CN106620714B - 7-乙基-10-羟基喜树碱-聚合物偶联药物及其纳米制剂制备方法 - Google Patents
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- C08G63/912—Polymers modified by chemical after-treatment derived from hydroxycarboxylic acids
Abstract
本发明公开了一种7‑乙基‑10‑羟基喜树碱(SN38)偶联聚合物，制备方法及其纳米制剂和抗肿瘤的用途。该纳米药物是由7‑乙基‑10‑羟基喜树碱化合物的C‑10位或者C‑20位羟基通过共价键偶联不同分子量端羧基聚合物，得到SN38系列偶联前药，再通过两亲性高分子材料与SN38前药制备成纳米药物。该纳米药物在解决了SN38极差水溶性问题的基础上，体外达到了SN38的缓慢释放的目的。此外，该纳米药物的颗粒直径主要分布在20‑50nm，满足纳米颗粒通过实体瘤的高通透和滞留效应(EPR效应)，增加其被动靶向功能。该纳米药物在体内外都有较不错的效果，应有不错的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及7-乙基-10-羟基喜树碱偶联聚乳酸或者聚乳酸-羟基乙酸共聚物的前药，前药的制备、其纳米制剂的构建及体内外抗肿瘤作用。
背景技术
7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)是喜树碱的衍生物，具有极强的抑制肿瘤细胞增殖的活性。主要通过与拓扑异构酶I及DNA的复合物(TOPcc)结合，从而抑制DNA的解链和肿瘤细胞的增殖。由于SN38分子不溶于水，也不溶于药剂学可以接受的溶剂(如吐温80、聚氧乙烯蓖麻油等)，导致不能直接通过静脉注射的方式用于临床。此外SN38一旦进入血液循环系统，很容易被水解并与血清白蛋白结合从而失去活性。美国FDA于1997年批准了水溶性的SN38衍生物伊立替康(Irinotecan，CPT-11)用于临床各种癌症的治疗。但是临床应用该药物具有非常大缺陷：i)伊立替康在体内转化成具有抗癌作用的SN38需要羧酸酯酶的酶解，但其在体内的转化率不到8％，导致生物利用率极低；ii)伊立替康在血液循环中仍然容易水解而导致失去活性；iii)伊立替康的代谢产物SN38在肠道残留，产生较大的副作用如血性腹泻，限制了药物剂量的提高。综上所述，采用SN38的核心结构，对其高效地利用，并降低该药物分子的临床应用副作用具有非常重要意义。
针对上述科学问题，目前已开发了各种纳米尺寸的药物输送系统来充分利用SN38治疗肿瘤。如日本科学家开发了聚二乙醇聚谷氨酸共聚物用于共价偶联SN38分子，具有两亲性的高聚物在水相中自组装形成直径约为20nm的颗粒，在皮下动物肿瘤模型中取得了有效的抑瘤效果(Koizumi et al.,Novel SN-38–Incorporating Polymeric Micelles,NK012,Eradicate Vascular Endothelial Growth Factor–Secreting Bulky Tumors,Cancer Research,2006,66,10048-10056)。相对CPT-11小分子药物，包裹有SN38的纳米药物进入体内循环后，载体可以有效保护药物分子，从而避免其降解或者失活。此外，肿瘤组织特殊的生物学特征，使得纳米材料通过实体瘤的高通透和滞留效应(EPR效应)对其具有被动靶向功能，提高药物的利用率。再者药物包裹于载体后，可有效降低血液中游离的药物的浓度，从而降低药物毒性。
