CN110384684B - 一种单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒及其制备方法 - Google Patents
一种单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒及其制备方法，是利用水溶性单羧基壳聚糖与三聚磷酸钠离子凝胶化作用形成包封紫草素的纳米颗粒，再通过亲水性高分子助剂与单羧基壳聚糖相互交联与组装，进而制备出粒径小、尺寸均一、稳定性高、生物活性好的复合纳米颗粒。本发明方法简单易行、成本低、反应条件温和、绿色环保、安全无毒，获得的复合纳米颗粒耐胃酸稳定性较强，有效提高了中草药紫草素的口服吸收利用率和靶向释药性能。
Description
技术领域
本发明涉及一种单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒及其制备方法，特别涉及一种高活性壳聚糖纳米载体的制备技术，属于功能性纳米材料制备技术领域。
背景技术
壳聚糖(Chitosan)是甲壳素的脱乙酰衍生物，来源于甲壳类动物、昆虫和其他无脊椎动物外壳或真菌酵母的细胞壁，每年的生物合成可达2000亿吨，是自然界唯一的天然阳离子碱性氨基多糖。壳聚糖来源广泛、可再生，且具有生物相容、无刺激、无致敏、无毒性、易降解、组织修复、免疫调节、止血、抗菌、抗癌、降血脂、抗氧化、保湿润肤等生物学活性，在医药保健、生物组织工程、环保化工、功能材料等领域的应用前景广阔。由于壳聚糖分子内与分子间存在较强的氢键作用使其难溶于水，只能溶于酸性溶液中，但酸性介质易挥发、腐蚀性强，且对生物体有一定的毒性，这些缺陷极大限制了壳聚糖的应用。单羧基壳聚糖由壳聚糖分子中C6位伯羟基部分或全部被选择性氧化为羧基而得到的壳聚糖衍生物，具有良好的水溶性、生物相容、降解性、反应活性、环境友好和无毒等特性，显示出了普通壳聚糖不具备的优良性质，水溶性壳聚糖更具应用潜力[Nicolas B,Stephane G,VeroniqueC.Advances on selective C-6oxidation of chitosan by TEMPO.Biomacromolecules,2008,9(9):2377-2382]。
壳聚糖纳米颗粒表现出独特的纳米小尺寸效应，其化学反应活性、生物活性、吸附性和比表面积都极大提高，在中性溶液中的溶解性显著改善，非常适合作为药物的递送和缓释载体。壳聚糖纳米载体通过调节其包埋药物的释放速度，使其在预订时间内控制释放，并在较长时间内维持有效浓度，延长药物作用时间，进而降低药物的副作用和提高生物利用率，壳聚糖纳米微球能实现对药物的缓释、控释和靶向释放药物的功能。
目前壳聚糖载药纳米粒的主要制备方法包括共价交联法、大分子复合法、去溶剂化法、乳滴联合技术[中国发明专利公开号：CN1903367A]，通常这些方法较繁琐，需要有机溶剂、分散剂和交联剂，且制备的纳米颗粒粒径较大，限制了某些给药途径；自组装构筑法可在水溶液中自组装形成粒径较小的壳聚糖纳米颗粒，但必须对壳聚糖进行化学改性使其具有两亲性，工序比较复杂，反应周期较长[中国发明专利公开号：CN103524750B]；离子凝胶法是制备壳聚糖纳米颗粒的一种简单迅速的方法，能在温和条件下生成粒径几十至数百纳米的颗粒，不使用有机溶剂和醛类交联剂，工艺简单，条件可控性高，易于规模化生产，得到的壳聚糖纳米颗粒稳定性好、粒径均匀。近年来，利用无毒副作用的三聚磷酸钠(TPP)对壳聚糖进行离子诱导凝胶化而形成纳米颗粒已成为热点方向，已有研究者在壳聚糖乙酸溶液中加入TPP、柠檬酸、催化剂次亚磷酸钠和表面活性剂吐温-80，通过离子凝胶交联制备出粒径20～30nm的纳米壳聚糖分散液[王成,陈宇岳,路艳华.