CN115611926B - 非敏感键桥连的sn38二聚体前药及其自组装纳米粒和应用 - Google Patents

非敏感键桥连的sn38二聚体前药及其自组装纳米粒和应用 Download PDF

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Abstract

非敏感键桥连的SN38二聚体前药及其自组装纳米粒和应用，属于药物制剂新辅料和新剂型领域，涉及一种7‑乙基‑10‑羟基喜树碱前药抗肿瘤制剂，具体涉及如式(I)所示的非敏感键桥连的SN38二聚体前药及其包含该前药的自组装纳米粒的构建，以及其作为药物递送系统在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的非敏感键桥连的SN38二聚体前药可以自组装成纳米粒，能有效提高疗效，降低其毒副作用。

Description

非敏感键桥连的SN38二聚体前药及其自组装纳米粒和应用
技术领域
本发明属于药物制剂新辅料和新剂型领域，具体涉及非敏感键桥连的SN38二聚体前药及其包含该前药的自组装纳米粒的构建，以及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
近年来，癌症的发病率和死亡率逐年提高，严重威胁着人们的健康。化疗是目前治疗癌症的主要手段。喜树碱(Camptothecin,CPT)属于生物碱类抗肿瘤药物，作用于DNA拓扑异构酶，可选择性杀伤增殖期肿瘤细胞，在临床上被广泛用于治疗大肠癌和结直肠癌等。在所有CPT类似物中，7-乙基-10-羟基喜树碱(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin,SN38)为最具代表的一个活性类似物，具有极高的抗肿瘤活性，且在生理环境的稳定性良好，已经成为一种有效的抗肿瘤药物而备受关注。然而，SN38水溶性极差，且肿瘤选择性差，静脉注射后在体内的广泛分布会引发严重的不良反应，如腹泻、呕吐、泌尿系统毒性等，极大限制了临床应用。
前药是通过化学结构修饰后，得到体外无活性或活性较小，在体内经酶或非酶的转化释放出活性药物而发挥药效。目前，前药策略是提高喜树碱类药物递送效率的主要方式，已有多种喜树碱类前药成功上市。包括羟基喜树碱(10-Hydroxycamptothecin,HCPT)，伊立替康(7-ethoxyxanthone-3-carboxylic acid,Irinotecan)，拓扑替康(9-Dimethylaminomethyl-10-hydroxycamptothecin,Topotecan)，鲁比替康(9-Nitrocellulose camptothecine,Rubitecan)，9-氨基喜树碱(9-Aminocamptothecin,9-AC)。其中，盐酸伊立替康注射液(Campto)是通过双哌啶基团对SN38进行结构修饰得到前体药物伊立替康(irinotecan)，通过伊立替康配制的静脉滴注射液，有效的改善SN38溶解性差、毒副作用大等问题，成为晚期大肠癌、晚期结直肠癌的临床一线化疗药物。然而，伊立替康的在体内的SN38活性转化率仅为0.1-1％，且个体差异大，限制了其抗肿瘤活性。纳米递送系统可以有效延长药物的体内循环时间，并能够通过主动靶向或被动靶向提高药物在肿瘤部位的蓄积等。因此，将前药策略和纳米递送系统相结合的小分子前药自组装纳米粒，具有载药量高、稳定性好、毒副作用低、制备工艺简单、重现性好等优势，具有较好的应用转化潜力。然而，现有的SN38前药纳米递送药物大多通过敏感键链接侧链和母药。但是由于喜树碱类药物极性过大、化学不稳定，使用敏感键会进一步降低稳定性，极大限制临床应用。
同型二聚体前药自组装纳米粒具有超高的载药量(大于50％)，正成为一种有潜力的抗癌药物递送技术。然而，二聚体前药的化学稳定性和自组装稳定性是影响二聚体前药自组装纳米粒的体内命运和制剂开发的两大关键因素。研究发现，二聚体前药中间连接链的长度和结构等显著影响二聚体前药纳米粒的组装稳定性、体内命运和抗肿瘤效果。此外，由于喜树碱类药物的极性较大，设计具有化学稳定性良好的二聚体前药至关重要。二聚体前药的中间连接链的长度越长，化学稳定性越好，但药物释放慢，抗肿瘤活性可能会受到限制。相反，二聚体前药的中间连接链的长度越短，其化学稳定性较差，药物释放快，会对正常组织和器官产生毒副作用。因此，亟需寻求一种合适连接链的长度平衡SN38二聚体前药的化学稳定性和组装稳定性。
发明内容
本发明目的是合成一种非敏感键桥连的SN38二聚体前药，制备该前药的自组装纳米药物递送系统。探讨不同长度非敏感链接键桥连对前药自组装纳米粒的稳定性、药物释放、细胞毒性、以及药效学的影响，综合筛选出最优长度的链接键。该非敏感键桥连的SN38二聚体前药形成的自组装纳米粒，具有粒径较小且分布均一、载药量高、稳定性好、抗肿瘤效果好和安全性好的优点。
为实现上述目的，本发明提供如通式(I)所示的非敏感键桥连的SN38二聚体前药。
