CN109912850B - 包载外泌体的自愈合水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种包载外泌体的自愈合水凝胶及其制备方法和应用，制备方法为：将甲基纤维素与对醛基苯甲酸反应修饰为醛基化甲基纤维素；壳聚糖与甲基聚乙二醇通过酰胺化反应得到中性条件下可溶解的聚乙二醇化的壳聚糖；通过离心的方法从胎盘间充质干细胞上清液中分离得到外泌体，将外泌体、醛基化甲基纤维素和聚乙二醇化的壳聚糖混合后即可通过醛基化甲基纤维素上的醛基与聚乙二醇化的壳聚糖分子中的氨基形成动态可逆希弗碱的交联网络结构即可；该自愈合水凝胶在运动处皮肤创伤修复中可以应用；由于凝胶具有抗菌性和外泌体在凝胶中表现出的缓释作用，使得本发明的包载外泌体的自愈合水凝胶具有良好的生物相容性、良好的自愈合性能和降解率。

Description

包载外泌体的自愈合水凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医学工程技术领域，具体属于智能仿生材料中的高分子材料，更具体涉及一种包载外泌体的自愈合水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

近年来随着生活水平的提高，人们也愈加关注医药健康。2006年到2016年，糖尿病导致的死亡绝对数和过早死亡寿命损失年(YLLs)分别增加了31.1％和25.3％。同时糖尿病带来的一些并发症给病人带来了极大的痛苦，从而降低了患者的生活质量。例如糖尿病患者的延迟伤口愈合是最具挑战性的问题之一，因为它会导致坏疽，增加截肢的风险与死亡率。目前主要采用的方法包括物理方法中的缝合减小伤口的面积，或采用注射细胞或生长因子等方式加速伤口愈合，但却存在流动性大效率低的问题。如何通过生物医用材料与载体的结合达到1+1＞2的效果，切实解决病人的痛苦，值得探索。

自愈合高分子水凝胶(self-healing polymer hydrogel)具有在材料内部和表面出现裂缝时自行恢复至初始强度和功能的能力，类似于生物组织中细胞的增殖与分化实现生物器官的自愈合修复，自愈合水凝胶通过可逆共价键与可逆非共价键的断裂与重连实现材料的自愈合。自愈合赋予了水凝胶多次“生命”，使其在生物传感器、伤口敷料、形状记忆材料与生物医用载体等应用领域大放异彩。(Nasim A.；Su R.S.et al.AdvancedMaterials,2016,28,40–49)水凝胶具有固定包载物位置的优势，可以达到局部浓度富集的需求，并尽可能地对周围正常组织不产生影响，从而避免了静脉注射或肌肉注射等常用方式对载体的浪费与疗效低等问题。同时自愈合性能使得材料出现破损时可以在一定时间内实现快速自愈，机械强度恢复至原始强度的90％以上。减少伤口暴露与外界接触的机会，有效隔绝细菌环境，避免感染带来的二次伤害(B.S.Kim et al.Biomaterials,2018,16,38-53)。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的首要目的是提供一种包载外泌体的自愈合水凝胶。

本发明的第二个目的是提供上述制备方法得到的自愈合水凝胶。

本发明的第三个目的是提供上述自愈合水凝胶的用途。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

一种包载外泌体的自愈合水凝胶的制备方法，其包括步骤：

将醛基化甲基纤维素(MC-CHO)的磷酸盐缓冲液和聚乙二醇化的壳聚糖(chitosan-g-PEG)的磷酸盐缓冲液混合，得到混合物，将胎盘间充质干细胞外泌体加入混合物内搅拌，静置得到包载外泌体的自愈合水凝胶；