本发明中，采用无毒、无刺激性、生物相容性好，并且可生物降解的聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)，对SN38进行分子改性，使其可与两亲性高分子如聚乙二醇-聚乳酸(mPEG-PLA)或者聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(mPEG-PLGA)自组装，形成纳米粒，实现药物在血液中实现长循环的目的，提高抗癌效果。
发明内容
本发明提供了可生物降解的聚乳酸(PLA)或者聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)共价偶联SN38上C-10或者C-20上的羟基，生成SN38-聚合物偶联前药，其偶联前药如式I所示，
其中，R1和R2为氢或具有如下结构，为端羧酸聚乳酸或者端羧基聚乳酸-羟基乙
酸共聚物，且R1≠R2，
m为1-5，表示引发剂的乙二醇数；n为0-18，表示两种聚合物中羧酸烷烃碳数，
虚线表示为此处为单键或双键。x为7-280，表示乳酸聚合度，y为8-100，表示羟基乙酸聚合度。
本发明中，所述端羧酸聚合物中，羧酸烷烃碳链为脂肪二酸或者不饱和脂肪二酸；
作为优选，所述n为1-6，进一步优选n＝2；
更为优选地，端羧酸聚合物选自聚乳酸(600)-丁二酸、聚乳酸(1200)-丁二酸、聚乳酸(2600)-丁二酸、聚乳酸(5100)-丁二酸、聚乳酸(10000)-丁二酸、聚乳酸(20000)-丁二酸、羧酸聚乳酸-羟基乙酸(5100)-丁二酸。
更为优选地，端羧酸聚合物选自聚乳酸(600)-丁二酸、聚乳酸(1200)-丁二酸、聚乳酸(2600)-丁二酸、聚乳酸(5100)-丁二酸；
本发明中，所述端羧酸聚乳酸分量在500-20000，端羧酸聚乳酸-羟基乙酸共聚物分子量在1000-25000。
本发明提供了式I所示的偶联前药的制备方法，包括：其中式I制备方法：
在缩合剂存在的情况下，端羧酸聚合物和SN38进行酯化反应，分离纯化得到式I所示的聚合物-SN38偶联前药。
优选的，当R2＝H时，所述式I的制备方法为：在SN38上C-10上引入保护基，在缩合剂存在的情况下，所述聚合物与SN38上C-20上羟基进行酯化反应，脱去上一步引入的保护基，分离纯化得到SN38-聚合物偶联前药。
本发明所提供的所有制备过程，所述的缩合剂均可选为N,N’-二环乙基碳二亚胺(DCC)、1-(3-二甲氨基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)或N,N’-二异丙基碳酰亚胺(DIPC)。
所述的反应中温度为10-80℃，优选为48℃。
所述的反应中反应溶剂可以为二氯甲烷，DMF(二甲基甲酰胺)、DMSO(二甲基亚砜)或者上述溶剂两种或者三种的混合液。
本发明也提供了SN38-聚合物纳米制剂制备，包括：
经酯化反应得到的SN38-聚合物偶联前药和两亲性高分子材料溶解于有机溶剂中，在一定比例下滴加到水溶液中，利用旋转蒸发仪除去有机溶剂后得到聚乳酸-SN38纳米制剂。
所述两亲性高分子材料为聚乙二醇和脂肪族聚酯的共聚物，其中脂肪族聚酯优选为聚乳酸和聚乳酸-羟基乙酸共聚物，即分别表示为如聚乙二醇-聚乳酸(mPEG-PLA)、聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(mPEG-PLGA)。脂肪族聚酯更优选为聚乳酸。
所述聚乙二醇的数均分子量为2000～8000，脂肪族聚酯指乳酸-羟基乙酸(PLGA)共聚物或聚乳酸共聚物(PLA)，分子量2000～20000。
所述SN38-聚合物偶联前药以0.5～2mg/ml，两亲性高分子材料以5～50mg/ml溶解在有机溶剂如四氢呋喃、乙腈、丙酮、乙醇、甲醇中的一种或者两两混合有机溶剂中。混合均匀后，滴加入水中的SN38-聚合物偶联前药浓度为0.06～0.5mg/ml，两亲性高分子材料的浓度为0.625～6.25mg/ml.