R为直链或含支链的C3-C30烃基；
优选地，R选自C5-C18饱和直链烷基；
具体地，当本发明非敏感键桥连的SN38二聚体前药中间连接链为饱和直链烷基时，所述的直链烷基由二元羧酸提供，所述二元羧酸为戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、十一烷基二酸、十二烷基二酸、十三烷基二酸、十四烷基二酸、十五烷基二酸、十六烷基二酸、十七烷基二酸或十八烷基二酸。
进一步优选地，本发明所述的非敏感键桥连的SN38二聚体前药的连接链为正戊基、正辛基、正癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基或正十八烷基，所对应二元酸为戊二酸、辛二酸、癸二酸、十二烷基二酸、十四烷基二酸、十六烷基二酸、十八烷基二酸，所对应的前药分别命名为SN38-C5-SN38，SN38-C8-SN38，SN38-C10-SN38，SN38-C12-SN38，SN38-C14-SN38，SN38-C16-SN38，SN38-C18-SN38。
以戊二酸桥连的SN38二聚体前药结构为：
以辛二酸桥连的SN38二聚体前药结构为：
以癸二酸桥连的SN38二聚体前药结构为：
以十二烷基二酸桥连的SN38二聚体前药结构为：
以十四烷基二酸桥连的SN38二聚体前药结构为：
以十六烷基二酸桥连的SN38二聚体前药结构为：
以十八烷基二酸桥连的SN38二聚体前药结构为：
本发明所述的非敏感键桥连的SN38二聚体前药的合成方法，包括如下步骤：
将戊二酸、辛二酸、癸二酸、十二烷基二酸、十四烷基二酸、十六烷基二酸、十八烷基二酸等二元酸分别溶于无水N,N-二甲基甲酰胺中搅拌均匀；另将部分4-二甲氨基吡啶(DMAP)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)及SN38溶于N,N-二甲基甲酰胺中搅拌均匀，然后分别与上述戊二酸、辛二酸、癸二酸、十二烷基二酸、十四烷基二酸、十六烷基二酸、十八烷基二酸溶液混合，N2保护下，室温搅拌10-12h；向混合溶液中补加剩余EDCI和DMAP，室温继续搅拌12-24h，所得产物经制备液相分离纯化。
所述的非敏感键桥连的SN38二聚体前药的合成方法反应全程在氮气保护下进行。
所述的步骤中，按摩尔比，二元酸:EDCI:DMAP:SN38＝1:(0.1-10):(0.1-10):(2-10)，优选为1:(2-10):(0.1-2):(2-5)。
所述的步骤中，制备的非敏感键桥连的SN38二聚体前药质量纯度≥99％。
本发明还提供所述非敏感键桥连的SN38二聚体前药的自组装纳米粒，所述的非敏感键桥连的SN38二聚体前药的自组装纳米粒包括非PEG修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药自组装纳米粒和PEG修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药自组装纳米粒。
所述的PEG修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药的自组装纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
将PEG修饰剂和非敏感键桥连的SN38二聚体前药溶解到有机溶剂中，在搅拌环境下滴加到水中，非敏感键桥连的SN38二聚体前药将自组装成粒径均一的纳米粒；除去制剂中的有机溶剂，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液，即为PEG修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药自组装纳米粒，其中，非敏感键桥连的SN38二聚体前药:PEG修饰剂的质量比为1:(0.1-1)，PEG修饰剂为两亲性聚合物或靶向基团，优选为DSPE-PEG、TPGS、PEG-PLGA、PEG-PE或DSPE-PEG-FA。非PEG修饰的二聚体前药纳米粒的制备方法不同点在于，制备过程中不加入PEG修饰剂。
本发明提供的PEG修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药的自组装纳米粒的粒径为80～250nm，粒径分布小于0.2，载药量为50-80％。
本发明还提供非敏感键桥连的SN38二聚体前药或PEG修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药的自组装纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供非敏感键桥连的SN38二聚体前药或PEG修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药的自组装纳米粒在制备注射给药、口服给药或局部给药系统中的应用。