其中，胎盘间充质干细胞外泌体属于物理掺杂，不参与该自愈合水凝胶骨架的构建。

优选地，醛基化甲基纤维素的磷酸盐缓冲液和聚乙二醇化的壳聚糖的磷酸盐缓冲液的体积比为1:1。

优选地，醛基化甲基纤维素的磷酸盐缓冲液中醛基化甲基纤维素的含量为10±1wt％，聚乙二醇化的壳聚糖的磷酸盐缓冲液中聚乙二醇化的壳聚糖的含量为3±1wt％。

优选地，醛基化甲基纤维素的制备过程包括：

将甲基纤维素(Methyl cellulose,MC)溶解在第一溶剂内得到第一混合物，将对醛基苯甲酸、二环己基碳二亚胺(Dicyclohexylcarbodiimide,DCC)和4-二甲氨基吡啶(4-Dimethylaminopyridine,DMAP)溶解在第一混合物内，经过冷冻-抽真空-充氩气-冷冻后，反应得到第二混合物，第二混合物在第二溶剂内沉淀后，重新溶解于第一溶剂内，透析并干燥得到醛基化甲基纤维素(MC-CHO)；

优选地，第一溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二乙基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二氯甲烷或三氯甲烷中的一种以上。

优选地，第二溶剂选自石油醚、正己烷、环己烷或乙醚中的一种以上。

优选地，对醛基苯甲酸、二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1-10:1.2-1.5:0.05-0.1。

优选地，反应的时间为12-24h。

优选地，透析的时间为2-5d。

优选地，聚乙二醇化的壳聚糖的制备过程包括：

(1)将甲基聚乙二醇(mPEG)、琥珀酸酐、三乙胺和4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解在第三溶剂内反应得到第三混合物，反应结束后将第三混合物中的溶剂蒸干，并将残余物溶解在第四溶剂内，之后在第二溶剂内沉淀，过滤得到羧甲基化甲氧基聚乙二醇(mPEG-COOH)；

(2)将壳聚糖(chitosan,CT)溶解在醋酸内得到第四混合物，将羧甲基化甲氧基聚乙二醇加入第四混合物内，将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在第五溶剂内得到第五混合物，第四混合物和第五混合物反应结束后用碱液将其pH调整为7，透析并冻干得到聚乙二醇化的壳聚糖(chitosan-g-PEG)；

优选地，步骤(1)中，第三溶剂为1,4-二氧六环。

优选地，步骤(1)中，第四溶剂选自二氯甲烷或三氯甲烷中的一种以上。

优选地，步骤(1)中，甲基聚乙二醇、琥珀酸酐、三乙胺和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:(1.5-2):1:1。

优选地，步骤(1)中，反应的时间为12-36h。

优选地，步骤(2)中，第五溶剂为去离子水。

优选地，步骤(2)中，反应的时间为4-8h。

优选地，步骤(2)中，碱液为氢氧化钠溶液。

优选地，胎盘间充质干细胞外泌体的提取过程包括：

将胎盘间充质干细胞离心收集细胞上清液，并将细胞上清液离心、过滤得到胎盘间充质干细胞外泌体，在-80℃下的环境下保存。

一种包载外泌体的自愈合水凝胶由上述的制备方法制备得到。

一种上述的包载外泌体的自愈合水凝胶在运动处皮肤创伤修复中的应用。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

第一、本发明制备的自愈合水凝胶具有良好的生物相容性和良好的自愈合性能，从而实现了作为一种用于皮肤创伤修复的水凝胶所需的可注射性、抗菌性与降解率。

第二、本发明的原料来源广泛，均可工业化生产；另外，本发明的制备方法简单易行，从而具有很好的推广应用价值。

附图说明

图1为本发明的包载外泌体的自愈合水凝胶的合成路线示意图。

图2为本发明的包载外泌体的自愈合水凝胶可逆过程示意图。

图3为本发明的包载外泌体的自愈合水凝胶注射在糖尿病小鼠的皮肤创伤处的示意图。

图4为本发明的包载外泌体的自愈合水凝胶用刚果红染色后的修复效果示意图。

图5为本发明的包载外泌体的自愈合水凝胶用刚果红和甲基蓝染色后的修复效果示意图。

图6为糖尿病小鼠注射PBS组、注射外泌体组(E组)、注射水凝胶组(H组)以及注射包载外泌体的水凝胶组(HE组)在5天、10天和15天时皮肤伤口愈合的效果示意图。

图7为糖尿病小鼠注射PBS组、注射外泌体组(E组)、注射水凝胶组(H组)以及注射包载外泌体的水凝胶组(HE组)在5天、10天和15天时皮肤伤口面积大小的效果示意图(横坐标Time为时间，纵坐标Wound Area为伤口面积)。

