CN113908289B - 一种具有精确调控药物比例的抗肿瘤多元载药体系及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医用高分子材料领域，涉及一种具有精确调控药物比例的抗肿瘤多元载药体系及其制备方法。所述抗肿瘤多元载药体系为将具有氧化还原响应的两亲性聚合物聚酯‑嵌‑聚N‑(2‑羟基)丙基甲基丙烯酰胺和/或修饰有靶向多肽的聚酯‑嵌‑聚N‑(2‑羟基)丙基甲基丙烯酰胺与至少两种二聚体化疗药前药经自组装得到。本发明通过对化疗原药采用特定的方式进行化学修饰，成功实现多种前药被同时包封在同一纳米载体中，负载药物的载药率和包封率均很高，且多种前药的比例精确可调，不同比例下所得多元载药纳米粒子具备相同的纳米属性，多元载药纳米粒子中药物之间比例维持与原始投料比例高度接近一致，多种药物呈现步调一致的同步释放。

Description

一种具有精确调控药物比例的抗肿瘤多元载药体系及其制备 方法
技术领域
本发明属于生物医用高分子材料领域，具体涉及一种具有精确调控药物比例的抗肿瘤多元载药体系及其制备方法。
背景技术
最具权威的期刊CA(A Cancer Journal for Clinicians)发布的全球最新癌症数据显示，仅2020全年新增癌症人数约1929万，死亡人数高达996万，与以往不同的是乳腺癌新发病例首次超过肺癌，成为全球第一大癌。常规的单一化学疗法是多种癌症常见且必不可少的治疗方法，但是几乎所有的临床一线的抗癌化疗药物均显示出剂量依赖性的非特异性细胞毒性，对正常细胞依然表现出很强的杀伤力，并且由于无法克服癌症的生理复杂性致使细胞对不同的抗肿瘤药物呈现出多药耐药性(multidrug resistance,MDR)，这成为临床上癌症无法取得预期治疗效果的主要障碍。多种药物联合使用为克服肿瘤的多药耐药性以及减轻其高剂量带来的毒副作用提供了一种切实可行的策略方案，但是多种药物只有按照特定最佳比例到达作用部位并且同步释放才能更好地发挥协同抑制效果，在此过程中维持多种药物原始的最佳比例就显得非常重要。
由于新药开发的速度较慢时间周期较长，将两种或更多目前可用的、具有不重叠的全身性毒性和不同治疗机制的药物协同使用便成为一种最佳策略。目前临床上被批准使用的抗癌药物，如阿霉素、紫杉醇、顺铂、长春新碱、喜树碱类等，均表现出剂量依赖性、时间依赖性和低毒性(如长春新碱和顺铂剂量限制性毒性表现为很严重的神经系统毒性，阿霉素、紫杉醇和喜树碱则呈现出心脏毒性、超敏反应、骨髓抑制、骨髓抑制或出血性膀胱炎)而且均被相应的耐药肿瘤细胞所抗。为了提高化疗药的安全性，限制其药物毒性，研究者探究与其他化疗药协同给药的给药方案并开发特定药物递送系统，以尽可能将药物有目的性地直接输送至肿瘤部位而杀伤肿瘤细胞便成为一种潜在的具有很大价值的策略。但是各种化疗药由于各自化学性质不同，如溶解性差异、包封条件差异、无靶向性或者靶向不同作用部位、进入体内药代动力学不同等一系列亟待解决的难题，对其进行合理有效地化学修饰使其成为前药成为潜在的可行方案。维持药物原始的比例到达作用部位并按照最佳比例释放出母药是发挥药物之间协同抗癌效果的前提。用于癌症治疗的新型纳米药物递送体系是一种极具创新和应用前景的治疗策略，将纳米技术引入到药物的联合使用代表了一种创新和有前途的治疗方法，它通过被动和主动靶向增强药物在肿瘤部位富集维持药物高浓度，从而达到抑制MDR的效果，来克服传统小分子化疗药物的各种局限性。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有的抗肿瘤多元载药体系无法实现不同药物原始比例的精确负载以及不同药物的同步释放的缺陷，而提供一种能够精确调控药物比例以及实现不同药物同步释放的抗肿瘤多元载药体系及其制备方法。
具体地，本发明提供的抗肿瘤多元载药体系为将聚合物与至少两种二聚体化疗药前药经自组装得到；所述聚合物为具有氧化还原响应的两亲性聚合物聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺(PLA-ss-PHPMA-X)和/或修饰有靶向多肽的聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺(PLA-ss-PHPMA-R3)；
所述具有氧化还原响应的两亲性聚合物聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺(PLA-ss-PHPMA-X)具有通式(1)所示的结构：
通式(1)中，R1为疏水链段，m为10～400的整数，X为卤素；
所述修饰有靶向多肽的聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺(PLA-ss-PHPMA-R3)具有通式(2)所示的结构：
通式(2)中，R2为疏水链段，m为10～400的整数，R3为肿瘤靶向分子源；
所述二聚体化疗药前药具有通式(3)所示的结构，且不同二聚体化疗药前药中R不同：
通式(3)，R4为疏水链段，R为抗癌化疗药源。
所述具有氧化还原响应的两亲性聚合物聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺(PLA-ss-PHPMA-X)中含有亲水链段、疏水链段以及二硫键，其中，亲水链段为聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺，疏水链段可以为聚乳酸链段、聚羟基乙酸链段、聚己内酯链段或聚(乙醇酸-乳酸)链段，亲疏水链段通过二硫键连接，二硫键为氧化还原响应键。
在一种优选实施方式中，所述具有氧化还原响应的两亲性聚合物聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺(PLA-ss-PHPMA-X)中所含的疏水链段为消旋聚乳酸链段，此时，其具有通式(1-1)所示的结构：
通式(1-1)中，m为10～400的整数，n为10～200的整数，X为卤素。
所述修饰有靶向多肽的聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺(PLA-ss-PHPMA-R3)为在具有氧化还原响应的两亲性聚合物聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺(PLA-ss-PHPMA-X)的亲水端键连有肿瘤靶向分子源的物质。其中，所含的疏水链段R2可以为聚羟基乙酸链段、聚己内酯链段或聚(乙醇酸-乳酸)链段。所含的肿瘤靶向分子源R3中对应的肿瘤靶向分子优选为iRGD(CRGDKGPDC二硫键成环)、RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)、透明质酸或叶酸。所述肿瘤靶向分子可以经由酯化反应、酰胺化反应以及点击化学等键合到聚合物上。所述修饰有靶向多肽的聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺(PLA-ss-PHPMA-R3)的使用能够增加肿瘤穿透效果，因此，所述抗肿瘤多元载药体系优选含有该聚合物。
在一种优选实施方式中，所述修饰有靶向多肽的聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺(PLA-ss-PHPMA-R3)中所含的疏水链段为消旋聚乳酸链段，且所含的肿瘤靶向分子源中对应的肿瘤靶向分子为iRGD，此时，其具有通式(2-1)所示的结构：
通式(2-1)中，m为10～400的整数，n为10～200的整数，R1为iRGD。
在一种优选实施方式中，所述二聚体化疗药前药具有通式(3-1)所示的结构：
