CN115746412B

CN115746412B - 一种水溶性壳聚糖复合水凝胶及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN115746412B
Application number: CN202211314199.6A
Authority: CN
Inventors: 吴德成; 黄林; 王挽涛; 刘洪梅
Original assignee: Southwest University of Science and Technology
Current assignee: Southwest University of Science and Technology
Priority date: 2022-10-25
Filing date: 2022-10-25
Publication date: 2024-01-16
Anticipated expiration: 2042-10-25
Also published as: CN115746412A

Abstract

一种水溶性壳聚糖复合水凝胶及其制备方法与应用，该水凝胶是由甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖和改性聚乙二醇交联得到，改性聚乙二醇为醛基改性的聚乙二醇、琥珀酰亚胺改性的聚乙二醇中的至少一种。该水凝胶为双重交联可注射壳聚糖‑聚乙二醇水凝胶，具体为光交联协同席夫碱或酰胺键交联的水凝胶，相比两种单独交联方式得到的水凝胶具有更好的抗压缩性能。

Description

一种水溶性壳聚糖复合水凝胶及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及水凝胶领域，具体涉及一种水溶性壳聚糖复合水凝胶及其制备方法与应用。

背景技术

针对年龄的增长及其他原因造成的椎间盘纤维环、髓核退化进而压迫神经导致腰部疼痛等问题，临床上通常是采取椎间盘部分或全部切除的方法来进行治疗。由于椎间盘部位缺少血液供应，手术摘取椎间盘髓核后其会恢复能力极差，因此亟待开发一种椎间盘退化治疗的材料。水凝胶是一类含有大量水的三维网络结构的交联聚合物，其力学强度与生物组织较为相似，同时能够为细胞提供模拟生理环境的代谢场所，使其在细胞培养、药物递送和组织再生工程中具有重要的应用。

然而，现有的可注射壳聚糖基水凝胶力学性能差。

发明内容

根据第一方面，在一实施例中，提供一种水溶性壳聚糖复合水凝胶，所述水凝胶是由甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖和改性聚乙二醇交联得到，所述改性聚乙二醇为醛基改性的聚乙二醇、琥珀酰亚胺改性的聚乙二醇中的至少一种。

根据第二方面，在一实施例中，提供第一方面任意一项所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括：将甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖和醛基或琥珀酰亚胺改性的聚乙二醇混合，反应得到所述水溶性壳聚糖复合水凝胶。

根据第三方面，在一实施例中，提供一种原位组织再生水凝胶，包含第一方面任意一项的水溶性壳聚糖复合水凝胶。

根据第四方面，在一实施例中，提供第一方面任意一项所述水溶性壳聚糖复合水凝胶在制备椎间盘摘除手术髓核填充水凝胶中的应用。

依据上述实施例的一种水溶性壳聚糖复合水凝胶及其制备方法与应用，采用甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖和改性聚乙二醇交联得到的水凝胶具有优异的抗压缩性能。

在一实施例中，该水凝胶为双重交联可注射壳聚糖-聚乙二醇水凝胶，具体为光交联协同席夫碱或酰胺键交联的水凝胶，相比两种单独交联方式得到的水凝胶具有更好的抗压缩性能。

附图说明

图1是席夫碱成胶所需时间和实施例3提出的双重交联策略成胶所需时间对比图。

图2是水凝胶交联效果和水凝胶可注射性的验证，其中左图是不同双键接枝率的改性壳聚糖光交联成胶效果；右图是改性壳聚糖和聚乙二醇水凝胶可注射性的验证。

图3是不同双键接枝率的改性壳聚糖与聚乙二醇在不同凝胶方式作用下的压缩模量统计结果。

图4是不同双键接枝率的改性壳聚糖与聚乙二醇在不同凝胶方式作用下的电镜形貌图。

图5是不同凝胶方式的水凝胶对髓核细胞的毒性测试结果。

图6是的双重交联水凝胶对髓核细胞三维培养的实验结果。

图7是对大鼠尾椎椎间盘修复的计算机断层扫描的表征结果。

图8是对大鼠尾椎椎间盘修复的核磁共振成像的表征结果。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。

本文中，“溶解质量分数”是指溶质的质量占溶液质量的百分比。

本文中，席夫碱(英文名：Schiff base)，也称希夫氏碱、西佛碱。席夫碱主要是指含有亚胺或甲亚胺特性基团(－RC＝N－)的一类有机化合物，通常席夫碱是由胺和活性羰基缩合而成。

