CN112656765B - 一种主动靶向抗癌药物纳米粒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种主动靶向抗癌药物纳米粒的制备方法，本发明涉及抗癌药物制备领域。本发明要解决现有抗肿瘤药物靶向性差的技术问题。方法：一、制备3,3’‑二硫代二丙酸酐；二、制备喜树碱‑20‑O‑3,3’‑二硫代二丙酸酯；三、制备CUR‑FA；四、制备CPT‑ss‑CUR‑FA；五、制备CPT‑ss‑CUR‑FA纳米粒子。本发明制备的纳米粒能通过增强渗透和滞留效应被动靶向于肿瘤部位，药物进入肿瘤细胞后在还原剂的作用下断开二硫键，P糖蛋白抑制剂姜黄素与喜树碱发生协同抗肿瘤作用，从而增强对肿瘤部位的选择性和疗效，降低对正常组织的副作用。本发明制备的主动靶向抗癌药物纳米粒用于癌症治疗领域。
Description
技术领域
本发明涉及抗癌药物制备领域。
背景技术
肿瘤在目前仍然是致死率非常高的一大类疾病。绝大多数的抗肿瘤药物具有水溶性差，靶向性差和细胞毒性的特点，不能直接到达肿瘤细胞，且会对正常细胞造成损害，不良反应发生频率高且严重。而喜树碱，姜黄素均是治疗肿瘤非常有效的药物，且具有协同抗肿瘤作用。因此如何将两者连接在一起制成复合物，使两者同时进入到细胞内发挥更好的药效，是目前研究的重点。
发明内容
本发明要解决现有抗肿瘤药物靶向性差的技术问题，而提供一种主动靶向抗癌药物纳米粒的制备方法。
一种主动靶向抗癌药物纳米粒的制备方法，具体按以下步骤进行：
一、将3,3’-二硫代二丙酸(DTPA)溶解在乙酸酐中，升温至反应温度进行反应，然后减压回收乙酸酐获得产物A，将产物A用冰乙醚洗涤，获得3,3’-二硫代二丙酸酐(DTDPA)；
二、将喜树碱(CPT)和步骤一获得的3,3’-二硫代二丙酸酐(DTDPA)加入到无水吡啶中，搅拌溶解，冰水浴条件下，加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)的无水吡啶溶液，升温至反应温度进行反应，减压蒸除溶剂，获得产物B，采用稀盐酸溶液洗涤产物B，再用甲醇溶解，滤除不溶性杂质，然后回收甲醇，真空干燥，得到固体粉末喜树碱-20-O-3,3’-二硫代二丙酸酯，即为CPT-ss-COOH；
三、将叶酸(FA)和碳化二亚胺(EDCI)加入到无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌溶解，升温至30～40℃保持0.8～1.2h，活化叶酸端羧基，然后采用冰水浴冷却至3～5℃，加入姜黄素(CUR)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，升温至反应温度进行反应，减压蒸除溶剂，获得固体物A，将固体物A用水溶解，滤除不溶性杂质，浓缩挥干水分，再溶解到甲醇中，滤除不溶性杂质，减压蒸除溶剂，得到CUR-FA；
四、将碳化二亚胺(EDCI)和步骤二获得的CPT-ss-COOH加入到无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌溶解，保持0.8～1.2h活化羧基，然后加入步骤三获得的CUR-FA，冰水浴条件下加入4-二甲氨基吡啶的无水N,N-二甲基甲酰胺溶液，升温至反应温度进行反应，反应结束后减压蒸除溶剂获得固体物B，用水洗涤固体物B，然后干燥，再采用硅胶柱分离，得到CPT-ss-CUR-FA；
五、将步骤四获得的CPT-ss-CUR-FA溶解到无水乙醇中，搅拌同时加入到含有微量聚乙烯醇的去离子水溶液中，升温挥发除去无水乙醇，然后冷冻干燥，得到CPT-ss-CUR-FA纳米粒子，即所述主动靶向抗癌药物纳米粒，完成该方法。
其中CPT-ss-COOH为喜树碱-20-O-3,3’-二硫代二丙酸酯，CUR-FA为姜黄素-叶酸。
肿瘤细胞表面具有高表达叶酸受体，本发明将药物分子连接上叶酸，能很好的达到主动靶向的作用，药物分子主动靶向肿瘤细胞，通过内吞作用将该复合物导入到肿瘤细胞内，从而提高治疗效果，降低不良反应的发生频率及严重性。
同时由于喜树碱，姜黄素均是治疗肿瘤非常有效的药物，而且他们具有协同抗肿瘤作用。并且姜黄素作为一种P糖蛋白抑制剂能很好的减少细胞内喜树碱的泵出而提高药物在细胞内的浓度，从而达到更好的治疗效果。因此本发明将两者连接在一起制成复合物能够使两者同时进入到细胞内发挥更好的药效。
谷胱甘肽是一种较强的还原剂，肿瘤细胞内的谷胱甘肽的浓度是细胞外浓度的7-10倍。二硫键是一种很容易被还原剂还原断开的化学键。所以本发明将喜树碱与姜黄素通过二硫键连接后再与叶酸相连，并将其制成纳米粒，即可达到主动靶向又可将其同时导入到肿瘤细胞内，在谷胱甘肽的作用下断开二硫键释放出游离的喜树碱和姜黄素，使两者发挥协同抗肿瘤作用。