纳米壳聚糖的制备及其对真丝纤维性能的影响.丝绸,2006(8):32-34；路艳华,王漓江,刘治梅.用于纺织品整理的低分子质量纳米壳聚糖的制备与表征.辽东学院学报,2009,16(2):93-96]，但长时间放置易发生沉降聚集，静置12h后纳米壳聚糖粒径大于70nm，纳米颗粒稳定性差，操作步骤较复杂，且制备过程中使用的酸、催化剂会残留于壳聚糖纳米颗粒中。发明专利CN101766820B公开了一种新型壳聚糖纳米载体的制备及其功能化的方法，其采用了醋酸溶液溶解壳聚糖，加入三聚磷酸钠TPP溶液得到纳米凝胶，再加入戊二醛交联和过量的硼氢化钠还原，经离心、透析后，制得粒径在200～600nm之间的壳聚糖纳米粒子，然而该方法制备的纳米颗粒粒径较大，戊二醛交联和硼氢化钠还原的时间均要8～15h，纳米粒子制备周期长，需要反应过夜，且使用了醛类化学交联剂，可能产生细胞毒性和副反应(如与药物分子反应等)。因此，利用水溶性壳聚糖衍生物制备包埋药物的新型壳聚糖纳米载体，对探索药物口服生物学活性的有效开发与广泛应用至关重要。
单羧基壳聚糖同时含有羧基和氨基，是一种两性聚电解质，其分子链中的伯氨基阳离子与三聚磷酸钠TPP的磷酸基阴离子产生电荷吸引作用，在适宜的条件下交联并把药物包裹在其中形成壳聚糖载药纳米颗粒；另一方面，单羧基壳聚糖分子中的活性羧基可与聚乙二醇(PEG)等高分子交联反应，引入亲水性PEG长链可提高壳聚糖纳米粒子的生物相容性及其在溶液中的稳定性和循环时间。紫草素(Shikonin)是从中草药紫草的根茎提取的萘醌类化合物，具有抑菌、消炎、抗过敏、降血糖、抗肿瘤、抗病毒、促进伤口愈合、活血化瘀、祛痘护肤等功效。近年来的研究显示，紫草素可以作为一种优良的天然药物与壳聚糖相结合形成载药复合纳米颗粒,能够有效传递和控释药物，具有药物包封率高、稳定性强和生物利用率好等特点[Sekine T,Kojima K,Matsumoto T.Evaluation of shikonin ongranulation tissue formation compared with carrageenan.Biological andPharmaceutical Bulletin,1998(21):950-952]。
发明内容
鉴于现有技术存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒及其制备方法，所述的复合纳米颗粒是以水溶性单羧基壳聚糖和天然中草药紫草素为原材料，通过无毒的三聚磷酸钠离子凝胶化作用和生物相容的高分子助剂交联而得到。该方法制得的纳米粒子粒径小、分布均匀、粒径可控，不使用有机溶剂和醛类交联剂，工艺简单、条件可控性好，具有绿色环保、稳定性强和生物活性高等优点。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒，其特点是：所述复合纳米颗粒是以单羧基壳聚糖和紫草素为原料，通过三聚磷酸钠的离子凝胶化作用和高分子助剂的交联作用而制得；所述单羧基壳聚糖、三聚磷酸钠以及紫草素的质量比为6～15:1:5～10；所述高分子助剂和所述单羧基壳聚糖的质量比为0.05～1:1。所述复合纳米颗粒的粒径范围为80～220nm，Zeta电位为22.36～38.73mV。
作为优选，所述单羧基壳聚糖的粘均分子量为4～36万，脱乙酰度≥88.6％，C6位羧基度为19.41％～56.25％。所述单羧基壳聚糖的结构式如下：
作为优选，所述的高分子助剂选为京尼平、β环糊精、乙二醇二甲基丙烯酸酯或数均分子量为600～2000的聚乙二醇。
所述单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒的制备方法，是按如下步骤进行：