图8为本发明的包载外泌体的自愈合水凝胶的生物相容性的示意图(横坐标Concentration of extract为提取物浓度，纵坐标Cell Valibility为细胞存活率)。

具体实施方式

本发明提供了一种包载外泌体的自愈合水凝胶及其制备方法和应用。

包载外泌体的自愈合水凝胶是由甲基纤维素和壳聚糖的两种改性天然高分子合成得到，天然高分子(natural polymers)是指以由重复单元连接成的线型长链为基本结构的高分子量化合物，是存在于动物、植物及生物体内的高分子物质。其中甲基纤维素(methylcellulose)是一种非离子纤维素醚，它是通过醚化在纤维素中引入甲基而制成的，具有良好的生物相容性。壳聚糖(chitosan)是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的，由于其具有抗菌性的特点而被广泛应用于医用敷料中。本发明的制备方法利用DCC反应和EDC/NHS反应，将醛基化的甲基纤维素与中性条件下可溶的聚乙二醇接枝壳聚糖，并结合通过低温超速离心方法从胎盘间充质干细胞上清液中分离得到外泌体，从而制备得到包载外泌体的自愈合水凝胶，进一步用于运动处皮肤创伤的修复。

<包载外泌体的自愈合水凝胶的制备方法>

如图1所示，本发明的包载外泌体的自愈合水凝胶的制备方法包括如下步骤：

将醛基化甲基纤维素(MC-CHO)的磷酸盐缓冲液和聚乙二醇化的壳聚糖(chitosan-g-PEG)的磷酸盐缓冲液混合，得到混合物；将胎盘间充质干细胞外泌体加入混合物内搅拌均匀，5min内实现溶液至凝胶的转变，即得到包载外泌体的自愈合水凝胶；

其中，醛基化甲基纤维素的磷酸盐缓冲液和聚乙二醇化的壳聚糖的磷酸盐缓冲液的体积比为1:1；胎盘间充质干细胞外泌体的个数为1×10¹⁰个/mL。

醛基化甲基纤维素的磷酸盐缓冲液中醛基化甲基纤维素的含量可以为10±1wt％，优选为10wt％；聚乙二醇化的壳聚糖的磷酸盐缓冲液中聚乙二醇化的壳聚糖的含量可以为3±1wt％，优选为3wt％。

实际上，如图2所示，包载外泌体的自愈合水凝胶的制备过程：通过醛基修饰的甲基纤维素中的醛基与水溶性较好的聚乙二醇接枝的壳聚糖中的氨基形成希弗碱这一动态可逆共价键形成网络状结构，即当该自愈合水凝胶受到外力作用时，可逆动态共价键希弗碱吸收应力，受力破坏变为醛基和氨基；当该自愈合水凝胶失去外力作用时，在无外界干扰的条件下醛基与氨基再一次结合变为希弗碱，将基体重新连接，从而实现该水凝胶自愈合。

<醛基化甲基纤维素的制备过程>

醛基化甲基纤维素(醛基改性甲基纤维素)的制备过程包括如下步骤：

将甲基纤维素(MC)溶解在第一溶剂内得到第一混合物，将对醛基苯甲酸、二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解在第一混合物内，该体系经过冷冻-抽真空-充氩气-冷冻三个回合后，常温下磁力搅拌反应得到第二混合物，第二混合物在第二溶剂内沉淀后，重新溶解于第一溶剂内，透析并冷冻干燥至恒重，得到白色固体醛基化甲基纤维素(MC-CHO)；

其中，第一溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二乙基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二氯甲烷或三氯甲烷中的一种以上。

第二溶剂选自石油醚、正己烷、环己烷或乙醚中的一种以上。

对醛基苯甲酸、二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1-10:1.2-1.5:0.05-0.1。

