CN113264906A - 多西他赛二聚体小分子前药及其自组装纳米粒的构建 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物制剂新辅料和新剂型领域，涉及多西他赛二聚体小分子前药及其自组装纳米粒的构建，以及其在药物递送中的应用。本发明所述的具有氧化还原双敏感的多西他赛二聚体前药，是以多西他赛作为模拟药物，分别通过(a)2,2'‑二硒代二乙酸、(b)2,2'‑二硫代二乙酸、(c)己二酸相连合成前药。并将该多西他赛二聚体前药，制备前药自组装纳米粒，探讨不同化学桥连对前药自组装纳米粒的稳定性、药物释放、细胞毒性、药动学、组织分布以及药效学产生的影响。试验结果表明，本发明的多西他赛二聚体小分子前药或其药物组合物或其小分子前药自组装纳米粒可以用于制备肿瘤微环境智能响应型药物传递系统，从而提高药物的抗肿瘤作用。

Description

多西他赛二聚体小分子前药及其自组装纳米粒的构建
技术领域
本发明属于药物制剂新辅料和新剂型领域，包括多西他赛二聚体小分子前药及其自组装纳米粒的构建，以及其在药物递送中的应用。
背景技术
癌症已成为危害人类健康与生命的大敌,近10多年来，我国的恶性肿瘤发病率每年保持约3.9％的增幅，死亡率每年保持约2.5％的增幅。化疗是目前治疗癌症最有效的手段之一，和手术、放疗一起并称癌症的三大治疗手段。但是现阶段化疗存在着递送效率低和靶向性差的问题，导致化疗临床效果不佳且毒副作用严重。例如，多西他赛(Docetaxel,DTX)在临床上被广泛用于治疗非小细胞肺癌和乳腺癌等。但是，由于多西他赛临床上递送效率低，会引起严重的毒副作用如体液潴留、骨髓抑制和过敏反应等。另外，由于多西他赛的水溶性低，为满足临床用药要求，多西他赛溶液剂泰索帝(Taxotere)使用吐温-80增溶，乙醇助溶，会引起严重的辅料相关的毒副作用。泰索帝还存在稳定性差的问题，制剂需现用现配，且需要在6小时之内使用。这些问题极大地限制了其在临床上的应用。因此，设计出高效低毒的药物递送系统在化疗药物递送中非常关键。
现已有许多提高药物递送效率的策略，如前体药物策略和纳米给药系统。前药策略可以有效改善化疗药物的不良性质，包括溶解度低，稳定性差，毒副作用大等。纳米给药系统可以显著改善药物的药动学性质，延长化疗药物的体内循环时间，提高药物在肿瘤部位的蓄积。然而，前药在体内易被消除，而传统的纳米给药系统存在载药量低、稳定性差的问题和辅料相关的毒性。结合这两种策略，发展出了小分子前药自组装纳米药物递送系统。由于小分子前药既作为药物载体又可释放出活性母药，小分子前药自组装纳米药物递送系统展现出了超高载药量和低辅料相关毒性的优点，已成为近几年化疗药物递送研究的热点。
小分子前药自组装纳米药物递送系统通常用碳链或者脂肪酸链修饰药物，以引入“结构缺陷”来平衡组装时的分子间作用力。这种前药自组装纳米粒的载药量可达30％-50％。二聚体前药是将两分子药物偶联在一起，可以进一步的提高载药量。但是，偶联了两分子药物的二聚体前药结构更加刚性，分子间作用力更强，阻碍了其自组装，并且影响其组装稳定性。因此，如何提高二聚体前药的自组装能力是二聚体前药自组装纳米粒研究的关键。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种具有氧化还原双敏感高载药量的多西他赛二聚体前药。并将该多西他赛二聚体前药，制备前药自组装纳米粒，探讨不同化学桥连对前药自组装纳米粒的稳定性、药物释放、细胞毒性、药动学、组织分布以及药效学产生的影响，综合筛选出效果最佳的化学桥连，为开发肿瘤微环境智能响应型药物递送系统提供新的策略和更多的选择，满足临床中对高效化疗制剂的迫切需求。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
本发明所述的具有氧化还原双敏感的多西他赛二聚体前药，是以多西他赛作为模拟药物，分别通过(a)2,2'-二硒代二乙酸、(b)2,2'-二硫代二乙酸、(c)己二酸相连合成前药，其结构式为：
