16.8mg)，加入到干燥的50mL单颈圆底烧瓶中，接着加入40mL无水乙腈，超声使完全溶解。通氮气0.5小时以除去反应体系中的空气，接着将反应混合物加热至沸腾状态并保持2小时。待反应结束后，收集所有反应混合物，以1×104转/分钟的转速离心10分钟，得空白PMAA纳米凝胶。接着，加入20mL乙腈，超声分散均匀，离心，重复此操作三次，获得白色的空白PMAA纳米凝胶。马尔文粒度仪测得的该纳米凝胶的粒径为425±6nm，电位为22.5±1.7mV。
以下通过试验例证明本发明的有益效果。
试验例1药物释放实验
通过透析法用于研究纳米凝胶的药物释放行为。简言之，将制备好的P(CPT-MAA)前药纳米凝胶(根据实施例6制备)分别分散，并超声助溶到不同pH值(pH＝7.4，pH＝6.4，pH＝5.0)的1mL磷酸盐缓冲溶液中。然后转移到预先浸润的透析袋中(MWCO＝14000)。之后将透析袋浸入到40mL含有不同浓度的谷胱甘肽的的PBS溶液(0，2μM，2mM和10mM)中，释放实验条件为37℃，100转/分钟。在预定的时间点，首先收集5mL释放介质，弃去其他释放介质，然后加入预热的新鲜释放介质。使用HPLC测定释放介质中CPT的浓度，每个实验重复三次。释放实验结果如图6所示。
从结果可以看出，在没有GSH或低GSH含量(2μm)的条件下，三种pH条件下药物的释放的均比较缓慢，48h时喜树碱的累积释放速率不超过10％。然而，当处于更高含量的GSH(2mM或10mM)中时，喜树碱的释放显著加快，其在48小时后达到25.0％或64.9％(pH＝7.4)、50.9％或87.7％(pH＝5.0)。pH 6.4条件下的喜树碱的累计释放速率略高于pH 7.4，但低于pH 5.0。考虑到肿瘤微环境与正常生理状况的显著差异，pH7.4或6.4的低释放率和低GSH含量(模拟正常组织和肿瘤组织微环境)有利于保持纳米凝胶稳定，而高释放率在pH5.0和高含量的GSH(模拟肿瘤细胞微环境)有助于快速释放癌细胞中的CPT，从而改善抗癌作用。
试验例2体外细胞毒性测试
选择人肝癌细胞HepG2和成纤维细胞L929以研究纳米凝胶的细胞毒性。将细胞在含有10％FBS和抗生素(青霉素和链霉素，100U/mL)的DMEM培养基中，于37℃在含有5％CO2的潮湿气氛中温育。
使用MTT测定法在L929细胞和HepG2细胞上测试细胞毒性。简而言之，将对数期的细胞接种到96孔板中。在100μLDMEM中孵育24小时后，将在100μLDMEM中具有不同浓度的一系列P(CPT-MAA)前药纳米凝胶(根据实施例6制备)加入每个孔中并进一步孵育24,48和72小时。在预定时间点，用200μL新鲜DMEM替换培养基，加入20μLMTT溶液(5mg/mL，在生理盐水中)。进一步温育4小时后，弃去培养基并用150μLDMSO替换。摇动后，通过酶标仪在570nm处测量每个孔的光密度(OD)。结果在六个单独的实验中取平均值，并表示为平均值±SD。细胞活力(CV)计算如下等式：CV(％)＝OD(处理的)/OD(未处理的)×100％。此外，如上所述评估空白纳米凝胶(根据实施例16制备)的细胞毒性。
如图7显示，P(CPT-MAA)前药纳米凝胶的IC50值在48小时和72小时分别为5.93μg/mL和4.61μg/mL，略高于游离喜树碱的3.65和1.81μg/mL，但无显著性差异。
试验例3癌细胞对本发明纳米凝胶的摄取实验
通过共聚焦激光扫描显微镜分析评估细胞对纳米凝胶的摄取。将处于对数期的Hep G2细胞接种到具有玻璃盖的6孔板中。在2mL培养基中孵育24小时后，加入含有或不含CPT的纳米凝胶并进一步温育4小时。然后除去培养基，用冷PBS(pH7.4)洗涤细胞三次。为了同时评估纳米凝胶的内体逃逸能力，通过Lyso-Tracker Red DND-99进一步染色细胞。然后，用4％多聚甲醛溶液固定细胞，并在CLSM下用DAPI通道观察纳米凝胶，TRITC通道用于内体。
结果如图8所示，将细胞培养4小时后，用空白PMAA纳米凝胶(根据实施例16制备)处理的细胞未观察到荧光，而P(CPT-MAA)前药纳米凝胶组可在1小时至4小时内逐渐观察到蓝色荧光，表明P(CPT-MAA)前药纳米凝胶可被Hep G2细胞成功摄取。此外，蓝色荧光不能与红色荧光完全重叠，表明纳米凝胶可以从晚期内体和溶酶体中逃逸并进入细胞质，然后通过高含量的GSH和癌细胞的细胞质中的低pH水平，可以快速触发CPT释放。
试验例4本发明纳米凝胶对癌细胞的抑制作用
采用流式细胞仪，对于细胞凋亡情况进行分析。分别用PBS，空白PMAA纳米凝胶(根据实施例16制备)，非还原响应性P(CPT-MAA)纳米凝胶(根据实施例5制备)，P(CPT-MAA)前药纳米凝胶(根据实施例6制备)和游离CPT与细胞共培养12小时，其中给药剂量以CPT含量计为2.5mg/mL。收集细胞，用冷PBS(pH7.4)洗涤三次，用Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒(Invitrogen)处理，然后在Beckman coulter流式细胞仪(Navios，Beckman，USA)上分析。
结果如图9所示，可以看出P(CPT-MAA)前药纳米凝胶(38.9％)和游离CPT(37.6％)处理后，Hep G2细胞凋亡率(包括早期凋亡和晚期凋亡)显著高于PBS；而空白PMAA纳米凝胶和不含SS的P(CPT-MAA)纳米凝胶对Hep G2的细胞凋亡率分别仅为5.1％和6.8％。以上实验结果表明，PMAA纳米凝胶可以有效地将CPT递送至癌细胞并发挥其抗肿瘤活性。
试验例5本发明纳米凝胶抑制肿瘤生长的体内实验
通过皮下注射将1×107个Hep G2细胞注射到雄性BALB/c裸鼠的右胁腹中来建立人肝细胞癌模型(HepG2)。当肿瘤体积达到50～100mm3时，将小鼠随机分为4组(n＝4)，通过尾静脉每两天分别注射PBS，空白PMAA纳米凝胶(根据实施例16制备)，游离CPT，P(CPT-MAA)纳米前药凝胶(根据实施例6制备)，非还原响应的P(CPT-MAA)纳米凝胶(根据实施例5制备)。在整个治疗过程中，每两天测量小鼠的体重和肿瘤体积。基于下式计算肿瘤体积：(a×b2)/2，其中a和b分别代表肿瘤的长径和短径(mm)。在实验期间，一旦小鼠死亡，或肿瘤体积大于4000mm3，安乐死小鼠，收集主要器官。另外，在给药后第21天处死所有小鼠，并收获肿瘤和主要器官。