反应的时间可以为12-24h，优选为12h；透析的时间可以为2-5d，优选为3d。

<聚乙二醇化的壳聚糖的制备过程>

聚乙二醇化的壳聚糖(聚乙二醇接枝壳聚糖)的制备过程包括如下步骤：

(1)将甲基聚乙二醇(mPEG)、琥珀酸酐、三乙胺和4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解在第三溶剂内，常温下加入磁性搅拌子搅拌反应得到第三混合物，反应结束后将第三混合物中的溶剂蒸干，并将残余物溶解在第四溶剂内，之后在第二溶剂内沉淀，过滤得到白色固体粉末羧甲基化甲氧基聚乙二醇(mPEG-COOH)；

(2)将壳聚糖(CT)溶解在1.0w/v％的醋酸内得到第四混合物，将羧甲基化甲氧基聚乙二醇加入第四混合物内，将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在第五溶剂内，逐滴滴入得到第五混合物，第四混合物和第五混合物室温反应，反应结束后用碱液将其pH调整为7，透析并冻干得到白色固体聚乙二醇化的壳聚糖(chitosan-g-PEG)；

其中，在步骤(1)中，第三溶剂为1,4-二氧六环。

在步骤(1)中，第四溶剂选自二氯甲烷或三氯甲烷中的一种以上。

在步骤(1)中，甲基聚乙二醇、琥珀酸酐、三乙胺和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:(1.5-2):1:1。

在步骤(1)中，反应的时间可以为12-36h，优选为24h。

在步骤(2)中，第五溶剂为去离子水。

在步骤(2)中，反应的时间可以为4-8h，优选为4h。

在步骤(2)中，碱液为氢氧化钠溶液。

<胎盘间充质干细胞外泌体的提取过程>

胎盘间充质干细胞外泌体的提取过程包括：

将胎盘间充质干细胞离心收集细胞上清液，并将细胞上清液离心以除去死亡细胞和细胞碎片，并使用0.22μm滤膜过滤后在4℃下离心(转速为10000rpm)30min，得到胎盘间充质干细胞外泌体，在-80℃下的超低温冰箱中保存。

综上，本发明的包载外泌体的自愈合水凝胶的制备方法是将甲基纤维素MC与对醛基苯甲酸通过DCC反应修饰为醛基化甲基纤维素MC-CHO；壳聚糖CT与甲基聚乙二醇mPEG通过酰胺化反应得到中性条件下可溶解的聚乙二醇化的壳聚糖chitosan-g-PEG；通过低温超速离心的方法从胎盘间充质干细胞上清液中分离得到外泌体(即促进细胞增殖分化的信号分子)，将外泌体、醛基化甲基纤维素和聚乙二醇化的壳聚糖混合后即可通过醛基化甲基纤维素上的醛基与聚乙二醇化的壳聚糖分子中的氨基形成动态可逆希弗碱形成交联网络从而得到包载外泌体的自愈合水凝胶，即包载外泌体的甲基纤维素-壳聚糖自愈合水凝胶。

<包载外泌体的自愈合水凝胶>

由上述制备方法得到包载外泌体的自愈合水凝胶。

<包载外泌体的自愈合水凝胶的用途>

包载外泌体的自愈合水凝胶可以在运动处皮肤创伤修复中应用。

以下结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：

本实施例的包载外泌体的自愈合水凝胶的制备方法包括如下步骤：

(1)将5g甲基纤维素(MC)溶解在N,N-二甲基甲酰胺内得到第一混合物，将0.149g,1mmol对醛基苯甲酸、0.178g,1.2mmol二环己基碳二亚胺(DCC)和14.66mg,0.12mmol 4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解在70mL第一混合物内，该体系经过冷冻-抽真空-充氩气-冷冻三个回合后，常温下磁力搅拌反应12h得到第二混合物，第二混合物在冰冻的乙醚内沉淀后，重新溶解于N,N-二甲基甲酰胺内，透析3d并冷冻干燥至恒重，得到白色固体醛基化甲基纤维素(MC-CHO)；

