CN111202850A

CN111202850A - 一种喜树碱前药及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111202850A
Application number: CN201911069553.1A
Authority: CN
Inventors: 柯学; 戴佳伶; 王梦然; 慈天元
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2019-11-05
Filing date: 2019-11-05
Publication date: 2020-05-29

Abstract

本发明公开了一种喜树碱前药及其制备方法和应用，所述喜树碱前药是以维生素B6作为亲水端、喜树碱作为疏水端，两部分通过二硫键相连。该喜树碱前药可以在水中自组装形成pH/氧化还原双敏感的纳米药物递送系统，该纳米药物递送系统具有一定的酸敏感性和氧化还原敏感性，在肿瘤微环境高浓度谷胱甘肽作用下，二硫键会迅速断裂，快速释放喜树碱，可以高效向肿瘤部位递送药物喜树碱，有望进一步提高喜树碱药物传递的安全性和有效性。

Description

一种喜树碱前药及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种pH/氧化还原双敏感的喜树碱-维生素B6前药自组装纳米传递系统。

背景技术

喜树碱（Camptothecin，CPT）系从我国特有植物喜树中提取得到的一类色氨酸-萜烯生物碱，为喜树所分离单体中抗癌效果最显著的化合物，它通过抑制拓扑异构酶 I 发挥抗癌作用，主要用于肝癌、白血病等疾病。喜树碱临床应用主要面临两大问题：第一，水溶性差；第二，其活性酯会在中性及碱性的条件下水解开环，生理条件下平衡闭环率低。近年来，研究者提出了许多喜树碱类抗肿瘤药物递送系统，如胶束、脂质体、纳米晶、纳米乳等。但这些传统的纳米药物传递系统存在载药量低、稳定性差、药物在储存过程中容易结晶及药物容易从纳米制剂中提前泄露出来等缺陷，因此，设计一种新型纳米药物递送系统持续高效递送喜树碱具有一定意义。

前药纳米药物递送系统是将前药策略与纳米技术结合为一体，具有结构简单、载药量高、易形成丰富的纳米结构等独特优势，改善了传统化疗药物的生物利用度、代谢稳定性和靶向性，降低了其毒副作用和给药量，已经在临床上取得很好的治疗效果。传统前药纳米药物递送系统，通常采用聚合物材料以化学键的方式连接药物，该策略可以有效防止药物的结晶和提前泄露，提高制剂稳定性，但同时聚合物材料的高分子量也导致药物递送系统结构复杂，合成困难、载药量低，药物释放后，还需考虑聚合物材料自身消化及代谢对生理的影响。

小分子前药纳米药物递送系统是利用小分子载体材料（例如低分子量聚乙二醇、油酸、角鲨烯酸等）以化学键的方式连接药物。与传统前药纳米药物递送系统相比，具有精确的化学结构，药物组成可以通过分子设计来调整，载药量高，不需要过多考虑药物释放后载体材料导致的不良反应。此外，高载药量能有效提高药物的递送效率，在摄取相同数量纳米粒的条件下，高载药量的纳米粒将会“携带”更多的药物进入细胞，迅速达到有效治疗浓度，实现高效的抗肿瘤作用。因此，小分子前药纳米药物递送系统成为重要的发展方向。但小分子纳米前药的缺点是药物载体仍然会进入正常组织中。为减少抗肿瘤药物在正常组织内释放，降低药物的不良反应，可以利用环境响应型的概念实现药物在肿瘤部位的靶向释放与蓄积。

发明内容

本发明的目的是克服上述现有技术的不足，提供一种pH/氧化还原双敏感的喜树碱-维生素B6前药自组装纳米传递系统，兼具高载药能力和高选择性释药能力的双重优势，可进一步提高喜树碱药物传递的安全性和有效性。

一种喜树碱前药，是以维生素B6作为亲水端、喜树碱作为疏水端，两部分通过二硫键相连；

所述喜树碱前药的结构式如下式所示：

。

上述喜树碱前药的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，将喜树碱、4-二甲氨基吡啶、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、3,3’-二硫代二丙酸在无水二氯甲烷中进行反应，制得喜树碱-20-O-3,3’-二硫代二丙酸酯；

步骤2，将喜树碱-20-O-3,3’-二硫代二丙酸酯、维生素B6、4-二甲氨基吡啶、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在无水二甲基亚砜中进行反应，即可制得喜树碱前药。