通式(3-1)，x为5～200的整数，y为0～200的整数，R为抗癌化疗药源。
在一种优选实施方式中，所述抗癌化疗药源中对应的抗癌化疗药为喜树碱类化合物(CPT、HCPT、SN38)、阿霉素(DOX)、紫杉醇(PTX)、表阿霉素(EPB)、顺铂(Pt)、长春碱(NVB)、长春新碱(VCR)、多西他赛(DTX)或吉西他滨(GEM)。其中，所述二聚体化疗药前药引入氧化还原敏感的二硫键，抗癌化疗药通过氨基甲酸酯以及碳酸酯连接到疏水链段例如低分子量聚乳酸两端。
在一种优选实施方式中，所述抗肿瘤多元载药体系中同时含有基于喜树碱的二聚体化疗药前药、基于阿霉素的二聚体化疗药前药和基于紫杉醇的二聚体化疗药前药。
在一种优选实施方式中，所述抗肿瘤多元载药体系的载药量为20～30％，包封率为94％以上，直径为90～100nm，zeta电位为-15mV～-20mV。
本发明提供的抗肿瘤多元载药体系的制备方法包括：在避光条件下，将具有氧化还原响应的两亲性聚合物聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺和/或修饰有靶向多肽的聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺与至少两种二聚体化疗药前药溶于有机溶剂中得到有机相，将所述有机相利用微流控混合器与水相进行混合，基于微流控技术的纳米沉淀方法组装得到抗肿瘤多元载药体系。
在一种优选实施方式中，所述具有氧化还原响应的两亲性聚合物聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺(PLA-ss-PHPMA-X)按照以下方法制得：
S11、以双(2-羟乙基)二硫化物和双端卤素异丁基化合物作为起始反应产物进行单端取代反应，得到HO-ss-iBuX；
S12、在催化剂的存在下，采用HO-ss-iBuBr引发消旋丙交酯进行开环聚合反应，得到大分子引发剂PLA-ss-iBuX；
S13、采用大分子引发剂PLA-ss-iBuX引发N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺进行ATRP聚合反应，即得具有氧化还原响应的两亲性聚合物聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺。
在所述PLA-ss-PHPMA-X的制备过程中，步骤S11中，所述双(2-羟乙基)二硫化物和双端卤素化合物的用量比优选为(1.2～1.8):1。所述单端取代反应的方式可以为将双(2-羟乙基)二硫化物与Et3N溶于有机溶剂中得到反应底物，将双端卤素化合物溶于有机溶剂中作为滴加物，在冰水浴条件下，将所述滴加物滴加至反应底物中，滴加完毕后，常温下反应10～20h。其中，所述双端卤素异丁基化合物例如可以为溴代异丁基溴和/或氯代异丁基氯。
在所述PLA-ss-PHPMA-X的制备过程中，步骤S12中，所述HO-ss-iBuX与丙交酯的用量比优选为1:(0.02～0.06)。所述开环聚合的条件通常包括温度可以为110～130℃，时间可以为15～20h。所述催化剂优选为辛酸亚锡(Sn(Oct)2)。所述开环聚合反应在惰性气体的保护下进行。
在所述PLA-ss-PHPMA-X的制备过程中，步骤S13中，所述PLA-ss-iBuX与HPMA的摩尔比优选为1:(75～85)。所述ATRP聚合反应的条件通常包括温度可以为70～80℃，时间可以为30～40h。
在一种优选实施方式中，所述修饰有靶向多肽的聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺(PLA-ss-PHPMA-R3)按照以下方法制得：
S21、将具有氧化还原响应的两亲性聚合物聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺与叠氮化钠进行叠氮反应，得到叠氮化聚合物PLA-ss-PHPMA-N3；
S22、将4-戊炔酸与八肽在第一催化剂的存在下进行酰胺化反应得到炔基化八肽，之后将炔基化八肽与肿瘤靶向分子在第二催化剂的存在下进行酰胺化反应得到炔基化靶向多肽；
S23、PLA-ss-PHPMA-N3与炔基化靶向多肽进行CuAAC点击化学反应，即得修饰有靶向多肽的聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺。
在所述PLA-ss-PHPMA-R3的制备过程中，步骤S21中，所述具有氧化还原响应的两亲性聚合物聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺与叠氮化钠的摩尔比优选为1:(35～45)。所述叠氮反应的条件可以包括温度为55～65℃，时间为25～35h。
在所述PLA-ss-PHPMA-R3的制备过程中，步骤S22中，所述4-戊炔酸与八肽的摩尔比优选为(9～11):1。所述炔基化八肽与肿瘤靶向分子的摩尔比优选为(1.8～2.2):1。为了将步骤S22中两次酰胺化反应使用的催化剂进行区分，将使4-戊炔酸与八肽实现酰胺化反应的催化剂称为“第一催化剂”，将使炔基化八肽与肿瘤靶向分子实现酰胺化反应的催化剂称为“第二催化剂”。其中，所述第一催化剂和第二催化剂的种类和用量均可以为本领域的常规选择，对此本领域技术人员均能知悉，在此不作赘述。
在所述PLA-ss-PHPMA-R3的制备过程中，步骤S23中，所述PLA-ss-PHPMA-N3与炔基化靶向多肽的摩尔比优选为1:(1.1～1.3)。所述CuAAC点击化学反应的条件通常包括温度为40～50℃，时间为20～30h。
在一种优选实施方式中，当R为喜树碱时，反应基团为羟基，所述二聚体化疗药前药按照包括以下步骤的方法制得：将喜树碱依次与三光气和双(2-羟乙基)二硫化物进行取代反应得到喜树碱单羟乙基二硫化物，之后将所述喜树碱单羟乙基二硫化物与丁二酸酐进行开环反应得到CPT-ss-COOH，接着将CPT-ss-COOH与低分子量聚乳酸进行酯化反应得到基于喜树碱的二聚体化疗药前药(PLA-ss-CPT2)；或者，将喜树碱依次与三光气和双(2-羟乙基)二硫化物进行取代反应得到喜树碱单羟乙基二硫化物，之后将所述喜树碱单羟乙基二硫化物与双羧基封端的低分子量聚乳酸进行酯化反应得到基于喜树碱的二聚体化疗药前药(PLA-ss-CPT2)。
在一种优选实施方式中，当R为阿霉素时，反应基团为氨基，所述二聚体化疗药前药按照包括以下步骤的方法制得：将双(2-羟乙基)二硫化物与4-硝基苯基氯甲酸酯进行缩合反应得到NPC-ss-OH，再将NPC-ss-OH与阿霉素进行氨酯交换反应得到DOX-ss-OH，最后将DOX-ss-OH与双羧基封端的低分子量聚乳酸进行酯化反应得到基于阿霉素的二聚体化疗药前药(PLA-ss-DOX2)；或者，将双(2-羟乙基)二硫化物与4-硝基苯基氯甲酸酯进行缩合反应得到NPC-ss-OH，接着将NPC-ss-OH与丁二酸酐进行开环反应得到NPC-ss-COOH，接着将NPC-ss-COOH与低分子量聚乳酸进行酯化反应得到PLA-ss-NPC2，最后将PLA-ss-NPC2与阿霉素进行取代反应得到基于阿霉素的二聚体化疗药前药(PLA-ss-DOX2)。
在一种优选实施方式中，当R为紫杉醇时，反应基团为羟基，所述二聚体化疗药前药按照包括以下步骤的方法制得：将紫杉醇与4-硝基苯基氯甲酸酯进行缩合反应得到PTX-NPC，再将PTX-NPC与双(2-羟乙基)二硫化物进行酯交换反应得到PTX-ss-OH，接着将PTX-ss-OH与双羧基封端的低分子量聚乳酸进行酯化反应得到基于紫杉醇的二聚体化疗药前药(PLA-ss-PTX2)；或者，将紫杉醇与4-硝基苯基氯甲酸酯进行缩合反应得到PTX-NPC，再将PTX-NPC与双(2-羟乙基)二硫化物进行酯交换反应得到PTX-ss-OH，接着将PTX-ss-OH与丁二酸酐进行开环反应得到PTX-ss-COOH，最后将PTX-ss-COOH与低分子量聚乳酸进行酯化反应得到基于紫杉醇的二聚体化疗药前药(PLA-ss-PTX2)。
