CN104324384A - 透明质酸-槲皮素结合物自组装胶束制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及透明质酸-槲皮素结合物自组装胶束制剂及其制备方法，由丁二酸酐修饰的槲皮素与己二酸二酰肼修饰的透明质酸反应得到的透明质酸-槲皮素结合物在蒸馏水中超声分散而成，透明质酸-槲皮素结合物为己二酸二酰肼修饰的透明质酸溶于磷酸盐缓冲液中，加入用DMSO溶解的丁二酸酐修饰的槲皮素，在N2保护下室温搅拌反应后透析、冻干制得。本发明胶束制剂在电镜下呈圆球形，平均粒径为172.1nm，界面电势为-20.3mV，药物含量为10.2％，且呈现明显的缓释特征，具有一定的pH敏感性。细胞实验显示制剂能明显提高槲皮素对肿瘤细胞的毒性，且在受体介导的内吞作用下，对CD44过表达的肿瘤细胞具有良好的靶向性。
Description
技术领域
本发明涉及透明质酸-槲皮素结合物自组装胶束制剂及其制备方法，属于胶束制备技术领域。
背景技术
槲皮素(Quercetin,QT)是从天然植物中提取的多酚黄酮类化合物，具有广泛的药理作用。研究表明槲皮素对多种癌症均具备良好的抑制作用，如乳腺癌，肺癌，卵巢癌等。然而由于其溶解度低，亲水性差，在胃肠道中不稳定，以及广泛的首过代谢，槲皮素在临床上的应用受到了很大的限制。为了提高槲皮素的生物利用度，目前的研究主要集中于利用纳米技术制备槲皮素的各种新型制剂，如包合物、微乳、脂质体、聚合物胶束、纳米结晶和胶束等。其中，制备具有自组装能力的天然聚合物-药物结合物受到了广泛关注。
透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是一种天然的高分子酸性黏多糖，具有良好的生物相容性和生物可降解性。将其与疏水性药物结合后可明显提高药物的水溶性。此外，透明质酸与肿瘤细胞表面过度表达的特异性标志物，如CD44具有较高的亲合力。因此以透明质酸为靶向分子与药物结合后，可增强由受体介导的细胞内吞作用，使药物主动靶向于病灶部位，避免对正常细胞的毒性，提高药物的治疗指数。
此外，透明质酸分子中众多的羟基和羧基为结合药物提供了活性位点，但直接结合有低效性，将槲皮素与透明质酸有效结合才有利于广泛应用。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足而提供一种透明质酸-槲皮素结合物自组装胶束制剂及其制备方法，不仅能够实现药物的有效结合，还可控制透明质酸分子中羧基的取代度，有利于保留其主动靶向性。
本发明是通过以下技术方案实现的：
透明质酸-槲皮素结合物自组装胶束制剂，由丁二酸酐修饰的槲皮素与己二酸二酰肼修饰的透明质酸反应得到的透明质酸-槲皮素结合物在蒸馏水中超声分散而成。
所述的透明质酸-槲皮素结合物为己二酸二酰肼修饰的透明质酸溶于磷酸盐缓冲液中，加入用DMSO溶解的丁二酸酐修饰的槲皮素，在N2保护下室温搅拌反应后透析、冻干制得。
透明质酸-槲皮素结合物自组装胶束制剂的制备方法，包括步骤如下：
(1)丁二酸酐修饰的槲皮素的制备：将槲皮素和丁二酸酐溶于四氢呋喃中，加入催化剂，N2保护下室温搅拌反应1～3天，除杂纯化处理得到反应中间体槲皮素半琥珀酸；将所得中间体溶于乙腈中，加入N-羟基丁二酰亚胺磷酸二苯酯(SDPP)和催化剂，N2保护下室温搅拌反应2～10h，将反应液后处理得丁二酸酐修饰的槲皮素，即QT-NHS酯粗品；
(2)己二酸二酰肼修饰的透明质酸的制备：将透明质酸HA溶于H2O中，加入己二酸二酰肼(ADH)，用盐酸调节pH至4.75，再加入催化剂，并保持pH在4.75时间0.1～1h后用氢氧化钠溶液调节pH至7.0，反应液用蒸馏水透析，冻干得HA-ADH；