(2)将5.2g,1.04mmol甲基聚乙二醇(mPEG)、1.56g,1.56mmol琥珀酸酐、0.1442mL,1.04mmol三乙胺和127mg,1.04mmol 4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解在40mL无水1,4-二氧六环内，常温下加入磁性搅拌子搅拌反应24h得到第三混合物，反应结束后将第三混合物中的溶剂旋转蒸干，并将残余物溶解在二氯甲烷内，之后在冰冻的乙醚内沉淀，过滤得到白色固体粉末羧甲基化甲氧基聚乙二醇(mPEG-COOH)；

(3)将0.3g壳聚糖(CT)溶解在30mL 1.0w/v％的醋酸内得到第四混合物，将1.05g羧甲基化甲氧基聚乙二醇加入第四混合物内，将0.2g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.12g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在20mL去离子水内，逐滴滴入得到第五混合物，第四混合物和第五混合物室温反应4h，反应结束后用0.5mol/L的NaOH溶液将其pH调整为7，透析3d并冻干得到白色固体聚乙二醇化的壳聚糖(chitosan-g-PEG)；

(4)将200mL胎盘间充质干细胞离心收集细胞上清液，并使用0.22μm滤膜过滤后在4℃下超速离心30min，得到3mL胎盘间充质干细胞外泌体，在-80℃下的超低温冰箱中保存；

(5)将醛基化甲基纤维素(MC-CHO)配成10wt％醛基化甲基纤维素的磷酸盐缓冲液，将聚乙二醇化的壳聚糖(chitosan-g-PEG)配成3wt％的聚乙二醇化的壳聚糖的磷酸盐缓冲液，并将10wt％醛基化甲基纤维素的磷酸盐缓冲液和3wt％的聚乙二醇化的壳聚糖的磷酸盐缓冲液按体积比1:1混合得到混合物，将胎盘间充质干细胞外泌体加入该混合物内混合搅拌均匀，5min内实现溶液至凝胶的转变，即得到包载外泌体的自愈合水凝胶。

实施例2：

本实施例的包载外泌体的自愈合水凝胶的制备方法包括如下步骤：

(1)将5g甲基纤维素(MC)溶解在N,N-二甲基甲酰胺内得到第一混合物，将0.149g,1mmol对醛基苯甲酸、0.178g,1.2mmol二环己基碳二亚胺(DCC)和14.66mg,0.12mmol 4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解在70mL第一混合物内，该体系经过冷冻-抽真空-充氩气-冷冻三个回合后，常温下磁力搅拌反应24h得到第二混合物，第二混合物在冰冻的环己烷内沉淀后，重新溶解于N,N-二甲基甲酰胺内，透析2d并冷冻干燥至恒重，得到白色固体醛基化甲基纤维素(MC-CHO)；

(2)将5.2g,1.04mmol甲基聚乙二醇(mPEG)、1.56g,1.56mmol琥珀酸酐、0.1442mL,1.04mmol三乙胺和127mg,1.04mmol 4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解在40mL无水1,4-二氧六环内，常温下加入磁性搅拌子搅拌反应24h得到第三混合物，反应结束后将第三混合物中的溶剂旋转蒸干，并将残余物溶解在二氯甲烷内，之后在冰冻的乙醚内沉淀，过滤得到白色固体粉末羧甲基化甲氧基聚乙二醇(mPEG-COOH)；

(3)将0.3g壳聚糖(CT)溶解在30mL 1.0w/v％的醋酸内得到第四混合物，将1.05g羧甲基化甲氧基聚乙二醇加入第四混合物内，将0.2g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.12g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在20mL去离子水内，逐滴滴入得到第五混合物，第四混合物和第五混合物室温反应4h，反应结束后用0.5mol/L的NaOH溶液将其pH调整为7，透析3d并冻干得到白色固体聚乙二醇化的壳聚糖(chitosan-g-PEG)；

(4)将200mL胎盘间充质干细胞离心收集细胞上清液，并使用0.22μm滤膜过滤后在4℃下超速离心30min，得到3mL胎盘间充质干细胞外泌体，在-80℃下的超低温冰箱中保存；

