CN108851084A - 一种荷载槲皮素的结肠定位胶束及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种荷载槲皮素的结肠定位胶束及其制备方法，属于食品功能活性成分加工技术领域。本发明是针对槲皮素亲水性差、口服难以到达结肠发挥功效的问题，采用银耳多糖、黄秋葵果胶等植物多糖，通过分子间作用力制备荷载槲皮素的胶束，以改善槲皮素的水溶性，使80%以上槲皮素能够在结肠定位释放，从而达到提高其体内生物利用率、改善结肠肠道菌群平衡的效果。
Description
技术领域
本发明属于食品功能活性成分加工技术领域，具体涉及一种荷载槲皮素的结肠定位胶束及其制备方法。
背景技术
槲皮素是一类天然的黄酮类化合物，其来源广泛，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种生物活性。但由于槲皮素亲水性、亲脂性较差，易被肠道和酶系统代谢，导致其口服血药浓度低、体内生物利用度低，大大限制了其临床应用；同时，槲皮素在酸性和中性条件下易被氧化，对光、热和氧气敏感，稳定性差，限制了其在食品工业中的应用。
发明内容
本发明针对槲皮素亲水性差、口服难以到达结肠发挥功效的问题，提供一种荷载槲皮素的结肠定位胶束及其制备方法，其具有生物相容性好、定位释药准确可靠、特异性强等优点。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种荷载槲皮素的结肠定位胶束，其制备方法包括如下步骤：
（1）按体积比1~2:1将0.8 mg/mL的银耳多糖溶液和0.5 mg/mL的黄秋葵果胶溶液混合，以2000r/min的速度搅拌30min，得到多糖混合液；
（2）将槲皮素用无水乙醇溶解，得到5mg/mL的槲皮素溶液；
（3）在5000r/min的搅拌速度下，按体积比1:0.01~0.03在步骤（1）所得多糖混合液中缓慢滴入步骤（2）所得槲皮素溶液，然后在37℃条件下继续以5000r/min的速度搅拌60min，得到槲皮素胶束混合液；
（4）将所得槲皮素胶束混合液置于截留分子量为3500 Da的透析袋内，于pH 5.80、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中37℃透析24 h，然后于流水中透析12h，再用超纯水透析12 h，所得内容物经真空冷冻干燥，即得荷载槲皮素的结肠定位胶束。
本发明的有益效果：
（1）本发明利用水溶性的银耳多糖和黄秋葵果胶通过氢键、范德华力等分子间作用力，吸附和包埋疏水性的槲皮素形成胶束，以改善游离槲皮素的水溶性，提高槲皮素在体内的生物利用率。
（2）本发明采用的银耳多糖、黄秋葵果胶为植物多糖，具有生物可降解性、无毒、可调节的控制释放特性和良好的生物相容性等特点，能抵抗胃肠道活性较高的蛋白酶和淀粉酶，以避免槲皮素在胃肠道上部的释放，而在结肠中，利用肠道菌群产生的多酶复合体系可特异性降解植物多糖，从而使80%以上槲皮素在结肠内释放，提高其体内生物利用度，且这些多糖可作为结肠肠道菌群的益生元，提供有益菌生长所需的能源，改善肠道菌群结构，并可经结肠肠道菌群发酵产生短链脂肪酸，在结肠中被吸收并对体内产生积极效应。
附图说明
图1为荷载槲皮素的胶束在模拟体外结肠发酵过程中槲皮素的累积释放率。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
银耳多糖的制备：将新鲜银耳于60℃干燥至水分含量为10％；粉碎机粉碎，过50目筛得银耳粉；然后在银耳粉中加入其重量50倍的水，置于85℃水浴中恒温浸提2h，然后500W超声波处理15min，Sevag法除蛋白后经95%乙醇沉淀，5000 r/min离心10 min，所得沉淀物经真空冷冻干燥，得到多糖含量为30-70%的银耳多糖。
黄秋葵果胶的制备：将新鲜黄秋葵去除结蒂部位并切碎成小块，置于60℃干燥箱内烘干至恒重，粉碎，过60目筛，按1g:30mL的料液比加入蒸馏水并搅拌均匀，然后加入盐酸调节pH为3.0左右，80℃、250 W条件下超声波辅助提取45min，5000 r/min离心10 min后，收集上层清液，在不断搅拌条件下加入等体积无水乙醇，静置2 h，然后4000 r/min离心10min，收集的沉淀用无水乙醇洗涤2～3次，再于50℃干燥至恒重，即得黄秋葵果胶。