(3)己二酸二酰肼修饰的透明质酸溶于磷酸盐缓冲液中形成1mg/ml的溶液，加入用DMSO溶解的丁二酸酐修饰的槲皮素，在N2保护下室温搅拌反应1～3天后透析、冻干制得透明质酸-槲皮素结合物HA-QT；
(4)将HA-QT固体，置于蒸馏水中，室温下，搅拌后超声分散，使其在水中分散均匀，形成胶束制剂。
上述制备方法中步骤(1)中槲皮素与丁二酸酐的摩尔比例为1:1～5，槲皮素与四氢呋喃的用量为1～5:1，mg/mL，槲皮素与催化剂的摩尔比例为1:1～20，所述的催化剂选自吡啶、三乙胺、EDCI中的任一种或两种以上。所述的除杂纯化处理为去除溶剂，碱洗，乙酸乙酯提取，饱和食盐水洗，无水Na2SO4干燥，过滤，蒸除溶剂。所述的中间体与SDPP的摩尔比例为1:1～5，中间体与乙腈的用量为1～5:1，mg/mL，中间体与催化剂的摩尔比例为1:1～10，所述的催化剂选自吡啶、三乙胺、EDCI中的任一种或两种以上。所述的后处理为旋蒸去除溶剂，乙酸乙酯溶解，水洗，饱和食盐水洗，无水Na2SO4干燥，过滤，蒸除溶剂。
步骤(2)中HA与ADH的摩尔比例为1:0.5～5，HA与H2O的用量为5～20:1，mg/mL，HA与催化剂的质量比例为3～10:1，所述的催化剂选自吡啶、三乙胺、EDCI中的任一种或两种以上。所述的盐酸的浓度为1mol/L，氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L。所述的蒸馏水透析两天，每12h换水一次。
步骤(3)中用的pH＝6.5的磷酸盐缓冲液，己二酸二酰肼修饰的透明质酸与丁二酸酐修饰的槲皮素用量的质量比例为2～10:1，DMSO与体系中水的体积比为2:1。所述的透析为先用DMSO透析2天，再用蒸馏水透析3天。
步骤(4)中HA-QT与蒸馏水的比例为2～10:1，mg/mL；所述的超声分散为搅拌10min后超声1min。
槲皮素水溶性差，在胃肠道中不稳定，口服生物利用度在小鼠中小于17％，人体还不到2％，极大的限制了其临床应用，因而研发具有良好溶解性能的槲皮素给药系统备受关注。透明质酸水溶性强，以其作为载体，在提高药物水溶性的同时，还能延长药物在体内的滞留时间，实现制剂对肿瘤的靶向治疗作用。本发明研究首次将槲皮素与透明质酸相结合，是一种具有较长的体内作用时间，较好的主动靶向功能的透明质酸-槲皮素结合物自组装胶束制剂。该结合物胶束与槲皮素原料药相比，显示了更强的细胞毒性和细胞摄取作用，以及更长的动物体内循环时间和抗肿瘤疗效。细胞研究结果显示，透明质酸-槲皮素结合物自组装胶束与非槲皮素原料药相比，可明显提高槲皮素对MCF-7细胞的毒性和摄取。动物研究表明，该结合物的胶束在大鼠体内的平均滞留时间，半衰期和血药峰浓度和体内抗肿瘤活性均显著高于槲皮素原料药。此外，与表面活性剂胶束相比，此类聚合物胶束具有较高的载药量，较低的临界胶束浓度浓度，且呈现良好的缓释行为，可有效避免剧烈的突释。本发明胶束制剂在电镜下呈圆球形，平均粒径为172.1nm，界面电势为-20.3mV，药物含量为10.2％(w/w)，且呈现明显的缓释特征，具有一定的pH敏感性。细胞实验显示制剂能明显提高槲皮素对肿瘤细胞的毒性，且在受体介导的内吞作用下，对CD44过表达的肿瘤细胞具有良好的靶向性。动物实验表明该胶束能明显改善药物在体内的药物动力学参数，增强药物的抗肿瘤效果，且安全无毒，无刺激。本发明的透明质酸-槲皮素结合物自组装胶束制剂将来有望成为癌症治疗的新型药物制剂。
此外，本发明所采用的制备方法，简单易行，且条件温和，有效地避免了剧烈反应条件对槲皮素药物活性的破坏。且该方法具有良好的通用性，可普遍用于以透明质酸为载体与其他药物相结合的制备工艺之中。
附图说明
图1：以pH＝7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)为释放介质于37℃下制剂及原料药的释放行为。三条曲线分别代表:HA-QT制剂在含有1％吐温-80的释放介质，HA-QT制剂在含有1％吐温-80和酯酶的释放介质，及槲皮素的丙二醇溶液的释放行为。