(5)将醛基化甲基纤维素(MC-CHO)配成10wt％醛基化甲基纤维素的磷酸盐缓冲液，将聚乙二醇化的壳聚糖(chitosan-g-PEG)配成3wt％的聚乙二醇化的壳聚糖的磷酸盐缓冲液，并将10wt％醛基化甲基纤维素的磷酸盐缓冲液和3wt％的聚乙二醇化的壳聚糖的磷酸盐缓冲液按体积比1:1混合得到混合物，将胎盘间充质干细胞外泌体加入该混合物内混合搅拌均匀，5min内实现溶液至凝胶的转变，即得到包载外泌体的自愈合水凝胶。

实施例3：

本实施例的包载外泌体的自愈合水凝胶的制备方法包括如下步骤：

(1)将5g甲基纤维素(MC)溶解在N,N-二甲基甲酰胺内得到第一混合物，将0.149g,1mmol对醛基苯甲酸、0.178g,1.2mmol二环己基碳二亚胺(DCC)和14.66mg,0.12mmol 4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解在70mL第一混合物内，该体系经过冷冻-抽真空-充氩气-冷冻三个回合后，常温下磁力搅拌反应24h得到第二混合物，第二混合物在冰冻环己烷内沉淀后，重新溶解于N,N-二甲基甲酰胺内，透析2d并冷冻干燥至恒重，得到白色固体醛基化甲基纤维素(MC-CHO)；

(2)将5.2g,1.04mmol甲基聚乙二醇(mPEG)、1.56g,1.56mmol琥珀酸酐、0.1442mL,1.04mmol三乙胺和127mg,1.04mmol 4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解在40mL无水1,4-二氧六环内，常温下加入磁性搅拌子搅拌反应24h得到第三混合物，反应结束后将第三混合物中的溶剂旋转蒸干，并将残余物溶解在二氯甲烷内，之后在冰冻的乙醚内沉淀，过滤得到白色固体粉末羧甲基化甲氧基聚乙二醇(mPEG-COOH)；

(3)将0.3g壳聚糖(CT)溶解在30mL 1.0w/v％的醋酸内得到第四混合物，将1.05g羧甲基化甲氧基聚乙二醇加入第四混合物内，将0.2g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.12g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在20mL去离子水内，逐滴滴入得到第五混合物，第四混合物和第五混合物室温反应8h，反应结束后用0.5mol/L的NaOH溶液将其pH调整为7，透析3d并冻干得到白色固体聚乙二醇化的壳聚糖(chitosan-g-PEG)；

(4)将200mL胎盘间充质干细胞离心收集细胞上清液，并使用0.22μm滤膜过滤后在4℃下超速离心30min，得到3mL胎盘间充质干细胞外泌体，在-80℃下的超低温冰箱中保存；

(5)将醛基化甲基纤维素(MC-CHO)配成10wt％醛基化甲基纤维素的磷酸盐缓冲液，将聚乙二醇化的壳聚糖(chitosan-g-PEG)配成3wt％的聚乙二醇化的壳聚糖的磷酸盐缓冲液，并将10wt％醛基化甲基纤维素的磷酸盐缓冲液和3wt％的聚乙二醇化的壳聚糖的磷酸盐缓冲液按体积比1:1混合得到混合物，将胎盘间充质干细胞外泌体加入该混合物内混合搅拌均匀，5min内实现溶液至凝胶的转变，即得到包载外泌体的自愈合水凝胶。

实施例4：

本实施例的包载外泌体的自愈合水凝胶的制备方法包括如下步骤：

(1)将5g甲基纤维素(MC)溶解在N,N-二甲基甲酰胺内得到第一混合物，将0.149g,1mmol对醛基苯甲酸、0.222g,1.5mmol二环己基碳二亚胺(DCC)和6.108mg,0.05mmol 4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解在70mL第一混合物内，该体系经过冷冻-抽真空-充氩气-冷冻三个回合后，常温下磁力搅拌反应36h得到第二混合物，第二混合物在冰冻环己烷内沉淀后，重新溶解于N,N-二甲基甲酰胺内，透析4d并冷冻干燥至恒重，得到白色固体醛基化甲基纤维素(MC-CHO)；

