CN108635589B - 一种葛根素透明质酸纳米胶束的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种葛根素透明质酸纳米胶束的制备方法，具体包括如下步骤：(1)溶解得到透明质酸衍生物的溶液I；(2)将ADH溶解，制得溶液II；(3)将溶液I滴加到溶液II中，调节体系酸碱度，反应后经离心分离、干燥得到透明质酸‑ADH中间体；(4)将透明质酸—ADH中间体和葛根素衍生物充分溶解，再向其中加入催化剂，制备得到葛根素‑透明质酸纳米胶束；(5)将葛根素‑透明质酸纳米胶束加入到有机分散相中与葛根素混合，透析处理，最后经过滤、干燥得到本发明的固体产品。具有操作方便，制备技术工艺简便稳定和制造成本低廉等优点。该研究对于提高葛根素的疗效，降低其不良反应，并为开发新型葛根素替代药物提供了新的制造技术。

Description

一种葛根素透明质酸纳米胶束的制备方法
技术领域
本发明属于新药研发技术领域，具体涉及一种葛根素透明质酸纳米胶束的制备方法。
背景技术
葛根素是一种从豆科植物野葛根中提取得到的黄酮苷，化学名为8-β-D-葡萄吡喃糖-4'，7-二羟基异黄酮，研究表明，葛根素具有明显扩张冠状动脉和脑血管，降低儿茶酚胺水平，β-受体阻断的作用，可保护心肌细胞，有效降低心肌耗氧量，临床广泛应用于心脑血管及外周血管疾病、糖尿病等疾病的治疗。由于葛根素分子结构中具有大豆异黄酮结构，因此其脂溶性和水溶性都较差，阻碍了葛根素在临床治疗中发挥更好的疗效，使其应用受到了极大的制约。为此，国内外尝试了大量的研究工作，旨在改善葛根素的性质，尤其近年来这方面的研究报道较多，其研究基本点集中于葛根素的生物利用度研究或是葛根素微粉化或和小分子物质成酯，但大多仅限于体外研究，临床数据不充分，实际应用效果尚无定论。因此，迄今采取何种措施提高葛根素的临床疗效、降低不良反应、扩大其应用范围，仍是医药界研究的热点之一。
透明质酸(HA)，又称玻尿酸，是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-葡萄糖糖氨组成的线性大分子天然酸性多糖。透明质酸是一种高分子聚合物，在自然状态下，呈白色、无异味，易溶于水，水溶液为电负性，不易溶于有机溶剂，透明质酸具有可以进行化学反应的活泼的羧基、氨基和羟基，可进行酯化、酰胺化、交联、接枝等，因其分子内和分子间强烈的氢键作用，使得透明质酸的溶解性具有强大的亲水性，易溶于水，不易溶于有机溶剂。这种天然高分子的亲水性、流动性、粘弹性、靶向性、生物相容性等优良性能，而倍受世界各国药学研究人员的瞩目。
发明内容
针对现有技术中存在的葛根素分子结构中具有大豆异黄酮结构，因此其脂溶性和水溶性都较差，使其应用受到了极大的制约的技术问题，本发明的目的在于提供一种葛根素透明质酸纳米胶束的制备方法。
本发明采取的技术方案为：
一种葛根素透明质酸纳米胶束的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)采用透明质酸衍生物为原料溶解，并向其中加入催化剂，得到质量浓度是0.4％-1.2％的透明质酸衍生物的溶液I；
(2)将ADH溶解，制得质量浓度是1％-10％的溶液II；
(3)在搅拌条件下按质量混合比例0.2-8将溶液I滴加到溶液II中，通过加入pH调节试剂调节体系酸碱度pH为1-12，控制反应温度为5-60℃，控制搅拌速度1000–10000rpm反应1-24小时，即得到含透明质酸-ADH中间体的混合液，经离心分离、干燥得到透明质酸-ADH中间体；