(1)将单羧基壳聚糖粉末搅拌分散在无水乙醇中，用超声波细胞粉碎器对分散液进行超声空洞处理5～20min，使其中的单羧基壳聚糖沉淀被粉碎成亚微米颗粒，然后干燥，获得单羧基壳聚糖亚微米颗粒；
(2)将干燥后的单羧基壳聚糖亚微米颗粒搅拌溶于超纯水中，配制成质量浓度0.1～1.0％的溶液，再加入乳化剂和紫草素，经磁力搅拌充分乳化1～3h后得到稳定的乳化液体系；其中乳化剂和单羧基壳聚糖的质量比为0.5～4:1；
(3)调节所述乳化液体系的pH至3.0～6.5，在300～500rpm的强力搅拌条件下，使用自动注射器以1.0～2.5mL/min的速度逐滴加入浓度1～10g/L的三聚磷酸钠溶液，使单羧基壳聚糖的氨基阳离子与三聚磷酸钠的磷酸基阴离子相互交联，并进一步离子凝胶化而形成纳米颗粒，此时溶液呈现乳光；
(4)继续搅拌并将溶液温度保持在25～45℃，向溶液中加入高分子助剂后搅拌反应30～60min，冷却至室温并静置陈化2～4h，使得单羧基壳聚糖与紫草素形成稳定、均匀以及高载药量的复合纳米颗粒分散体；
(5)将步骤(4)所得的复合纳米颗粒分散体经高速冷冻离心机离心并弃去上清液后，加入质量浓度0.5～2％的冻干保护剂溶液，冷冻干燥即得分散良好的单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒。
作为优选，步骤(1)中所述超声波细胞粉碎器的工作频率为19～25kHz、超声波功率为50～300W。
作为优选，步骤(2)中所述超纯水是用0.22～0.45μm滤膜过滤2～3次的去离子水。
作为优选，步骤(3)中所述乳化液体系的pH通过浓度为0.05～0.1mol/L的乙酸或氢氧化钠溶液调节。
作为优选，步骤(2)中所述乳化剂为聚山梨酯-80、聚乙烯吡咯烷酮、脂肪醇聚氧乙烯醚或司盘-80。
作为优选，步骤(5)中所述冻干保护剂为甘露醇、海藻糖、葡萄糖或乳糖。
通过优化超声空洞处理时间、乳化剂用量、乳化液pH值、单羧基壳聚糖与三聚磷酸钠和紫草素的质量比、高分子助剂用量、反应时间和温度，可以获得一系列不同粒径的复合纳米颗粒。
与现有技术相比，本发明中复合纳米颗粒的制备原理和有益效果体现在：
1、本发明利用超声空洞处理技术，通过超声波细胞粉碎器在液体中产生的空化效应，形成高频的交变水压强和高强度剪切力，使单羧基壳聚糖颗粒破碎；同时超声波在液体中传播产生剧烈的扰动作用，可使颗粒加速，引起互相碰撞而击碎颗粒，从而将单羧基壳聚糖沉淀粉碎成亚微米颗粒，使单羧基壳聚糖的分子链变短，分子间氢键等作用力削弱，分子排列规整性和结晶度降低，增加了分子中活性氨基的可及度与反应活性，表现出低分子量壳聚糖的独特性质；同时，低分子量单羧基壳聚糖与TPP容易交联成球，并离子凝胶化生成粒径小、稳定性强的纳米粒子，有效避免了大分子壳聚糖由于粘度增大、分子链易缠绕聚集而阻碍壳聚糖与TPP的分子内交联。
2、本发明先通过水溶性单羧基壳聚糖与三聚磷酸钠离子凝胶化作用而形成包封紫草素的纳米颗粒，再利用亲水性高分子助剂与单羧基壳聚糖相互交联，在壳聚糖分子中引入亲水性高分子长链以提高壳聚糖纳米载体的生物相容性及其在溶液中的稳定性。制备得到的单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒的粒径较小、分布均匀、稳定性好、生物活性高，能够实现对包封药物紫草素的缓释、控释和靶向释放药物的功能。
