CN109512785A - 一种叶酸-Pluronic F87修饰姜黄素纳米脂质体的制备方法 - Google Patents

一种叶酸-Pluronic F87修饰姜黄素纳米脂质体的制备方法 Download PDF

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龚妍春
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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种叶酸‑Pluronic F87修饰姜黄素纳米脂质体的制备方法，是以磷脂、胆固醇、叶酸‑Pluronic F87和姜黄素为原料，采用薄膜分散法结合动态高压微射流技术，经溶解、成膜、水化及动态高压微射流等处理制备的叶酸‑Pluronic F87修饰姜黄素纳米脂质体。本方法制备的叶酸‑Pluronic F87修饰姜黄素纳米脂质体的平均粒径为81.0±2.9nm，分散系数为0.384±0.061，姜黄素包封率为88.6±1.4％。本发明制备的叶酸‑Pluronic F87修饰姜黄素纳米脂质体具有良好的缓释性，在pH7.4条件下，经72h后有82.9％的姜黄素释放出来，且叶酸修饰可增强姜黄素脂质体的细胞毒性。

Description

一种叶酸-Pluronic F87修饰姜黄素纳米脂质体的制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种叶酸-Pluronic F87修饰姜黄素纳米脂质体的制备方法。
背景技术
姜黄素是一种从姜黄根茎中提出的一种多酚类植物化学物，具有抗肿瘤、改善心血管功能、抗炎、抗病毒、保肝、增强免疫力等生物活性。但是在实际应用过程中，由于姜黄素存在水溶性差、稳定性差、口服生物利用率低、以及体内易被代谢等缺陷，因此限制了其在食品和药物当中的应用。纳米载体如脂质体、纳米粒子、胶囊、胶束、乳液等在药物传递过程中显示出巨大的潜力，通过纳米载体包埋可提高姜黄素的生物利用率和扩大其使用范围。
脂质体是由磷脂、胆固醇等组成的内部为水相、具有类细胞膜结构的双分子层闭合囊泡。可以运载亲水性和亲脂性的物质，在生物医药、食品营养、化妆品等领域有广泛的应用。Pluronic F87嵌段共聚物是一种已经商业化的产品，具有很好的生物相容性，Pluronic F87已经被美国食品与药物管理局(FDA)批准使用。叶酸是人体所需的B族维生素，叶酸(FA)与肿瘤细胞表面过度表达的叶酸受体(Folate Receptor,FR)亲和力高，因此通过叶酸与叶酸受体介导的靶向治疗已成为国内外研究的热点。
本发明以叶酸-Pluronic F87为修饰剂，采用薄膜分散法结合动态高压微射流技术制备叶酸-Pluronic F87修饰姜黄素纳米脂质体，该法制备的叶酸-Pluronic F87修饰姜黄素纳米脂质体具有良好的缓释性能，且增强了姜黄素的细胞毒性。
发明CN201510671604.3一种叶酸-壳聚糖修饰姜黄素纳米脂质体的制备方法也公开了姜黄素纳米脂质体的制备方法，其制备方法与本发明不同，本发明通过采用脱水缩合的方法将叶酸连接在Pluronic F87的一端，效果侧重也与本发明不同，CN201510671604.3主要是侧重于提高修饰后的缓释特性，而本发明的主要是增强其对KB细胞的细胞毒性。
发明内容
本发明目的是为了针对现有姜黄素脂质体水溶性差、稳定性差、口服生物利用率低、以及体内易被代谢等不足，提供一种叶酸-Pluronic F87修饰姜黄素纳米脂质体的制备方法，以提高姜黄素的细胞毒性，评价其缓释性能，促进叶酸-Pluronic F87修饰姜黄素纳米脂质体的开发。本发明的具体工艺步骤如下：
A、叶酸-Pluronic F87的合成：
(1)取叶酸(0.836g,1.9mmol)与1,3－二环己基碳二亚胺(0.367g,1.75mmol)于圆底烧瓶中，加入35mL经干燥的二甲基亚砜进行溶解，于室温下搅拌24h；
(2)将干燥后的F87(14.6g,1.60mmol)和4-二甲氨基吡啶(0.196g,1.60mmol)加入步骤1的圆底烧瓶中，继续于室温下搅拌48h；
(3)将步骤(2)所得的溶液于5000rpm离心5min,取上清液装入截留分子量为3500Da的透析袋中，在DMSO环境中透析6h，以除去混合液中未反应的FA，继续用超纯水透析48h以除去溶液中的DMSO；
(4)将步骤(3)所得的透析液用旋转蒸发仪旋干除水后于真空下干燥，最后将干燥的产物用CH2Cl2溶解，于冰乙醚中沉淀两次。收集沉淀于真空干燥箱中干燥24h,干燥后的产物即FA-F87；
B、薄膜分散法结合动态高压微射流技术制备叶酸-Pluronic F87修饰姜黄素纳米脂质体：
(1)各原料的质量比为：磷脂：胆固醇：FA-F87：姜黄素为20:4:10:1；
(2)按上述质量比称取磷脂、胆固醇和FA-F87和姜黄素，在50℃温度下，用20mL无水乙醇完全溶解各组分；