结果如图10所示。在连续5次注射后，在所有组中，给药10mg/kg(以喜树碱含量计)的P(CPT-MAA)前药纳米凝胶显示出最高的抑制肿瘤生长率。注射21天后，肿瘤体积(187.3±92.3mm3)显著低于PBS处理的小鼠(1354.4±283.3mm3，p<0.01)，空白PMAA纳米凝胶(1251.1±301.2mm3，p<0.01)和非还原敏感的P(CPT-MAA)纳米凝胶(955.5±169.1mm3，p<0.01)，略低于P(CPT-MAA)前药纳米凝胶5mg/kg CPT处理的小鼠(418.3±96.2mm3，p<0.05)。给予5mg/kg游离喜树碱的组在最初13天也获得良好的抗肿瘤效果，但它引起较严重的毒副作用：游离CPT组中的所有小鼠显示出极度疼痛的状况，并且体重显着降低22％；更糟糕的是，该组中的所有小鼠在13天后迅速死亡。相反，用P(CPT-MAA)前药纳米凝胶处理的小鼠的体重和疼痛状态没有显著变化，即使给予10mg/kg的治疗剂量。
需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。

Claims (35)

1.喜树碱前药凝胶，其特征是：它是包含喜树碱前药、甲基丙烯酸、交联剂和引发剂的原料通过聚合制备得到的；其中，所述喜树碱前药：甲基丙烯酸的质量比为1：(4～19)；其中，所述喜树碱前药的结构如式Ⅰ所示：
Figure FDA0003403620810000011
2.如权利要求1所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：所述原料的重量配比为：喜树碱前药50～100份、甲基丙烯酸400～475份、交联剂26.3～125份、引发剂11.2～22.2份。
3.如权利要求2所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：所述原料的重量配比为：喜树碱前药50份、甲基丙烯酸450份、交联剂55.6份、引发剂16.8份。
4.如权利要求1所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：喜树碱前药：交联剂的质量比为50：(26.3～125)。
5.如权利要求1所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：喜树碱前药：引发剂的质量比为50：(8.4～33.6)。
6.如权利要求1～5任意一项所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：所述交联剂选自甲叉双丙烯酰胺、N,N'-双(丙烯酰)胱胺中一种或两种。
7.如权利要求1～5任意一项所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：所述引发剂选自偶氮类引发剂。
8.如权利要求6所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：所述引发剂选自偶氮类引发剂。
9.如权利要求7所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：所述引发剂为偶氮二异丁腈。
10.如权利要求8所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：所述引发剂为偶氮二异丁腈。
11.如权利要求1～5或8～10任意一项所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：喜树碱前药的接枝率为75.5～95.4％。
12.如权利要求6所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：喜树碱前药的接枝率为75.5～95.4％。
13.如权利要求7所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：喜树碱前药的接枝率为75.5～95.4％。
14.如权利要求1～5或8～10所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：所述喜树碱前药凝胶的粒径为331～1205nm。
15.如权利要求6所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：所述喜树碱前药凝胶的粒径为331～1205nm。
16.如权利要求7所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：所述喜树碱前药凝胶的粒径为331～1205nm。
17.如权利要求1～5或8～10任意一项所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：所述喜树碱前药凝胶的电位为-21.5～-17.4mV。
18.如权利要求6所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：所述喜树碱前药凝胶的电位为-21.5～-17.4mV。
19.如权利要求7所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：所述喜树碱前药凝胶的电位为-21.5～-17.4mV。
20.如权利要求1～5任意一项所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：由下述方法制备得到：取喜树碱前药、甲基丙烯酸、交联剂和引发剂，分散于反应溶剂中，于保护气氛下反应，即得。
21.如权利要求20所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：所述反应溶剂为乙腈。
22.如权利要求20所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：所述保护气氛为氮气氛。
23.如权利要求20所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：将反应混合物加热至沸腾状态进行反应。
24.如权利要求20所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：反应时间为2小时。
25.如权利要求20所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：待反应结束后，收集所有反应混合物，离心，即得喜树碱前药凝胶。
26.如权利要求25所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：以1×104转/分钟的转速离心10分钟。
27.如权利要求20所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：还包含如下纯化步骤：取喜树碱前药凝胶，加入乙腈，超声分散均匀，离心。
28.如权利要求27所述的喜树碱前药凝胶，其特征是：重复所述纯化步骤三次。
29.权利要求1～28任意一项所述喜树碱前药凝胶的制备方法，其特征是：包括如下步骤：取喜树碱前药、甲基丙烯酸、交联剂和引发剂，分散于反应溶剂中，于保护气氛下反应，即得。