Figure BDA0002384667350000021
Figure BDA0002384667350000031
进一步地，本发明提供了所述的多西他赛二聚体前药的合成方法，包括如下步骤：首先将二元酸与一分子多西他赛成酯得到中间产物。然后中间产物再与另一分子多西他赛成酯，得到终产物。
所述的二元酸为2,2'-二硒代二乙酸、2,2'-二硫代二乙酸、己二酸。
进一步地，本发明提供2,2'-二硒代二乙酸的合成方法，包括如下步骤：首先将硒粉与硼氢化钠反应，然后与第二份硒粉反应得到中间产物。中间产物与溴乙酸反应，得到终产物。
具体地，本发明提供了2,2'-二硒代二乙酸的合成方法：
将硒粉-乙醇混悬液在冰水浴中滴加硼氢化钠的乙醇溶液，搅拌至溶液澄清透明，加入第二份硒粉，缓慢升温至80-90℃，搅拌30-40分钟，降至室温后滴加溴乙酸乙醇溶液，过夜反应，反应液过滤并用水稀释，加乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯层干燥后减压旋转蒸发除去溶剂，得到产物，上述反应全程都在N2保护下进行。
本发明提供了系列多西他赛二聚体小分子前药的合成方法：
将多西他赛溶于二氯甲烷中，加入等摩尔量的2,2'-二硒代二乙酸、2,2'-二硫代二乙酸或己二酸，两倍摩尔量EDCI和等摩尔量DMAP，室温下搅拌1-2个小时，将所得中间产物加入等摩尔量多西他赛、EDCI和DMAP，室温条件下搅拌24-48小时，所得产物经制备液相分离纯化，上述反应全程都在N2保护下进行。
本发明所制备的多西他赛二聚体小分子前药性质如表1、2所示。
与油酸前药相比，在二聚体前药中母药占前药的分子量比例明显增加。相同条件下，二聚体前药纳米粒载药量更高，将该前药用于自组装纳米粒，可实现载药量高、稳定性好、毒副作用低的效果，进而提高抗肿瘤活性。
表1.多西他赛二聚体前药
Figure BDA0002384667350000041
表2.多西他赛-油酸前药
Figure BDA0002384667350000042
本发明还提供了所述的系列多西他赛二聚体小分子前药自组装纳米粒及其制备方法。
所述的小分子前药纳米粒可以是非PEG化的前药纳米粒和PEG修饰的前药纳米粒。
本发明中所述的多西他赛可以用其他含有活性羟基或氨基的抗癌药物，如紫杉烷类化合物、核苷类化合物、蒽环类化合物或喜树碱类化合物所代替。
本发明提供的多西他赛二聚体小分子前药自组装纳米粒的制备方法如下：
将一定量的多西他赛二聚体小分子前药单独或与PEG修饰剂的混合物溶解到适量的乙醇中，搅拌下，将该乙醇溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒。最后，采用减压旋转蒸发法除去制剂中的乙醇，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液。
所述的PEG修饰剂为TPGS、DSPE-PEG、PLGA-PEG和PE-PEG等，优选的PEG修饰剂为DSPE-PEG。所述PEG的分子量为1000-5000，具体为1000、2000和5000，优选的PEG分子量为2000。小分子前药与PEG修饰剂的重量比为：90:10～70:30，在此范围条件下，多西他赛可以发挥最好的抗肿瘤效果。
(1)非PEG化的小分子前药自组装纳米粒的制备方法：将一定量的前药溶解到适量的乙醇中，搅拌下，将该乙醇溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒。采用减压旋转蒸发法除去制剂中的乙醇，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液。
(2)PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的制备方法：将一定量的PEG修饰剂(TPGS、DSPE-PEG、PLGA-PEG或PE-PEG)和前药溶解到适量的乙醇中，搅拌下，将该乙醇溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒。采用减压旋转蒸发法除去制剂中的乙醇，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液。