在一种优选实施方式中，所述有机溶剂为二甲基亚砜(DMF)和/或N,N-二甲基甲酰胺(DMSO)。
在一种优选实施方式中，所述水相为磷酸盐缓冲盐溶液。
本发明通过对化疗原药采用特定的方式进行化学修饰，如此能够在一定程度上改变其原有化学性质，成功实现多种前药被同时包封在同一纳米载体中，负载药物的载药率和包封率均很高，并且多种前药的比例可以是任意的，精确可调的，不同比例下所得多元载药纳米粒子具备相同的纳米属性(如尺寸、电荷、聚合物分散指数)，多元载药纳米粒子中药物之间比例维持与原始投料比例高度接近一致，在体外药物释放实验中，多种药物呈现步调一致的同步释放，从而为发挥多种药物协同抗癌奠定了基础。此外，在体外细胞实验中准确验证了多药联合使用所表现出的多药协同抑制细胞生长效果，同时在构建的小鼠皮下肿瘤模型中，多重载药纳米粒子体系依然表现出很好地抑制肿瘤生长的效果。多重药物递送体系为改善并提升临床上对单一疗法产生耐药性的恶性肿瘤治疗效果以及为癌症患者“量身”定做个性化治疗方案有一定价值和意义，具备临床进一步应用的潜能。
附图说明
图1为制备例1所得HO-ss-Br的核磁谱图。
图2为制备例1所得PLA-ss-iBuBr的核磁谱图。
图3为制备例1所得PLA-ss-PHPMA-Br的核磁谱图。
图4为制备例1所得PLA-ss-PHPMA-Br和制备例2所得PLA-ss-PHPMA-N3的红外谱图。
图5为制备例2所采用的(a)4-戊炔酸、(b)八肽GPLGIAGQ和(c)iRGD以及所得的(d)炔基化八肽和(e)炔基化iRGD的核磁谱图。
图6为制备例2所得炔基化GPLGIAGQ的质谱图。
图7为制备例2所得炔基化iRGD的质谱图。
图8为制备例2所得PLA-ss-PHPMA-iRGD的核磁谱图。
图9为制备例3所得HO-PLA-OH的核磁谱图。
图10为制备例3所得HOOC-PLA-COOH的核磁谱图。
图11为制备例4所得CPT-ss-OH的核磁谱图。
图12为制备例4所得CPT-ss-COOH的核磁谱图。
图13为制备例4所得CPT-ss-COOH的质谱图。
图14为制备例4所得PLA-ss-CPT2的核磁谱图。
图15为制备例5所得PTX-NPC的核磁谱图。
图16为制备例5所得PTX-ss-OH的核磁谱图。
图17为制备例5所得PTX-ss-OH的质谱图。
图18为制备例5所得PLA-ss-PTX2的核磁谱图。
图19为制备例6所得NPC-ss-OH的核磁谱图。
图20为制备例6所得DOX-ss-OH的核磁谱图。
图21为制备例6所得DOX-ss-OH的质谱图。
图22为制备例6所得PLA-ss-DOX2的核磁谱图。
图23为对比制备例1所得PLA-cc-CTA的核磁谱图。
图24为对比制备例1所得PLA-cc-PHPMA的核磁谱图。
图25为三药联合载药纳米粒子在响应不同谷胱甘肽浓度条件下CPT释放曲线图。
图26为三药联合载药纳米粒子在响应不同谷胱甘肽浓度条件下DOX释放曲线图。
图27为三药联合载药纳米粒子响应不同谷胱甘肽浓度条件下PTX释放曲线图。
图28为不同给药实验组与4T1细胞作用24h的MTT细胞生存曲线图。
图29为不同载药纳米粒子实验组与MCF-7/PTX细胞作用24h的MTT细胞生存曲线图。
图30为三重载药纳米载体对皮下4T1乳腺癌模型小鼠的联合协同抑廇曲线图。
图31为不同实验组小鼠相对体重变化曲线图。
具体实施方式
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
制备例1该制备例用于说明具有氧化还原响应的两亲性聚合物聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺(PLA-ss-PHPMA-X)的合成。
(1)小分子引发剂(HO-ss-iBuBr)合成
在氩气环境下，将(4.62g，30mmol)双(2-羟乙基)二硫化物(ss-DOH)、4mL Et3N和100mL新鲜除水的THF加入到反应瓶中，搅拌溶解；将Br-iBuBr(4.60g,20mmol)与40mL除水的THF加入至恒压滴液漏斗中，在冰水浴条件下，缓慢滴加至上述反应瓶中；滴加完毕后，常温反应16h；反应完毕后过滤除去反应不溶物，收集液相浓缩至一定体积，重新溶在二氯甲烷(DCM)中，饱和食盐水洗，收集有机相，无水Mg2SO4干燥12h，过滤旋蒸浓缩，柱层层析法(以乙酸乙酯:正己烷按照体积比3:7的混合物作为流动相)分离纯化，收集第二个点为目标产物点，旋蒸浓缩，放于45℃真空干燥12h，得到黄色液体(3.15g，产率52％)，记为HO-ss-iBuBr。该HO-ss-iBuBr的核磁谱图如图1所示。从图1可以看出，ss-DOH和Br-iBuBr实现了单端取代反应。
(2)大分子引发剂PLA-ss-iBuBr的合成
准确称取HO-ss-iBuBr(300mg,1mmol)和丙交酯(D,L-Lactide)(5.8g，0.04mol)并转移至干燥schlenk瓶中，抽真空充氮气，将体系置换为氩气，用注射器吸取新鲜除水的甲苯(2mL/g丙交酯)并注射至上述schlenk瓶中，将该schlenk瓶置于提前预热的120℃油浴中，搅拌溶解5min左右，按单体质量5％加入Sn(oct)2反应18h，之后通大气迅速冷却淬灭反应，接着往反应体系中加入少量二氯甲烷稀释，在过量无水甲醇中沉淀离心循环三次，收集固体干燥，得到大分子引发剂PLA-ss-iBuBr(4.8g，产率83％)。该大分子引发剂PLA-ss-iBuBr的核磁谱图如图2所示。从图2可以看出，HO-ss-iBuBr与丙交酯实现了开环聚合反应。
(3)具有氧化还原响应的两亲性聚合物聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺PLA-ss-PHPMA-Br的合成
取一干燥洁净的Schlenk瓶进行抽真空-充氩气三次，在氩气环境中依次加入准确称量好的N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺HPMA(230mg，4mmol)、PLA-ss-iBuBr(250mg，0.05mmol)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷Me4(10.8mg，0.0625mmol)、CuBr2(0.55mg，0.0025mmol)以及1mL无水DMSO溶剂，搅拌溶解，反应体系冷冻抽排循环三次，氩气环境下，称量好的CuBr(7.2mg，0.05mmol)快速加入，进行额外一次冷冻抽排循环后置于75℃油浴下反应36h。用液氮猝灭反应，选择MWCO3500渗析袋于去离子水中透析除铜盐，冻干得到目标聚合物PLA-ss-PHPMA-Br(700mg，产率70％)。其中，PLA-ss-PHPMA-Br的核磁谱图如图3所示。PLA-ss-PHPMA-Br的红外谱图如图4所示。从图3和图4可以看出，大分子引发剂PLA-ss-iBuBr成功引发N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺进行原子转移自由基聚合。该PLA-ss-PHPMA-Br具有通式(1-1)所示的结构，其中，m和n均为40，X为溴。
制备例2该制备例用于说明修饰有靶向多肽的聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺(PLA-ss-PHPMA-iRGD)的合成。