(2)将5.2g,1.04mmol甲基聚乙二醇(mPEG)、1.56g,1.56mmol琥珀酸酐、0.1442mL,1.04mmol三乙胺和127mg,1.04mmol 4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解在40mL无水1,4-二氧六环内，常温下加入磁性搅拌子搅拌反应24h得到第三混合物，反应结束后将第三混合物中的溶剂旋转蒸干，并将残余物溶解在三氯甲烷内，之后在冰冻的乙醚内沉淀，过滤得到白色固体粉末羧甲基化甲氧基聚乙二醇(mPEG-COOH)；

(3)将0.3g壳聚糖(CT)溶解在30mL 1.0w/v％的醋酸内得到第四混合物，将1.05g羧甲基化甲氧基聚乙二醇加入第四混合物内，将0.2g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.12g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在20mL去离子水内，逐滴滴入得到第五混合物，第四混合物和第五混合物室温反应4h，反应结束后用0.5mol/L的NaOH溶液将其pH调整为7，透析3d并冻干得到白色固体聚乙二醇化的壳聚糖(chitosan-g-PEG)；

(4)将200mL胎盘间充质干细胞离心收集细胞上清液，并使用0.22μm滤膜过滤后在4℃下超速离心30min，得到3mL胎盘间充质干细胞外泌体，在-80℃下的超低温冰箱中保存；

(5)将醛基化甲基纤维素(MC-CHO)配成10wt％醛基化甲基纤维素的磷酸盐缓冲液，将聚乙二醇化的壳聚糖(chitosan-g-PEG)配成3wt％的聚乙二醇化的壳聚糖的磷酸盐缓冲液，并将10wt％醛基化甲基纤维素的磷酸盐缓冲液和3wt％的聚乙二醇化的壳聚糖的磷酸盐缓冲液按体积比1:1混合得到混合物，将胎盘间充质干细胞外泌体加入该混合物内混合搅拌均匀，5min内实现溶液至凝胶的转变，即得到包载外泌体的自愈合水凝胶。

<实验>

如图3所示，将上述实施例的包载外泌体的自愈合水凝胶注射在糖尿病小鼠的皮肤创伤处进行如下实验，实际上，将磷酸缓冲液注射在糖尿病小鼠的皮肤创伤处成为PBS组，将醛基化甲基纤维素和聚乙二醇化的壳聚糖混合得到的水凝胶注射在糖尿病小鼠的皮肤创伤处成为H组，将胎盘间充质干细胞外泌体的磷酸盐缓冲液注射在糖尿病小鼠的皮肤创伤处成为E组，将本发明的包载外泌体的自愈合水凝胶注射在糖尿病小鼠的皮肤创伤处成为HE组。具体地，将7-8周大的糖尿病小鼠分为四组，分别是PBS组(仅注射0.5mL磷酸缓冲液)；H组(仅注射0.5mL MC-CT水凝胶)；E组(注射0.5mL磷酸缓冲液，其中包含5×10⁹个外泌体)以及HE组(注射0.5mL MC-CT水凝胶，其中包含5×10⁹个外泌体)。

<实验1>

本实验的目的是验证包载外泌体的自愈合水凝胶具有良好的自愈合性能。

(1)如图4所示，将包载外泌体的自愈合水凝胶用刚果红染色，在该自愈合水凝胶的中心挖开一个直径为5mm的圆洞，经过一段时间，通过光学显微镜观察到孔洞逐渐变小，最终消失，说明该自愈合水凝胶具有良好的自愈合性能。

(2)如图5所示，将包载外泌体的自愈合水凝胶用甲基蓝染色，并在该自愈合水凝胶的中心挖开一个直径为5mm的圆洞，放置染过刚果红的水凝胶，经过一段时间，通过光学显微镜观察到甲基蓝和刚果红融合在一起，两者的截面最终消失成为一个整体，说明该自愈合水凝胶具有良好的自愈合性能。

通过上述实验，说明本发明的包载外泌体的自愈合水凝胶具有良好的自愈合性能。

<实验2>

如图6所示，将PBS组、E组、H组合HE组的小鼠经过15天的观察后，由于通过该自愈合水凝胶注射至糖尿病小鼠的皮肤创伤处，水凝胶的抗菌性与外泌体在凝胶中表现出的缓释作用，使得受损处皮肤具有较高的恢复效率，故通过光学显微镜可以看出HE组的皮肤伤口愈合效果最好，并生长出了毛囊结构，因此说明本发明的包载外泌体的自愈合水凝胶具有良好的自愈合性能。