本发明考察了多西他赛二聚体以二硒键、二硫键和二碳键相连的前药在键角/二面角、氧化还原敏感响应能力以及抗肿瘤活性等方面的差异，以及对前药自组装纳米粒的稳定性、药物释放、细胞毒性、药动学、组织分布以及药效学产生的影响。
结果表明，三种前药均可以自组装成纳米粒。非PEG化纳米粒的粒径都在110nm左右，DSeSeD可形成稳定的纳米粒，DSSD和DCCD纳米粒离心后产生明显的沉淀。PEG化纳米粒粒径在70-90nm，大小顺序为：DSeSeD纳米粒<DSSD纳米粒<DCCD纳米粒。DSeSeD纳米粒胶体稳定性最好，相比之下，DSSD纳米粒和DCCD纳米粒的胶体稳定性较差。二聚体前药策略显著提高了载药量，三种纳米粒的载药量都在70％左右。DSeSeD纳米粒和DSSD纳米粒具有明显的氧化敏感释放，可选择性地在肿瘤细胞中释放活性母药。由于二硒键增强了自组装纳米粒的胶体稳定性，相比于DSSD纳米粒和DCCD纳米粒，DSeSeD纳米粒具有更高的AUC，有助于纳米粒在肿瘤部位的蓄积。DSeSeD纳米粒具有良好的抗肿瘤活性，显著降低了多西他赛的毒性。
本发明的多西他赛二聚体小分子前药或其药物组合物或其小分子前药自组装纳米粒可以用于制备肿瘤微环境智能响应型药物传递系统。且可用于注射给药、口服给药或局部给药。
本发明具有以下有益效果：(1)设计合成了含有二硒键、二硫键、二碳键桥连的氧化还原双敏感小分子前药，合成方法简单易行；(2)制备了均匀的小分子前药自组装纳米粒，制备方法简单易行，稳定性好，实现多西他赛的高效包载；(3)考察了不同化学桥连在键角/二面角、氧化还原敏感响应能力以及抗肿瘤活性等方面的差异，以及对前药自组装纳米粒的稳定性、药物释放、细胞毒性、药动学、组织分布以及药效学产生的影响。综合筛选出效果最佳的化学桥连，为开发肿瘤微环境智能响应型药物递送系统提供新的策略和更多的选择，满足临床中对高效低毒化疗制剂的迫切需求。
附图说明
图1为本发明实施例1的二硒键桥连多西他赛二聚体前药(DSeSeD)的1HNMR谱图和质谱图。
图2为本发明实施例2的二硫键桥连多西他赛二聚体前药(DSSD)的1HNMR谱图和质谱图。
图3为本发明实施例3的二碳键桥连多西他赛二聚体前药(DCCD)的1HNMR谱图和质谱图。
图4为本发明实施例4的非PEG化小分子前药自组装纳米粒离心后照片。
图5为本发明实施例5的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的粒径图和透射电子显微镜图。
图6为本发明实施例6的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的粒径-存储时间图。
图7为本发明实施例8的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的体外释放试验图。
图8为本发明实施例9的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的细胞毒性图。
图9为本发明实施例9的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的肿瘤细胞内药物释放图。
图10为本发明实施例10的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的血药浓度-时间曲线图。
图11为本发明实施例11的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的在体抗肿瘤实验图。
图12为本发明实施例11的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的安全性实验图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1：二硒键桥连多西他赛小分子前药(DSeSeD)的合成