本发明提供了所述SN38-聚合物纳米制剂的粒径和扫描电镜。所述前药纳米制剂的粒径为20～50nm。
本发明还提供了SN38-聚合物纳米制剂在磷酸缓冲液、37℃条件下的药物释放。释放实验表明，在该条件下，纳米制剂中抗肿瘤活性分子SN38被缓慢释放，且不同分子量的聚乳酸对释放速度有很大程度上的影响。
内含SN38的纳米载体在血液中实现长循环的目的，到达肿瘤组织后缓慢释放出抗癌活性分子SN38，显著提高抗癌效果。
另外所述偶联前药纳米制剂中，构建SN38前药及制备纳米制剂所使用的高分子材料都是美国FDA批准用于临床的，因此有望提高药物的临床转化的前景。此外，疏水的SN38在mPEG-PLA或者mPEG-PLGA沉淀形成纳米粒的过程中，使得药物分子处于纳米粒的疏水内核，在血液循环中有效保护药物，从而降低毒性，提高药物利用率。
本发明还提供不同分子量聚乳酸和SN38制备的SN38-聚乳酸纳米制剂细胞毒性实验和动物药效学实验。细胞毒性实验表明所述纳米制剂对肿瘤细胞的毒性不亚于SN38单分子直接用药。动物皮下肝癌模型进行对所述纳米制剂的药效学评价，实验表明，对照生理盐水组，实验组肿瘤体积缩小了8-120倍，对照伊立替康组，肿瘤缩小2-29倍。SN38-聚合物偶联纳米药物治疗组生存时间可以延长3倍。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
(1)与临床用药伊立替康极低的酶促水解产率相比，本发明中的SN38-聚合物偶联药物包裹于疏水内核，在生理环境下，既有效降低水解导致的失活，又能通过载体的降解从而缓慢均衡释放具有抗癌活性的SN38分子。
(2)本发明通过不同分子量的聚乳酸调控SN38的释放速度，在减缓药物释放的同时，提高药物在体循环中的稳定性。
(3)本发明中构建SN38-聚合物偶联前药及制备纳米制剂时所使用的高分子材料都是美国FDA批准用于临床的，在体内都可被吸收以及自行进行生物降解的，安全性高，符合临床药物制备要求，符合大规模生产的要求具备良好的市场前景。
(4)从图9可以得出制备得到的纳米药物的颗粒直径主要分布在20-50nm，满足纳米颗粒通过实体瘤的高通透和滞留效应(EPR效应)，增加其被动靶向功能。
本发明中的缩略语，mPLA(600)-SA、mPLA(1200)-SA、mPLA(2600)-SA、mPLA(5100)-SA、mPLA(10000)-SA和mPLA(20000)-SA分别表示分子量不同的端丁二酸聚乳酸；mPLA(5000)-SA表示端丁二酸聚乳酸-羟基乙酸共聚物；EDC表示1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的盐酸盐；(Boc)2O表示二羰基二叔丁酯；TFA表示三氟乙酸；mPEG(5k)-PLA(8K)表示聚乙二醇-聚乳酸共聚物；DCM表示二氯甲烷；MeOH表示甲醇。
附图说明
图1为实施例1SN38-PLA(600)偶联前药1的合成路线；
图2为实施例2SN38-PLA(1200)偶联前药2的合成路线；
图3为实施例3SN38-PLA(2600)偶联前药3的合成路线；
图4为实施例4SN38-PLA(5100)偶联前药4的合成路线；
图5为实施例5SN38-PLA(10000)偶联前药5的合成路线；
图6为实施例6SN38-PLA(20000)偶联前药6的合成路线；
图7为实施例7SN38-PLA(5100)(C-20)偶联前药7的合成路线；
图8为实施例8SN38-PLGA(5000)前药8的合成路线；
图9为实施例9-12SN38-PLA纳米制剂的粒径分布；
图10-13实施例9-12SN38-PLA纳米制剂的透射电镜；
图14为实施例13SN38-PLA纳米制剂的体外释放；
图15为实施例15SN38-PLA纳米制剂的体内抗肿瘤药效评价。
具体实施方式
下面的实施例用来进一步说明本发明，但是这不意味着对本发明的任何限制。
实施例1 SN38-聚乳酸偶联前药1的合成(图1)
在100mL圆底烧瓶中加入mPLA(600)-SA(207mg，0.26mmol)和SN38(100mg，0.26mmol)，溶解在10mL无水二氯甲烷中，再加入EDC(59mg，0.38mmol)。50℃搅拌4小时，除去反应溶剂后，分别用5％柠檬酸，饱和碳酸氢钠，饱和食盐水清洗。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液后减压除去溶剂。用柱层析色谱分离纯化(DCM:MeOH＝120:1)后得到产物1(102mg，34％)。