图2：以pH＝5.0的磷酸盐缓冲液(PBS)为释放介质于37℃下制剂及原料药的释放行为。三条曲线分别代表:HA-QT制剂在含有1％吐温-80的释放介质，HA-QT制剂在含有1％吐温-80和酯酶的释放介质，及槲皮素的丙二醇溶液的释放行为。
图3：槲皮素及HA-QT胶束制剂在MCF-7细胞和L929细胞中的毒性和摄取情况。A：HA-QT胶束制剂的细胞摄取图，B：HA阻断后HA-QT胶束制剂的细胞摄取图。
图4：静脉注射槲皮素及HA-QT胶束制剂后血浆浓度对时间的曲线图。大鼠给予槲皮素8mg/kg，两条曲线分别代表注射槲皮素原料药(菱形)，HA-QT胶束制剂(方形)的血药浓度变化。
图5：小鼠在体荷瘤实验中肿瘤体积的变化曲线。小鼠注射H22肝癌细胞以诱导其发生肿瘤。四条曲线分别代表给药生理盐水(圆形)，透明质酸溶液(方形)，槲皮素原料药(三角形)和HA-QT胶束制剂(菱形)后小鼠肿瘤体积的变化。
图6：小鼠在体荷瘤实验中肿瘤组织照片。
图7：兔耳缘静脉注射部位病理切片图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：制备透明质酸-槲皮素结合物自组装胶束制剂
步骤如下：(1)将槲皮素(30mg)和丁二酸酐(10mg)溶于四氢呋喃(10mL)中，加入吡啶(20μL)，N2保护下，室温搅拌反应3天。去除溶剂，碱洗，乙酸乙酯提取，饱和食盐水洗，无水Na2SO4干燥。过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析纯化得到反应中间体槲皮素半琥珀酸。将所得固体(20mg)溶于乙腈中，加入SDPP(18mg)和三乙胺(7μL)，N2保护下，室温搅拌反应6h。去除溶剂，碱洗，乙酸乙酯提取，饱和食盐水洗，无水Na2SO4干燥。过滤，蒸除溶剂，得QT-NHS酯粗品。
(2)将HA(50mg)溶于H2O(10mL)中，加入ADH(4.4mg)，用1mol/L的盐酸调节pH至4.75。再加入EDCI(8mg)，并保持pH在4.75。10分钟后用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.0。反应液用蒸馏水透析两天，每12h换水一次。冻干得HA-ADH。
(3)将HA-ADH(50mg)溶于3mM、pH＝6.5的磷酸盐缓冲液中，形成1mg/ml的溶液。加入用DMSO溶解的QT-NHS(5mg)，以形成澄清均匀的反应液(DMSO:H2O＝2:1)。N2保护下，室温搅拌反应2天。将反应液先用DMSO透析2天，再用蒸馏水透析3天。冻干得透明质酸-槲皮素结合物(HA-QT)。
(4)将所得HA-QT结合物(10mg)室温下溶于5mL蒸馏水中，超声1min，以形成自组装胶束制剂。
实施例2：制备透明质酸-槲皮素结合物自组装胶束制剂
步骤如下：(1)将槲皮素(30mg)和丁二酸酐(20mg)溶于四氢呋喃中，加入三乙胺(56μL)，N2保护下，室温搅拌反应3天。过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析纯化得到反应中间体槲皮素半琥珀酸。将所得固体(20mg)溶于乙腈中，加入SDPP(36mg)和吡啶(16μL)，N2保护下，室温搅拌反应6h。去除溶剂，碱洗，乙酸乙酯提取，饱和食盐水洗，无水Na2SO4干燥。过滤，蒸除溶剂，得QT-NHS酯粗品。
(2)将HA(50mg)溶于H2O(5mL)中，加入ADH(8.7mg)，用1mol/L的盐酸调节pH至4.75。再加入EDCI(10mg),，并保持pH在4.75。20分钟后用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.0。反应液用蒸馏水透析两天，每12h换水一次。冻干得HA-ADH。