3、本发明采用单羧基壳聚糖制备壳聚糖纳米载体，单羧基壳聚糖是将壳聚糖分子中C6位伯羟基选择性氧化为羧基，不影响壳聚糖环骨架和壳聚糖作为碱性多糖的特性，具有良好的水溶性、生物相容、降解性、反应活性、抑菌性、环境友好和安全卫生等特点。单羧基壳聚糖分子中含有羧基和氨基，是一种两性聚电解质，其吡喃糖环中的氨基可被羧基质子化而带有正电荷(-NH3 +)，增强了与TPP磷酸基阴离子的交联作用，有利于形成粒径小和稳定性强的纳米颗粒；另一方面，单羧基壳聚糖C6位的羧基在空间构象上可自由旋转，空间位阻小，化学活性高，易与亲水性高分子链接触及结合反应，通过高分子助剂的辅助交联作用，极大提高了壳聚糖纳米载体的物理化学稳定性和生物活性，使纳米颗粒尺寸更小、粒径均一、应用更广泛。
4、本发明制备的复合纳米颗粒是以水溶性单羧基壳聚糖和天然中草药紫草素为原料，通过无毒的三聚磷酸钠离子凝胶化作用和生物相容的高分子助剂交联而得到，反应过程简单、制备条件温和、不使用有机溶剂和醛类交联剂，绿色环保、安全无毒、成本较低，适合规模化生产。
附图说明
图1是本发明实施例3的复合纳米颗粒的扫描电镜图。
图2是本发明实施例4的复合纳米颗粒的扫描电镜图。
图3是本发明测试项3中单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒在体外模拟胃肠道环境中的药物释放曲线图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述，以下所述的参考实施例仅用于解释说明的目的，但不以任何形式限制本发明。
一、单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒的制备
实施例1
(1)将粘均分子量为4～36万、脱乙酰度≥88.6％、C6位羧基度为19.41％～56.25％的单羧基壳聚糖粉末搅拌分散在无水乙醇中，用工作频率为19～25kHz、超声波功率为50～300W的超声波细胞粉碎器对分散液进行超声空洞处理5～20min，使其中的单羧基壳聚糖沉淀被粉碎成亚微米颗粒，然后干燥，获得单羧基壳聚糖亚微米颗粒。
(2)将干燥后的单羧基壳聚糖亚微米颗粒搅拌溶于超纯水(用0.22～0.45μm滤膜过滤2～3次的去离子水)中配制成质量浓度0.1～1.0％溶液，再加入乳化剂和紫草素，经磁力搅拌充分乳化1～3h后得到稳定的乳化液体系。其中的乳化剂为聚山梨酯-80、聚乙烯吡咯烷酮、脂肪醇聚氧乙烯醚或司盘-80，乳化剂和单羧基壳聚糖的质量比为0.5～4:1；紫草素的纯度≥92％，紫草素与单羧基壳聚糖的质量比为5～10:6～15。
(3)用0.05～0.1mol/L的乙酸或氢氧化钠溶液调节上述均一乳化液的pH至3.0～6.5，在强力搅拌条件下(转速为300～500rpm)，使用自动注射器以1.0～2.5mL/min的速度逐滴加入浓度1～10g/L的三聚磷酸钠溶液，使单羧基壳聚糖的氨基阳离子与三聚磷酸钠的磷酸基阴离子相互交联，并进一步离子凝胶化而形成纳米颗粒，此时溶液呈现乳光。其中的单羧基壳聚糖和三聚磷酸钠的质量比为6～15:1。
(4)继续搅拌并将溶液温度保持在25～45℃，向溶液中加入一定量的高分子助剂后搅拌反应30～60min，冷却至室温并静置陈化2～4h，使得单羧基壳聚糖与紫草素形成稳定、均匀以及高载药量的复合纳米颗粒分散体。其中的高分子助剂选为京尼平、β环糊精、数均分子量为600～2000聚乙二醇或乙二醇二甲基丙烯酸酯；高分子助剂和单羧基壳聚糖的质量比为0.05～1:1。
(5)将复合纳米颗粒分散体经高速冷冻离心机离心(转速15000～20000rpm，时间20～40min)并弃去上清液后，加入质量浓度0.5～2％的冻干保护剂并冷冻干燥，制备成冻干粉，即获得分散良好的单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒，其粒径范围为80～220nm，Zeta电位为22.36～38.73mV。其中的冻干保护剂为甘露醇、海藻糖、葡萄糖或乳糖。
实施例2