实施例1
（1）称取1.0g纯度为40%的银耳多糖，加500mL蒸馏水溶解，得0.8 mg/mL银耳多糖溶液；称取0.5g纯度为50%的黄秋葵果胶，加500mL蒸馏水溶解，得0.5 mg/mL黄秋葵果胶溶液；然后将500mL 0.8 mg/mL的银耳多糖溶液和500mL 0.5 mg/mL的黄秋葵果胶溶液混合，以2000r/min的速度搅拌30min，得到多糖混合液；
（2）取0.05g槲皮素，用10mL无水乙醇溶解，制备得到5mg/mL的槲皮素溶液；
（3）在5000r/min的搅拌速度下，在1000mL多糖混合液中缓慢滴入10mL槲皮素溶液，在37℃条件下以5000r/min的速度搅拌60min，得到槲皮素胶束混合液；
（4）将所得槲皮素胶束混合液置于截留分子量为3500 Da的透析袋内，将透析袋浸入pH5.80、0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液溶液中，37℃透析24 h，然后将透析袋于流水透析12h，再用超纯水透析12 h，把透析袋内容物进行真空冷冻干燥，得荷载槲皮素的结肠定位胶束。
实施例2
（1）称取1.2g纯度为40%的银耳多糖，加600mL蒸馏水溶解，得0.8 mg/mL银耳多糖溶液；称取0.3g纯度为50%的黄秋葵果胶，加300mL蒸馏水溶解，得0.5 mg/mL黄秋葵果胶溶液；然后将600mL 0.8 mg/mL的银耳多糖溶液和300mL 0.5 mg/mL的黄秋葵果胶溶液混合，以2000r/min的速度搅拌30min，得到多糖混合液；
（2）取0.135g槲皮素，用27mL无水乙醇溶解，制备得到5mg/mL的槲皮素溶液；
（3）在5000r/min的搅拌速度下，在900mL多糖混合液中缓慢滴入27mL槲皮素溶液，在37℃条件下以5000r/min的速度搅拌60min，得到槲皮素胶束混合液；
（4）将所得槲皮素胶束混合液置于截留分子量为3500 Da的透析袋内，将透析袋浸入pH5.80、0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液溶液中，37℃透析24 h，然后将透析袋于流水透析12h，再用超纯水透析12 h，把透析袋内容物进行真空冷冻干燥，得荷载槲皮素的结肠定位胶束。
实施例3
（1）称取1.2g纯度为60%的银耳多糖，加900mL蒸馏水溶解，得0.8 mg/mL银耳多糖溶液；称取1.0g纯度为30%的黄秋葵果胶，加600mL蒸馏水溶解，得0.5 mg/mL黄秋葵果胶溶液；然后将900mL 0.8 mg/mL的银耳多糖溶液和600mL 0.5 mg/mL的黄秋葵果胶溶液混合，以2000r/min的速度搅拌30min，得到多糖混合液；
（2）取0.15g槲皮素，用30mL无水乙醇溶解，制备得到5mg/mL的槲皮素溶液；
（3）在5000r/min的搅拌速度下，在1500mL多糖混合液中缓慢滴入30mL槲皮素溶液，在37℃条件下以5000r/min的速度搅拌60min，得到槲皮素胶束混合液；
（4）将所得槲皮素胶束混合液置于截留分子量为3500 Da的透析袋内，将透析袋浸入pH5.80、0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液溶液中，37℃透析24 h，然后将透析袋于流水透析12h，再用超纯水透析12 h，把透析袋内容物进行真空冷冻干燥，得荷载槲皮素的结肠定位胶束。
一、荷载槲皮素的胶束体外模拟消化的稳定性试验
体外模拟消化液的配制：
（1）人工唾液：分别称取2.38 g Na2HPO4、0.19 g KH2PO4和8.00 g NaCl溶于1 L蒸馏水中， 调节pH值至6.75后加入α-淀粉酶，使溶液的酶活力为200 U/mL。
（2）人工胃液：将0.1 mol/L稀盐酸用蒸馏水稀释至pH=1.2。每100 mL pH=1.2的盐酸溶液中加入0.20 g胃蛋白酶，混匀。
（3）人工小肠液：取KH2PO4 6.80 g，加500 mL蒸馏水溶解，用0.1 mol/L NaOH溶液回调pH值至6.8。每100 mL溶液中加入0.20 g胰蛋白酶，混匀。