(3)将HA-ADH(50mg)溶于3mM、pH＝6.5的磷酸盐缓冲液中，形成1mg/ml的溶液。加入用DMSO溶解的QT-NHS(10mg)，以形成澄清均匀的反应液(DMSO:H2O＝2:1)。N2保护下，室温搅拌反应2天。将反应液先用DMSO透析2天，再用蒸馏水透析3天。冻干得透明质酸-槲皮素结合物(HA-QT)。
(4)将所得HA-QT结合物(15mg)室温下溶于5mL蒸馏水中，超声1min，以形成自组装胶束制剂。
实施例3：制备透明质酸-槲皮素结合物自组装胶束制剂
步骤如下：(1)将槲皮素(30mg)和丁二酸酐(50mg)溶于四氢呋喃中，加入吡啶(60μL)，N2保护下，室温搅拌反应3天。过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析纯化得到反应中间体槲皮素半琥珀酸。将所得固体(20mg)溶于乙腈中，加入SDPP(72mg)和三乙胺(70μL)，N2保护下，室温搅拌反应6h。将反应液旋蒸去除溶剂，乙酸乙酯溶解，水洗，饱和食盐水洗，无水Na2SO4干燥。过滤，蒸除溶剂，得QT-NHS酯粗品。
(2)将HA(50mg)溶于H2O(15mL)中，加入ADH(43.6mg)，用1mol/L的盐酸调节pH至4.75。再加入EDCI(5mg)，并保持pH在4.75。1h后用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.0。反应液用蒸馏水透析两天，每12h换水一次。冻干得HA-ADH。
(3)将HA-ADH(50mg)溶于3mM、pH＝6.5的磷酸盐缓冲液中，形成1mg/ml的溶液。加入用DMSO溶解的QT-NHS(6mg)，以形成澄清均匀的反应液(DMSO:H2O＝2:1)。N2保护下，室温搅拌反应2天。将反应液先用DMSO透析2天，再用蒸馏水透析3天。冻干得透明质酸-槲皮素结合物(HA-QT)。
(4)将所得HA-QT结合物(50mg)室温下溶于5mL蒸馏水中，超声1min，以形成自组装胶束制剂。
实施例4：制备透明质酸-槲皮素结合物自组装胶束制剂
步骤如下：(1)将槲皮素(30mg)和丁二酸酐(30mg)溶于四氢呋喃中，加入吡啶(40μL)，N2保护下，室温搅拌反应3天。过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析纯化得到反应中间体槲皮素半琥珀酸。将所得固体(20mg)溶于乙腈中，加入SDPP(54mg)和三乙胺(35μL)，N2保护下，室温搅拌反应6h。去除溶剂，碱洗，乙酸乙酯提取，饱和食盐水洗，无水Na2SO4干燥。过滤，蒸除溶剂，得QT-NHS酯粗品。
(2)将HA(50mg)溶于H2O(12mL)中，加入ADH(26mg)，用1mol/L的盐酸调节pH至4.75。再加入EDCI(15mg)，并保持pH在4.75。0.5h后用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.0。反应液用蒸馏水透析两天，每12h换水一次。冻干得HA-ADH。
(3)将HA-ADH(50mg)溶于3mM、pH＝6.5的磷酸盐缓冲液中，形成1mg/ml的溶液。加入用DMSO溶解的QT-NHS(15mg)，以形成澄清均匀的反应液(DMSO:H2O＝2:1)。N2保护下，室温搅拌反应2天。将反应液先用DMSO透析2天，再用蒸馏水透析3天。冻干得透明质酸-槲皮素结合物(HA-QT)。
(4)将所得HA-QT结合物(35mg)室温下溶于5mL蒸馏水中，超声1min，以形成自组装胶束制剂。
实施例5：制备透明质酸-槲皮素结合物自组装胶束制剂