将多西他赛溶于二氯甲烷中，加入等量2,2'-二硒代二乙酸、两倍量EDCI和等量DMAP，室温下搅拌1个小时，将所得中间产物加入等量多西他赛、EDCI和DMAP，室温条件下搅拌24小时，所得产物经制备液相分离纯化，上述反应全程都在N2保护下进行。
采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例1中前药的结构，结果如图1所示。核磁共振选用的溶剂为CDCl3，波谱解析结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.046(d,4H,Ar-H,J＝7.5Hz),7.541(t,2H,Ar-H,J＝7.5Hz),7.450(t,4H,Ar-H,J＝7.5Hz),7.381(t,4H,Ar-H,J＝7.5Hz),7.243(d,6H,Ar-H),6.171(s,2H,13-CH),5.614(d,2H,2-CH,J＝7Hz),5.422(s,2H,3’-H),5.309(s,2H,10-CH),5.228(s,2H,2’-H),5.150(s,2H,-CH),4.908(d,2H,5-CH,J＝9Hz),4.255(d,2H,-CH),4.173and 4.130(dd,4H,20-CH2,J＝8.5Hz),3.853(d,2H,7-CH,J＝7Hz),3.356(s,4H,CH2 SeSeCH2 ),2.504(m,2H,3-CH),2.375(s,6H,-OAc),1.880(s,6H,18-CH3),1.788(t,4H,14-CH),1.668(s,6H,19-CH3),1.256(s,18H,C(CH3 )3),1.151(s,6H,16-CH3),1.045(s,6H,17-CH3).MS(ESI)m/z for DSeSeD[M+Na]+＝1879.52009,[M+K]+＝1895.49488.
实施例2：二硫键桥连多西他赛二聚体小分子前药(DSSD)的合成
将多西他赛溶于二氯甲烷中，加入等量2,2'-二硫代二乙酸、两倍量EDCI和等量DMAP，室温下搅拌1个小时，将所得中间产物加入等量多西他赛、EDCI和DMAP，室温条件下搅拌24小时，所得产物经制备液相分离纯化，上述反应全程都在N2保护下进行。
采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例2中前药的结构，结果如图2所示。核磁共振选用的溶剂为CDCl3，波谱解析结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.050(d,4H,Ar-H,J＝7.5Hz),7.541(t,2H,Ar-H,J＝7.5Hz),7.436(t,4H,Ar-H,J＝7.5Hz),7.317(t,4H,Ar-H,J＝7.5Hz),7.249(d,6H,Ar-H),6.174(s,2H,13-CH),5.616(d,2H,2-CH,J＝7Hz),5.432(s,2H,3’-H),5.320(s,2H,10-CH),5.228(s,2H,2’-H),5.152(s,2H,-CH),4.908(d,2H,5-CH,J＝9Hz),4.258(d,2H,-CH),4.177and 4.132(dd,4H,20-CH2,J＝8.5Hz),3.849(d,2H,7-CH,J＝7Hz),3.378(s,4H,CH2 SSCH2 ),2.503(m,2H,3-CH),2.375(s,6H,-OAc),1.874(s,6H,18-CH3),1.789(t,4H,14-CH),1.671(s,6H,19-CH3),1.249(s,18H,C(CH3 )3),1.152(s,6H,16-CH3),1.044(s,6H,17-CH3).MS(ESI)m/z for DSSD[M+Na]+＝1784.63129,[M+K]+＝1800.60514.