上述喜树碱前药在制备治疗肿瘤药物中的应用。

一种纳米药物递送系统，是上述喜树碱前药在溶剂中自组装形成纳米粒后制成。

进一步地，所述溶剂为纯水、缓冲溶液、体液、组织培养液或其他不以有机溶剂为主体的溶剂介质。

本发明以维生素B6为亲水段同时作为pH敏感性官能团、喜树碱为模型药物同时作为疏水端、二硫键作为氧化还原敏感键连接亲水段和疏水端，制成喜树碱前药。该喜树碱前药可以在水中自组装形成pH/氧化还原双敏感的纳米药物递送系统，该纳米药物递送系统具有一定的酸敏感性和氧化还原敏感性，在肿瘤微环境高浓度谷胱甘肽作用下，二硫键会迅速断裂，快速释放喜树碱，可以高效向肿瘤部位递送药物喜树碱，有望进一步提高喜树碱药物传递的安全性和有效性。

附图说明

图1为本发明中氧化还原敏感性实验的粒径变化对比图。

图2为本发明中酸敏感性实验的粒径变化对比图。

图3为本发明中喜树碱体外累计释放图。

图4为本发明中细胞毒性实验的各组细胞存活率对比图。

具体实施方式

为减少抗肿瘤药物在正常组织内释放，降低药物的不良反应，可以利用环境响应型的概念实现药物在肿瘤部位的靶向释放与蓄积。目前，有多种环境响应型纳米给药系统，如 pH 响应型、氧化还原响应型性、温度响应型、磁场相响应型、超声温度响应型以及多重响应型等。其中，pH响应型和氧化还原响应型是根据肿瘤部位微环境的特点而构建，不需要外加辅助刺激条件，被认为是理想的环境响应型纳米给药系统。

氧化还原响应型：二硫键（又称S-S键）是一种还原敏感的化学键，它可以被肿瘤细胞内微环境高浓度的谷胱甘肽（Glutathione，GSH）还原成两个巯基(-SH)而断裂。因此，可以利用肿瘤组织与正常组织之间谷胱甘肽的浓度差, 在药物载体中引入二硫键制备还原响应型纳米药物递送系统。使其在血液循环时，体系稳定存在并保护药物不释放，而进入肿瘤细胞后在高浓度的谷胱甘肽作用下，快速释放游离药物，提高治疗效果。因此，具有氧化还原敏感的小分子前药纳米药物递送系统日益成为近些年研究的热点。

pH响应型：维生素B6（VitB6）作为亲水性的小分子天然材料其pKa为5.6，在血液pH7.4环境中VitB6荷负电；在肿瘤细胞的微酸性环境中，VitB6荷正电。因此可以利用维生素B6作为小分子前药纳米药物递送系统的pH响应型官能团，使其在血液循环中荷负电从而避免被网状内皮系统摄取，但在肿瘤部位快速转变为正电荷，促进肿瘤细胞摄取和溶酶体逃逸，从而增强细胞内药物的释放。

基于以上背景，传统的前药纳米药物递送系统载药量较低，聚合物材料难以消化代谢，以及仅靠单一的环境响应难以达到药物的高效释放，因此本发明设计采用二硫键作为化学连接臂，将小分子维生素B6与喜树碱连接，合成喜树碱的新型小分子前药（CPT-s-s-VitB6）。喜树碱作为模型药物同时作为疏水段，VitB6作为小分子亲水材料同时作为pH敏感型官能团，二硫键作为连接臂的同时作为氧化还原敏感键。该喜树碱小分子前药可以在水中自组装形成纳米药物递送系统，不但能够保护喜树碱不被过快的清除和抑制喜树碱的突释，而且具有pH/氧化还原双敏感，从而达到高选择性的释药能力，与此同时能够实现定量及较高的载药量。

具体来说，所形成的纳米药物递送系统：首先，具有酸敏感性，VitB6可以在小于pH5.6的条件下完全质子化而带有正电荷，使其在内涵体的弱酸性环境下带正电荷。所构筑的VitB6（pH响应部分）介导的pH敏感小分子前药纳米制剂具备的电荷可逆性反转功能，不仅可以提高纳米前药在血液循环中的稳定性，还可以在酸性条件下促进肿瘤细胞摄取和溶酶体逃逸，从而增强细胞内药物的释放。其次，具有氧化还原敏感性，其在血液循环时，体系稳定存在并保护药物不释放，而进入肿瘤细胞后在高浓度的GSH作用下，二硫键快速发生断裂，快速释放游离药物，提高治疗效果。