步骤如下：(1)将槲皮素(30mg)和丁二酸酐(15mg)溶于四氢呋喃中，加入吡啶(40μL)，N2保护下，室温搅拌反应3天。过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析纯化得到反应中间体槲皮素半琥珀酸。将所得固体(20mg)溶于乙腈中，加入SDPP(27mg)和三乙胺(28μL)，N2保护下，室温搅拌反应6h。去除溶剂，碱洗，乙酸乙酯提取，饱和食盐水洗，无水Na2SO4干燥。过滤，蒸除溶剂，得QT-NHS酯粗品。
(2)将HA(50mg)溶于H2O(20mL)中，加入ADH(19mg)，用1mol/L的盐酸调节pH至4.75。再加入EDCI(20mg)，并保持pH在4.75。15分钟后用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.0。反应液用蒸馏水透析两天，每12h换水一次。冻干得HA-ADH。
(3)将HA-ADH(50mg)溶于3mM、pH＝6.5的磷酸盐缓冲液中，形成1mg/ml的溶液。加入用DMSO溶解的QT-NHS(20mg)，以形成澄清均匀的反应液(DMSO:H2O＝2:1)。N2保护下，室温搅拌反应2天。将反应液先用DMSO透析2天，再用蒸馏水透析3天。冻干得透明质酸-槲皮素结合物(HA-QT)。
(4)将所得HA-QT结合物(25mg)室温下溶于5mL蒸馏水中，超声1min，以形成自组装胶束制剂。
取上述制备的胶束制剂适量，用动态光散射法测定其粒度分布，界面电位分析仪测定脂质体样品的界面电位。室温下测得平均粒径为172.1nm，界面电势为-20.3mV。透射电镜下呈圆球形，大小均一，表面光滑，无粘连。紫外分光光度计测得载药量为10.2％(w/w)。
试验例1：
按照实施例5制备透明质酸-槲皮素结合物自组装胶束，取2mL HA-QT胶束溶液置于透析袋中，排出气泡，密封，放入30ml释放介质中，37℃水浴振荡(100r·min-1)。在预设的时间点取样2mL，同时补加2mL的释放介质。用HPLC法测定释放介质中药物浓度，计算累积释放率Qn。同法以槲皮素的丙二醇溶液作为对照进行体外释放实验。此外，为了更好模拟槲皮素进入机体后的释放行为，我们又增设了两组释放实验，即将结合物胶束置于透析袋中的同时加入一定量的酯酶(16U/mL)，并分别以pH＝5.5或pH＝7.4含有1％Tween 80的PBS溶液为释放介质。
结果：如图1和2所示，HA-QT结合物的胶束在pH＝7.0的PBS中的释放明显高于pH＝5.0的PBS，显示出良好的pH敏感性释放特征。同时，与不含酯酶的释放介质相比，制剂在含有酯酶的释放介质中明显释放较快，表明结合物通过酯键的断裂以释放槲皮素。无论在何种释放介质中，与槲皮素溶液相比，HA-QT胶束均显示了较好的缓释特性。
试验例2：
采用MTT法，取对数生长期的MCF-7和L929细胞，以1×104个/孔的密度接种到96孔培养板中，用含有10％(v/v)胎牛血清的RPMI培养基在37℃下孵育24h。待细胞贴壁后，加入不同浓度的HA-QT胶束制剂或槲皮素溶液，且每个浓度设置6个复孔。孵育72h后，每孔加入20μL MTT溶液，继续孵育4h。最后，吸弃含有MTT的培养基，滴加100μL DMSO以充分溶解甲瓒结晶，酶联免疫检测仪(测定波长570nm)检测。
结果：如表1所示，HA-QT胶束对MCF-7细胞(CD44高表达)和L929细胞(CD44低表达)的毒性分别是槲皮素原料药的3.93和1.63倍。对比制剂在这两种细胞中的毒性增强程度，可以发现HA-QT胶束对透明质酸受体高度表达的肿瘤细胞具有较好的选择性和细胞毒性。
表1MTT实验测试槲皮素及其制剂在对MCF-7和L929细胞的毒性
试验例3：