(1)叠氮化聚合物PLA-ss-PHPMA-N3的合成
取一干燥洁净的25mL单口瓶，加入称量好的聚合物PLA-SS-PHPMA-Br和NaN3(40倍聚合物摩尔比)以及6mL无水超干DMF中，搅拌至溶解后转移至60℃下反应30h。将反应液转移到渗析袋中透析2d，冷冻干燥得到白色目标产物PLA-ss-PHPMA-N3。PLA-ss-PHPMA-N3的红外谱图如图4所示。从图4可以看出，红外谱图在2095cm-1处出现N3 -特征吸收峰，成功实现聚合物端基由溴(-Br)到叠氮基(N3 -)的转化。
(2)炔基化iRGD的合成
GPLGIAGQ炔基化修饰：取一单口反应瓶，量取10mL超干DMF加入，准确称量4-戊炔酸(275mg，2.8mmol)和八肽GPLGIAGQ(200mg，0.28mmol)至上述溶剂中，反应装置避光搅拌溶解一段时间后，接着加入EDCI(107.3mg，0.56mmol)、HOBT(75.9mg，0.56mmol)以及TEA(340.5mg，3.36mmol)，反应体系在室温下搅拌反应36h，反应结束旋蒸浓缩于过量冰乙醚中沉淀，干燥得到褐色粉末为目标产物炔基化八肽(145mg，产率65％)。
炔基化iRGD的合成：取一带支口的干燥洁净的25mL单口瓶，抽真空充氩气置换为氩气环境，反应装置注意避光，依次加入准确称量好的炔基化八肽(100mg，0.126mmol)、HOBT(51mg，0.38mmol)和EDCI(72mg，0.38mmol)，移取3mL超干DMF加入搅拌溶解，领取一单口瓶将称量好的iRGD(239mg，0.252mmol)溶在2mL超干DMSO中，之后转移至上述反应液中，常温反应36h，旋蒸浓缩在过量冰乙醚中沉淀，粗产物通过RP-HPLC纯化，得到炔基化iRGD。
(3)修饰有靶标分子的聚合物(PLA-ss-PHPMA-iRGD)合成
PLA-ss-PHPMA-iRGD是通过炔基化iRGD和叠氮基封端的PLA-ss-PHPMA-N3之间的CuAAC点击化学合成。常规经典过程如下：将炔基化iRGD(100mg，0.06mmol炔基)、PDLLA-ss-PHPMA-N3(586mg，0.05mmol叠氮基)、抗坏血酸(8.81mg，0.05mmol)以及DMF(5mL)加入到25mL schlenk瓶中，在对体系进行冷冻抽排解冻循环三次之后，在氩气环境下添加CuSO4·5H2O(2.5mg，0.01mmol)，然后再进行额外一次冷冻-抽排-解冻循环再次对反应溶液脱气。将schlenk瓶在真空下密封，于45℃下在油浴中避光反应24小时，之后将反应冷却至室温并暴露于空气猝灭反应。将反应液转移至MWCO3500透析袋中于去离子水中渗析3d来纯化粗产物，冻干得到目标聚合物PLA-ss-PHPMA-iRGD。该PLA-ss-PHPMA-iRGD具有通式(2-1)所示的结构，其中，m和n均为40，R1为iRGD。
其中，(a)4-戊炔酸、(b)八肽GPLGIAGQ、(c)iRGD、(d)炔基化八肽和(e)炔基化iRGD的核磁谱图如图5所示。炔基化八肽和炔基化iRGD的质谱分别如图6和图7所示。PLA-ss-PHPMA-iRGD的核磁谱图如图8所示。从图5～图8可以看出，通过两次酰胺化反应成功合成得到了炔基化iRGD，并且最终目标产物PLA-ss-PHPMA-iRGD通过炔基化iRGD和叠氮基封端的PDLLA-ss-PHPMA-N3在抗坏血酸/CuSO4·5H2O经典体系下完成CuAAC点击化学合成。
制备例3该制备例用于说明寡聚(D,L-乳酸)-二醇(HO-PLA-OH)和寡聚(D,L-乳酸)-二羧酸(HOOC-PLA-COOH)的合成。
(1)寡聚(D,L-乳酸)-二醇(HO-PLA-OH)合成：
取在120℃烘箱干燥的schlenk瓶，进行抽真空充氩气循环三次，在氩气环境下准确称量D,L-丙交酯(5.8g,0.04mol)于反应瓶中，用玻璃注射器吸取10mL新鲜蒸馏的甲苯(11.6mL，2mL/g)下以及乙二醇(250mg，4mmol)加入，放置于120℃油浴中，搅拌待其溶解后，加入5％的Sn(Oct)2，于120℃油浴中反应48h，液氮猝灭反应，加入几滴二氯甲烷稀释反应液于异丙醇中沉淀离心3次，收集沉淀物于60℃干燥即为目标产物寡聚(D,L-乳酸)-二醇(HO-PLA-OH)(5.22g，产率89％)。该寡聚(D,L-乳酸)-二醇(HO-PLA-OH)的核磁谱图如图9所示。从图9可以看出，小分子乙二醇在经典的Sn(Oct)2催化下，成功引发消旋丙交酯(单体)开环聚合得到低分子量的聚乳酸。
(2)寡聚(D,L-乳酸)-二羧酸(HOOC-PLA-COOH)合成：
取在120℃烘箱干燥的反应瓶，进行抽真空充氩气循环三次，在氩气环境下依次加入OH-PLA-OH(2.0g，1.43mmol)、丁二酸酐(429mg，4.29mmol)、DMAP(180mg，1.48mmol)和三乙胺(297mg，2.94mmol)以及40mL除水二氯甲烷，常温反应24h。反应结束，反应液依次用饱和食盐水和去离子水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤旋蒸浓缩在过量异丙醇中沉淀离心，收集沉淀物于60℃下干燥即为目标产物寡聚(D,L-乳酸)-二羧酸(HOOC-PLA-COOH)(1.65g，产率72％)。该寡聚(D,L-乳酸)-二羧酸(HOOC-PLA-COOH)的核磁谱图如图10所示。从图10可以看出，双羟基(-OH)封端的寡聚(D,L-乳酸)成功变为双羧酸封端的寡聚(D,L-乳酸)。
制备例4该制备例用于说明基于喜树碱的二聚体化疗药前药(PLA-ss-CPT2)的合成。
(1)CPT-ss-OH合成
准确称量喜树碱CPT(1.0g，2.87mmol)和三光气(311.6mg，1.05mmol)于带支管的反应瓶中，整个装置时刻保持避光。对装置抽换气，在氩气气流下加入90mL无水DCM成为悬浮液，之后将DMAP/DCM(1.12g，9.18mmol)逐滴加入。常温搅拌反应3h后，将双(2-羟乙基)二硫化物(4.43g，28.7mmol)的无水THF(18mL)溶液通过滴液漏斗滴加至反应瓶，常温下反应24h。除去不溶物，收集液相去离子水洗涤，无水Na2SO4干燥。浓缩除去部分溶剂置于-20℃下结晶纯化，得到浅黄色粉末0.5g，产率为40％，整个反应过程时刻避光。将上述浅黄色粉末记为CPT-ss-OH，其核磁谱图如图11所示。从图11可以看出，成功合成带有二硫键的目标产物CPT-ss-OH。
(2)CPT-ss-COOH合成
取一干燥洁净的50mL带支口的单口瓶，进行抽真空充氩气置换为氩气环境，用注射器移取12mL无水DCM，用锡纸包裹整个反应装置注意避光，准确称量CPT-ss-OH(200mg，0.378mmol)加入，搅拌溶解后，依次加入计算好的丁二酸酐(151mg，1.51mmol)和DMAP(23mg，0.189mmol)，室温搅拌反应，随着反应进行，溶液会慢慢变得澄清透明，反应12h。反应溶液依次用饱和食盐水及去离子水洗涤，干燥有机相，浓缩干燥得到固体目标产物CPT-ss-COOH138mg，产率58％。该CPT-ss-COOH的核磁谱图和质谱分别如图12和13所示。从图12和图13可以看出，成功实现将羟基端(-OH)向羧基末端(-COOH)的转变。
(3)PLA-ss-CPT2合成