实施例3：二碳键桥连多西他赛二聚体小分子前药(DCCD)的合成
将多西他赛溶于二氯甲烷中，加入等量己二酸、两倍量EDCI和等量DMAP，室温下搅拌1个小时，将所得中间产物加入等量多西他赛、EDCI和DMAP，室温条件下搅拌24小时，所得产物经制备液相分离纯化，上述反应全程都在N2保护下进行。
采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例3中前药的结构，结果如图3所示。核磁共振选用的溶剂为CDCl3，波谱解析结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.044(d,4H,Ar-H,J＝7.5Hz),7.539(t,2H,Ar-H,J＝7.5Hz),7.435(t,4H,Ar-H,J＝7.5Hz),7.311(t,4H,Ar-H,J＝7.5Hz),7.29(d,6H,Ar-H),6.148(s,2H,13-CH),5.602(d,2H,2-CH,J＝7Hz),5.389(s,2H,3’-H),5.293(s,2H,10-CH),5.227(s,2H,2’-H),5.155(s,2H,-CH),4.906(d,2H,5-CH,J＝9Hz),4.254(d,2H,-CH),4.177and 4.258(dd,4H,20-CH2,J＝8.5Hz),3.849(d,2H,7-CH,J＝7Hz),2.511(m,2H,3-CH),2.359(s,6H,-OAc),2.284(t,4H,CH2 CH2CH2 CH2 ),1.865(s,6H,18-CH3),1.784(t,4H,14-CH),1.670(s,6H,19-CH3),1.424(m,4H,CH2 CH2CH2 CH2),1.263(s,18H,C(CH3 )3),1.149(s,6H,16-CH3),1.041(s,6H,17-CH3).MS(ESI)m/z for DCCD[M+Na]+＝1748.72163,[M+K]+＝1764.69643.
实施例4：非PEG化小分子前药自组装纳米粒稳定性评价
精密称取前药0.8mg，用1mL乙醇将其溶解，搅拌下，将该乙醇溶液缓缓滴加到4mL去离子水中。在25℃的条件下减压旋转蒸发除去纳米制剂中的有机溶剂。将所制备的小分子前药自组装纳米粒离心(1000rpm，10分钟)后观察。将所制备的小分子前药自组装纳米粒取出50μL，加1mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH为7.4)，通过动态光散射法测定PBS稀释前后纳米粒粒径变化。
如图4所示，DSeSeD可形成稳定的纳米粒，在离心后仍保持澄清透明；DSSD和DCCD纳米粒离心后产生明显的沉淀。如表3所示，非PEG化纳米粒的粒径都在110nm左右，稀释之后粒径都明显增长，DSeSeD纳米粒粒径增长最少。
表3.非PEG化的小分子前药自组装纳米粒稀释前后粒径变化
Figure BDA0002384667350000091
实施例5：PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的制备
精密称取DSPE-PEG2k 1mg和前药4mg，用1mL乙醇将其溶解，搅拌下，将该乙醇溶液缓缓滴加到4mL去离子水中，自发形成均匀的纳米粒(DSeSeD纳米粒,DSSD纳米粒,DCCD纳米)。在25℃的条件下减压旋转蒸发除去纳米制剂中的有机溶剂。
如表4所示，纳米粒的粒径都在70-90nm，粒径分布小于0.2，表面电荷在-30mV左右，载药量都在70％左右。通过透射电子显微镜测定实施例5中制备的小分子前药自组装纳米粒的粒径和形态，结果如图5，透射电镜图表明载药纳米粒为均一的球形，粒径在70-90nm。
表4.PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的粒径、粒径分布、表面电荷和载药量
Figure BDA0002384667350000092
实施例6：PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的胶体稳定性试验