壳聚糖是自然界中唯一带正电荷的阳离子聚多糖，与细胞外基质主要成分之一的透明质酸分子结构类似，均是由糖苷键连接而成的线性氨基葡萄糖分子结构，以此为基质的水凝胶材料具有较好的生物活性。壳聚糖在生理条件下难以直接利用，因此制备水溶性壳聚糖水凝胶具有重要意义。甲基丙烯酸酐修饰的壳聚糖具有一定的水溶性，在引发剂存在的条件下可交联形成水凝胶。

改性聚乙二醇具有良好的化学反应活性，通常利用不同分子量的改性聚乙二醇作为高分子水凝胶的交联网络，以提升水凝胶的力学性能。此外聚乙二醇在体内外均有良好的生物安全性，是一种较好的合成高分子基材料，并且在生物医用水凝胶中有广泛地应用。醛基或琥珀酰亚胺基改性的聚乙二醇有较好的水溶性，能够与水溶性壳聚糖中的氨基发生席夫碱或酰胺键反应，为构建可注射壳聚糖水凝胶提供了可能。

针对可注射壳聚糖基水凝胶力学性能差、凝胶时间较长等问题，在一实施例中，本发明提出一种双重交联策略来改善上述问题，同时发现该水凝胶对髓核细胞具有良好的生物活性，在大鼠尾部椎间盘退化实验中证明，该复合水凝胶可以有效阻止椎间盘退化，能够较好地维持椎间盘中髓核的形态与结构，为临床开发椎间盘退化治疗水凝胶材料提供理论基础知识。

根据第一方面，在一实施例中，提供一种水溶性壳聚糖复合水凝胶，该水凝胶是由甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖和改性聚乙二醇交联得到，改性聚乙二醇为醛基改性的聚乙二醇、琥珀酰亚胺改性的聚乙二醇中的至少一种。该水凝胶为双重交联可注射壳聚糖-聚乙二醇水凝胶，具体为光交联协同席夫碱或酰胺键交联的水凝胶，相比两种单独交联方式得到的水凝胶具有更好的抗压缩性能。

在一实施例中，壳聚糖的分子量为10～100kDa，脱乙酰度大于95％。壳聚糖的分子量不受限制，包括但不限于10kDa、20kDa、30kDa、40kDa、50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa、100kDa。

在一实施例中，壳聚糖的双键接枝率为10～30％(ChiMA1，10％、ChiMA2，20％、ChiMA3，30％)。

在一实施例中，壳聚糖的溶解质量分数为1wt％～3wt％。此为壳聚糖在用于制备甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖的溶液中的质量分数。

在一实施例中，制备式I所示的甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖的反应式如下：

在一实施例中，席夫碱交联水凝胶的凝胶时间与改性聚乙二醇分子量、含量、种类相关。

在一实施例中，改性聚乙二醇的分子式为式II～IV中的至少一种：

式II～IV中，n为12～110的自然数，优选为12～100的自然数，更优选为12～80的自然数，更优选为12～70的自然数，更优选为12～60的自然数，更优选为12～50的自然数，更优选为12～44的自然数。

在一实施例中，式II～IV所示聚乙二醇的溶解质量分数为2～12wt％。此为聚乙二醇在用于制备改性聚乙二醇的溶液中的质量分数。

在一实施例中，酰胺键交联水凝胶的凝胶时间与改性聚乙二醇分子量、含量、种类相关。

在一实施例中，改性聚乙二醇的分子式为式V～VII中的至少一种：

式V～VII中，n为12～110的自然数，优选为12～100的自然数，更优选为12～80的自然数，更优选为12～70的自然数，更优选为12～60的自然数，更优选为12～50的自然数，更优选为12～44的自然数。