准确称量CPT-ss-COOH(0.22g，0.35mmol)、DMAP(30.6mg，0.25mmol)和EDCI(77mg，0.4mmol)加入预装有适量除水DCM的反应瓶中，整个反应装置体系保持避光，常温下搅拌3h后，将HO-PLA-OH(0.15g，0.1mmol)加入至反应瓶中。同时反应2h后要补加EDCI(48mg，0.25mmol)和DMAP(15mg，0.12mmol)，补加2次，在室温下避光反应2d。反应结束后，将反应液采用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤浓缩反应液利用柱层析色谱法(展开剂：CH3OH:CH2Cl2(体积比)＝6:98～10:100)分离纯化粗产物，旋蒸浓缩真空干燥得到最终粉末即为产物PLA-ss-CPT2(170mg，产率45％)。该PLA-ss-CPT2的核磁谱图如图14所示。从图14可以看出，成功通过酯化反应在寡聚乳酸两端键合上化疗药喜树碱CPT。
制备例5该制备例用于说明基于紫杉醇的二聚体化疗药前药(PLA-ss-PTX2)的合成。
(1)PTX-NPC的合成
准确称量紫杉醇(PTX)(1.0g，1.17mmol)和对硝基苯基氯甲酸酯(0.3g，1.5mmol)于预装有10mL除水DCM的干燥单口反应瓶中，同时移液枪移取N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(227mg，1.75mmol)加入搅拌溶解后于45℃下回流反应24h。反应结束后，反应液用饱和食盐水以及超纯水洗涤，无水Na2SO4干燥。粗产物通过硅胶柱层析法以正己烷:乙酸乙酯按照体积比1:1作为流动相分离纯化，得到白色固体即为PTX-NPC(656mg，产率55％)。该PTX-NPC的核磁谱图如图15所示。从图15可以看出，通过取代反应成功合成得到PTX-NPC。
(2)PTX-ss-OH的合成
准确称量PTX-NPC(110mg，0.11mmol)和DMAP(17mg，0.14mmol)于预装有3mL除水DCM的干燥单口反应瓶中，同时移液枪移取2-羟乙基二硫化物(83mg，0.54mmol)溶于除水THF后加入上述反应液搅拌溶解，之后在45℃温度下回流反应6h。反应结束后，反应液用饱和食盐水以及超纯水洗涤，无水Na2SO4干燥。粗产物通过硅胶柱层析法以正己烷:乙酸乙酯(体积比)＝3:2.5～1:2作为流动相梯度洗脱分离纯化，得到白色固体即为PTX-ss-OH(39mg，产率35％)。该PTX-ss-OH的核磁谱图和质谱分别如图16和图17所示。从图16和图17可以看出，成功合成带有二硫键的目标产物PTX-ss-OH。
(3)PLA-ss-PTX2合成
准确称量HOOC-PLA-COOH(200mg,0.125mmol)加入提前预装有20mL无水DCM的单口瓶中，按顺序加入称量好的DMAP(30.6mg，0.25mmol)、EDCI(95.7mg，0.50mmol)，常温搅拌活化羧基4h左右，将称量好的PTX-ss-OH(516mg，0.5mmol)稀释于无水DCM中加入上述反应液，在25℃避光条件下反应12h后，补加少量EDC·HCl(48mg，0.25mmol)和DMAP(15mg，0.12mmol)至反应液中，继续反应24h。将反应液去离子水洗涤，干燥浓缩，利用柱层析法(CH3OH:CHCl2(体积比)＝1:40～1:15)分离纯化，得到双端接有PTX的前药PLA-ss-PTX2，产率40％。该PLA-ss-PTX2核磁谱图如图18所示。从图18可以看出，成功通过酯化反应在寡聚乳酸两端键合上化疗药紫杉醇PTX。
制备例6该制备例用于说明基于阿霉素的二聚体化疗药前药(PLA-ss-DOX2)的合成。
(1)NPC-ss-OH合成
取一干燥反应瓶，将称量好的双(2-羟乙基)二硫化物(10g，64.8mmol)和三乙胺(9mL，64.8mmol)以及无水THF加入，搅拌溶解30min；另称取4-硝基苯基氯甲酸酯(NPC)(6g，29.2mmol)溶于新鲜除水的四氢呋喃中，在冰水浴条件下缓慢滴加至上述反应液，随后室温下反应8h。过滤除去反应液中的白色沉淀，并将滤液通过旋转蒸发浓缩。然后，向浓缩的溶液中加入70mL CH2Cl2，饱和食盐水(3×60mL)洗涤，之后采用无水硫酸镁干燥有机相8h，过滤浓缩反应液，接着以正己烷/乙酸乙酯按体积比1:2所得混合溶剂作为洗脱剂通过柱色谱法分离纯化粗产物，得到油状目标产物NPC-ss-OH(4.27g，产率55％)。该NPC-ss-OH的核磁谱图如图19所示。从图19可以看出，成功引入二硫键(-s-s-)合成得到单端的目标产物NPC-ss-OH。
(2)DOX-ss-OH合成
取一洁净干燥的50mL圆底三口瓶，连接恒压滴液漏斗，在氩气环境下，准确量取DOX·HCl(580mg，1.0mmol)加入至提前预装有无水DMF(8mL)和TEA(809mg，8mmol)的三口瓶中搅拌一段时间。接着将NPC-ss-OH(383mg，1.2mmol)加到上述溶液中，避光条件下于25℃反应24小时。然后将反应液过滤旋蒸浓缩后，加入40mL无水DCM稀释，依次用饱和食盐水和水洗，无水Na2SO4干燥，将粗产物通过硅胶柱层析色谱法分离纯化，以CH2Cl2/CH3OH(体积比1:25～1:15)作为洗脱剂梯度洗脱，得到产物DOX-ss-OH(72mg，产率10％)。该DOX-ss-OH的核磁谱图和质谱分别如图20和图21所示。从图20可以看出，可以发现在4.5、4.0以及2.55-3.0ppm出现新的信号峰，而DOX其余氢信号均得以保留，确认为目标产物DOX-ss-OH成功合成。从图21可以看出，质谱上出现746.17分子离子峰对应为[M+H]+，这就表明成功得到目标产物DOX-ss-OH。
(3)PLA-ss-DOX2合成：
将HOOC-PLA-COOH(160mg，0.1mmol)溶于预装有10mL无水DCM的反应瓶中，接着加入EDCI(57mg，0.3mmol)和DMAP(33.4mg，0.273mmol)，室温下活化4h，将DOX-ss-OH(362mg，0.5mmol)溶于5mL无水DCM中转移到恒压滴液管中，滴加至上述溶液中。同时反应4h后要补加EDCI(19mg，0.1mmol)和DMAP(16.7mg，0.14mmol)，室温避光条件下反应2d。反应结束后，将反应液用去离子水洗，无水硫酸钠干燥，粗产物利用柱层析以二氯甲烷和甲醇作为流动相(CH2Cl2:CH3OH(体积比)＝10:1～25:1)梯度洗脱分离纯化，浓缩得到目标产物PLA-ss-DOX2(134mg，产率62％)。该PLA-ss-DOX2的核磁谱图如图22所示。从图22可以看出，成功通过酯化反应在寡聚乳酸两端键合上化疗药阿霉素DOX。
对比制备例1该对比制备例用于说明无氧化还原响应性两亲性聚合物(PLA-cc-PHPMA)的合成。
(1)大分子引发剂PLA-cc-CTA的合成
取在120℃烘箱干燥的schlenk瓶，进行抽真空充氩气循环三次，在氩气环境下准确称量D,L-丙交酯(4.94g，0.034mol)于反应瓶中，用玻璃注射器吸取6mL新鲜蒸馏的甲苯(2ml/g丙交酯)下以及CTA-OH(300mg，0.77mmol)加入，放置于预先升温到120℃油浴中，搅拌待其溶解后，加入5％的Sn(Oct)2，于120℃油浴中反应40h，液氮猝灭反应，加入几滴二氯甲烷稀释反应液于过量甲醇中沉淀离心3次，收集沉淀物通风处放置一晚，置于60℃干燥，收集即为产物PLA-cc-CTA(3.5g，产率85％)。PLA-cc-CTA的核磁谱图见图23。从图23可以看出，CTA-OH与消旋丙交酯实现了开环聚合反应。
(2)无氧化还原响应性两亲性聚合物(PLA-cc-PHPMA)合成