<实验3>

如图7所示，将PBS组、E组、H组合HE组的小鼠经过15天的观察后，可以看出HE组的皮肤伤口面积从100％降低至8％，说明本发明的包载外泌体的自愈合水凝胶的自愈合性能好。

<实验4>

如图8所示，将不同浓度的包载外泌体的水凝胶的浸提液与细胞培养基混合共培养293T细胞24h后，使用MTT验证细胞存活率，各组细胞存活率均大于90％，因此说明本发明的自愈合水凝胶的生物相容性好，无生物毒性。

上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种包载外泌体的自愈合水凝胶的制备方法，其特征在于：其包括步骤：

将醛基化甲基纤维素的磷酸盐缓冲液和聚乙二醇化的壳聚糖的磷酸盐缓冲液混合，得到混合物；将胎盘间充质干细胞外泌体加入所述混合物内搅拌，静置得到包载外泌体的自愈合水凝胶；

所述醛基化甲基纤维素的制备过程包括：

将甲基纤维素溶解在第一溶剂内得到第一混合物，将对醛基苯甲酸、二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶溶解在所述第一混合物内，经过冷冻-抽真空-充氩气-冷冻后，反应得到第二混合物，所述第二混合物在第二溶剂内沉淀后，重新溶解于所述第一溶剂内，透析并干燥得到醛基化甲基纤维素；

所述聚乙二醇化的壳聚糖的制备过程包括：

(1)将甲基聚乙二醇、琥珀酸酐、三乙胺和4-二甲氨基吡啶溶解在第三溶剂内反应得到第三混合物，反应结束后将所述第三混合物中的溶剂蒸干，并将残余物溶解在第四溶剂内，之后在第二溶剂内沉淀，过滤得到羧甲基化甲氧基聚乙二醇；

(2)将壳聚糖溶解在醋酸内得到第四混合物，将所述羧甲基化甲氧基聚乙二醇加入所述第四混合物内，将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶解在第五溶剂内得到第五混合物，所述第四混合物和所述第五混合物反应结束后用碱液将其pH调整至中性，透析并冻干得到聚乙二醇化的壳聚糖。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述醛基化甲基纤维素的磷酸盐缓冲液和聚乙二醇化的壳聚糖的磷酸盐缓冲液的体积比为1:1；

所述醛基化甲基纤维素的磷酸盐缓冲液中醛基化甲基纤维素的含量为10±1wt％，所述聚乙二醇化的壳聚糖的磷酸盐缓冲液中聚乙二醇化的壳聚糖的含量为3±1wt％。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述第一溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二乙基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二氯甲烷或三氯甲烷中的一种以上；

所述第二溶剂选自石油醚、正己烷、环己烷或乙醚中的一种以上。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述对醛基苯甲酸、所述二环己基碳二亚胺和所述4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1-10:1.2-1.5:0.05-0.1；

所述反应的时间为12-24h；

所述透析的时间为2-5d。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述第三溶剂为1,4-二氧六环；

步骤(1)中，所述第四溶剂选自二氯甲烷或三氯甲烷中的一种以上；

步骤(1)中，所述甲基聚乙二醇、所述琥珀酸酐、所述三乙胺和所述4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:(1.5-2):1:1；

步骤(1)中，所述反应的时间为12-36h；

步骤(2)中，所述第五溶剂为去离子水；

步骤(2)中，所述反应的时间为4-8h；

步骤(2)中，所述碱液为氢氧化钠溶液。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述胎盘间充质干细胞外泌体的提取过程包括：

将胎盘间充质干细胞离心收集细胞上清液，并将所述细胞上清液离心、过滤得到胎盘间充质干细胞外泌体，在-80℃下的环境下保存。

7.一种包载外泌体的自愈合水凝胶，其特征在于：其由如权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到。

8.一种由如权利要求7所述的包载外泌体的自愈合水凝胶在运动处皮肤创伤修复中的应用。

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