(4)在搅拌条件下先将透明质酸—ADH中间体和葛根素衍生物充分溶解，倾入到有机分散相中，葛根素衍生物的添加量是透明质酸—ADH中间体质量的0.2-7倍，再向其中加入催化剂，通过加入pH调节试剂调节体系酸碱度pH为1-12，控制反应温度为10-60℃，在超声条件下，反应1-10小时，得到含葛根素-透明质酸纳米胶束的混合液，经分离、透析、冷冻干燥洗涤，得到葛根素-透明质酸纳米胶束；
(5)在超声条件下将葛根素-透明质酸纳米胶束加入到有机分散相中与葛根素混合，葛根素-透明质酸纳米胶束与葛根素的质量混合比例为(1-6):(1-4)；置于透析袋内透析处理，最后经过滤、干燥得到本发明的固体产品。
进一步的，所述步骤(1)中透明质酸衍生物为分子量为20，000Da-2，000，00Da的透明质酸及其衍生物，透明质酸衍生物为透明质酸、部分脱乙酰基透明质酸、透明质酸甲酯、乙酰化透明质酸或硫酸化透明质酸。
进一步的，所述步骤(4)中葛根素衍生物为葛根素、4’乳酸酰葛根素、葛根素磺酸钠、琥珀酸酯葛根素和丁二酸酯葛根素中的任意一种。
进一步的，所述步骤(1)和步骤(4)中的催化剂为EDC、NHS、DCC、DIC、HOBt、PyBop、DIEA、DMAP中的任意一种或两种。
进一步的，所述步骤(3)和步骤(4)中的pH调节试剂为碳酸氢铵、氢氧化钠、氨水、氢氧化钾、盐酸或醋酸中的任意一种。
进一步的，所述步骤(4)中透明质酸—ADH中间体和葛根素衍生物形成的混合液体积是有机分散相体积的1/4-1/16。
进一步的，所述步骤(4)中的有机分散相为乙醇、甲醇、异丙醇或正丁醇中的任意一种。
进一步的，所述步骤(4)和步骤(5)中的超声条件一致且均为：控制超声输出功率10-200w，超声时间2-12s，间隔时间4-16s，超声次数60-150次。
进一步的，所述步骤(4)中冷冻干燥温度和时间分别是-20℃--40℃和24-48h；步骤(5)中透析处理所使用的透析袋截留分子量(MwCO)为6kD-8kD、12kD-14kD或8kD-10kD。
本发明的有益效果为：
本发明拟以天然透明质酸为基本骨架，在透明质酸的羧基上通过己二酸二酰肼(ADH)为连接臂，接入葛根素衍生物，形成含有亲水性透明质酸部分和疏水性的葛根素衍生物部分的具有两亲性的、兼具聚合物胶束特征的理想的葛根素前体药物，随后在一定条件下该前体药物在水性介质中形成内部疏水、外部含亲水性透明质酸分子的聚合物胶团，再经药物增溶、超声分散、过滤透析、冷冻干燥等最终制得目标产物-水溶性的葛根素-透明质酸纳米胶束，经查新证明国内外无类同报告，该研究对于提高葛根素的疗效，降低其不良反应，并为开发新型葛根素替代药物提供了新的制造技术，具有巨大的社会效益及经济效益。
本发明具有操作方便，制备技术工艺简便稳定和制造成本低廉等优点。本发明对原材料有广泛的适用性，所有具有游离羧基的透明质酸衍生物均可以适用。因此，本发明的原料来源十分广泛。本发明的重要意义还在于药物负载采用了化学偶联和疏水内核包载相结合的技术，从而实现药物的增溶作用，使制备的葛根素透明质酸纳米胶束不仅更加致密、稳定，而且具有载药量高、起效快、作用时间长等优点。本发明采用的材料安全无毒副作用、具有良好的生物相容性、生物可降解性等特点。本发明有望开发一类治疗和预防心脑血管疾病的理想的葛根素替代药物，具有良好的研究和开发应用前景。因此，该发明技术具有很好经济开发潜力。
附图说明
图1为葛根素透明质酸纳米胶束冻干粉样品图；
图2为葛根素和葛根素衍生物的红外吸收光谱图；