本发明还提供的非敏感键桥连的SN38二聚体前药或PEG修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药的自组装纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用中，能够提高疗效、降低毒性。
本发明的有益效果：
(1)本发明设计合成了含有不同非敏感键桥连的SN38二聚体前药，合成方法简单易行；并制备了粒径较小、粒度分布均一的非敏感键桥连的SN38二聚体前药的自组装纳米粒，制备方法简单易行；(2)考察了不同长度的非敏感键桥连对二聚体前药自组装纳米粒制剂学性质、和抗肿瘤活性等方面的影响。结果表明：非敏感键桥连的SN38二聚体前药的自组装纳米粒能有效提高SN38和市售处方盐酸伊立替康注射液的疗效，降低其毒副作用；不同的链长非敏感键桥连会对非敏感键桥连的SN38二聚体前药的自组装纳米粒的制剂学性质、与抗肿瘤活性产生显著影响；十二烷基二酸桥连时前药自组装纳米粒的制剂学性质、药效学行为最佳。本发明为开发高效-低毒化疗制剂提供了新的策略与选择；(3)本发明为开发新的前药，以及其自组装纳米粒作为纳米药物递送系统提供了更多的选择，满足了临床对于高效、高稳定性、低毒化疗制剂的迫切需求。
附图说明
图1为本发明实施例1戊二酸桥连的SN38二聚体(SN38-C5-SN38)的质谱图。
图2为本发明实施例2辛二酸桥连的SN38二聚体(SN38-C8-SN38)的质谱图。
图3为本发明实施例3癸二酸桥连的SN38二聚体(SN38-C10-SN38)的质谱图。
图4为本发明实施例4十二烷基二酸桥连的SN38二聚体(SN38-C12-SN38)的质谱图。
图5为本发明实施例5十四烷基二酸桥连的SN38二聚体(SN38-C14-SN38)的质谱图。
图6为本发明实施例6十六烷基二酸桥连的SN38二聚体(SN38-C16-SN38)的质谱图。
图7为本发明实施例7十八烷基二酸桥连的SN38二聚体(SN38-C18-SN38)的质谱图。
图8为本发明实施例9中的PEG修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药自组装纳米粒的放置稳定性图。
图9为本发明实施例10中的非敏感键桥连的SN38二聚体前药溶液剂的体外释放试验图。
图10为本发明实施例13的PEG修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药自组装纳米粒在体内抗肿瘤实验中肿瘤体积变化图。
n.s.：P≥0.05**：P<0.01****：P<0.0001(均为双侧t检验)
图11为本发明实施例13的PEG修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药自组装纳米粒在体内抗肿瘤实验中体重变化图。
n.s.：P≥0.05(均为双侧t检验)
图12为本发明实施例13的PEG修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药自组装纳米粒在体内抗肿瘤实验中肿瘤负荷图。
n.s.：P≥0.05**：P<0.01***：P<0.001(均为双侧t检验)
图13为本发明实施例13的PEG修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药自组装纳米粒在体内抗肿瘤实验中肿瘤图。
图14为本发明实施例13的PEG修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药自组装纳米粒在体内抗肿瘤实验中血液常规指标图。
图15为本发明实施例13的PEG修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药自组装纳米粒在体内抗肿瘤实验中生化常规指标图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：
戊二酸桥连SN38二聚体前药的合成
将0.25mmol的戊二酸溶于10mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，另将0.05mmol的4-二甲氨基吡啶(DMAP)及1mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和0.5mmol的SN38溶于20mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，并与戊二酸的无水N,N-二甲基甲酰胺溶液混合，室温条件下搅拌12h。然后再加入0.5mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.05mmol 4-二甲氨基吡啶，室温条件下搅拌12h，上述反应全程都在N2保护下进行，所得产物经制备液相分离纯化。