取在120℃烘箱干燥的schlenk瓶，进行抽真空充氩气循环三次，在氩气环境下依次加入称量好的CTA-PLA(300mg，0.0625mmol)、HPMA(408mg，2.85mmol)以及少量的V501，并注入1.5mL超干DMSO，搅拌使其溶解，在对体系进行冷冻抽排解冻循环三次之后，置于70℃下在油浴中反应24小时，反应结束后，将反应液转移至MW3500透析袋中于去离子水中每8h更换一次水透析3d，冻干得到白色聚合物即为目标产物PLA-cc-PHPMA(400mg，70％)。PLA-cc-PHPMA的核磁谱图见图24。从图24可以看出，大分子引发剂PLA-cc-CTA成功引发N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺进行可逆加成-断裂链转移聚合反应。
实施例1该实施例用于说明抗肿瘤多元载药体系的制备。
基于微流控技术载药纳米体系的制备：准确称取聚合物(由制备例1所得具有氧化还原响应的两亲性聚合物聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺(PLA-ss-PHPMA-Br)或由制备例2所得修饰有靶向多肽的聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺(PLA-ss-PHPMA-iRGD))、由制备例4所得基于喜树碱的二聚体化疗药前药(PLA-ss-CPT2)、由制备例5所得基于紫杉醇的二聚体化疗药前药(PLA-ss-PTX2)、由制备例6所得基于阿霉素的二聚体化疗药前药(PLA-ss-DOX2)，PLA-ss-PHPMA-Br和PLA-ss-PHPMA-iRGD的总用量均为10mg，PLA-ss-CPT2、PLA-ss-PTX2和PLA-ss-DOX2的总用量为2mg，将以上物质共溶于一定体积的DMSO中得到有机相，将该有机相和十倍体积的PBS注入微混合器中，总流速为8mL/min，流速配比为5:1(聚合物混合物流速为2mL/min，PBS流速为10mL/min)。组装完毕，继续搅拌一段时间后，将纳米粒子转移至MWCO8000-14000透析袋中，在PBS中透析过夜以去除有机溶剂，然后用超滤离心管将纳米粒子浓缩到一定浓度即为抗肿瘤多元载药体系，待用。该抗肿瘤多元载药体系中各原料药的用量以及抗肿瘤多元载药体系的载药率(LC)、包封率(EE)、D/P/C摩尔比、直径和zeta电位见表1。表1中，所采用的聚合物全部为PLA-ss-PHPMA-Br，载药率(LC)和包封率(EE)通过高效液相色谱(HPLC)和紫外可见分光光度计测定并计算得到，EE(％)＝(负载药物的质量)/(初始添加药物的质量)×100％，LC(％)＝(负载药物的质量)/(载药纳米粒子总质量)×100％，其中，负载药物中CPT和PTX的含量通过HPLC监测，而负载药物中DOX含量通过紫外可见分光光度计监测，下同。
表1 负载不同前药组合的纳米粒子表征
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注：表1中，P-DOX代表前药为PLA-ss-DOX2；P-PTX代表前药为PLA-ss-PTX2；P-CPT代表前药为PLA-ss-CPT2；a)LC代表载药量；b)EE代表包封率；c)D/P/C代表负载药物中DOX、PTX和CPT摩尔比；d)纳米粒子粒径和zeta电位通过动态光散射测试得到；e)数字代表PLA-ss-DOX2、PLA-ss-PTX2以及PLA-ss-CPT2三种前药用量的摩尔比。
从表1可以看出，本发明通过对化疗原药采用特定的方式进行化学修饰，能够实现多种前药被同时包封在同一纳米载体中，负载药物的载药率和包封率均很高，并且多种前药的比例可以是任意的，精确可调的，多元载药纳米粒子中药物之间比例维持与原始投料比例高度一致，当多种前药按照不同比例进行包封时，所得抗肿瘤多元载药体系的直径和zeta电位均极为接近，从而为发挥多种药物协同抗癌奠定了基础。
对比例1该对比例用于说明抗肿瘤游离药物体系的制备。
按照实施例1的方法制备抗肿瘤游离药物体系，不同的是，将由制备例4所得基于喜树碱的二聚体化疗药前药(PLA-ss-CPT2)采用游离前药CPT替代，将由制备例5所得基于紫杉醇的二聚体化疗药前药(PLA-ss-PTX2)采用游离前药PTX替代，由制备例6所得基于阿霉素的二聚体化疗药前药(PLA-ss-DOX2)采用游离前药DOX替代，且所采用的聚合物均为PLA-ss-PHPMA-Br，游离前药CPT、PTX和DOX的总用量为2mg，其余条件与实施例1相同，得到抗肿瘤游离药体系。该抗肿瘤游离药体系中各原料药的用量以及抗肿瘤游离药体系的载药率(LC)、包封率(EE)、D/P/C摩尔比、直径和zeta电位见表2。
表2 负载不同游离药组合的纳米粒子表征
注：表2中，DOX NPs代表前药为游离化疗药DOX；PTX NPs代表前药为游离化疗药PTX；CPT NPs代表前药为游离化疗药CPT；a)LC代表载药量；b)EE代表包封率；c)D/P/C代表游离药物中DOX、PTX和CPT摩尔比；d)纳米粒子粒径和zeta电位通过动态光散射测试得到；e)数字代表三种游离化疗药DOX、PTX以及CPT用量的摩尔比。
从表2可以看出，当未对化疗原药采用本发明的方法进行化学修饰时，无法实现有效包封，并且不同药物无法实现精确负载，多元载药纳米粒子中药物之间比例维持与原始投料比例相差悬殊，当多种前药按照不同比例进行包封时所得抗肿瘤多元载药体系的直径和zeta电位的差异也较大。
此外，由于三种化疗药本身的物理化学性质差异性较大，直接将三种游离药物包封在同一聚合物中所制备的载药纳米粒子，其药物比例与原始药物比例相比已经发生了改变，并且不同药物组合的纳米粒子其粒径和电位也表现出差异性较大的特点，这为后续进行体内一系列试验带来很大不确定性。从表1和表2可以看出，本发明通过合理地化学修饰将游离药转变为相应前药，通过将三种前药包封在同一聚合物中所制备的载药纳米粒子，结果表明，不同药物组合的载药纳米粒子能够使负载的药物比例保持与原始药物比例一致，不会改变初始药物之间的比例，这对后续探究药物之间最佳比例以及维持药物最佳比例达到作用部位至关重要。同时，不同药物组合的载药纳米粒子具有相似的纳米属性，即纳米粒子粒径和电位大小接近，即改变药物组合及其比例不会使纳米粒子特征变化，具有优良的规整性和工程化特点。
对比例2该对比例用于说明参比抗肿瘤多元载药体系的制备。
按照实施例1的方法制备抗肿瘤多元载药体系，不同的是，将由制备例1所得具有氧化还原响应的两亲性聚合物聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺(PLA-ss-PHPMA-Br)采用由对比制备例1所得不具有氧化还原响应的两亲性聚合物聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺(PLA-cc-PHPMA)替代，且DOX:PTX:CPT用量的摩尔比为2:1:2，其余条件与实施例1相同，得到参比抗肿瘤多元载药体系。该参比抗肿瘤多元载药体系中CPT的含量为1.2wt％，DOX的含量为3.7wt％，PTX的含量为1.4wt％。该抗肿瘤多元载药体系的载药率为24％，包封率为92.5％。
测试例
(1)药物体外释放：
采用渗析法研究了在不同GSH浓度(0mM和10mM)下，载药纳米粒子(实施例1所得抗肿瘤多元载药体系，其中，DOX:PTX:CPT(摩尔比)＝2:1:2)在20mL PBS缓冲液(pH 7.4，0.01M)中的药物释放行为。具体操作步骤如下：将负载有前药的3mL的纳米粒子溶液于MWCO14000渗析袋中置于30mL含有GSH的PBS缓冲液(pH 7.4，0.01M)(吐温80体积浓度0.5％)中，离心管用锡纸包裹，进行避光处理，放入37℃、100r/min恒温摇床中培养，按照设定好的时间点(每8h取样一次)从离心管中取一定体积的溶液，过0.45μm滤膜后进行HPLC和紫外-可见光监测，同时补充等体积的新鲜缓冲液以维持透析袋外总体积保持不变。其中释放至透析袋外的CPT和PTX的含量通过HPLC监测，而DOX含量通过紫外可见分光光度计监测，每组实验均设定三组平行实验。三药联合载药纳米粒子在响应不同谷胱甘肽浓度(0mM和10mM)条件下CPT释放曲线、DOX释放曲线和PTX释放曲线分别如图25、图26和图27所示。从图25～图27可以看出，在0mM GSH下，三种游离药释放总量均很低几乎在10％以下，这说明药物在整个循环体系中单纯靠扩散泄漏损失很低，这也是在血液循环中不会产生毒副作用的保障；在10mM GSH(多种癌细胞内GSH的浓度)下，CPT、DOX和PTX在64h内释放量分别为88.8％±5.1％、85.9％±5.0％和90.9％±5.0％，同时三种药物在整个释放过程最大程度维持了三种药物比例，其释放几乎是同步进行(即药物之间比例最大程度的维持了初始比例)。