图3为透明质酸(Hya)、葛根素(Pue)、Hya-ADH，Hya-ADH-PS的红外谱图；那个味
图4为Hya-ADH-PS的1HNMR谱图；
图5为纳米胶束的透射电镜图；
注：图5中a：Hya-ADH-PS纳米胶束；b：Hya-ADH-PS载药纳米胶束
图6为葛根素(Pue)、丁二酸酐(SAA)、己二酸二酰肼(ADH)、透明质酸(Hya)及葛根素-透明质酸纳米胶束(Hya-ADH-PS)的热重分析(TG)曲线图；
图7为葛根素(Pue)、丁二酸酐(SAA)、己二酸二酰肼(ADH)、透明质酸(Hya)及葛根素-透明质酸纳米胶束(Hya-ADH-PS)的微商热重分析(DTG)曲线图。
具体实施方式
下面结合附图进一步说明本发明。
实施例1
先将透明质酸加入到去离子水中充分溶解，再配成质量浓度是0.4％的溶液，并向其中加入催化剂DCC、HOBt，制的溶液I。再将己二酸二酰肼(ADH)加入到去离子水中溶解，制得质量浓度是1％的溶液II。在搅拌条件下将溶液I滴加到溶液II中，通过加入pH调节试剂-盐酸调节体系酸碱度pH4、控制反应温度5℃、搅拌速度1000rpm和反应时间24小时，即得到透明质酸-ADH中间体和催化剂的混合液，然后将其分离、干燥得到本发明的透明质酸-ADH中间体；在搅拌条件下先将适量透明质酸—ADH中间体和葛根素充分溶解，再向其中加入催化剂EDC和DMAP等溶液，通过加入pH调节试剂-盐酸调节体系酸碱度pH4、通过控制反应温度10℃、反应时间10小时、和超声输出功率10W、时间8s、间隔时间4s、超生次数100次，即得到葛根素-透明质酸纳米胶束和催化剂的混合液，经分离、透析、冷冻干燥洗涤，得到葛根素-透明质酸纳米胶束；在超声条件下将其加入到乙醇有机分散相中与葛根素混合、置于透析袋内透析处理，最后经过滤、干燥得到总收率为48.36％，白色粉末状本发明的可溶性的高药物含量的固体产品。
实施例2
先将部分脱乙酰基透明质酸加入到去离子水中充分溶解，再配成质量浓度是1％的溶液，并向其中加入催化剂EDC和NHS，制得溶液I。再将己二酸二酰肼(ADH)加入到去离子水中溶解，制得质量浓度是8％的溶液II。在搅拌条件下将溶液I滴加到溶液II中，通过加入pH调节试剂-碳酸氢铵调节体系酸碱度pH10、控制反应温度25℃、搅拌速度5000rpm和反应时间12小时，即得到部分脱乙酰基透明质酸-ADH中间体和催化剂的混合液，然后将其分离，干燥得到本发明的透明质酸-ADH中间体；在搅拌条件下先将适量部分脱乙酰基透明质酸—ADH中间体和琥珀酸酯葛根素充分溶解，再向其中加入催化剂DCC和DMAP等溶液，通过加入pH调节试剂-碳酸氢铵调节体系酸碱度pH10，通过控制反应温度25℃、反应时间5小时、和超声输出功率50W、时间4s、间隔时间8s、超生次数80次，即得到琥珀酸酯葛根素-部分脱乙酰基透明质酸纳米胶束和催化剂的混合液，经分离、透析、冷冻干燥洗涤，得到琥珀酸酯葛根素-部分脱乙酰基透明质酸纳米胶束；在超声条件下将其加入到乙醇有机分散相中与葛根素混合、置于透析袋内透析处理，最后经过滤、干燥得到总收率为49.92％，白色粉末状本发明的可溶性的高药物含量的固体产品。
实施例3