(1)将粘均分子量为8万、脱乙酰度为90％、C6位羧基度为26.74％的单羧基壳聚糖粉末搅拌分散在无水乙醇中，用工作频率为20kHz、超声波功率为100W的超声波细胞粉碎器对分散液进行超声空洞处理10min，使其中的单羧基壳聚糖沉淀被粉碎成亚微米颗粒，然后干燥，获得单羧基壳聚糖亚微米颗粒。
(2)将干燥后的单羧基壳聚糖亚微米颗粒搅拌溶于超纯水(0.22μm滤膜过滤3次的去离子水)中配制成质量浓度0.4％溶液，加入乳化剂脂肪醇聚氧乙烯醚和紫草素，经磁力搅拌充分乳化2h后得到稳定的乳化液体系。其中的乳化剂脂肪醇聚氧乙烯醚和单羧基壳聚糖的质量比为1:1；紫草素的纯度为95％，紫草素与单羧基壳聚糖的质量比为5:6。
(3)用0.08mol/L的乙酸溶液调节上述均一乳化液的pH至4.5，在强力搅拌条件下(转速为500rpm)，使用自动注射器以1.5mL/min逐滴加入浓度5g/L的三聚磷酸钠溶液，使单羧基壳聚糖的氨基阳离子与三聚磷酸钠的磷酸基阴离子相互交联，并进一步离子凝胶化而形成纳米颗粒，此时溶液呈现乳光。其中的单羧基壳聚糖和三聚磷酸钠的质量比为12:1。
(4)继续搅拌并将溶液温度保持在25℃，向溶液中加入一定量的高分子助剂京尼平后搅拌反应40min，冷却至室温并静置陈化2h，使得单羧基壳聚糖与紫草素形成稳定、均匀以及高载药量的复合纳米颗粒分散体。其中的高分子助剂京尼平和单羧基壳聚糖的质量比为0.2:1。
(5)将复合纳米颗粒分散体经高速冷冻离心机离心(转速18000rpm，时间30min)后并弃去上清液后，加入质量浓度0.5％的冻干保护剂甘露醇并冷冻干燥，制备成冻干粉，即获得分散良好的单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒。利用动态光散射仪(DLS)进行测试，本实施例制得的复合纳米颗粒平均粒径为207nm左右、Zeta电位为37.51mV。
实施例3
(1)将粘均分子量为8万、脱乙酰度为90％、C6位羧基度为43.61％的单羧基壳聚糖粉末搅拌分散在无水乙醇中，用工作频率为20kHz、超声波功率为100W的超声波细胞粉碎器对分散液进行超声空洞处理15min，使其中的单羧基壳聚糖沉淀被粉碎成亚微米颗粒，然后干燥，获得单羧基壳聚糖亚微米颗粒。
(2)将干燥后的单羧基壳聚糖亚微米颗粒搅拌溶于超纯水(0.22μm滤膜过滤3次的去离子水)中配制成质量浓度0.4％溶液，加入乳化剂聚乙烯吡咯烷酮和紫草素，经磁力搅拌充分乳化2h后得到稳定的乳化液体系。其中的乳化剂聚乙烯吡咯烷酮和单羧基壳聚糖的质量比为2:1；紫草素的纯度为95％，紫草素与单羧基壳聚糖的质量比为5:6。
(3)用0.08mol/L的乙酸溶液调节上述均一乳化液的pH至3.5，在强力搅拌条件下(转速为500rpm)，使用自动注射器以1.5mL/min逐滴加入浓度5g/L的三聚磷酸钠溶液，使单羧基壳聚糖的氨基阳离子与三聚磷酸钠的磷酸基阴离子相互交联，并进一步离子凝胶化而形成纳米颗粒，此时溶液呈现乳光。其中的单羧基壳聚糖和三聚磷酸钠的质量比为10:1。
(4)继续搅拌并将溶液温度保持在25℃，向溶液中加入一定量的高分子助剂乙二醇二甲基丙烯酸酯后搅拌反应45min，冷却至室温并静置陈化2h，使得单羧基壳聚糖与紫草素形成稳定、均匀以及高载药量的复合纳米颗粒分散体。其中的高分子助剂乙二醇二甲基丙烯酸酯和单羧基壳聚糖的质量比为0.2:1。
(5)将复合纳米颗粒分散体经高速冷冻离心机离心(转速18000rpm，时间30min)并弃去上清液后，加入质量浓度0.5％的冻干保护剂甘露醇并冷冻干燥，制备成冻干粉，即获得分散良好的单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒。利用动态光散射仪(DLS)进行测试，本实施例制得的复合纳米颗粒平均粒径为86nm左右、Zeta电位为30.19mV。