前药1的1H NMR核磁数据以及质谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ1.00-1.01(t,3H),1.38-1.42(t,3H),1.58(s,24H),1.88-1.92(q,2H),2.89-2.92(t,2H),2.98-3.03(m,2H),3.13-3.19(q,2H),3.38(s,3H),3.53-3.56(t,2H),3.61-3.64(t,2H),3.68-3.70(t,2H),4.25-4.33(m,2H),5.15-5.22(m,8H),5.27(s,2H),5.36(s,1H),5.74-5.78(d,1H,J＝16.4),7.57-7.59(t,1H),7.65(s,1H),7.85-7.85(d,1H,J＝2.4),8.22-8.25(d,1H,J＝9.2).
实施例2 SN38-聚乳酸偶联前药2的合成(图2)
在100mL圆底烧瓶中加入mPLA(1200)-SA(357mg，0.26mmol)和SN38(100mg，0.26mmol)，溶解在13mL无水二氯甲烷中，再加入EDC(59mg，0.38mmol)。50℃搅拌4小时，除去反应溶剂后，分别用5％柠檬酸，饱和碳酸氢钠，饱和食盐水清洗。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液后减压除去溶剂。用柱层析色谱分离纯化(DCM:MeOH＝120:1)后得到产物2(185mg，41％)。
前药2的1H NMR核磁数据以及质谱数据如下：
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ1.02-1.06(t,3H),1.38-1.42(t,3H),1.57-1.61(m,51H),1.88-1.92(q,2H),2.89-2.94(m,2H),2.98-3.07(m,2H),3.13-3.18(q,2H),3.38(s,3H),3.54-3.56(q,2H),3.63-3.65(q,2H),3.68-3.70(t,2H),4.25-4.33(m,2H),5.15-5.22(m,17H),5.27(s,2H),5.33(s,1H),5.73-5.77(d,1H,J＝16.0),7.55-7.58(q,1H),7.66(s,1H),7.84-7.84(d,1H,J＝2.4),8.22-8.24(d,1H,J＝9.2).
实施例3 SN38-聚乳酸偶联前药3的合成(图3)
在100mL圆底烧瓶中加入mPLA(2600)-SA(591mg，0.20mmol)和SN38(79mg，0.20mmol)，溶解在15mL无水二氯甲烷中，再加入EDC(47mg，0.30mmol)。50℃搅拌4小时，除去反应溶剂后，分别用5％柠檬酸，饱和碳酸氢钠，饱和食盐水清洗。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液后减压除去溶剂。用柱层析色谱分离纯化(DCM:MeOH＝120:1)后得到产物3(320mg,48％)。
前药3的1H NMR核磁数据以及质谱数据如下：
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ1.02-1.06(t,3H),1.38-1.42(t,3H),1.53-1.61(m,108H),1.86-1.92(m,2H),2.89-2.92(m,2H),2.98-3.03(m,2H),3.13-3.19(q,2H),3.38(s,3H),3.53-3.56(q,2H),3.63-3.65(t,2H),3.68-3.70(t,2H),4.23-4.34(m,2H),5.13-5.19(m,36H),5.27(s,2H),5.33(s,1H),5.74-5.78(d,1H,J＝16.0),7.55-7.58(q,1H),7.65(s,1H),7.84-7.85(d,1H,J＝2.4),8.22-8.24(d,1H,J＝8.8).