先将透明质酸甲酯加入到去离子水中充分溶解，再配成质量浓度是1.2％的溶液，并向其中加入催化剂PyBop、DIEA，制的溶液I。再将己二酸二酰肼(ADH)加入到去离子水中溶解，制得质量浓度是10％的溶液II。在搅拌条件下将溶液I滴加到溶液II中，通过加入pH调节试剂-氢氧化钠调节体系酸碱度pH12、控制反应温度60℃、搅拌速度10000rpm和反应时间1小时，即得到透明质酸甲酯-ADH中间体和催化剂的混合液，然后将其分离，干燥得到本发明的透明质酸甲酯-ADH中间体；在搅拌条件下先将适量透明质酸甲酯—ADH中间体和丁二酸酯葛根素充分溶解，再向其中加入催化剂DIC和DMAP等溶液，通过加入pH调节试剂-氢氧化钠调节体系酸碱度pH12、通过控制反应温度60℃、反应时间1小时和超声输出功率100W、时间2s、间隔时间10s、超生次数60次，即得到丁二酸酯葛根素-透明质酸甲酯纳米胶束和催化剂的混合液，经分离、透析、冷冻干燥洗涤，得到丁二酸酯葛根素-透明质酸甲酯纳米胶束；在超声条件下将其加入到甲醇有机分散相中与葛根素混合、置于透析袋内透析处理，最后经过滤、干燥得到总收率为47.68％，微黄色粉末状本发明的可溶性的高药物含量的固体产品。
实施例4
先将乙酰化透明质酸加入到去离子水中充分溶解，再配成质量浓度是0.6％的溶液，并向其中加入催化剂EDC和DIC，制的溶液I。再将己二酸二酰肼(ADH)加入到去离子水中溶解，制得质量浓度是3％的溶液II。在搅拌条件下将溶液I滴加到溶液II中，通过加入pH调节试剂-氨水调节体系酸碱度pH为9，控制反应温度为15℃，控制搅拌速度3000rpm反应12小时，即得到透明质酸甲酯-ADH中间体和催化剂的混合液，然后将其分离，干燥得到本发明的透明质酸甲酯-ADH中间体；在搅拌条件下先将适量透明质酸甲酯—ADH中间体和丁二酸酯葛根素充分溶解，再向其中加入催化剂EDC、HOBt等溶液，通过加入pH调节试剂-氨水调节体系酸碱度pH为9，通过控制反应温度15℃、反应时间8小时和超声输出功率60W、时间2s、间隔时间10s、超生次数40次，即得到丁二酸酯葛根素-透明质酸甲酯纳米胶束和催化剂的混合液，经分离、透析、冷冻干燥洗涤，得到丁二酸酯葛根素-透明质酸甲酯纳米胶束；在超声条件下将其加入到异丙醇有机分散相中与葛根素混合、置于透析袋内透析处理，最后经过滤、干燥得到总收率为49.79％，白色粉末状本发明的可溶性的高药物含量的固体产品。
实施例5
先将硫酸化透明质酸加入到去离子水中充分溶解，再配成质量浓度是0.8％的溶液，并向其中加入催化剂EDC和DIC，制的溶液I。再将己二酸二酰肼(ADH)加入到去离子水中溶解，制得质量浓度是5％的溶液II。在搅拌条件下将溶液I滴加到溶液II中，通过加入pH调节试剂-醋酸调节体系酸碱度pH为4，控制反应温度为40℃，控制搅拌速度8000rpm反应6小时，即得到透明质酸甲酯-ADH中间体和催化剂的混合液，然后将其分离，干燥得到本发明的透明质酸甲酯-ADH中间体；在搅拌条件下先将适量透明质酸甲酯—ADH中间体和丁二酸酯葛根素充分溶解，再向其中加入催化剂EDC、DMAP等溶液，通过加入pH调节试剂-醋酸调节体系酸碱度pH为4，通过控制反应温度40℃、反应时间6小时和超声输出功率100W、时间2s、间隔时间15s、超生次数50次，即得到丁二酸酯葛根素-透明质酸甲酯纳米胶束和催化剂的混合液，经分离、透析、冷冻干燥洗涤，得到丁二酸酯葛根素-透明质酸甲酯纳米胶束；在超声条件下将其加入到正丁醇有机分散相中与葛根素混合、置于透析袋内透析处理，最后经过滤、干燥得到总收率为47.27％，浅褐色粉末状本发明的可溶性的高药物含量的固体产品。
催化剂的选择和配比对对Hya-ADH-PS类接枝双亲聚合物收率的影响，具体如下表1所示：
表1催化剂种类对Hya-ADH-PS类接枝双亲聚合物收率的影响
Figure BDA0001690951980000051