(2)MTT细胞毒性实验：
将生长状态良好处于对数期的小鼠乳腺癌细胞(4T1)或者耐药性细胞(MCF-7/PTX)以5000个/孔的细胞密度加入至96孔板中，弃用孔板外圈孔，改加PBS。待观察细胞已经贴壁生长，长满整个培养皿的70％左右，吸走旧培养基，加入100μL稀释好的负载三种前药的纳米粒子实验组溶液，浓度梯度依次为100μM、64μM、32μM、16μM、8μM、4μM、2μM、1μM、0.5μM，每个浓度均设3个平行组，将加完药的孔板快速放入培养箱中培养48h。一段时间后，96孔板替换为每孔加入10μL MTT溶液和90μL培养基，继续孵育4h。之后每孔加入100微升Formazan溶解液，适当混匀，在细胞培养箱内再继续孵育待formazan全部溶解。最后在570nm处测定吸光度，计算细胞存活率，利用公式(1)计算细胞相对存活率：
细胞相对存活率(％)＝(Ax-A0)/(Ac-A0)×100％…………………………(1)
其中Ax、A0以及Ac分别为实验组、调零组以及阴性对照组的吸光度值。
不同给药实验组与4T1细胞作用24h的MTT细胞生存曲线如图28所示，其中，CPT组代表游离化疗药喜树碱(Camptothecin，CPT)，PTX组代表使用游离化疗药紫杉醇(Paclitaxel，PTX)，DOX组代表游离化疗药阿霉素(Doxorubicin，DOX)，2:1:1代表三种游离药摩尔比DOX:PTX:CPT＝2:1:1，2:1:2代表三种游离药摩尔比DOX:PTX:CPT＝2:1:2，cNPs组代表非二硫键的多元载药体系由是PLA-cc-PHPMA-Br与PLA-ss-CPT2、PLA-ss-PTX2以及PLA-ss-DOX2(2:1:2)制备的多元载药体系；载药sNPs组代表PLA-ss-PHPMA-Br与PLA-ss-CPT2、PLA-ss-PTX2以及PLA-ss-DOX2(摩尔比2:1:2)制备的多元载药体系；载药isNPs组代表修饰有靶向多肽的聚乳酸-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰PLA-ss-PHPMA-iRGD与PLA-ss-CPT2、PLA-ss-PTX2以及PLA-ss-DOX2(摩尔比2:1:2)制备的多元载药体系。从图28可以看出三种游离药物2:1:1以及2:1:2的IC50值相比于三种单前药明显降低，CI为0.606和0.465均低于1，表现出协同效果，说明在4T1肿瘤细胞中三药联合使用表现出对细胞更强的细胞毒性。
不同载药纳米粒子实验组与MCF-7/PTX细胞作用24h的MTT细胞生存曲线如图29所示，其中，2-1-1isNPs代表以PLA-ss-PHPMA-iRGD作为载体负载摩尔比为2:1:1的三种二聚体化疗药前药PLA-ss-CPT2、PLA-ss-PTX2和PLA-ss-DOX2所得抗肿瘤多元载药体系，2-1-2isNPs代表以PLA-ss-PHPMA-iRGD作为载体负载摩尔比为2:1:2的三种二聚体化疗药前药PLA-ss-CPT2、PLA-ss-PTX2和PLA-ss-DOX2所得抗肿瘤多元载药体系，pDOX isNPs代表以PLA-ss-PHPMA-iRGD作为载体负载二聚体化疗药前药PLA-ss-DOX2所得抗肿瘤多元载药体系，pPTX isNPs代表以PLA-ss-PHPMA-iRGD作为载体负载二聚体化疗药前药PLA-ss-PTX2所得抗肿瘤多元载药体系，pCPT isNPs代表以PLA-ss-PHPMA-iRGD作为载体负载二聚体化疗药前药PLA-ss-CPT2所得抗肿瘤多元载药体系。从图29可以看出，当三种前药分别以2:1:1和2:1:2摩尔比例进行负载，其半数致死量(IC50)值远远低于单独负载三种前药的纳米粒子的半数致死量(IC50)，其联合治疗指数(CI)分别为0.4385和0.3167，均小于1，表明三药之间表现为很好地协同效应，进一步说明三种药物的联合使用确实相比于单独药物的抑制肿瘤细胞生长效果有显著提升。
(3)抑廇实验：
将模型构建好的皮下乳腺癌模型小鼠分为7组(5只/组)，设计实验组分别为：Saline组、游离PTX组、游离CPT组、游离DOX组、游离药组合(DOX:PTX:CPT＝2:1:2，n/n/n)组、载药cNPs组、载药sNPs组、载药isNPs组，通过尾静脉注射给药，药物总浓度为5mg/kg，100μL/只，每隔2天给一次药，给药5次。
每天量取并记录肿瘤的长(L)和宽(W)，以及称量记录小鼠体重，小鼠肿瘤体积按公式(2)计算：
Vn＝1/2LW2……………………………………(2)
其中Vn为第n天肿瘤体积。
相对肿瘤体积比按公式(3)计算：
A＝Vn/V0………………………………………(3)
其中Vn为第n天肿瘤体积，V0为起始给药小鼠肿瘤体积。
三重载药纳米载体对皮下4T1乳腺癌模型小鼠的联合协同抑廇曲线如图30所示。不同实验组小鼠相对体重变化曲线如图31所示。图30和图31中，saline组代表生理盐水组；CPT组代表游离的化疗药喜树碱(Camptothecin，CPT)，PTX组代表游离的化疗药紫杉醇(Paclitaxel，PTX)，DOX组代表游离的化疗药阿霉素(Doxorubicin，DOX)，2:1:2代表三种游离药摩尔比DOX:PTX:CPT＝2:1:2，cNPs组代表以PLA-cc-PHPMA-Br作为载体负载摩尔比为2:1:2的三种二聚体化疗药前药PLA-ss-CPT2、PLA-ss-PTX2和PLA-ss-DOX2所得抗肿瘤多元载药体系；sNPs组代表以PLA-ss-PHPMA-Br作为载体负载摩尔比为2:1:2的三种二聚体化疗药前药PLA-ss-CPT2、PLA-ss-PTX2和PLA-ss-DOX2所得抗肿瘤多元载药体系；isNPs组代表以PLA-ss-PHPMA-iRGD作为载体负载摩尔比为2:1:2的三种二聚体化疗药前药PLA-ss-CPT2、PLA-ss-PTX2和PLA-ss-DOX2所得抗肿瘤多元载药体系。从图30可以看出，相比于其他实验组，sNPs组和isNPs抑廇效果最好，肿瘤抑制效果分别达到72％和89％，抑廇效率最为突出。从图31可以看出，除了游离的DOX组在15d实验结束，体重下降至原始体重的0.95左右外，其他小组小鼠体重均没有出现体重下降现象，一方面说明三种药物联合使用在剂量一致的前提下，某种程度上是减轻了使用单独一种药物所引发的动物毒性以及基于纳米载体的给药体系同时避免了所负载药物的全身性毒性。
实验结束后对Saline组、游离药组合(DOX:PTX:CPT＝2:1:2，n/n/n)和载药isNPs组的小鼠进行血液生化测试，所得结果见表1。从表1可以看出，与Saline相比，游离药物212组使ALT和UREA水平偏离出正常范围，这正是对肝肾造成损伤所展现出来的引起分泌物异常的结果，而载药纳米粒子组在ALT、AST、ALP、UREA、CREA五个指标上均没有表现出差异，说明不会对肝肾造成任何毒副作用，进一步说明基于纳米载药的药物递送体系的生物安全性。