实施例4 SN38-聚乳酸偶联前药4的合成(图4)
在100mL圆底烧瓶中加入mPLA(5100)-SA(1.27g，0.26mmol)和SN38(100mg，0.26mmol)，溶解在15mL无水二氯甲烷中，再加入EDC(59mg，0.38mmol)。50℃搅拌4小时，除去反应溶剂后，分别用5％柠檬酸，饱和碳酸氢钠，饱和食盐水清洗。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液后减压除去溶剂。用柱层析色谱分离纯化(DCM:MeOH＝120:1)后得到产物4(640mg，47％)。
前药4的1H NMR核磁数据以及质谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ1.02-1.06(t,3H),1.40-1.42(t,3H),1.53-1.61(m,213H),1.88-1.92(m,2H),2.89-2.92(m,2H),2.98-3.07(m,2H),3.13-3.19(q,2H),3.38(s,3H),3.54-3.56(q,2H),3.63-3.65(t,2H),3.68-3.70(t,2H),4.27-4.31(m,2H),5.13-5.13(m,71H),5.27(s,2H),5.33(s,1H),5.73-5.77(d,1H,J＝16.4),7.55-7.58(q,1H),7.65(s,1H),7.84-7.85(d,1H,J＝2.4),8.22-8.24(d,1H,J＝9.2).
实施例5 SN38-聚乳酸偶联前药5的合成(图5)
在100mL圆底烧瓶中加入mPLA(10000)-SA(1.04g，0.13mmol)和SN38(50mg，0.13mmol)，溶解在15mL无水二氯甲烷中，再加入EDC(29.5mg，0.19mmol)。50℃搅拌4小时，除去反应溶剂后，分别用5％柠檬酸，饱和碳酸氢钠，饱和食盐水清洗。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液后减压除去溶剂。用柱层析色谱分离纯化(DCM:MeOH＝120:1)后得到产物5(497mg，45％)。
前药5的1H NMR核磁数据以及质谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ1.02-1.06(t,3H),1.40-1.42(t,3H),1.52-1.60(m,324H),1.88-1.92(m,2H),2.89-2.92(m,2H),2.98-3.07(m,2H),3.13-3.19(q,2H),3.38(s,3H),3.54-3.56(q,2H),3.63-3.65(t,2H),3.68-3.70(t,2H),4.27-4.31(m,2H),5.13-5.14(m,108H),5.27(s,2H),5.33(s,1H),5.73-5.76(d,1H,J＝12.0),7.55-7.58(q,1H),7.65(s,1H),7.85-7.86(d,1H,J＝2.4),8.22-8.24(d,1H,J＝8.8).
实施例6 SN38-聚乳酸偶联前药6的合成(图6)
在100mL圆底烧瓶中加入mPLA(20000)-SA(2.59g，0.26mmol)和SN38(50mg，0.13mmol)，溶解在18mL无水二氯甲烷中，再加入EDC(29.5mg，0.19mmol)。50℃搅拌4小时，除去反应溶剂后，分别用5％柠檬酸，饱和碳酸氢钠，饱和食盐水清洗。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液后减压除去溶剂。用柱层析色谱分离纯化(DCM:MeOH＝120:1)后得到产物6(919mg，43％)。
前药6的1H NMR核磁数据以及质谱数据如下：
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ1.02-1.06(t,3H),1.38-1.42(t,3H),1.57-1.63(m,822H),1.88-1.92(q,2H),2.89-2.94(m,2H),2.98-3.07(m,2H),3.13-3.18(q,2H),3.38(s,3H),3.53-3.55(q,2H),3.63-3.65(q,2H),3.68-3.70(t,2H),4.25-4.33(m,2H),5.15-5.23(m,274H),5.27(s,2H),5.33(s,1H),5.73-5.77(d,1H,J＝17.2),7.55-7.58(q,1H),7.66(s,1H),7.84-7.84(d,1H,J＝2.4),8.21-8.23(d,1H,J＝9.6).