表1所示，采用A种催化剂催化Hya-ADH上的-NH2与葛根素衍生物的羧基进行化学嫁接，Hya-ADH-PS类接枝双亲聚合物收率显著提高。
产品检测：本申请的上述实施例2中制备得到的固体产品的相关实验数据如说明书附图所示，具体如下：
如图1所示，葛根素透明质酸纳米胶束冻干粉样品。
如图2所示，葛根素的红外吸收光谱图中，3376.89cm-1是缔合的醇和酚的O-H伸缩振动，2950.03cm-1、2900.06cm-1是C-H的反对称伸缩振动，1634.19cm-1、1514.97cm-1左右出现C＝CA环和C环的苯环的两条伸缩振动峰，1448.06cm-1是葡萄吡喃糖环上6”CH2的弯曲振动峰，1275.06～1005.48cm-1是B环和葡萄吡喃糖环上C-O的伸缩振动，1058.71cm-1是葡萄吡喃糖6”位仲醇的伸缩振动，893.44cm-1是O-H的伸缩振动。对比葛根素的红外吸收，葛根素衍生物上的红外谱图有了明显的变化，官能团增加。3193.17cm-1处宽峰减弱，产物中羟基减少；1728.88cm-1处出现新峰，是反应后葛根素衍生物具有羧基官能团，而且在1256.16cm-1新出现的峰推测是酯化反应后生成的酯键引起的吸收峰，以上说明葛根素与丁二酸酐发生酯化反应，结构修饰后的葛根素带有了羧基。
如图3所示，Hya-ADH-PS的红外光谱与原料透明质酸相比，1737.17cm-1羧酸的C＝O伸缩振动消失，而1645.82cm-1C＝O的伸缩振动和N-H的弯曲振动增强，说明透明质酸的羧基参与了酰胺反应，生成酰胺键，同时葛根素衍生物也以酰胺键连接透明质酸，另外，1152.17cm-1和1208.08cm-1是酯C-O-C的两条对称和反对称伸缩振动，说明葛根素酚羟基与丁二酸酐反应后以酯键连接。795.47cm-1处出现葛根素的特征吸收峰。以上结果说明，透明质酸与葛根素通过酯键和酰胺键成功连接。
如图4所示，红外光谱分析结果表明，目标化合物Hya-ADH-PS含有透明质酸、己二酸二酰肼、丁二酸和葛根素的片段，其中只有葛根素中含有苯环，1HNMR氢谱(图4)显示在δ7到8之间出现苯环氢的吸收峰，从而可以说明目标化合物Hya-ADH-PS的结构中存在葛根素片段。
如图5所示，Hya-ADH-PS载体在水中可以自组装生成具有空心疏水性内核的纳米胶束，纳米胶束的直径大约在65nm。对于Hya-ADH-PS载药纳米胶束，在水中形成球形的纳米胶束后，直径减小，在57nm左右，此可能与葛根素填充疏水内核后，内核的疏水性增强，胶束更加紧密，因而胶束尺寸减小。
如图6和图7所示，Pue、SAA、ADH、Hya及Hya-ADH-PS的热重分析(TG)和微商热重分析(DTG)曲线。从图可以看出，Hya由于附在透明质酸上的水和其他挥发性化合物的损失，在42.23～130.95℃有一个分解阶段，失重5.1553％，最大分解温度是74.51℃；第二个主要分解阶段162.60～554.41℃，失重在62.2674％左右，最大分解温度是221.01℃。Hya-ADH-PS有两个主要分解阶段：第一阶段是吸附的结晶水和挥发性化合物以及连接的Pue开始分解导致在41.51～137.41℃范围内，最大分解温度是74.56℃，失重增加到6.1324％；第二个主要分解阶段186.86～537.76℃，失重在62.1146％，最大分解温度是241.81℃左右，比Hya纯品高，表明在Hya-ADH-PS中，有ADH、SAA和Pue片段，其中ADH两步分解中最大分解温度是356.34℃和458.80℃，SAA最大分解温度是211.39℃，Pue主要分解阶段的最大分解温度是284.28℃，这三个原料片段的最大分解温度显著高于Hya，此与含有ADH、SAA、Pue片段的Hya-ADH-PS热稳定性增强有关。