将实施例1、实施例2和实施例3制备的荷载槲皮素的胶束进行体外模拟消化的稳定性试验。其具体是将20.0 mg/mL胶束0.5 mL分别用人工唾液、人工胃液和人工小肠液稀释至2.5mL，在漩涡混合器上震荡1 min。然后将混合液体置于恒温振荡器中，并设置摇床转速为120 r/min，人工唾液样品37 ℃孵育1 h，人工胃液样品和人工小肠液样品在37 ℃孵育4 h，孵育结束后消化液经8000 r/min离心10 min，取上清液，测定上清液中槲皮素含量，并计算槲皮素的保留率。以未荷载的游离槲皮素作为对照，结果见表1。
表1 在不同消化液中的槲皮素保留情况对比（%）
由表1可知，游离槲皮素在人工唾液和人工胃液中较稳定，而在人工小肠液中环境中很不稳定，保留率仅62.74%。而实施例1、实施例2和实施例3制备的槲皮素胶束在人工唾液和人工胃液中槲皮素保留率优于游离槲皮素，且在人工小肠液中槲皮素的保留率都超过85%以上，说明本发明制备的槲皮素胶束稳定性较好。
二、槲皮素胶束体外结肠发酵释放试验
结肠肠道菌群培养液配制：
（1）厌氧培养液的制备：37.5 mL 0.78% K2HPO4、37.5 mL混合液（0.47% KH2PO 4、1.18%NaCl 、1.2% (NH4)2SO4、0.12% CaCl2、0.25% MgSO4·H2O）、2 mL 25% L-抗坏血酸、0.5 g L-半胱氨酸、50 mL 8% Na2CO3、1 g蛋白胨、1 g牛肉膏，加蒸馏水至1 L，将pH值调至7.5～8.0范围内。
（2）结肠肠道菌群培养液的制备：取SD大鼠的新鲜粪便和生理盐水按1:4（m/v）的比例混合制成混悬液，2000 r/min离心15 min后取上清液，即为大鼠肠道菌液。将所得肠道菌液与厌氧培养液按1:9（v/v）混匀后得到结肠肠道菌群培养液。
将实施例1、实施例2和实施例3制备的荷载槲皮素的胶束进行体外结肠发酵释放试验。其具体是将20.0 mg /mL胶束0.5 mL用结肠肠道菌群培养液稀释至2.5mL，在漩涡混合器上震荡1 min。然后将混合液体置于恒温振荡器中，并设置摇床转速为120 r/min，37℃厌氧培养，间隔一定时间取消化液，8000 r/min离心10 min后取上清液，测定上清液中槲皮素的含量，并计算槲皮素释放率。结果见图1。
由图1可见，各实施例制备的槲皮素胶束在体外结肠发酵前7h，槲皮素的平均释放速率相对较快，累积释放率达到90%左右。
由此说明，槲皮素胶束被银耳多糖和黄秋葵果胶包裹吸附，在进入大肠之前基本不被水解，不会被吸收利用，当到达肠道菌群较多的结肠后，结肠微生物发酵将银耳多糖和黄秋葵果胶分解成为短链脂肪酸等可利用的功效小分子，同时使槲皮素释放出来，因此，本发明所得槲皮素胶束可实现槲皮素的结肠定位释放，防治结肠炎症，提高体内生物利用率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (4)
1.一种荷载槲皮素的结肠定位胶束的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将0.8 mg/mL的银耳多糖溶液和0.5 mg/mL的黄秋葵果胶溶液混合，以2000r/min的速度搅拌30min，得到多糖混合液；
（2）将槲皮素用无水乙醇溶解，得到5mg/mL的槲皮素溶液；
（3）在5000r/min的搅拌速度下，在步骤（1）所得多糖混合液中缓慢滴入步骤（2）所得槲皮素溶液，然后在37℃条件下继续以5000r/min的速度搅拌60min，得到槲皮素胶束混合液；
（4）将所得槲皮素胶束混合液置于截留分子量为3500 Da的透析袋内，于pH 5.80、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中37℃透析24 h，然后于流水中透析12h，再用超纯水透析12 h，所得内容物经真空冷冻干燥，即得荷载槲皮素的结肠定位胶束。
2.根据权利要求1所述结肠定位胶束的制备方法，其特征在于，步骤（1）中银耳多糖溶液与黄秋葵果胶溶液混合的体积比为1~2:1。
3.根据权利要求1所述结肠定位胶束的制备方法，其特征在于，步骤（3）中多糖混合液与槲皮素溶液混合的体积比为1:0.01~0.03。
4.一种如权利要求1所述方法制得的荷载槲皮素的结肠定位胶束。
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