(3)将步骤2中的溶液于旋转蒸发仪上旋蒸除去无水乙醇，各组形成均匀薄膜，其中水浴温度为45℃；
(4)按2％的磷脂浓度加入纯水进行水化洗膜30min，水浴温度为45℃，形成粗脂质体悬液；
(5)采用动态高压微射流处理步骤4中的粗脂质体悬液2次，操作压力为120MPa，即得叶酸-Pluronic F87修饰姜黄素纳米脂质体。
本发明的有益效果是
(1)制备的叶酸-Pluronic F87修饰的姜黄素脂质体(cur-FA-F87-Lps)平均粒径为81.0±2.9nm，分散系数为0.384±0.061，姜黄素的包封率高达88.6±1.4％，其微观结构为球形，且分散均匀，在pH 7.4的环境下具有良好的缓释行为。
(2)采用人口腔表皮样癌KB细胞进行细胞毒性(MTT)实验后发现，cur-FA-F87-Lps经48h和72h的细胞培养后，KB细胞存活率明显高于Pluronic F87修饰的姜黄素脂质体。
附图说明
图1为叶酸-Pluronic F87修饰姜黄素纳米脂质体的工艺路线图；
图2为叶酸-Pluronic F87修饰姜黄素纳米脂质体的粒径分布图；
图3为叶酸-Pluronic F87修饰姜黄素纳米脂质体的透射电镜图；
图4为叶酸-Pluronic F87修饰姜黄素纳米脂质体的释放行为图；
图5为叶酸-Pluronic F87修饰姜黄素纳米脂质体的细胞毒性。
具体实施方式
实施例1
1、准确称取FA(0.835g,1.9mmol)、DCC(0.361g,0.75mmol)于250mL圆底烧瓶中，加入35mL经干燥的DMSO进行溶解，于室温下搅拌24h。将干燥后的F87(20.1g,1.60mmol)和DMAP(0.195g,1.60mmol)加入烧瓶中，继续于室温下搅拌48h。将反应后的产物于5000rpm离心5min,取上清液装入截留分子量为3500Da的透析袋中，在DMSO环境中透析6h，以除去混合液中未反应的FA。继续用超纯水透析48h以除去溶液中的DMSO。将透析液用旋转蒸发仪旋干除水后于真空下干燥，最后将干燥的产物用CH2Cl2溶解，于冰乙醚中沉淀两次。收集沉淀于真空干燥箱中干燥24h,干燥后的产物即FA-F87。
2、将磷脂、胆固醇、FA-F87和姜黄素(质量比为20:4:10:1)混合于少量无水乙醇中溶解,将溶解后的混合溶液置于旋转蒸发仪中，于45℃水浴除去乙醇，形成脂质薄膜。加入超纯水于45℃条件下水化30min，将溶液用DHPM于120MPa条件下处理2次，即得到cur-FA-F87-Lps。
3、粒径及分散性考察：用激光纳米粒度仪测定其平均粒径和分散系数。结果显示cur-FA-F87-Lps的平均粒径为85.4±2.7nm，分散系数为0.388±0.015，结果如说明书附图2所示。
4、姜黄素包封率的测定：将cur-FA-F87-Lps于8000rpm下离心10min，取上清液用无水乙醇稀释20倍，用紫外分光光度计于420nm测定吸光度，根据姜黄素乙醇标准曲线计算姜黄素的包封率。结果表明姜黄素的包封率高达87.8±2.4％。
5、微观形态观察：采用透射电镜(TEM)观察cur-FA-F87-Lps的微观形态。测定步骤如下：在封口膜上滴一滴cur-FA-F87-Lps溶液，将铜网置于液滴中3min后取出，用滤纸从边缘吸去溶液，再置于1％磷钨酸钠溶液负染色2min后取出，用滤纸从边缘吸去溶液，于室温下晾干，在TEM下进行观察。由电镜照片可知，cur-FA-F87-Lps呈球形，大小均一。结果如说明书附图3所示。
6、缓释行为：在体外模拟生物体内环境(pH 7.4)条件下，cur-FA-F87-Lps中姜黄素的释放行为在最初的12h，姜黄素的释放呈现了突释行为，随后呈现缓慢且持续释放现象。最后，在72h内，cur-FA-F87-Lps释放了78.3％的姜黄素。结果如说明书附图4所示。7、细胞毒性实验：取对数生长期的人口腔表皮样癌(KB)细胞接种于96孔细胞培养板中，调整细胞浓度为5×103个/mL，培养24h。待细胞贴壁生长后，吸弃培养基，然后加入100μL预先配制的姜黄素浓度为1-20mg/L的cur-F87-Lps和cur-FA-F87-Lps，继续培养和72h。培养结束后，吸弃培养基，每孔用PBS清洗两遍后，加入100μL浓度为0.5mg/mL的MTT溶液，继续培养4h。吸弃MTT溶液，继续用PBS清洗，再加入150μL DMSO溶液溶解MTT甲瓒晶体。振动平板10min后，用酶标仪在492nm处测量吸光度。细胞存活率(％)按以下公式进行计算:
细胞存活率(％)＝Atest/Acontrol×100％ (1)
公式中Atest以及Acontrol分别代表实验组与对照组的吸光度值，每组均设五个平行孔。结果如图5所示。由说明书附图5可以看出，含有叶酸的cur-FA-F87-Lps比不含叶酸的cur-F87-Lps更能够有效地将姜黄素输送到叶酸受体过度表达的KB细胞中，且作用时间越长，细胞毒性越明显。