采用1H-NMR对产物结构进行确证。波谱解析结果如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)δ0.90(t,J＝8Hz,6H),1.24(t,J＝8Hz,6H),1.88(m,4H),2.16(m,2H),2.89(t,J＝8Hz,4H),3.05(q,J＝8Hz,4H),5.25(s,4H,C5),5.43(s,4H,C22),6.49(s,2H,C20-OH),7.32(s,2H,C14),7.70(m,C11),7.97(s,2H,C9),8.20(d,J＝8Hz,2H,C12)。
采用质谱法对产物结构进行确证，质谱图如图1所示，MS(ESI)m/z for C49H44N4O12[M+H]+:881.29868。
实施例2：
辛二酸桥连SN38二聚体前药的合成
将0.25mmol的辛二酸溶于10mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，另将0.05mmol的4-二甲氨基吡啶(DMAP)及1mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和0.5mmol的SN38溶于20mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，并与辛二酸的无水N,N-二甲基甲酰胺溶液混合，室温条件下搅拌12h。再加入0.5mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.05mmol 4-二甲氨基吡啶，室温条件下搅拌12h，上述反应全程都在N2保护下进行，所得产物经制备液相分离纯化。
采用1H-NMR对产物结构进行确证。波谱解析结果如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)δ0.89(t,J＝8Hz,6H),1.28(t,J＝8Hz,6H),1.42(m,4H),1.45(m,4H),1.73(m,4H),1.87(m,4H),2.68(t,J＝8Hz,4H),3.16(m,4H),5.26(s,4H,C5),5.42(s,4H,C22),6.51(s,2H,C20-OH),7.30(s,2H,C14),7.63(m,2H,C11),7.94(s,2H,C9),8.13(d,J＝8Hz,2H,C12)。
采用质谱法对产物结构进行确证，质谱图如图2所示，MS(ESI)m/z for C52H50N4O12[M+H]+:923.35000。
实施例3：
癸二酸桥连SN38二聚体前药的合成
将0.25mmol的癸二酸溶于10mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，另将0.05mmol的4-二甲氨基吡啶(DMAP)及1mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和0.5mmol的SN38溶于20mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，并与癸二酸的无水N,N-二甲基甲酰胺溶液混合，室温条件下搅拌24h。再加入0.5mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.05mmol 4-二甲氨基吡啶，室温条件下搅拌24h，上述反应全程都在N2保护下进行，所得产物经制备液相分离纯化。
采用1H-NMR对产物结构进行确证。波谱解析结果如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)δ0.89(t,J＝8Hz,6H),1.29(t,J＝8Hz,6H),1.51(m,4H),1.79(m,4H),1.88(m,4H),2.72(3,4H),3.16(m,4H),5.27(s,4H,C5),5.42(s,4H,C22),6.50(s,2H C20-OH),7.29(s,2H C14),7.60(m,2H,C11),7.94(s,2H,C9),8.15(d,J＝8Hz,2H,C12)。
采用质谱法对产物结构进行确证，质谱图如图3所示，MS(ESI)m/z for C54H54N4O12[M+H]+:951.37998。
实施例4：
十二烷基二酸桥连SN38二聚体前药的合成
将0.25mmol的十二烷基二酸溶于10mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，另将0.05mmol的4-二甲氨基吡啶(DMAP)及1mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和0.5mmol的SN38溶于20mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，并与十二烷基二酸的无水N,N-二甲基甲酰胺溶液混合，室温条件下搅拌24h。再加入0.5mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.05mmol 4-二甲氨基吡啶，室温条件下搅拌24h，上述反应全程都在N2保护下进行，所得产物经制备液相分离纯化。