实施例7 SN38-聚乳酸(C-20)偶联前药7的合成(图7)
在100mL圆底烧瓶中加入(Boc)2O(145mg，0.66mmol)和SN38(200mg，0.51mmol)，溶解在15mL无水二氯甲烷中，再加入EDC(118.8mg，0.77mmol)。50℃搅拌4小时，除去反应溶剂后，分别用饱和碳酸氢钠，饱和食盐水清洗。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液后减压除去溶剂。用柱层析色谱分离纯化(DCM:MeOH＝120:1)后得到中间体7a,Boc-SN38(180mg，80％)。
7a的1H NMR核磁数据以及质谱数据如下：
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ1.03-1.06(t,3H),1.39-1.42(t,3H),1.62-1.62(S,9H),1.85-1.96(m,2H),3.14-3.19(m,2H),3.79-3.79(s,1H),5.27(s,2H),5.30-5.34(d,1H,J＝16),3.74-3.78(d,1H,J＝16),7.26-7.27(s,1H),7.66-7.68(d,1H,J＝9.2),7.9(s,1H),8.23-8.26(d,1H,J＝10.8).
在100mL圆底烧瓶中加入mPLGA(5100)-SA(1.27g，0.26mmol)和Boc-SN38(132.1mg，0.26mmol)，溶解在15mL无水二氯甲烷中，再加入EDC(59mg，038mmol)。50℃搅拌4小时，除去反应溶剂后，分别用5％柠檬酸，饱和碳酸氢钠，饱和食盐水清洗。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液后减压除去溶剂。用柱层析色谱分离纯化(DCM:MeOH＝120:1)得到中间体7b(506mg，37％)后，加入无水二氯甲烷和三氟乙酸(TFA)分别5ml溶解，室温搅拌0.5h，去除溶剂，用柱层析色谱分离纯化(DCM:MeOH＝100:1)得到产物7(396mg，80％)。
7b的1H NMR核磁数据以及质谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ1.02-1.06(t,3H),1.40-1.42(t,3H),1.53-1.62(m,222H),1.88-1.92(m,2H),2.89-2.91(m,2H),2.98-3.07(m,2H),3.13-3.19(q,2H),3.38(s,3H),3.54-3.56(q,2H),3.63-3.65(t,2H),3.68-3.70(t,2H),4.28-4.31(m,2H),5.12-5.13(m,71H),5.28(s,2H),5.33(s,1H),5.73-5.76(d,1H,J＝16.0),7.55-7.58(q,1H),7.65(s,1H),7.84-7.85(d,1H,J＝2.4),8.22-8.24(d,1H,J＝9.2).
前药7的1H NMR核磁数据以及质谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ1.02-1.06(t,3H),1.40-1.42(t,3H),1.53-1.61(m,213H),1.88-1.91(m,2H),2.89-2.92(m,2H),2.98-3.07(m,2H),3.13-3.18(q,2H),3.38(s,3H),3.55-3.57(q,2H),3.63-3.65(t,2H),3.68-3.70(t,2H),4.27-4.31(m,2H),5.13-5.13(m,71H),5.27(s,2H),5.33(s,1H),5.73-5.76(d,1H,J＝16.4),7.55-7.58(q,1H),7.64(s,1H),7.84-7.85(d,1H,J＝2.4),8.22-8.24(d,1H,J＝9.0).