Claims (1)

1.一种叶酸-Pluronic F87修饰姜黄素纳米脂质体的制备方法，其特征在于：
A、叶酸-Pluronic F87的合成：
(1)取叶酸(0.836g,1.9mmol)与1,3－二环己基碳二亚胺(0.367g,1.75mmol)于圆底烧瓶中，加入35mL经干燥的二甲基亚砜进行溶解，于室温下搅拌24h；
(2)将干燥后的F87(14.6g,1.60mmol)和4-二甲氨基吡啶(0.196g,1.60mmol)加入步骤1的圆底烧瓶中，继续于室温下搅拌48h；
(3)将步骤(2)所得的溶液于5000rpm离心5min,取上清液装入截留分子量为3500Da的透析袋中，在DMSO环境中透析6h，以除去混合液中未反应的FA，继续用超纯水透析48h以除去溶液中的DMSO；
(4)将步骤(3)所得的透析液用旋转蒸发仪旋干除水后于真空下干燥，最后将干燥的产物用CH2Cl2溶解，于冰乙醚中沉淀两次。收集沉淀于真空干燥箱中干燥24h,干燥后的产物即FA-F87；
B、薄膜分散法结合动态高压微射流技术制备叶酸-Pluronic F87修饰姜黄素纳米脂质体：
(1)各原料的质量比为：磷脂：胆固醇：FA-F87：姜黄素为20:4:10:1；
(2)按上述质量比称取磷脂、胆固醇和FA-F87和姜黄素，在50℃温度下，用20mL无水乙醇完全溶解各组分；
(3)将步骤2中的溶液于旋转蒸发仪上旋蒸除去无水乙醇，各组形成均匀薄膜，其中水浴温度为45℃；
(4)按2％的磷脂浓度加入纯水进行水化洗膜30min，水浴温度为45℃，形成粗脂质体悬液；
(5)采用动态高压微射流处理步骤4中的粗脂质体悬液2次，操作压力为120MPa，即得叶酸-Pluronic F87修饰姜黄素纳米脂质体。
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