本实施例所得的复合纳米粒子的扫描电镜图(×50.0k)如图1所示，外观形态为均匀一致的球形，粒径较小。
实施例4
(1)将粘均分子量为8万、脱乙酰度为90％、C6位羧基度为52.37％的单羧基壳聚糖粉末搅拌分散在无水乙醇中，用工作频率为20kHz、超声波功率为100W的超声波细胞粉碎器对分散液进行超声空洞处理15min，使其中的单羧基壳聚糖沉淀被粉碎成亚微米颗粒，然后干燥，获得单羧基壳聚糖亚微米颗粒。
(2)将干燥后的单羧基壳聚糖亚微米颗粒搅拌溶于超纯水(0.22μm滤膜过滤3次的去离子水)中配制成质量浓度0.4％溶液，加入乳化剂聚山梨酯-80和紫草素，经磁力搅拌充分乳化2h后得到稳定的乳化液体系。其中的乳化剂聚山梨酯-80和单羧基壳聚糖的质量比为3:1；紫草素的纯度为95％，紫草素与单羧基壳聚糖的质量比为5:6。
(3)用0.08mol/L的乙酸溶液调节上述均一乳化液的pH至3.5，在强力搅拌条件下(转速为500rpm)，使用自动注射器以1.5mL/min逐滴加入浓度5g/L的三聚磷酸钠溶液，使单羧基壳聚糖的氨基阳离子与三聚磷酸钠的磷酸基阴离子相互交联，并进一步离子凝胶化而形成纳米颗粒，此时溶液呈现乳光。其中的单羧基壳聚糖和三聚磷酸钠的质量比为8:1。
(4)继续搅拌并将溶液温度保持在25℃，向溶液中加入一定量的高分子助剂聚乙二醇后搅拌反应45min，冷却至室温并静置陈化2h，使得单羧基壳聚糖与紫草素形成稳定、均匀以及高载药量的复合纳米颗粒分散体。其中的高分子助剂聚乙二醇和单羧基壳聚糖的质量比为0.4:1，聚乙二醇的数均分子量为1000。
(5)将复合纳米颗粒分散体经高速冷冻离心机离心(转速18000rpm，时间30min)并弃去上清液后，加入质量浓度0.5％的冻干保护剂海藻糖并冷冻干燥，制备成冻干粉，即获得分散良好的单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒。利用动态光散射仪(DLS)进行测试，本实施例制得的复合纳米颗粒平均粒径为150nm左右，Zeta电位为35.14mV。
本实施例所得的复合纳米粒子的扫描电镜图(×50.0k)如图2所示，外观为球形，尺寸较均匀，粒径较大。
对比例
复合纳米颗粒的制备(不加入高分子助剂)：
(1)将粘均分子量为8万、脱乙酰度为90％、C6位羧基度为43.61％的单羧基壳聚糖粉末搅拌分散在无水乙醇中，用工作频率为20kHz，超声波功率为100W的超声波细胞粉碎器对分散液进行超声空洞处理15min，使其中的单羧基壳聚糖沉淀被粉碎成亚微米颗粒，然后干燥，获得单羧基壳聚糖亚微米颗粒。
(2)将干燥后的单羧基壳聚糖亚微米颗粒搅拌溶于超纯水(0.22μm滤膜过滤3次的去离子水)中配制成质量浓度0.4％溶液，加入乳化剂聚乙烯吡咯烷酮和紫草素，经磁力搅拌充分乳化2h后得到稳定的乳化液体系。其中的乳化剂聚乙烯吡咯烷酮和单羧基壳聚糖的质量比为2:1；紫草素的纯度为95％，紫草素与单羧基壳聚糖的质量比为5:6。
(3)用0.08mol/L的乙酸溶液调节上述均一乳化液的pH至3.5，在强力搅拌条件下(转速为500rpm)，使用自动注射器以1.5mL/min逐滴加入浓度5g/L的三聚磷酸钠溶液，使单羧基壳聚糖的氨基阳离子与三聚磷酸钠的磷酸基阴离子相互交联，并进一步离子凝胶化而形成纳米颗粒，此时溶液呈现乳光。其中的单羧基壳聚糖和三聚磷酸钠的质量比为10:1。
(4)继续搅拌并将溶液温度保持在25℃，搅拌反应45min，冷却至室温并静置陈化2h，使得单羧基壳聚糖与紫草素形成稳定、均匀以及高载药量的复合纳米颗粒分散体。