实施例8 聚乳酸-羟基乙酸-SN38偶联前药8的合成(图8)
在100mL圆底烧瓶中加入mPLGA(5000)-SA(1.29g，0.26mmol)和SN38(100mg，0.26mmol)，溶解在15mL无水二氯甲烷中，再加入EDC(59mg，0.38mmol)。50℃搅拌4小时，除去反应溶剂后，分别用5％柠檬酸，饱和碳酸氢钠，饱和食盐水清洗。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液后减压除去溶剂。用柱层析色谱分离纯化(DCM:MeOH＝120:1)后得到产物8(624mg，45％)。
前药8的1H NMR核磁数据以及质谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ1.03-1.06(t,3H),1.40-1.42(t,3H),1.53-1.61(m,120H),1.89-1.93(m,2H),2.89-2.92(m,2H),2.99-3.07(m,2H),3.13-3.19(q,2H),3.38(s,3H),3.54-3.56(q,2H),3.63-3.65(t,2H),3.67-3.70(t,2H),4.27-4.31(m,2H),5.13-5.13(m,70H),5.27(s,2H),5.33(s,1H),5.74-5.77(d,1H,J＝16.4),7.55-7.58(q,1H),7.65(s,1H),7.84-7.85(d,1H,J＝2.4),8.23-8.26(d,1H,J＝9.2).
实施例9 前药1纳米药物的制备
将实施例1中纯化得到的1(10mg，活性分子SN38为4.7mg)和mPEG(5k)-PLA(8k)96mg溶解于3mL丙酮中，均匀后滴加到10mL水中，滴加完毕后，减压去除丙酮，即可得到聚乳酸-SN38纳米药物。透射电镜(TEM)观察纳米粒形貌大小如图10所示。
实施例10 前药2纳米药物的制备
将实施例2中纯化得到的2(15mg，活性分子SN38为3.9mg)和mPEG(5k)-PLA(8k)78mg溶解于3mL丙酮中，均匀后滴加到10mL水中，滴加完毕后，减压去除丙酮，即可得到聚乳酸-SN38纳米药物。TEM观察纳米粒形貌大小如图11所示。
实施例11 前药3纳米药物的制备
将实施例3中纯化得到的3(25mg，活性分子SN38为3.5mg)和mPEG(5k)-PLA(8k)70mg溶解于3mL丙酮中，均匀后滴加到10mL水中，滴加完毕后，减压去除丙酮，即可得到聚乳酸-SN38纳米药物。TEM观察纳米粒形貌大小如图12所示。
实施例12 前药4纳米药物的制备
将实施例4中纯化得到的4(48mg，活性分子SN38为3.4mg)和mPEG(5k)-PLA(8k)68mg溶解于3mL丙酮中，均匀后滴加到10mL水中，滴加完毕后，减压去除丙酮，即可得到聚乳酸-SN38纳米药物。TEM观察纳米粒形貌大小如图13所示。
实施例13 9-12纳米药物的体外释放(图14)
将实施例中9-12制备的纳米药物3mL分别置于分子量为14000kDa的透析袋中，置于外界20mL pH为7.4的磷酸缓冲液中，在温度为37℃，转速为150r/min的环境中，分别在2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h和120h取出外界磷酸缓冲液，用紫外分光光度计测得SN38含量，从而得到4个纳米药物的相应的体外释放情况。有图11可知，聚乳酸分子量越高，释放地越缓慢。
实施例14 9-12纳米药物体外细胞毒性评价
为评价实施例9-12制备的纳米药物对肝癌肿瘤细胞的杀伤能力，以Hep3B、LM3、7402为例，采用MTT法进行了药效评价，并以伊立替康及SN38作为对照。对各种肿瘤细胞的毒性结果见表1。由表1可见，本发明中的SN38纳米药物与细胞共培养72小时后，其体外抗肿瘤活性均远远优于临床用药伊立替康，并且具有与SN38相类似的效果。
表1.药物培养72小时后细胞成活率的测定(MTT)IC50±SD inμM
实施例15 9-12纳米药物抗肿瘤动物药效评价(图15)
对实施例9-12制备的纳米药物对动物皮下肝癌肿瘤HCC(来源于肝癌病人)进行抑瘤评价。Balb/c裸鼠移植肿瘤2周后，每隔三天一次尾静脉给药，总共三次：生理盐水，伊立替康(17.25mg/kg)，纳米药物5-8(15mg/kg)，总共6组。以第一次给药为0天，每隔三天测量瘤体体积变化进行结果统计。对皮下肝癌瘤的药效评价结果见图12。由图可知，实例9-12中的纳米药物，相对于临床伊立替康对抑制肿瘤生长具非常显著的效果，且实例11和12的效果优于实例9和10中的纳米药物。在治疗一个月后，纳米药物11和12用药组的肿瘤以基本消除。