采用1H-NMR对产物结构进行确证。波谱解析结果如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)δ0.89(t,J＝8Hz,6H),1.28(t,J＝8Hz,6H),1.34(m,4H),1.37(m,4H),1.41(m,4H),1.71(m,4H),1.87(m,4H),2.67(t,J＝8Hz,4H),3.15(m,4H),5.28(s,4H,C5),5.42(s,4H,C22),6.50(s,2H,C20-OH),7.30(s,2H,C14),7.60(m,2H,C11),7.94(s,2H,C9),8.15(d,J＝8Hz,2H,C12)。
采用质谱法对产物结构进行确证，质谱图如图4所示，MS(ESI)m/z for C56H58N4O12[M+H]+:979.41262。
实施例5：
十四烷基二酸桥连SN38二聚体前药的合成
将0.25mmol的十四烷基二酸溶于10mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，另将0.05mmol的4-二甲氨基吡啶(DMAP)及1mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和0.5mmol的SN38溶于20mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，并与十四烷基二酸的无水N,N-二甲基甲酰胺溶液混合，室温条件下搅拌24h。再加入0.5mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.05mmol 4-二甲氨基吡啶，室温条件下搅拌24h，上述反应全程都在N2保护下进行，所得产物经制备液相分离纯化。
采用1H-NMR对产物结构进行确证。波谱解析结果如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)δ0.88(t,J＝8Hz,6H),1.29(t,J＝8Hz,6H),1.31(m,4H),1.36(m,4H),1.40(m,4H),1.42(m,4H),1.70(m,4H),1.87(m,4H),2.67(t,J＝8Hz,4H),3.17(m,4H),5.29(s,4H,C5),5.49(s,4H,C22),6.50(s,2H,C20-OH),7.31(s,2H,C14),7.62(m,2H,C11),7.95(s,2H,C9),8.17(d,J＝8Hz,2H,C12)。
采用质谱法对产物结构进行确证，质谱图如图5所示，MS(ESI)m/z for C58H62N4O12[M+H]+:1007.44536。
实施例6：
十六烷基二酸桥连SN38二聚体前药的合成
将0.25mmol的十六烷基二酸溶于10mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，另将0.05mmol的4-二甲氨基吡啶(DMAP)及1mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和0.5mmol的SN38溶于20mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，并与十六烷基二酸的无水N,N-二甲基甲酰胺溶液混合，室温条件下搅拌20h。再加入0.5mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.05mmol 4-二甲氨基吡啶，室温条件下搅拌20h，上述反应全程都在N2保护下进行，所得产物经制备液相分离纯化。
采用1H-NMR对产物结构进行确证。波谱解析结果如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)δ0.88(t,J＝8Hz,6H),1.29(t,J＝8Hz,6H),1.31(m,4H),1.36(m,4H),1.40(m,4H),1.42(m,4H),1.44(m,4H),1.68(m,4H),1.87(m,4H),2.65(t,J＝8Hz,4H),3.16(m,4H),5.29(s,4H,C5),5.43(s,4H,C22),6.48(s,2H,C20-OH),7.31(s,2H,C14),7.60(m,2H,C11),7.94(s,2H,C9),8.18(d,J＝8Hz,2H,C12)。
