CN103524750B - 聚乙二醇壳聚糖自组装纳米粒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
聚乙二醇壳聚糖自组装纳米粒的制备方法，属于功能材料制备技术领域。本发明以聚乙二醇修饰壳聚糖获得具有水溶性及生物相容性的壳聚糖衍生物，从而制备聚乙二醇壳聚糖自组装纳米粒。本发明的优点是：在温和的条件下，以TEMED·HCL为稀释剂，EDC和NHS为活化剂，通过共价偶联将mPEG-COOH接枝到CS上，以PEG修饰壳聚糖制备一种具有水溶性及良好生物相容性的聚乙二醇壳聚糖衍生物，使其能够在水溶液中自组装形成纳米粒。
Description
技术领域
本发明属于功能材料制备技术领域。
背景技术
壳聚糖是自然界唯一的碱性多糖，是甲壳素N-脱乙酰基的产物，在贝壳、虾壳蟹壳、节肢动物、环节动物、软体动物中大量存在。壳聚糖具有无毒、生物相容、生物降解及抗菌等优点，被广泛应用于生物、医学等领域。然而，由于分子内及分子间强大氢键的存在，导致壳聚糖不溶于水及生理环境，极大地限制了其应用，因此，具有特定性能的壳聚糖衍生物的开发备受关注。
在生物、医学领域中，可作为大分子药物及生物活性大分子载体应用的壳聚糖纳米颗粒的制备方法主要有：共价交联法、沉淀析出法、自组装等。共价交联法会影响大分子物质的释放；沉淀析出法为非均相反应，制备条件苛刻。因此制备一种具有水溶性及良好生物相容性的两亲性壳聚糖，通过分子在水溶液中自组装形成尺寸均匀的纳米粒，以实现大分子药物及生物活性大分子的包埋与释放具有重要的意义，是壳聚糖作为药物载体的绿色理想途径。
发明内容
本发明的目的在于提出一种能克服以上壳聚糖及壳聚糖纳米粒制备方法缺陷的聚乙二醇壳聚糖自组装纳米粒。
本发明的分子结构式为：
其中，n=2598，x=300。
此纳米粒的水分散体系稳定，尺寸均一，适合于大分子药物，活性大分子的包埋与释放，有望成为极具应用前景的生物活性大分子、药物缓释的理想载体。
本发明还提出以上聚乙二醇壳聚糖自组装纳米粒的制备方法。
包括以下步骤：
1）制备mPEG-COOH：先将mPEG溶解于干燥吡啶，然后加入琥珀酸酐，恒温反应至结束，再除去吡啶，所得固体经甲苯溶解，磁力搅拌下缓慢加入正己烷，至产物沉淀析出，粗产物经透析、冷冻干燥，可获得分子量为2000的mPEG-COOH；
2）将分子量为500KDa的CS溶解于醋酸水溶液中，再用pH为4.7的TEMED·HCL稀释CS醋酸水溶液，取得CS稀释液；
3）将1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-N-羟基琥珀酰亚胺与步骤2）制成的CS稀释液混合，再加入mPEG-COOH，在35℃恒温条件下，搅拌并控制反应体系pH值维持在4～6，制得PEG-CS粗产品；
4）将PEG-CS粗产物置于透析袋中透析，冷冻干燥得PEG-CS白色固体；
5）将PEG-CS白色固体分散于37℃蒸馏水中，得聚乙二醇壳聚糖自组装纳米粒。
本发明以聚乙二醇修饰壳聚糖获得具有水溶性及生物相容性的壳聚糖衍生物，从而制备聚乙二醇壳聚糖自组装纳米粒。
本发明的优点是：在温和的条件下，以TEMED·HCL为稀释剂，EDC和NHS为活化剂，通过共价偶联将mPEG-COOH接枝到CS上，以PEG修饰壳聚糖制备一种具有水溶性及良好生物相容性的聚乙二醇壳聚糖衍生物，使其能够在水溶液中自组装形成纳米粒。
另外，步骤1）中，所述mPEG与琥珀酸酐的投料摩尔比为1:1.2，以保证mPEG完全转化为mPEG-COOH；所述恒温为60℃，反应2h，可保证加热的均匀性，使得反应完全。
步骤2）中所述醋酸水溶液的浓度为2%w/v，所述CS与醋酸水溶液的投料比为1g︰6ml。可保证CS完全溶解于醋酸水溶液中。
步骤3）中mPEG-COOH与稀释液中CS的摩尔比可调，以获得一定接枝度的PEG-CS。