本发明的有益效果是：
1)由于肿瘤细胞内谷胱甘肽的浓度是正常细胞的7-10倍，而谷胱甘肽又是一种较强的还原剂，利用该特点，本发明中将喜树碱与姜黄素通过二硫键连接，该复合物进入细胞后，很容易在谷胱甘肽的作用下使二硫键断开释放出游离的喜树碱和姜黄素而发挥抗肿瘤作用。
2)喜树碱与姜黄素均具有抗肿瘤作用，同时两种药物又具有协同作用。
3)姜黄素是一种P糖蛋白抑制剂，能很好的减少P糖蛋白对喜树碱的泵出，从而提高细胞内喜树碱的浓度而发挥更好的抗肿瘤效果。
4)本发明制备的纳米粒的粒径为10-800nm。纳米粒能通过增强渗透和滞留效应被动靶向于肿瘤部位，药物进入肿瘤细胞后在还原剂的作用下断开二硫键，P糖蛋白抑制剂姜黄素与喜树碱发生协同抗肿瘤作用，从而增强对肿瘤部位的选择性和疗效，降低对正常组织的副作用。本发明将药物制成纳米粒，能通过该效应达到被动靶向的目的，同时在叶酸的主动靶向的作用下改变药物在体内的分布，降低抗癌药物的不良反应发率及严重性，提高患者用药的顺应性。
本发明制备的主动靶向抗癌药物纳米粒用于癌症治疗领域。
附图说明
图1为实施例一制备的CPT-ss-CUR-FA纳米粒子的透射电镜图；
图2为实施例一制备的主动靶向抗癌药物纳米粒的红外谱图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，还包括各具体实施方式之间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式一种主动靶向抗癌药物纳米粒的制备方法，具体按以下步骤进行：
一、将3,3’-二硫代二丙酸(DTPA)溶解在乙酸酐中，升温至反应温度进行反应，然后减压回收乙酸酐获得产物A，将产物A用冰乙醚洗涤，获得3,3’-二硫代二丙酸酐(DTDPA)；
二、将喜树碱(CPT)和步骤一获得的3,3’-二硫代二丙酸酐(DTDPA)加入到无水吡啶中，搅拌溶解，冰水浴条件下，加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)的无水吡啶溶液，升温至反应温度进行反应，减压蒸除溶剂，获得产物B，采用稀盐酸溶液洗涤产物B，再用甲醇溶解，滤除不溶性杂质，然后回收甲醇，真空干燥，得到固体粉末喜树碱-20-O-3,3’-二硫代二丙酸酯，即为CPT-ss-COOH；
三、将叶酸(FA)和碳化二亚胺(EDCI)加入到无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌溶解，升温至30～40℃保持0.8～1.2h，活化叶酸端羧基，然后采用冰水浴冷却至3～5℃，加入姜黄素(CUR)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，升温至反应温度进行反应，减压蒸除溶剂，获得固体物A，将固体物A用水溶解，滤除不溶性杂质，浓缩挥干水分，再溶解到甲醇中，滤除不溶性杂质，减压蒸除溶剂，得到CUR-FA；
四、将碳化二亚胺(EDCI)和步骤二获得的CPT-ss-COOH加入到无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌溶解，保持0.8～1.2h活化羧基，然后加入步骤三获得的CUR-FA，冰水浴条件下加入4-二甲氨基吡啶的无水N,N-二甲基甲酰胺溶液，升温至反应温度进行反应，反应结束后减压蒸除溶剂获得固体物B，用水洗涤固体物B，然后干燥，再采用硅胶柱分离，得到CPT-ss-CUR-FA；
五、将步骤四获得的CPT-ss-CUR-FA溶解到无水乙醇中，搅拌同时加入到含有微量聚乙烯醇的去离子水溶液中，升温挥发除去无水乙醇，然后冷冻干燥，得到CPT-ss-CUR-FA纳米粒子，即所述主动靶向抗癌药物纳米粒，完成该方法。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中3,3’-二硫代二丙酸与乙酸酐的反应温度为80～150℃。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二中喜树碱与3,3’-二硫代二丙酸酐的摩尔比为(0.25～3)：1。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二所述反应温度为30～100℃。