用共聚焦激光扫描显微镜和流式细胞仪评价透明质酸-槲皮素结合物自组装胶束制剂的细胞摄取效率。取MCF-7和L929细胞接种至6孔培养板，37℃下培养过夜。待细胞贴壁后，弃去原来的培养基，分别加入用无血清新鲜培养基稀释的载有香豆素6的HA-QT胶束制剂(香豆素浓度为10μg/ml)。孵育2h后，弃去培养基，用预冷的PBS冲洗3次，用荧光显微镜观察细胞内香豆素-6的荧光强度，流式细胞仪(FL1-H通道)对平均荧光强度进行定量测定。为了考察制剂和HA受体的靶向结合作用，本实验设置了HA受体阻断组(含10mg/ml的游离HA)，阴性对照组(L929细胞)。细胞摄取实验均在4℃下进行。
结果：与透明质酸弱表达的L929细胞相比，MCF-7细胞对制剂的摄取明显较强。预先加入透明质酸阻断透明质酸受体后，细胞对制剂的摄取减弱。表明，制剂具有良好的靶向性，可主动靶向于CD44高表达的肿瘤细胞。
试验例4：
按照实施例5制备透明质酸-槲皮素结合物自组装胶束，使用雄性昆明鼠研究其药物动力学。将大鼠分五只一组，通过尾静脉按8mg/kg体重静脉注射HA-QT胶束制剂或槲皮素溶液。在不同的时间点用肝素抗凝的试管收集血液样品，3000r/min离心10min，分离血浆，在-20℃下储藏。用乙腈:乙酸＝9:1沉淀血浆提取槲皮素。漩涡混合90s，于50℃水浴15min。然后10000rpm，离心10min。。吸取上清液20μl，注入液相色谱仪中测定血药浓度。计算药代动力学参数包括曲线下的面积(AUC)、平均滞留时间(MRT)、半衰期(t1/2)和血药峰浓度(Cmax)。
表2大鼠静脉注射QT和HA-QT后药动学参数
结果：制剂组中，24h内均可检测到槲皮素的血药浓度，而槲皮素的溶液剂在血液中清除很快，一小时后就从血液循环中消失。这表明HA-QT胶束能够在较长的时间内缓慢持续的释放槲皮素。药物动力学参数显示，HA-QT胶束在大鼠体内的半衰期为3.3h，远高于槲皮素溶液剂(0.17h)，且血液平均滞留时间(4.3h)较槲皮素溶液剂延长了23.2倍。此外，作为标准治疗指数的关键参数，制剂组的AUC较槲皮素溶液剂也增大了3.9倍。
试验例5：
从大鼠锁骨下静脉窦取血，血样置于事先加有肝素(10mg/ml)的EP管中于1,000rpm离心10min后，吸弃上清液。所得沉淀红细胞加入适量生理盐水后，轻轻震荡混匀，于1,000rpm离心10min后，弃去上清液。按上述方法反复操作三次至上清液不显红色为止。用适量红细胞，以生理盐水为溶剂，配制成2％(v/v)的红细胞混悬液。
取上述红细胞悬液2.5ml，加入2.5ml HA-QT胶束制剂和槲皮素溶液剂(QT终浓度为1-100μM)，涡旋混匀后，置于37℃恒温振荡水浴中孵育1h。再于4,000rpm离心10min，取上清于采用紫外分光光度法，376nm处测定吸光度A。另分别以同体积的生理盐水为阴性对照组，蒸馏水为阳性对照组。结果如表5-1所示，溶血率计算公式如下：
溶血率(％)＝[(A样品-A阴性对照)/(A阳性对照-A阴性对照)]×100％
表3HA-QT胶束制剂溶血性考察结果
结果：槲皮素的溶液剂溶血率较高。相反，在QT浓度在1-100μM范围内，制剂均显示了良好的血液相容性。即使随着药物浓度升高，HA-QT胶束制剂对大鼠红细胞的溶血率均小于1.0％，符合制剂溶血性要求，可以用作注射给药
试验例6：
取健康的家兔9只，随机分成3组，第一组给药生理盐水(阴性对照组)，第二组给药槲皮素溶液(阳性对照组)，第三组给药HA-QT胶束制剂(用生理盐水制备)。每日以耳缘静脉推注给药一次，给药体积5ml，给药速度1ml/min，给药剂量8mg/kg。给药后定时观察家兔给药部位的血管和周围组织变化情况。连续给药3天后，处死家兔，以耳缘静脉注射点至向心方向，取4.5cm的局部血管组织，立即投入预先配制好的4％(v/v)甲醛溶液中固定，常规脱水，石蜡包埋，切3μm薄片，苏木素-伊红染色，光镜下做组织学检查。