为了保证mPEG-COOH完全活化，促进后续反应，步骤3）中，EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）、NHS（N-N-羟基琥珀酰亚胺）和mPEG-COOH的混合质量比为16～77︰1～46︰8～400。
步骤4）中所述透析袋的截留分子量为25KDa，透析时间4天，保证将未参与反应的小分子物质完全透析出去，以获得纯产物。
附图说明
图1聚乙二醇壳聚糖PEG-CS(PEG:CS=5:1)的红外光谱图。
图2芘在不同浓度PEG-CS(PEG:CS=5:1)中的荧光光谱图。
图3芘的I1/I3值随PEG-CS(PEG:CS=5:1)浓度变化关系曲线图。
图4聚乙二醇壳聚糖PEG-CS(PEG:CS=5:1)自组装纳米粒TEM照片。
具体实施方式
一、实施例1：制备PEG:CS=5:1的聚乙二醇壳聚糖自组装纳米粒：
1、mPEG-COOH的合成：
称取5gmPEG放入圆底烧瓶中，用25ml干燥吡啶溶解，再加入0.3g琥珀酸酐，60℃恒温反应2h后，在45℃用旋转蒸发仪减压蒸馏除去绝大部分吡啶。所得固体用30ml甲苯溶解，在磁力加热搅拌器上不断搅拌，慢慢加入40ml正己烷沉淀剂，至产物析出。粗产物用透析袋透析四天，然后将透析所得物质冷冻干燥即得产物，可获得分子量为2000的mPEG-COOH。
2、聚乙二醇化壳聚糖PEG-CS（PEG:CS=5:1）的制备：
称取1gCS（500KDa）溶解于6ml醋酸（2%，w/v）中，用20mlpH为4.7的TEMED·HCL稀释，加入到三口烧瓶中，然后加入0.77mgEDC和0.46mgNHS，30min后按mPEG-COOH与CS摩尔比为5:1称取分子量为2000的20mgmPEG-COOH与分子量为500KDa的1gCS（摩尔比为5:1），加入到三口烧瓶中，恒温水浴35℃，搅拌反应36h，反应过程中控制pH4～6。
粗产物置于透析袋中透析4天，冷冻干燥得到聚乙二醇化壳聚糖(PEG:CS=5:1)固体。
3、聚乙二醇化壳聚糖PEG-CS(PEG:CS=5:1)自聚集组装纳米粒的制备：
将聚乙二醇化壳聚糖PEG-CS固体在37℃时分散于蒸馏水中，得到聚乙二醇壳聚糖自组装纳米粒。
FT-IR用BRUKER，Tensor27光谱测定。如图1所示，通过对比可以看出，PEG-CS的IR谱图上1074cm-1左右醚键吸收峰的相对强度明显高于壳聚糖，同时可观察到1632cm-1、1522cm-1处酰胺Ⅰ谱带和酰胺Ⅱ谱带的出现，证明壳聚糖与mPEG-COOH发生了反应。
由图1得知mPEG成功接枝到壳聚糖，mPEG-COOH上的羧基和壳聚糖上的氨基在EDC的作用下，发生酰化作用，形成酰胺键，mPEG接枝到壳聚糖，PEG-CS分子结构如图2所示。
以芘为荧光探针，用荧光光谱（F4500型荧光度计）研究PEG-CS纳米颗粒在水溶液中的聚集行为。如图2、3所示，在低浓度的PEG-CS溶液中，芘的I1/I3值接近芘在纯水中的I1/I3值1.72，当PEG-CS浓度为0.5~1.4mg/mL时，I1/I3值有明显的下降，PEG-CS浓度大于1.4mg/mL时，I1/I3值恒定在1.20左右，虽然小于在纯水中的值，但是界面依然很亲水。将PEG-CS放置7天后重复实验得到了相同的结果，表明聚乙二醇壳聚糖自组装纳米粒具有较好的稳定性。
图4是PEG-CS自组装纳米粒用磷钨酸染色后的照片，Tecnai-12型透射电子显微镜观察。由图中可以看出PEG-CS自组装纳米粒呈规整的球形，粒径约35±5nm，具有非常光洁的表面及良好的规整性。
所制备的聚乙二醇化壳聚糖自组装纳米粒可作为药物载体，增加药物的溶解度、代谢稳定性及体内循环时间。如本文中所制备的聚乙二醇化壳聚糖纳米粒可成功负载胰岛素，包封率可达85%以上。