所述的小分子喜树碱前药纳米药物递送系统在体内的作用机制：（1）该小分子前药纳米药物递送系统经注射给药进入血液后，通过 EPR效应（Enhanced Permeabilityand Retention effect），被动靶向于肿瘤部位；（2）通过早期内涵体转运至溶酶体中，在溶酶体酸性条件下，VitB6发生质子化后产生“质子海绵效应”，溶酶体渗透压增大，使复合物从溶酶体中逃逸出来而进入细胞质中；（3）在肿瘤细胞微环境高浓度的GSH刺激下，二硫键发生断裂，CPT快速释放进入细胞核，发挥抗肿瘤作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，未详细描述的技术均按照本领域人员熟知的标准方法进行。本申请中提及的试剂等均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作为举例，对本发明不是唯一的。可分别用其它适合的工具或生物材料来替代。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

喜树碱前药（CPT-s-s-VitB6）的制备

首先对二氯甲烷进行无水处理。称取100 mg喜树碱（CPT），70.7 mg 4-二甲氨基吡啶（DMAP），222.7 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），304.5 mg 3,3’-二硫代二丙酸（DPA）置于500 mL三颈瓶内，溶于250 mL无水二氯甲烷，超声使充分溶解，在氮气的保护下40°C反应24h。以二氯甲烷/甲醇（v/v=20:1）为展开剂进行薄层色谱跟踪反应，喜树碱的RF值为0.6左右，CPT-20-O-3,3’-二硫代二丙酸酯的RF值为0.3左右，根据喜树碱的荧光斑点和CPT-20-O-3,3’-二硫代二丙酸酯的荧光斑点判断反应进行的情况。反应完毕后，有机相用0.01M盐酸萃取两次，然后用蒸馏水萃取两次，有机相旋转蒸发除去二氯甲烷，得到淡黄色固体。将该产物在硅胶柱上用二氯甲烷/甲醇（v/v=10:1）分离，减压蒸馏，真空干燥，得到黄色结晶状固体，即CPT-20-O-3,3’-二硫代二丙酸酯（CPD）。

取制备的CPD 54 mg，VitB6 61.6 mg，DMAP 48.8 mg，EDC 96 mg于25 mL圆底烧瓶内，溶于5 mL无水DMSO，抽真空通氮气（反复5次），在氮气的保护下，30°C反应24 h。反应完毕后，将反应液转移至截留分子量为300 MW透析袋内，透析24h，每隔6h换一次水，透析完毕后，进行冷冻干燥，得到淡红色粉末，即为产物CPT-s-s-VitB6。

实施例2

利用直接水溶法制备纳米粒溶液，取实施例1中所制备的产物CPT-s-s-VitB6 5 mg溶解于10 mL去离子水中，然后探头超声30 min（功率为400 w）。探头超声结束后，用0.45μm孔径的注射器式过滤器过滤，即得纳米粒溶液。

实施例3

利用透析法制备纳米粒溶液，取实施例1中所制备的产物CPT-s-s-VitB6 5 mg充分溶解于10 mL二甲基亚砜（DMSO），并转移至截留分子量为5000 Da的透析袋内。透析液为1 L的去离子水，每隔6 h换一次水，透析24 h。透析结束后，将透析袋内的液体探头超声30 min（功率为400 w）。探头超声结束后，用0.45μm孔径的注射器式过滤器过滤，即得纳米粒溶液。

实施例4

利用纳米沉淀法制备纳米粒溶液，取实施例1中所制备的产物CPT-s-s-VitB6 5 mg充分溶解于1 mL四氢呋喃（THF），在磁力搅拌的作用下逐滴滴加到10 mL去离子水中，在通风橱内继续搅拌至THF全部蒸发除去。探头超声30 min（功率为400 w），探头超声结束后，用0.45μm孔径的注射器式过滤器过滤，即得纳米粒溶液。

试验例

1、粒径、电位、载药量测定

分别取实施例2、3、4的CPT-s-s-VitB6纳米粒溶液2 mL，利用粒度仪测定其粒径和电位。再分别取实施例2、3、4的CPT-s-s-VitB6纳米粒溶液一定量，利用紫外分光光度计测定其载药量。

表1 不同组粒径（nm）、电位（mV）、载药量（%）结果

样品组	名称	粒径（nm）	电位（mV）	载药量（%）
					1	直接水溶法	367.29±6.7	-8.49±4.2	3.6%
2	透析法	259.86±5.7	-12.93±5.8	7.8%
					3	纳米沉淀法	157.83±3.2	-11.26±28	36.3%