采用质谱法对产物结构进行确证，质谱图如图6所示，MS(ESI)m/z for C60H66N4O12[M+H]+:1035.48203。
实施例7：
十八烷基二酸桥连SN38二聚体前药的合成
将0.25mmol的十八烷基二酸溶于10mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，另将0.05mmol的4-二甲氨基吡啶(DMAP)及1mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和0.5mmol的SN38溶于20mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，并与十八烷基二酸的无水N,N-二甲基甲酰胺溶液混合，室温条件下搅拌20h。再加入0.5mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.05mmol 4-二甲氨基吡啶，室温条件下搅拌20h，上述反应全程都在N2保护下进行，所得产物经制备液相分离纯化。
采用1H-NMR对产物结构进行确证。波谱解析结果如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)δ0.88(t,J＝8Hz,6H),1.25(t,J＝8Hz,6H),1.30(m,28H),1.67(m,4H),1.87(m,4H),2.65(t,J＝8Hz,4H),3.15(m,4H),5.30(s,4H,C5),5.43(s,4H,C22),6.54(s,2H,C20-OH),7.25(s,2H,C14),7.63(m,2H,C11),7.97(s,2H,C9),8.16(d,J＝8Hz,2H,C12)。
采用质谱法对产物结构进行确证，质谱图如图7所示，MS(ESI)m/z for C62H70N4O12[M+H]+:1063.51109。
实施例8：
PEG修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药自组装纳米粒的制备
精密称取0.0125mg DSPE-PEG2K和0.05mg实施例1中的前药，精密称取0.05mgDSPE-PEG2K和0.2mg实施例2-7中的前药。用200μL四氢呋喃将其溶解，搅拌下将该四氢呋喃溶液缓缓滴加到2mL去离子水中，自发形成粒径均匀的PEG修饰的非敏感键桥连SN38二聚体前药自组装纳米粒。用减压旋转蒸发法去除四氢呋喃，得到不含有机试剂的纳米胶体溶液。见表1。
表1.PEG修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药自组装纳米粒的粒径、粒径分布和载药量
结果表明：不同非敏感键桥连的SN38二聚体前药均可以形成自组装纳米粒，但组装能力不同。中间链长最短的SN38-C5-SN38在超低浓度0.02mg/ml的情况下无法自组装形成粒径均一纳米粒。SN38-C8-SN38、SN38-C16-SN38、SN38-C18-SN38由于中间链长过短或过长，同样无法在0.1mg/ml情况下自组装形成粒径大小合适且均一的纳米粒。只有当中间链接链链长合适的SN38-C10-SN38、SN38-C12-SN38、SN38-C14-SN38，能在0.1mg/ml情况下可以自组装形成粒径为120nm左右且均一的纳米粒。
实施例9：
PEG修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药自组装纳米粒的放置稳定性
精密称取0.05mg DSPE-PEG2K和0.2mg实施例1-7中的前药，精密称取0.2mg DSPE-PEG2K和0.8mg实施例1-7中的前药，按照实施例8中的制备方法制备PEG修饰非敏感键桥连的SN38二聚体前药。并对其进行室温稳定性考察，结果如图8所示。
结果表明：不同非敏感键桥连的SN38二聚体前药组装能力和组装稳定性不同。如图8所示，在0.1mg/ml情况下，SN38-C5-SN38无法形成纳米粒，SN38-C8-SN38、SN38-C18-SN38由于SN38二聚体中间链接链过短或过长，形成的纳米粒在14天内无法保持稳定。在0.4mg/ml情况下，在0.1mg/ml情况下无法形成稳定纳米粒的SN38-C5-SN38、SN38-C8-SN38、SN38-C18-SN38此时无法形成纳米粒，SN38-C14-SN38、SN38-C16-SN38形成的纳米粒在14天内无法保持稳定。只有SN38-C10-SN38、SN38-C12-SN38形成的纳米粒可以在0.1mg/ml和0.4mg/ml情况下保持稳定。说明中间链接链长对纳米粒的组装能力和组装稳定性有巨大影响，只有合适的链长才能形成最稳定的纳米粒。这有助于纳米粒提高通过实体肿瘤的通透性和滞留效应实现肿瘤靶向蓄积。
实施例10：
非敏感键桥连的SN38二聚体前药溶液剂的体外释放试验