分子结构式为：
其中，n=2598，x=300。
二、实施例2：制备mPEG:CS=1:10的聚乙二醇壳聚糖自组装纳米粒：
1、mPEG-COOH的合成：
称取5gmPEG放入圆底烧瓶中，用25ml干燥吡啶溶解，再加入0.3g琥珀酸酐，60℃恒温反应2h后，在45℃用旋转蒸发仪减压蒸馏除去绝大部分吡啶。所得固体用30ml甲苯溶解，在磁力加热搅拌器上不断搅拌，慢慢加入40ml正己烷沉淀剂，至产物析出。粗产物用透析袋透析四天，然后将透析所得物质冷冻干燥即得产物，可获得分子量为2000的mPEG-COOH。
2、聚乙二醇化壳聚糖PEG-CS(PEG:CS=1:10)的制备：
称取1gCS(500KDa)溶解于6ml醋酸（2%，w/v）中，用20mlTEMED·HCL（pH4.7）稀释，加入到三口烧瓶中，然后加入EDC(0.016mg)和NHS(0.01mg)，30min后按mPEG:CS=1:10的比例称取0.4mg分子量为2000的mPEG-COOH与1g分子量为500KDa的CS（摩尔质量比为1:10），加入到三口烧瓶中，恒温水浴35℃，搅拌反应36h，反应过程中控制pH4-6。
粗产物置于透析袋中透析4天，冷冻干燥得聚乙二醇化壳聚糖(PEG:CS=1:10)固体。
3、聚乙二醇化壳聚糖PEG-CS(PEG:CS=1:10)自聚集组装纳米颗粒的制备：
将聚乙二醇化壳聚糖PEG-CS(PEG:CS=1:10)固体在37℃时分散于蒸馏水中，得到聚乙二醇壳聚糖自组装纳米颗粒。
分子结构式为：
其中，n=2598，x=300。
Claims (5)
1.聚乙二醇壳聚糖自组装纳米粒的制备方法，分子结构式为：
其中，n=2598，x=300，所述聚乙二醇壳聚糖自组装纳米粒的制备方法包括以下步骤：
1）制备mPEG-COOH：先将mPEG溶解于干燥吡啶，然后加入琥珀酸酐，恒温反应至结束，除去吡啶，所得固体经甲苯溶解，磁力搅拌下缓慢加入正己烷，至产物沉淀析出，粗产物经透析、冷冻干燥得mPEG-COOH；
2）将分子量为500KDa的CS溶解于醋酸水溶液中，再用pH为4.7的TEMED·HCL稀释CS醋酸水溶液，取得CS稀释液；
3）将1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-N-羟基琥珀酰亚胺与步骤2）制成的CS稀释液混合，再加入mPEG-COOH，在35℃恒温条件下，搅拌并控制反应体系pH值维持在4～6，制得PEG-CS粗产品；
4）将PEG-CS粗产物置于透析袋中透析，冷冻干燥得到PEG-CS白色固体；
5）将PEG-CS白色固体分散于37℃蒸馏水中，得聚乙二醇壳聚糖自组装纳米粒。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤1）中，所述mPEG与琥珀酸酐的投料摩尔比为1:1.2，所述反应温度为60℃恒温，反应2h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤2）中所述醋酸水溶液的浓度为2%w/v，所述CS与醋酸水溶液的投料比为1g︰6ml。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤3）中所述1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-N-羟基琥珀酰亚胺和mPEG-COOH的混合质量比为16～77︰1～46︰8～400。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤4）中所述透析袋的截留分子量为25KDa，透析时间4天。
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