由上表可知，本发明提供的纳米粒载药量最高可达36%，具有高载药量，其将会“携带”更多的药物进入细胞，迅速达到有效治疗浓度，实现高效的抗肿瘤作用。

由上表可知，本发明提供的纳米粒粒径粒径为157.83±3.2 nm可以通过EPR效应，被动靶向到肿瘤部位，从而提高对肿瘤部位的药效，减少对其他组织器官的毒副作用。

2、氧化还原敏感性测定

取实施例4中所制备的纳米粒溶液与含有不同浓度二硫苏糖醇（DTT）的磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7.4，10mM）孵育，DTT的终浓度为0、10 mM，孵育温度为37°C。测定纳米粒在2、4、8、12、24 h的粒径。CPT-s-s-VitB6纳米粒的氧化还原敏感性结果如图1所示，纳米粒在没有DTT加入时，随着时间的延长纳米粒的粒径均保持在150 nm左右；当加入10 mM DTT时，随着孵育时间的延长，纳米粒的粒径逐渐增加，表明该纳米粒溶液在经过10 mM DTT处理后，二硫键发生断裂纳米粒结构破坏，粒径增大，具有氧化还原敏感性。

3、酸敏感性测定

分别配置不同pH磷酸盐缓冲溶液（pH=5.0、pH=5.5、pH=6.0、pH=6.5、pH=7.4），取实施例4中所制备的纳米粒溶液400 μL，分别与1600 μL不同pH磷酸盐缓冲液孵育4 h，分别测定其粒径。CPT-s-s-VitB6纳米粒的酸敏感性结果如图2所示，纳米粒溶液在不同pH条件下孵育后，随着pH的降低，粒径逐步增加，纳米粒结构发生破裂沉降，具有酸敏感性。

4、体外释放实验

用动态膜透析法进行CPT体外释放实验，选择含有不同浓度DTT（0、10 mM）的0.5 %吐温80的PBS溶液作为释放介质。取1mL CPT-s-s-VitB6纳米粒溶液置于透析袋中(截留分子量为1000Da)，然后将透析袋置于上述不同的30mL释放介质中, 每组释放介质中含有三个样品，于37°C恒温震荡箱中孵育。在给定的时间点取释放介质量1 mL，并补以相同体积的释放介质。测定各时间点释放介质的荧光强度，计算CPT的含量及各时间点的累计释放量，以时间为横坐标，各时间点的累计释放量为纵坐标，绘制CPT体外累计释放曲线。CPT体外累计释放曲线图如图3所示，CPT在CPT-s-s-VitB6纳米粒中的释放具有氧化还原敏感特性，在没有DTT的PBS溶液中，CPT在24小时内从CPT-s-s-VitB6纳米粒中释放40%；在含有10mM DTT的PBS溶液中，CPT在24小时的累计释放量达到92%，说明CPT-s-s-VitB6纳米粒可以在生理条件下稳定存在，在还原性环境下响应性释放药物。

5、细胞毒性实验

用胰蛋白酶消化处于对数生长期的结肠癌细胞CT-26并将其制成单细胞悬液后，按照每孔5000个细胞的数量将其接种到96孔板中培养过夜。待细胞贴壁后，加入用培养基稀释的一系列不同浓度的CPT，CPT-s-s-VitB6纳米粒溶液，使样品的最终浓度为0.01，0.05，0.1，0.5，1，5，10 μg/mL，未加药物的培养基作为空白对照。每个样品的每个浓度设立六个复孔，于孵箱中分别培养24 h。达到孵育时间后，每个孔中加入20 μL MTT溶液，继续培养4h，然后吸取上清，每个孔中加入200 μL DMSO溶液，在酶标仪的490 nm波长处测定每个孔吸光度，并计算每个孔的细胞存活率。纳米粒的细胞毒性结果如图4所示，CPT以及CPT-s-s-VitB6纳米粒溶液都随着CPT浓度的增加，对结肠癌细胞CT-26的毒性显著增加，表明CPT-s-s-VitB6纳米粒对结肠癌细胞CT-26具有显著的杀伤能力。

Claims

1.一种喜树碱前药，其特征在于：以维生素B6作为亲水端、喜树碱作为疏水端，两部分通过二硫键相连；

所述喜树碱前药的结构式如下式所示：

。

2.权利要求1所述喜树碱前药的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

3.权利要求1所述的喜树碱前药在制备治疗肿瘤药物中的应用。

4.一种纳米制剂，其特征在于：是由权利要求1所述的喜树碱前药在溶剂中自组装形成纳米粒后制成。

5.根据权利要求4所述的纳米制剂，其特征在于：所述溶剂为纯水、缓冲溶液、体液、组织培养液或其他不以有机溶剂为主体的溶剂介质。