(5)将复合纳米颗粒分散体经高速冷冻离心机离心(转速18000rpm，时间30min)并弃去上清液后，加入质量浓度0.5％的冻干保护剂甘露醇并冷冻干燥，制备成冻干粉，即获得分散良好的单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒。利用动态光散射仪(DLS)进行测试，本实施例制得的复合纳米颗粒平均粒径为246nm左右，Zeta电位为43.27mV。
二、对上述实施例所得样品进行检测试验
测试项1：加入不同质量的高分子助剂乙二醇二甲基丙烯酸酯形成的复合纳米颗粒粒径测试
将按实施例3的方法所获得的不同高分子助剂乙二醇二甲基丙烯酸酯和单羧基壳聚糖质量比(0:1、0.1:1、0.2:1、0.5:1、1:1)的复合纳米分散液经动态光散射仪(DLS)进行检测，测试结果参见表1。
表1 复合纳米颗粒的平均粒径
由表1所示的测试数据分析后可知，将本发明中高分子助剂乙二醇二甲基丙烯酸酯按不同质量比例加入到纳米分散液中，制备的复合纳米颗粒粒径较小、大小均一、多分散系数低、稳定性好；与未添加高分子助剂所得到的复合纳米粒子粒径246nm相比，加入高分子助剂的复合纳米颗粒平均粒径在86～182nm左右，纳米粒尺寸显著减小，分布均匀，说明单羧基壳聚糖可与亲水性高分子链结合反应，在高分子助剂的辅助交联作用下，壳聚糖纳米载体的稳定性以及生物活性明显增强，且复合纳米颗粒的尺寸更小，粒径均匀，应用范围广阔。
测试项2：复合纳米颗粒的稳定性测试
分别取对比例和实施例2～4的复合纳米分散液样品各10mL，装入20mL西林瓶中，瓶口密封，在室温下放置1个星期。在规定时间测定复合纳米粒颗的平均粒径和Zeta电位，比较各样品的外观变化，测试结果如表2所示。
表2 静置1个星期前后复合纳米颗粒的粒径和电位变化
从表2可以看出，本发明采用特定高分子助剂与单羧基壳聚糖相互交联，明显改善了复合纳米颗粒的粒径及稳定性，高分子助剂的辅助交联作用将显著影响复合纳米粒的粒径、电位、稳定性和药理效果。通过优化高分子助剂的种类和加入比例，本发明技术制备的单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒具有更理想的粒径、电位和稳定性以及更有效的药理活性。
测试项3：复合纳米颗粒在体外模拟胃肠道环境中的药物释放测试
将包埋紫草素的复合纳米颗粒冻干粉(本发明实施例3的冻干粉)以及不含高分子助剂的复合纳米颗粒(对比例的冻干粉)对照样分别添加到pH值6.8～7.0的磷酸盐缓冲液中，再用HCl溶液调整pH值至2.0，并添加一定量的猪胃蛋白酶，使溶液中猪胃蛋白酶质量浓度为0.5％，在37℃振荡水浴中孵育200rpm，将上述样品液在不同时间收集并检测紫草素的释放特性。随后，利用碳酸氢钠溶液将反应液pH值调节至5.3，再加入一定量的脂肪酶、胰酶和胆汁提取物配制成肠液，在37℃振荡水浴中孵育200rpm，将样品液在不同时间收集后检测紫草素的释放特性。样品在模拟胃肠道环境中的释放结果见图3，与对照样相比，本发明制备的复合纳米颗粒在模拟胃液中的紫草素释放量相对较低，单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒的稳定性增强，可有效提高中草药紫草素的口服吸收利用率和靶向释药性能。
综上所述，采用水溶性单羧基壳聚糖与三聚磷酸钠离子凝胶化作用形成包封紫草素的纳米颗粒，再通过亲水性高分子助剂的辅助交联反应，制备得到粒径小、尺寸均一、稳定性高、生物活性好、靶向释药能力强的单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒。本发明利用无毒的三聚磷酸钠离子凝胶化作用和生物相容的高分子助剂交联来获得复合纳米颗粒，制备过程简单、反应条件温和、不使用有机溶剂和醛类交联剂，绿色环保、安全无毒、成本较低，因此，本发明具有规模化应用前景。