将实施例5中制备的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒取出1mL，加入到20mL含有10％FBS的磷酸盐缓冲液(PBS，pH为7.4)中，在37℃的条件下孵育24小时，并且在预定的时间点(0,2,4,6,8,12和24小时)通过动态光散射法测定其粒径变化。结果如图6所示，DSeSeD纳米粒胶体稳定性最好，在24小时内粒径没有发生明显的变化。相比之下，DSSD纳米粒和DCCD纳米粒的胶体稳定性较差，随着孵化时间的延长，纳米粒的粒径逐渐增大。
实施例7：二硒/二硫/二碳键在小分子前药中的键角、二面角和结合能
通过分子动态模拟，对不同连接键在小分子前药中的键角进行计算，如表5所示，结果为：二硒键(89.330°/91.825°)、二硫键(92.080°/93.385°)、二碳键(109.997°/113.544°)。二硒键的键角最接近90°，在DSeSeD的结构中造成“结构缺陷”，有效地提高分子结构的灵活度，平衡分子间作用力。而DCCD的键角远大于100°，使得分子结构灵活度降低，不利于自组装。同时，对不同连接键的二面角进行分子模拟计算：二硒键(118.343°)，二硫键(129.201°)，二碳键(171.537°)。二硒键的二面角最接近90°，使得DSeSeD在组装过程中呈现出最佳构象，使得DSeSeD组装能力强，形成的纳米粒稳定性好。另外，通过分子对接，对多西他赛二聚体小分子前药自组装过程的结合能进行了计算，如表5所示，结果为DSeSeD(-1.938kcal mol-1)<DSSD(-1.809kcal mol-1)<DCCD(-1.585kcal mol-1)。DSeSeD具有最小的结合能，说明二硒键有助于前药自组装时构建最优构象，降低体系自由能，提高体系的稳定性。
表5.二硒/二硫/二碳键在小分子前药中的键角、二面角和结合能
Figure BDA0002384667350000101
实施例8：PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的体外释放试验。
以含30％乙醇的pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)为释放介质，考察小分子前药自组装纳米粒的体外释放情况。将实施例5中制备的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒(多西他赛含量为200μg/mL)加入到30mL释放介质中，在37℃条件下，于设定的时间点取样，通过高效液相色谱测定释放出的多西他赛浓度。向释放介质中加入一定浓度的双氧水(H2O2,1mM,5mM,10mM)或谷胱甘肽(GSH,50μM,200μM,500μM)，以分别考察纳米粒在氧化条件和还原条件下的释放情况。
结果如图7所示，二硒/二硫键桥连的前药纳米粒具有明显的氧化敏感释放。其中，氧化敏感性大小顺序为二硫键>二硒键。与硫元素相比，硒元素原子半径更大，电负性更低，键能更低，因此二硒键与二硫键相比更易被氧化。但是由于DSeSeD纳米粒具有更强的胶体稳定性，减弱了双氧水对二硒键的氧化作用，所以DSeSeD纳米粒氧化条件下释放得稍慢于DSSD纳米粒。二硒/二硫键桥连的前药纳米粒也具有还原敏感释放，大小为二硫键>二硒键，硫接受电子的能力强于硒，还原条件更加敏感。与二硒/二硫键相比，二碳键没有氧化还原响应型，在双氧水或谷胱甘肽的作用下都只释放出少量多西他赛。
实施例9：PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的细胞毒性