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤二在氮气气氛下加入4-二甲氨基吡啶的无水吡啶溶液然后进行反应。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤二所述稀盐酸溶液的浓度为0.01～0.5mol/L。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤三中叶酸与姜黄素的摩尔比为(0.5～5)：1。其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤三所述反应温度为10～60℃。其它与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤四中CPT-ss-COOH与CUR-FA的摩尔比为(0.15～2)：1。其它与具体实施方式一至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤四在氮气气氛下加入CUR-FA和4-二甲氨基吡啶的无水N,N-二甲基甲酰胺溶液，然后进行反应。其它与具体实施方式一至九之一相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一至十之一不同的是：步骤四所述反应温度为20～80℃。其它与具体实施方式一至十之一相同。
具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一至十一之一不同的是：步骤五所述含有微量聚乙烯醇的去离子水溶液中聚乙烯醇的质量百分含量为0.001～0.1％。其它与具体实施方式一至十一之一相同。
具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式一至十二之一不同的是：步骤五CPT-ss-CUR-FA溶解到无水乙醇获得的溶液中CPT-ss-CUR-FA的质量百分含量为1～30％。其它与具体实施方式一至十二之一相同。
采用以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例一：
本实施例一种主动靶向抗癌药物纳米粒的制备方法，具体按以下步骤进行：
一、将0.25g 3,3’-二硫代二丙酸溶解在2.5mL乙酸酐中，升温至130℃磁力搅拌反应4h，然后减压回收乙酸酐获得黑褐色固体产物A，将产物A用冰乙醚洗涤，获得3,3’-二硫代二丙酸酐；
二、室温条件下，将1.2mmol喜树碱和2.39mmol步骤一获得的3,3’-二硫代二丙酸酐加入到装有30mL无水吡啶的三口瓶中，搅拌至完全溶解，在氮气气氛、冰水浴条件下，加入10mL 4-二甲氨基吡啶(4.79mmol)的无水吡啶溶液，控制温度为0℃保持0.5h，升温75℃磁力搅拌反应72h，减压回收溶剂，获得黑褐色泥浆产物B，采用浓度为0.1mol/mL的稀盐酸溶液洗涤产物B2次，再用甲醇溶解，滤除不溶性杂质，然后回收甲醇，真空干燥，得到固体粉末喜树碱-20-O-3,3’-二硫代二丙酸酯，即为CPT-ss-COOH；CPT-ss-COOH的产率为69％；
三、在室温条件下，将0.114mmol叶酸和1.590mmol碳化二亚胺加入到装有10mL无水N,N-二甲基甲酰胺的三口瓶中，搅拌至完全溶解，升温至37℃活化叶酸端羧基1h，然后采用冰水浴冷却至4℃，加入0.227mmol姜黄素和1.590mmol 4-二甲氨基吡啶，升温至37℃磁力搅拌反应12h，控制搅拌转速为600r/min，减压蒸除溶剂，获得黑褐色固体物A，将固体物A用水溶解，滤除不溶性杂质，浓缩挥干水分，再溶解到甲醇中，滤除不溶性杂质，然后减压蒸除溶剂，得到CUR-FA；CUR-FA的产率为51％；
四、在室温条件下，将0.126mmol碳化二亚胺和0.012mmol步骤二获得的CPT-ss-COOH加入到装有10mL无水N,N-二甲基甲酰胺的三口瓶中，搅拌至完全溶解，活化羧基1h，然后在氮气气氛条件下加入0.025mmol步骤三获得的CUR-FA，冰水浴条件下加入10mL 4-二甲氨基吡啶(0.126mmol)的无水N,N-二甲基甲酰胺溶液，控制温度为0℃保持0.5h，升温至37℃磁力搅拌反应12h，反应结束后减压蒸除溶剂获得固体物B，用水洗涤固体物B，然后干燥再采用硅胶柱分离，得到CPT-ss-CUR-FA；CPT-ss-CUR-FA产率为46％；
五、将10mg步骤四获得的CPT-ss-CUR-FA溶解到10mL无水乙醇中，搅拌同时加入到30mL含有微量聚乙烯醇的去离子水溶液中，溶液中聚乙烯醇的质量百分含量为0.005％，升温挥发除去无水乙醇，然后冷冻干燥，得到CPT-ss-CUR-FA纳米粒子，即所述主动靶向抗癌药物纳米粒，完成该方法。