以上仅为本发明的较佳实施例而已并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒，其特征是：所述复合纳米颗粒是以单羧基壳聚糖和紫草素为原料，通过三聚磷酸钠的离子凝胶化作用和高分子助剂的交联作用而制得；所述单羧基壳聚糖、三聚磷酸钠以及紫草素的质量比为6～15:1:5～10；所述高分子助剂和所述单羧基壳聚糖的质量比为0.05～1:1；
所述单羧基壳聚糖的粘均分子量为4～36万，脱乙酰度≥88.6％，C6位羧基度为19.41％～56.25％；所述单羧基壳聚糖的结构式如下：
所述的高分子助剂选为京尼平、β环糊精、乙二醇二甲基丙烯酸酯或数均分子量为600～2000的聚乙二醇；
所述单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒的制备方法，是按如下步骤进行：
(1)将单羧基壳聚糖粉末搅拌分散在无水乙醇中，用超声波细胞粉碎器对分散液进行超声空洞处理5～20min，使其中的单羧基壳聚糖沉淀被粉碎成亚微米颗粒，然后干燥，获得单羧基壳聚糖亚微米颗粒；
(2)将干燥后的单羧基壳聚糖亚微米颗粒搅拌溶于超纯水中，配制成质量浓度0.1～1.0％的溶液，再加入乳化剂和紫草素，经磁力搅拌充分乳化1～3h后得到稳定的乳化液体系；所述乳化剂和单羧基壳聚糖的质量比为0.5～4:1；所述乳化剂为聚山梨酯-80、聚乙烯吡咯烷酮、脂肪醇聚氧乙烯醚或司盘-80；
(3)调节所述乳化液体系的pH至3.0～6.5，在300～500rpm的强力搅拌条件下，使用自动注射器以1.0～2.5mL/min的速度逐滴加入浓度1～10g/L的三聚磷酸钠溶液，使单羧基壳聚糖的氨基阳离子与三聚磷酸钠的磷酸基阴离子相互交联，并进一步离子凝胶化而形成纳米颗粒，此时溶液呈现乳光；
(4)继续搅拌并将溶液温度保持在25～45℃，向溶液中加入高分子助剂后搅拌反应30～60min，冷却至室温并静置陈化2～4h，使得单羧基壳聚糖与紫草素形成稳定、均匀以及高载药量的复合纳米颗粒分散体；
(5)将步骤(4)所得的复合纳米颗粒分散体经高速冷冻离心机离心并弃去上清液后，加入质量浓度0.5～2％的冻干保护剂溶液，冷冻干燥即得分散良好的单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒，其特征在于：所述复合纳米颗粒的粒径范围为80～220nm，Zeta电位为22.36～38.73mV。
3.根据权利要求1所述的单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒，其特征在于：步骤(1)中所述超声波细胞粉碎器的工作频率为19～25kHz、超声波功率为50～300W。
4.根据权利要求1所述的单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒，其特征在于：步骤(2)中所述超纯水是用0.22～0.45μm滤膜过滤2～3次的去离子水。
5.根据权利要求1所述的单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒，其特征在于：步骤(3)中所述乳化液体系的pH通过浓度为0.05～0.1mol/L的乙酸或氢氧化钠溶液调节。
6.根据权利要求1所述的单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒，其特征在于：步骤(5)中所述冻干保护剂为甘露醇、海藻糖、葡萄糖或乳糖。
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