采用MTT法考察PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒对小鼠乳腺癌(4T1)细胞、人口腔上皮癌(KB)细胞、人肺癌(A549)细胞和人肝(L02)细胞的细胞毒性。将状态良好的细胞消化，用培养液稀释至1000cells/mL细胞密度，吹匀后于96孔板中每孔加入细胞悬液200μL，置培养箱中孵育24h使其贴壁。待细胞贴壁后加泰索帝或实施例5中制备的前药纳米粒。小鼠乳腺癌(4T1)细胞和人肝(L02)细胞实验中药物溶液与纳米粒制剂的配制和稀释均用1640培养液，人口腔上皮癌(KB)细胞和人肺癌(A549)细胞实验中药物溶液与纳米粒制剂的配制和稀释均用DMEM培养液，并用0.22μm滤膜无菌过滤。受试溶液每孔加入200μL，每个浓度3个平行孔。对照组，即不加待测药液，单一补加200μL培养液，置培养箱中和细胞共同孵育。于加药后48h，将96孔板取出，每孔加入5mg/mL MTT溶液35μL，置培养箱中孵育4h后甩板，将96孔板倒扣于滤纸上充分吸干残留液体后，每孔加入200μL DMSO于振荡器上振荡10min以溶解蓝紫色结晶物。设定A1孔(只含有200μL DMSO)为调零孔。使用酶标仪在570nm处测定各孔调零后的吸光度值。
为了确定与4T1细胞孵育后前药纳米粒释放的多西他赛的量，在固定的时间点(24、48和72小时)收集细胞和培养基(多西他赛初始浓度：50ng/mL)。超声处理和离心后，通过液相色谱-质谱联用仪测量上清液中游离多西他赛的浓度。
细胞毒性结果如图8所示。由于前药纳米粒释放多西他赛需要一定时间，多西他赛药效发挥受到一定限制，所以与泰索帝组相比，前药纳米粒的细胞毒性要低。前药纳米粒的细胞毒性大小顺序为DSeSeD纳米粒>DSSD纳米粒>DCCD纳米粒。这是因为DSeSeD和DSSD纳米粒能在肿瘤细胞内特异性释放药物。前药纳米粒细胞毒性与多西他赛从纳米粒中的释放速度相关。因此，考察了前药纳米粒在4T1细胞中紫杉醇的释放速度。从图9可知，与DSSD纳米粒相比，DSeSeD纳米粒释放多西他赛的速度更快，这与细胞毒性的结果一致。DCCD纳米粒几乎不释放药物，所以表现出较低的细胞毒性。考察了泰索帝和前药纳米粒对正常细胞和肿瘤细胞的选择性。如表6所示，与泰索帝相比，前药纳米粒对L02细胞的毒性明显降低。选择性指数(SI)大于1时，说明药物对肿瘤细胞的毒性大于对正常细胞的毒性，数值越大说明毒性区别越明显。DSeSeD纳米粒和DSSD纳米粒的SI值明显大于DCCD纳米粒和泰索帝的，说明DSeSeD纳米粒和DSSD纳米粒可以分辨肿瘤细胞和正常细胞，选择性在肿瘤细胞内释放活性母药，显著降低了多西他赛的毒性。
表6.泰索帝和前药纳米粒对4种细胞的半抑制浓度(IC50)和选择性指数(SI)
Figure BDA0002384667350000121
实施例10：PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的药代动力学研究
取体重在200-250g之间的SD大鼠，随机分成5组，给药前禁食12h，自由饮水。分别静脉注射泰索帝以及实施例5中制备的PEG化的小分子前药自组装纳米粒。多西他赛的剂量为2.5mg/kg。于规定的时间点眼眶取血，分离获得血浆。通过液相色谱-质谱联用仪测定血浆中的药物浓度。
实验结果如图10所示，泰索帝的多西他赛被迅速地从血液中清除。相比之下，小分子前药自组装纳米粒的循环时间明显延长。二硒/二硫/二碳键对前药纳米粒的药动学行为有显著影响。相比于DSSD纳米粒和DCCD纳米粒，DSeSeD纳米粒具有更高的AUC。可能是因为二硒键增强了自组装纳米粒的胶体稳定性。体内循环时间增长，有助于纳米粒在肿瘤部位的蓄积。即使DCCD纳米粒胶体稳定性较差，但是二碳键不具有化学敏感性，在体内难断裂，所以DCCD纳米粒在血液循环过程中只释放出少量多西他赛。由于DSSD纳米粒胶体稳定性较差，具有强氧化还原敏感性，DSSD纳米粒在血液循环过程中迅速解聚并释放出大量多西他赛。说明纳米粒的胶体稳定性和氧化还原敏感性都会对纳米粒的药动学行为造成影响。
实施例11：PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的在体抗肿瘤实验