结果：在光学显微镜下，在生理盐水组和制剂组中，家兔耳缘静脉注射部位血管无明显的形态学变化，血管内皮及血管壁结构完整，管壁无炎症细胞浸润，内皮细胞无肿胀、变性、坏死。轻微的血栓则可能是由于物理刺激所导致。而槲皮素溶液组中，可看到注射给药后，血管官腔内出现大量血栓。在远离注射部位处，生理盐水组合制剂组的组织形态完好，而槲皮素溶液组可看到红细胞聚集。
Claims (9)
1.透明质酸-槲皮素结合物自组装胶束制剂，由丁二酸酐修饰的槲皮素与己二酸二酰肼修饰的透明质酸反应得到的透明质酸-槲皮素结合物在蒸馏水中超声分散而成。
2.根据权利要求1所述的透明质酸-槲皮素结合物自组装胶束制剂，其特征是，所述的透明质酸-槲皮素结合物为己二酸二酰肼修饰的透明质酸溶于磷酸盐缓冲液中，加入用DMSO溶解的丁二酸酐修饰的槲皮素，在N2保护下室温搅拌反应后透析、冻干制得。
3.透明质酸-槲皮素结合物自组装胶束制剂的制备方法，其特征是，包括步骤如下：
(1)丁二酸酐修饰的槲皮素的制备：将槲皮素和丁二酸酐溶于四氢呋喃中，加入催化剂，N2保护下室温搅拌反应1～3天，除杂纯化处理得到反应中间体槲皮素半琥珀酸；将所得中间体溶于乙腈中，加入N-羟基丁二酰亚胺磷酸二苯酯SDPP和催化剂，N2保护下室温搅拌反应2～10h，将反应液后处理得丁二酸酐修饰的槲皮素，即QT-NHS酯粗品；
(2)己二酸二酰肼修饰的透明质酸的制备：将透明质酸HA溶于H2O中，加入己二酸二酰肼ADH，用盐酸调节pH至4.75，再加入催化剂，并保持pH在4.75时间0.1～1h后用氢氧化钠溶液调节pH至7.0，反应液用蒸馏水透析，冻干得HA-ADH；
(3)己二酸二酰肼修饰的透明质酸溶于磷酸盐缓冲液中形成1mg/ml的溶液，加入用DMSO溶解的丁二酸酐修饰的槲皮素，在N2保护下室温搅拌反应1～3天后透析、冻干制得透明质酸-槲皮素结合物HA-QT；
(4)将HA-QT固体，置于蒸馏水中，室温下，搅拌后超声分散，使其在水中分散均匀，形成胶束制剂。
4.根据权利要求3所述的透明质酸-槲皮素结合物自组装胶束制剂的制备方法，其特征是，(1)中槲皮素与丁二酸酐的摩尔比例为1:1～5，槲皮素与四氢呋喃的用量为1～5:1，mg/mL，槲皮素与催化剂的摩尔比例为1:1～20，所述的催化剂选自吡啶、三乙胺、EDCI中的任一种或两种以上。
5.根据权利要求3所述的透明质酸-槲皮素结合物自组装胶束制剂的制备方法，其特征是，步骤(1)中所述的中间体与SDPP的摩尔比例为1:1～5，中间体与乙腈的用量为1～5:1，mg/mL，中间体与催化剂的摩尔比例为1:1～10，所述的催化剂也选自吡啶、三乙胺、EDCI中的任一种或两种以上。
6.根据权利要求3所述的透明质酸-槲皮素结合物自组装胶束制剂的制备方法，其特征是，步骤(2)中HA与ADH的摩尔比例为1:0.5～5，HA与H2O的用量为5～20:1，mg/mL，HA与催化剂的质量比例为3～10:1，所述的催化剂选自吡啶、三乙胺、EDCI中的任一种或两种以上。
7.根据权利要求3所述的透明质酸-槲皮素结合物自组装胶束制剂的制备方法，其特征是，步骤(3)中用的pH＝6.5的磷酸盐缓冲液，己二酸二酰肼修饰的透明质酸与丁二酸酐修饰的槲皮素用量的质量比例为2～10:1，DMSO与体系中水的体积比为2:1。
8.根据权利要求3所述的透明质酸-槲皮素结合物自组装胶束制剂的制备方法，其特征是，步骤(4)中HA-QT与蒸馏水的比例为2～10:1，mg/mL。
9.根据权利要求3所述的透明质酸-槲皮素结合物自组装胶束制剂的制备方法，其特征是，步骤(4)中所述的超声分散为搅拌10min后超声1min。
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