以含30％甲醇的pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)为释放介质，考察非敏感键桥连的SN38二聚体前药的母药释放和前药降解情况。精密称取1mg实施例1-7中的前药，加入1mL二甲基亚砜中。取200μL上述二甲基亚砜溶液加入30mL释放介质中。在37℃条件下，于设定的时间点取样，通过高效液相色谱测定释放出的SN38浓度。结果如图9所示，母药释放速率为SN38-C5-SN38>SN38-C8-SN38>SN38-C10-SN38≈SN38-C12-SN38>SN38-C14-SN38≈SN38-C16-SN38>SN38-C18-SN38。前药降解速率与母药释放速率相反，但SN38-C5-SN38、SN38-C8-SN38、SN38-C10-SN38、SN38-C12-SN38均在24h后降解完全。表明二聚体前药的中间连接链的长度越长，化学稳定性越好，母药药释放和前药降解速率越慢，影响临床应用。
实施例11：
非敏感键桥连的SN38二聚体前药溶液剂的细胞毒性
采用MTT法考察PEG修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药溶液剂的细胞毒性对小鼠结肠癌(CT26)细胞的细胞毒性。首先将状态良好的细胞消化，用培养液稀释至5×103cells/ml细胞吹匀后于96孔板中每孔加入细胞悬液200μL，置37℃，5％CO2的培养箱中孵育24h使其贴壁。待细胞贴壁后加SN38溶液剂或实施例10中制备非敏感键桥连的SN38二聚体前药溶液剂(以SN38浓度计算)，稀释均用相应的培养液，并用0.22μm滤膜无菌过滤。受试溶液每孔加入200μL，每个浓度3个平行孔。对照组，即不加待测药液，单一补加200μL培养液，置培养箱中和细胞共同孵育。于加药的48h后，将96孔板取出，每孔加入5mg/ml MTT溶液20μL，置培养箱中孵育4h后移除培养基，并每孔加入200μL DMSO于振荡器上振荡10min以充分溶解蓝紫色结晶物。设定A1孔(只含有200μL DMSO)为调零孔。使用酶标仪在490nm处测定各孔调零后的吸光度值。
对细胞毒性实验结果进行分析，计算得出溶液剂和前药纳米粒的半数抑制浓度(IC50)。结果如表2所示。
表2.PEG修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药溶液剂的细胞毒性
结果表明，与SN38溶液剂相比，由于SN38-C5-SN38、SN38-C8-SN38释放过快且前药可以完全降解成母药，因此细胞毒与SN38溶液剂无显著性差别。其他前药细胞毒性降低，与前药降解速率和母药释放速率趋势相对应，即SN38≈SN38-C5-SN38≈SN38-C8-SN38>SN38-C10-SN38≈SN38-C12-SN38>SN38-C14-SN38≈SN38-C16-SN38>SN38-C18-SN38。
实施例12：
PEG修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药自组装纳米粒的细胞毒性
采用MTT法考察PEG修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药自组装纳米粒的细胞毒性对小鼠结肠癌(CT26)细胞的细胞毒性。首先将状态良好的细胞消化，用培养液稀释至5×103cells/ml细胞吹匀后于96孔板中每孔加入细胞悬液200μL，置37℃，5％CO2的培养箱中孵育24h使其贴壁。待细胞贴壁后加SN38溶液剂或实施例8中制备的PEG修饰的SN38-脂肪醇前药自组装纳米粒(以SN38浓度计算)。本实验中药物溶液与PEG修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药自组装纳米粒制剂的配制和稀释均用相应的培养液，并用0.22μm滤膜无菌过滤。受试溶液每孔加入200μL，每个浓度3个平行孔。对照组，即不加待测药液，单一补加200μL培养液，置培养箱中和细胞共同孵育。于加药的48h后，将96孔板取出，每孔加入5mg/ml MTT溶液20μL，置培养箱中孵育4h后移除培养基，并每孔加入200μLDMSO于振荡器上振荡10min以充分溶解蓝紫色结晶物。设定A1孔(只含有200μL DMSO)为调零孔。使用酶标仪在490nm处测定各孔调零后的吸光度值。
对细胞毒性实验结果进行分析，计算得出溶液剂和前药纳米粒的半数抑制浓度(IC50)。结果如表3所示。
表3.PEG修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药自组装纳米粒的细胞毒性