考察了PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒对两种肿瘤模型(4T1原位瘤模型和4T1异位瘤模型)的抗肿瘤活性。将4T1细胞悬液(5x 106cells/50μL)接种于雌性Balb/c鼠乳房垫内构建4T1原位瘤模型。待肿瘤体积生长至60mm3时，将荷瘤小鼠随机分组，每组五只,分别给与生理盐水、泰索帝和实施例5中制备的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒。每隔1天给药1次，连续给药5次，按多西他赛计算，给药剂量为8mg/kg。给药后，每天观察小鼠的存活状态，称体重，测量肿瘤体积。最后一次给药的后一天将荷瘤小鼠处死，获取器官和肿瘤，进行进一步分析评价。收集主要器官(心脏，肝脏，脾脏，肺，肾脏)和肿瘤组织并用福尔马林固定用于H&E染色。收集血浆用于肝肾功能检查，收集血液用于血常规检查。在雌性Balb/c鼠右侧背部皮下注射4T1细胞悬液(5x 106cells/100μL)构建4T1异位瘤模型。当肿瘤体积达到100mm3时，将荷瘤小鼠随机分组，其他方法同上所述。
实验结果如图11所示，DCCD纳米粒的抗肿瘤活性低，与生理盐水相比无显著性差异。这是由于其母药释放得少，抗肿瘤活性低。相比之下，DSeSeD纳米粒和DSSD纳米粒可在肿瘤细胞内释放出活性母药，具有显著的抗肿瘤作用。但是，由于DSeSeD纳米粒具有更好的胶体稳定性，更长的血液循环和有效地药物释放，DSeSeD纳米粒的抗肿瘤活性强于DSSD纳米粒。泰索帝抗肿瘤活性很强，但经泰索帝治疗的小鼠体重急剧下降，中性粒细胞和白细胞数明显降低，如图12。而经DSeSeD纳米粒治疗的小鼠体重维持在稳定的水平，并且没有表现出明显的肝肾和骨髓功能损伤。这说明，由于DSeSeD纳米粒选择性地在肿瘤细胞内释放药物，降低了多西他赛的毒性。在异位瘤模型中表现出相似的结果，DSeSeD纳米粒在具有明显的抗肿瘤效果的同时，没有对机体造成显著的非特异性毒性，是安全有效的抗癌药物传递系统。

Claims (10)

1.多西他赛二聚体小分子前药，其特征在于，以多西他赛作为模拟药物，以二硒键、二硫键或二碳键作为桥连键，其结构如下：
Figure FDA0002384667340000011
2.如权利要求1所述的多西他赛二聚体小分子前药的制备方法，其特征在于，首先将二元酸与一分子多西他赛成酯得到中间产物，然后中间产物再与另一分子多西他赛成酯，得到终产物。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的二元酸为2,2'-二硒代二乙酸、2,2'-二硫代二乙酸、己二酸。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将多西他赛溶于二氯甲烷中，加入等摩尔量2,2'-二硒代二乙酸/2,2'-二硫代二乙酸/己二酸、两倍量EDCI和等量DMAP，室温下搅拌，将所得中间产物加入等量多西他赛、EDCI和DMAP，室温条件下搅拌，所得产物经制备液相分离纯化，上述反应全程都在N2保护下进行。
5.如权利要求1所述的多西他赛二聚体小分子前药，其特征在于，所述的多西他赛可以用核苷类化合物、蒽环类化合物或喜树碱类化合物代替。
6.一种药物组合物，包含权利要求1所述的多西他赛二聚体小分子前药和药学上可接受的载体或赋形剂。
7.多西他赛二聚体小分子前药自组装纳米粒，其特征在于，其制备过程如下：
将一定量的多西他赛二聚体小分子前药或多西他赛二聚体小分子前药与PEG修饰剂的混合物溶解到适量的乙醇中，搅拌下，将该乙醇溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒，最后，采用旋转蒸发法除去制剂中的乙醇，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液。
8.根据权利要求7所述的多西他赛二聚体小分子前药自组装纳米粒，其特征在于，所述的PEG为TPGS、DSPE-PEG、PLGA-PEG、PE-PEG和DSPE-PEG-AA，小分子前药与PEG修饰剂的比例为90:10～70:30。
9.权利要求1所述的多西他赛二聚体小分子前药或权利要求6所述的药物组合物或权利要求7-8任何一项所述的小分子前药自组装纳米粒在制备药物传递系统中的应用。
10.权利要求1所述的多西他赛二聚体小分子前药或权利要求6所述的药物组合物或权利要求7-8任何一项所述的小分子前药自组装纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
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