以上所述并非是对本发明的限制，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实质范围的前提下，还可以做出若干变化、改型、添加或替换，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种葛根素前体药物，其特征在于，该前体药物的制备方法具体包括如下步骤：
（1）采用透明质酸为原料溶解，并向其中加入催化剂，得到质量浓度是0.4%-1.2%的透明质酸的溶液I；
（2）将ADH溶解，制得质量浓度是1%-10%的溶液II；
（3）在搅拌条件下按0.2-8的质量混合比例将溶液I滴加到溶液II中，通过加入pH调节试剂调节体系酸碱度pH为1-12，控制反应温度为5-60℃，控制搅拌速度1000–10000rpm反应1-24小时，即得到含透明质酸-ADH中间体的混合液，经离心分离、干燥得到透明质酸-ADH中间体；
（4）在搅拌条件下先将透明质酸-ADH中间体和琥珀酸酯葛根素充分溶解，倾入到有机分散相中，琥珀酸酯葛根素的添加量是透明质酸-ADH中间体质量的0.2-7倍，再向其中加入催化剂，通过加入pH调节试剂调节体系酸碱度pH为1-12，控制反应温度为10-60℃，在超声条件下，反应1-10小时，得到含葛根素-透明质酸纳米胶束的混合液，经分离、透析、冷冻干燥洗涤，得到葛根素-透明质酸纳米胶束；
（5）在超声条件下将葛根素-透明质酸纳米胶束加入到有机分散相中与葛根素混合，葛根素-透明质酸纳米胶束与葛根素的质量混合比例为（1-6）:（1-4）；置于透析袋内透析处理，最后经过滤、干燥即得。
2.根据权利要求1所述葛根素前体药物，其特征在于，所述步骤（1）中透明质酸的分子量为20，000Da-2，000，00Da。
3.根据权利要求1或2所述葛根素前体药物，其特征在于，用透明质酸衍生物代替透明质酸，所述透明质酸衍生物选自部分脱乙酰基透明质酸、透明质酸甲酯、乙酰化透明质酸或硫酸化透明质酸。
4.根据权利要求1所述葛根素前体药物，其特征在于，所述步骤（1）和步骤（4）中的催化剂为EDC、NHS、DCC、DIC、HOBt、PyBop、DIEA、DMAP中的任意一种或两种。
5.根据权利要求1所述葛根素前体药物，其特征在于，所述步骤（3）和步骤（4）中的pH调节试剂为碳酸氢铵、氢氧化钠、氨水、氢氧化钾、盐酸或醋酸中的任意一种。
6.根据权利要求1所述葛根素前体药物，其特征在于，所述步骤（4）中透明质酸-ADH中间体和琥珀酸酯葛根素形成的混合液体积是有机分散相体积的1/4-1/16。
7.根据权利要求1所述葛根素前体药物，其特征在于，所述步骤（4）中的有机分散相为乙醇、甲醇、异丙醇或正丁醇中的任意一种。
8.根据权利要求1所述葛根素前体药物，其特征在于，所述步骤（4）和步骤（5）中的超声条件一致且均为：控制超声输出功率10-200w，超声时间2-12s，间隔时间4-16s，超声次数60-150次。
9.根据权利要求1所述葛根素前体药物，其特征在于，所述步骤（4）中冷冻干燥温度和时间分别是-20℃--40℃和24-48h；步骤（5）中透析处理所使用的透析袋截留分子量（MwCO）为6kD-8kD、12kD-14kD或8kD-10kD。
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