结果表明，细胞毒趋势为SN38溶液剂>SN38-C10-SN38 NPs≈SN38-C12-SN38 NPs>SN38-C14-SN38 NPs≈SN38-C16-SN38 NPs>SN38-C18-SN38 NPs>SN38-C8-SN38 NPs>SN38-C5-SN38 NPs。由于细胞毒是由细胞摄取和SN38释放速率(化学稳定性)两方面决定的。与实施例11相比，SN38-C5-SN38 NPs、SN38-C8-SN38 NPs由于制剂稳定性过差，影响细胞摄取，导致细胞毒性降低。而SN38-C10-SN38 NPs、SN38-C12-SN38 NPs由于SN38释放速率较快、制剂稳定，因此对肿瘤细胞具有更高的细胞毒性。
实施例13：
PEG修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药自组装纳米粒的在体内抗肿瘤实验
根据上述实验，我们选取了具有代表性的SN38-C8-SN38 NPs(短链)，SN38-C12-SN38NPs(中链)，SN38-C16-SN38 NPs(长链)进行体内抗肿瘤实验。将小鼠结肠癌细胞悬液(4T1,5x106 cells/100μL)接种于雄性BALB/c小鼠背侧皮下。待肿瘤体积生长至100mm3时，将荷瘤小鼠随机分为6组，每组5只。磷酸盐缓冲液(PBS)，SN38溶液剂，SN38-C8-SN38 NPs，SN38-C12-SN38 NPs，SN38-C16-SN38 NPs以及CAMPTO。给药所用的纳米粒为实施例9中制备的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒，给药剂量为2.5mg/kg(以SN38浓度计算)。每隔1天给药1次，连续给药5次。给药后，每天测量肿瘤体积，检测小鼠的存活状态和体重变化情况，结果如图10和图11所示。最后一次给药后一天将小鼠处死，获取器官和肿瘤，进行进一步分析评价。肿瘤负荷图见图12，血液常规指标图见图14生化常规指标图见图15。
图10表明，在PBS组中，肿瘤体积迅速增长，在第10天达到1500mm3左右。SN38溶液剂，SN38-C8-SN38 NPs，SN38-C16-SN38 NPs以及CAMPTO均在一定程度上抑制了肿瘤的生长。相比之下，SN38-C12-SN38 NPs表现出更高的抗肿瘤效果。这是由于SN38-C12-SN38NPs具有良好的制剂稳定性，同时具有较快的释药速率和较好的细胞毒。图11表明，SN38溶液剂、CAMPTO、前药自组装纳米粒组体重无显著变化。其中，肿瘤负荷图12和肿瘤图13表明，SN38-C12-SN38 NPs组的荷瘤率显著低于其他组。图14表明，在中性粒细胞指标中，只有SN38-C12-SN38 NPs组为正常，证明SN38-C12-SN38 NPs组安全性最好。图15表明，SN38-C8-SN38 NPs组的肝功指标谷丙转氨酶高于标准值，安全性较差。综上所述，在较低剂量下，十二烷二酸作为桥连链接的SN38二聚体前药自组装形成的SN38-C12-SN38 NPs在具有强力抗肿瘤效果的同时，没有造成明显的系统毒性，是一个安全有效的化疗药物递送系统。

Claims (5)

1.一种非敏感键桥连的SN38二聚体前药的自组装纳米粒的制备方法，其特征在于，其具体为DSPE-PEG2K修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药自组装纳米粒；所述非敏感键桥连的SN38二聚体前药的结构式为：
以十二烷基二酸为链接键桥连的SN38-C12-SN38
所述DSPE-PEG2K修饰的非敏感键桥连的SN38二聚体前药自组装纳米粒的制备方法包括：
将十二烷基二酸溶于N,N-二甲基甲酰胺中搅拌均匀；将部分DMAP、EDCI及SN38溶于N,N-二甲基甲酰胺中搅拌均匀，然后与十二烷基二酸溶液混合，N2保护下，搅拌；向混合溶液中补加剩余EDCI和DMAP，室温继续搅拌，产物分离纯化，制得非敏感键桥连的SN38二聚体前药；按摩尔比，十二烷基二酸:EDCI:DMAP:SN38＝1:(0.1-10):(0.1-10):(2-10)；
将非敏感键桥连的SN38二聚体前药与DSPE-PEG2K溶解到四氢呋喃中，搅拌下，将该溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒，除去溶剂，得到不含有机溶剂的纳米胶体溶液。
2.根据权利要求1所述的非敏感键桥连的SN38二聚体前药自组装纳米粒的制备方法，其特征在于，非敏感键桥连的SN38二聚体前药与DSPE-PEG2K的质量比为1:(0.1-1)。
3.权利要求1或2所述的制备方法制得的非敏感键桥连的SN38二聚体前药自组装纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
4.权利要求1或2所述的制备方法制得的非敏感键桥连的SN38二聚体前药自组装纳米粒在制备注射给药、口服给药或局部给药系统中的应用。
5.权利要求1或2所述的制备方法制得的非敏感键桥连的SN38二聚体前药自组装纳米粒在制备提高疗效、降低毒性药物传递系统中的应用。
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