Claims (13)
1.一种具有如下式I结构的7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)-聚合物偶联前药，
其中，
当R1为氢时，R2为具有如下结构的端羧酸聚乳酸，
当R2为氢时，R1为具有如下结构的端羧酸聚乳酸或者端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物，
其中，m为1-5，表示引发剂的乙二醇数；n为1-6，表示两种聚合物中羧酸烷烃碳数，虚线表示为此处为单键或双键；x为7-280，表示乳酸聚合度，y为8-100，表示羟基乙酸聚合度；
其中所述SN38-聚合物偶联前药由下述方法制备得到，包括：
(1)在缩合剂存在的情况下，SN38与端羧基聚合物进行酯化反应；
(2)反应完成后，进行分离纯化，得到式(I)所示SN38-聚合物偶联前药。
2.如权利要求1所述SN38-聚合物偶联前药，其特征在于，所述端羧酸聚乳酸分子量在500-20000，端羧酸聚乳酸-羟基乙酸共聚物分子量在1000-25000。
3.如权利要求1所述的SN38-聚合物偶联前药，所述R2＝H。
4.权利要求1所述的SN38-聚合物偶联前药的制备方法，包括：
a)在SN38的C-10位上引入保护基；
b)在缩合剂存在的情况下，SN38的C-20位羟基与端羧基聚乳酸进行酯化反应；
c)反应完成后，脱去步骤(a)的保护基；
d)分离纯化后获得SN38-聚合物偶联前药。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述缩合剂包括N,N’-二环乙基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基)-3-乙基碳二亚胺或N,N’-二异丙基碳酰亚胺。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述保护基为叔丁基二苯基硅基或者叔丁氧羰基。
7.一种包含权利要求1所述的SN38-聚合物偶联前药的纳米制剂。
8.如权利要求7所述的偶联前药纳米制剂，其特征在于，为粉剂、片剂、注射剂或者丸剂。
9.权利要求7所述的纳米制剂的制备方法，包括：取SN38-聚合物偶联物1份，两亲性高分子材料5-20份，将两亲性高分子材料和聚乳酸-SN38用有机溶剂溶解作为油相，然后再将油相在滴入水相，最后，除去有机溶剂，得到所述的纳米制剂，其中所述两亲性高分子材料为聚乙二醇和脂肪族聚酯的共聚物，其中所述脂肪族聚酯为乳酸-羟基乙酸共聚物或聚乳酸共聚物。
10.根据权利要求9所述的制剂的制备方法，其中所述聚乙二醇分子量为2000-8000，所述脂肪族聚酯分子量为2000-20000。
11.根据权利要求9所述的制剂的制备方法，其中所述的有机溶剂可以是四氢呋喃、乙腈、丙酮、乙醇、甲醇中任何一种或者两两混合有机溶剂中。
12.根据权利要求9所述的制剂的制备方法，其中所述油相中两亲性高分子材料浓度为5-50mg/ml，油相中SN38-聚合物偶联前药浓度为0.5-2mg/ml。
13.如权利要求7或8所述的SN38-聚合物偶联前药纳米制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
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| "Synthesis, characterization, and evaluation of mPEG –SN38 and mPEG –PLA –SN38 micelles for cancer therapy";Jing Xie，et al;《International Journal of Nanomedicine》;20160426;第11卷;第1680页图1 * |
| "Synthesis, characterization, and evaluation of mPEG –SN38 and mPEG –PLA –SN38 micelles for cancer therapy";Jing Xie，et al;《International Journal of Nanomedicine》;20160426;第11卷;第1680页图1、摘要 * |
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