本实施例获得的CPT-ss-CUR-FA纳米粒子的平均粒径为80nm。
本实施例制备的CPT-ss-CUR-FA纳米粒子的透射电镜图如图1所示；
本实施例制备的主动靶向抗癌药物纳米粒的红外谱图如图2所示，其中DTDPA为3,3’-二硫代二丙酸红外图谱，CPT为喜树碱红外图谱，CUR为姜黄素红外图谱，CPT-ss-COOH为喜树碱-20-O-3,3’-二硫代二丙酸酯图谱，CUR-FA为姜黄素-叶酸的红外谱图，CPT-ss-CUR-FA为主动靶向抗癌药物纳米粒的红外谱图。
采用本发明制备的主动靶向抗癌药物纳米粒进行的体外细胞毒研究表明，喜树碱原药和本实施例制备的喜树碱-姜黄素-叶酸纳米粒对A549肺癌细胞均能产生剂量依赖性抑制作用，它们的半数抑制浓度分别为1.85μg/mL和0.48μg/mL。这表明，本发明制备的复合物纳米粒中的喜树碱与姜黄素产生协同作用，抗癌作用高于原药。
Claims (10)
1.一种主动靶向抗癌药物纳米粒的制备方法，其特征在于该方法具体按以下步骤进行：
一、将3,3’-二硫代二丙酸溶解在乙酸酐中，升温至反应温度进行反应，然后减压回收乙酸酐获得产物A，将产物A用冰乙醚洗涤，获得3,3’-二硫代二丙酸酐；
二、将喜树碱和步骤一获得的3,3’-二硫代二丙酸酐加入到无水吡啶中，搅拌溶解，冰水浴条件下，加入4-二甲氨基吡啶的无水吡啶溶液，升温至反应温度进行反应，减压蒸除溶剂，获得产物B，采用稀盐酸溶液洗涤产物B，再用甲醇溶解，滤除不溶性杂质，然后回收甲醇，真空干燥，得到固体粉末喜树碱-20-O-3,3’-二硫代二丙酸酯，即为CPT-ss-COOH；
三、将叶酸和碳化二亚胺加入到无水N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解，升温至30～40℃保持0.8～1.2h，然后采用冰水浴冷却至3～5℃，加入姜黄素和4-二甲氨基吡啶，升温至反应温度进行反应，减压蒸除溶剂，获得固体物A，将固体物A用水溶解，滤除不溶性杂质，浓缩挥干水分，再溶解到甲醇中，滤除不溶性杂质，减压蒸除溶剂，得到CUR-FA；
四、将碳化二亚胺和步骤二获得的CPT-ss-COOH加入到无水N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解，保持0.8～1.2h，然后加入步骤三获得的CUR-FA，冰水浴条件下加入4-二甲氨基吡啶的无水N,N-二甲基甲酰胺溶液，升温至反应温度进行反应，反应结束后减压蒸除溶剂获得固体物B，用水洗涤固体物B，然后干燥，再采用硅胶柱分离，得到CPT-ss-CUR-FA；
五、将步骤四获得的CPT-ss-CUR-FA溶解到无水乙醇中，搅拌同时加入到含有微量聚乙烯醇的去离子水溶液中，升温挥发除去无水乙醇，然后冷冻干燥，得到CPT-ss-CUR-FA纳米粒子，即所述主动靶向抗癌药物纳米粒，完成该方法。
2.根据权利要求1所述的一种主动靶向抗癌药物纳米粒的制备方法，其特征在于步骤一中3,3’-二硫代二丙酸与乙酸酐的反应温度为80～150℃。
3.根据权利要求1所述的一种主动靶向抗癌药物纳米粒的制备方法，其特征在于步骤二中喜树碱与3,3’-二硫代二丙酸酐的摩尔比为(0.25～3)：1。
4.根据权利要求1所述的一种主动靶向抗癌药物纳米粒的制备方法，其特征在于步骤二所述反应温度为30～100℃。
5.根据权利要求1所述的一种主动靶向抗癌药物纳米粒的制备方法，其特征在于步骤三中叶酸与姜黄素的摩尔比为(0.5～5)：1。
6.根据权利要求1所述的一种主动靶向抗癌药物纳米粒的制备方法，其特征在于步骤三所述反应温度为10～60℃。
7.根据权利要求1所述的一种主动靶向抗癌药物纳米粒的制备方法，其特征在于步骤四中CPT-ss-COOH与CUR-FA的摩尔比为(0.15～2)：1。
8.根据权利要求1所述的一种主动靶向抗癌药物纳米粒的制备方法，其特征在于步骤四所述反应温度为20～80℃。
9.根据权利要求1所述的一种主动靶向抗癌药物纳米粒的制备方法，其特征在于步骤五所述含有微量聚乙烯醇的去离子水溶液中聚乙烯醇的质量百分含量为0.001～0.1％。
10.根据权利要求1所述的一种主动靶向抗癌药物纳米粒的制备方法，其特征在于步骤五CPT-ss-CUR-FA溶解到无水乙醇获得的溶液中CPT-ss-CUR-FA的质量百分含量为1～30％。
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