30.权利要求1～28任意一项所述喜树碱前药凝胶在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途。
31.如权利要求30所述的用途，其特征是：所述的癌症为肝癌。
32.如权利要求30所述的用途，其特征是：所述的药物为注射制剂或口服制剂。
33.治疗和/或预防癌症的药物组合物，其特征是：它是以权利要求1～28任意一项所述的喜树碱前药凝胶为活性成分，加入或不加入药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
34.如权利要求33所述的药物组合物，其特征是：所述的制剂为注射制剂或口服制剂。
35.如权利要求33所述的药物组合物，其特征是：所述的癌症为肝癌。
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Qu et al. Redox/pH dual-stimuli responsive camptothecin prodrug nanogels for “on-demand” drug delivery
Shen et al. A glutathione-responsive sulfur dioxide polymer prodrug as a nanocarrier for combating drug-resistance in cancer chemotherapy
Dong et al. Self-assembly of oxidation-responsive polyethylene glycol-paclitaxel prodrug for cancer chemotherapy
Ke et al. A robust strategy for preparation of sequential stimuli-responsive block copolymer prodrugs via thiolactone chemistry to overcome multiple anticancer drug delivery barriers
Zhang et al. Transferrin-mediated fullerenes nanoparticles as Fe2+-dependent drug vehicles for synergistic anti-tumor efficacy
Wang et al. Heparin− paclitaxel conjugates as drug delivery system: synthesis, self-assembly property, drug release, and antitumor activity
Tan et al. Effective encapsulation of apomorphine into biodegradable polymeric nanoparticles through a reversible chemical bond for delivery across the blood–brain barrier
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Zhou et al. Acidity-responsive shell-sheddable camptothecin-based nanofibers for carrier-free cancer drug delivery
Li et al. Smart pH-responsive and high doxorubicin loading nanodiamond for in vivo selective targeting, imaging, and enhancement of anticancer therapy
Pan et al. Synthesis and characterization of biodegradable polyurethanes with folate side chains conjugated to hard segments
KR20180097707A (ko) 생분해성 양친매성 폴리머, 그것에 의해 제조되는 폴리머 베시클, 및 폐암표적 치료제의 제조에 있어서의 사용
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Wu et al. Synergistic action of doxorubicin and 7-Ethyl-10-hydroxycamptothecin polyphosphorylcholine polymer prodrug
Chen et al. Hydrogen Peroxide and Glutathione Dual Redox‐Responsive Nanoparticles for Controlled DOX Release
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Sun et al. Supramolecular nanomedicine for selective cancer therapy via sequential responsiveness to reactive oxygen species and glutathione
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Xu et al. The design and synthesis of redox-responsive oridonin polymeric prodrug micelle formulation for effective gastric cancer therapy
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Zhang et al. Preparation, characterization and in vivo antitumor evaluation of a micellar formulation of camptothecin prodrug
Chu et al. Stimulus‐Responsive Nano‐Prodrug Strategies for Cancer Therapy: A Focus on Camptothecin Delivery

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