表1 不同实验组血液生化指标试验
项目(单位) Saline组 212 isNPs
ALT(U/L) 45.94±1.434 41.66±3.296 46.88±3.778
AST(U/L) 75.83±5.163 77.07±3.561 73.88±4.864
ALP(U/L) 230.9±32.83 223.5±38.26 223.8±38.87
UREA(mg/dL) 19.96±0.4830 23.13±2.94 19.65±2.193
CREA(μmol/L) 14.33±0.6395 13.89±3.374 15.43±3.561
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (8)

1.一种抗肿瘤多元载药体系，其特征在于，所述抗肿瘤多元载药体系为将聚合物与至少两种二聚体化疗药前药经自组装得到；所述聚合物为具有氧化还原响应的两亲性聚合物聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺和/或修饰有靶向多肽的聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺；
所述具有氧化还原响应的两亲性聚合物聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺具有通式(1-1)所示的结构：
通式(1-1)中，m为10～400的整数，n为10～200的整数，X为卤素；
所述修饰有靶向多肽的聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺具有通式(2-1)所示的结构：
通式(2-1)中，m为10～400的整数，n为10～200的整数，R1为iRGD；
所述二聚体化疗药前药具有通式(3-1)所示的结构：
通式(3-1)，x为5～200的整数，y为0～200的整数，R为抗癌化疗药源；所述抗癌化疗药源中对应的抗癌化疗药为喜树碱、阿霉素、紫杉醇、表阿霉素、顺铂、长春碱、长春新碱、多西他赛或吉西他滨。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤多元载药体系，其特征在于，所述抗肿瘤多元载药体系中同时含有基于喜树碱的二聚体化疗药前药、基于阿霉素的二聚体化疗药前药和基于紫杉醇的二聚体化疗药前药。
3.根据权利要求1所述的抗肿瘤多元载药体系，其特征在于，所述抗肿瘤多元载药体系的载药量为20～30％，包封率为94％以上，直径为90～100nm，zeta电位为-15mV～-20mV。
4.权利要求1～3中任意一项所述的抗肿瘤多元载药体系的制备方法，其特征在于，该方法包括：在避光条件下，将具有氧化还原响应的两亲性聚合物聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺和/或修饰有靶向多肽的聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺与至少两种二聚体化疗药前药溶于有机溶剂中得到有机相，将所述有机相利用微流控混合器与水相进行混合，基于微流控技术的纳米沉淀方法组装得到抗肿瘤多元载药体系。
5.根据权利要求4所述的抗肿瘤多元载药体系的制备方法，其特征在于，所述具有氧化还原响应的两亲性聚合物聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺按照以下方法制得：
S11、以双(2-羟乙基)二硫化物和双端卤素异丁基化合物作为起始反应产物进行单端取代反应，得到HO-ss-iBuX；
S12、在催化剂的存在下，采用HO-ss-iBuX引发消旋丙交酯进行开环聚合反应，得到大分子引发剂PLA-ss-iBuX；
S13、采用大分子引发剂PLA-ss-iBuX引发N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺进行ATRP聚合反应，即得具有氧化还原响应的两亲性聚合物聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺。
6.根据权利要求4所述的抗肿瘤多元载药体系的制备方法，其特征在于，所述修饰有靶向多肽的聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺按照以下方法制得：
S21、将具有氧化还原响应的两亲性聚合物聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺与叠氮化钠进行叠氮反应，得到叠氮化聚合物PLA-ss-PHPMA-N3；
S22、将4-戊炔酸与八肽在第一催化剂的存在下进行酰胺化反应得到炔基化八肽，之后将炔基化八肽与肿瘤靶向分子在第二催化剂的存在下进行酰胺化反应得到炔基化靶向多肽；
S23、PLA-ss-PHPMA-N3与炔基化靶向多肽进行CuAAC点击化学反应，即得修饰有靶向多肽的聚酯-嵌-聚N-(2-羟基)丙基甲基丙烯酰胺。
7.根据权利要求4所述的抗肿瘤多元载药体系的制备方法，其特征在于，
(1)当R为喜树碱时，反应基团为羟基，所述二聚体化疗药前药按照包括以下步骤的方法制得：将喜树碱依次与三光气和双(2-羟乙基)二硫化物进行取代反应得到喜树碱单羟乙基二硫化物，之后将所述喜树碱单羟乙基二硫化物与丁二酸酐进行开环反应得到CPT-ss-COOH，接着将CPT-ss-COOH与低分子量聚乳酸进行酯化反应得到基于喜树碱的二聚体化疗药前药；或者，将喜树碱依次与三光气和双(2-羟乙基)二硫化物进行取代反应得到喜树碱单羟乙基二硫化物，之后将所述喜树碱单羟乙基二硫化物与双羧基封端的低分子量聚乳酸进行酯化反应得到基于喜树碱的二聚体化疗药前药；
(2)当R为阿霉素时，反应基团为氨基，所述二聚体化疗药前药按照包括以下步骤的方法制得：将双(2-羟乙基)二硫化物与4-硝基苯基氯甲酸酯进行缩合反应得到NPC-ss-OH，再将NPC-ss-OH与阿霉素进行氨酯交换反应得到DOX-ss-OH，最后将DOX-ss-OH与双羧基封端的低分子量聚乳酸进行酯化反应得到基于阿霉素的二聚体化疗药前药；或者，将双(2-羟乙基)二硫化物与4-硝基苯基氯甲酸酯进行缩合反应得到NPC-ss-OH，接着将NPC-ss-OH与丁二酸酐进行开环反应得到NPC-ss-COOH，接着将NPC-ss-COOH与低分子量聚乳酸进行酯化反应得到PLA-ss-NPC2，最后将PLA-ss-NPC2与阿霉素进行取代反应得到基于阿霉素的二聚体化疗药前药；
(3)当R为紫杉醇时，反应基团为羟基，所述二聚体化疗药前药按照包括以下步骤的方法制得：将紫杉醇与4-硝基苯基氯甲酸酯进行缩合反应得到PTX-NPC，再将PTX-NPC与双(2-羟乙基)二硫化物进行酯交换反应得到PTX-ss-OH，接着将PTX-ss-OH与双羧基封端的低分子量聚乳酸进行酯化反应得到基于紫杉醇的二聚体化疗药前药；或者，将紫杉醇与4-硝基苯基氯甲酸酯进行缩合反应得到PTX-NPC，再将PTX-NPC与双(2-羟乙基)二硫化物进行酯交换反应得到PTX-ss-OH，接着将PTX-ss-OH与丁二酸酐进行开环反应得到PTX-ss-COOH，最后将PTX-ss-COOH与低分子量聚乳酸进行酯化反应得到基于紫杉醇的二聚体化疗药前药。
8.根据权利要求4所述的抗肿瘤多元载药体系的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为二甲基亚砜和/或N,N-二甲基甲酰胺；所述水相为磷酸盐缓冲盐溶液。
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