在一实施例中，式V～VII所示聚乙二醇的溶解质量分数为2～12wt％。此为聚乙二醇在用于制备改性聚乙二醇的溶液中的质量分数。

在一实施例中，双重交联水凝胶中的PEG分子量约为5kDa，式II～式VII中的n优选为12～50的自然数。

在一实施例中，制得的光交联协同席夫碱或酰胺键交联复合水凝胶具有快速凝胶效果，凝胶时间为5～60秒，优选为5～50秒，更优选为5～40秒，更优选为5～20秒；复合水凝胶压缩模量为0.1kPa～100kPa，优选为10kPa～100kPa，更优选为50kPa～100kPa，更优选为80kPa～100kPa；压缩强度为16～60kPa，优选为25～60kPa，更优选为35～60kPa，更优选为50～60kPa。

在一实施例中，双重交联可注射壳聚糖-聚乙二醇水凝胶对椎间盘髓核细胞具有良好的增殖作用，可用于椎间盘摘除手术髓核填充水凝胶材料，同时还可以作为缓解纤维环受损而引起的椎间盘退化的治疗水凝胶。

在一实施例中，水溶性壳聚糖复合水凝胶的制备方法包括：将甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖和醛基或琥珀酰亚胺改性的聚乙二醇混合，反应得到所述水溶性壳聚糖复合水凝胶。该水凝胶具有优异的抗压缩性能。

在一实施例中，水溶性壳聚糖复合水凝胶的制备方法包括：将甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖和醛基或琥珀酰亚胺改性的聚乙二醇混合，在光引发剂存在的条件下，光照，得到水溶性壳聚糖复合水凝胶。光照可以显著缩短凝胶时间。

在一实施例中，光引发剂包括但不限于LAP、Irgacure2959、α-酮戊二酸中的至少一种。

LAP是指苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphos phinate)，CAS：85073-19-4，化学式：C₁₆H₁₈LiO₃P。

Irgacure2959是指(2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮)(2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)，CAS:106797-53-9，化学式：C₁₂H₁₆O₄。

在一实施例中，光照时使用的光的波长为365～405nm，优选为405nm。

根据第二方面，在一实施例中，提供第一方面任意一项的水溶性壳聚糖复合水凝胶的制备方法，将甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖和醛基或琥珀酰亚胺改性的聚乙二醇混合，反应得到所述水溶性壳聚糖复合水凝胶。该水凝胶具有优异的抗压缩性能。

在一实施例中，将甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖和醛基或琥珀酰亚胺改性的聚乙二醇混合，在光引发剂存在的条件下，光照，得到所述水溶性壳聚糖复合水凝胶。

根据第三方面，在一实施例中，提供一种原位组织再生水凝胶，包含第一方面任意一项的水溶性壳聚糖复合水凝胶。第一方面任意一项的水溶性壳聚糖复合水凝胶可以直接作为原位组织再生水凝胶，也可以加入其他组分，形成原位组织再生水凝胶。

根据第四方面，在一实施例中，提供第一方面任意一项的水溶性壳聚糖复合水凝胶在制备椎间盘摘除手术髓核填充水凝胶中的应用。

在一实施例中，本发明提供了一种水溶性壳聚糖复合水凝胶及其制备方法，该水凝胶由光引发交联和席夫碱或琥珀酰亚胺酯键交联得到，形成的双重交联网络水凝胶具有良好的力学性能。制备方法如下：首先将壳聚糖与甲基丙烯酸酐反应，得到水溶性的甲基丙烯酸化壳聚糖，同时其具有良好的蓝光(405nm)引发交联成胶效果。其次将对羧基苯甲醛或N-琥珀酰亚胺与聚乙二醇反应，得到醛基或N-琥珀酰亚胺改性的聚乙二醇，与甲基丙烯酸化壳聚糖共混后能形成席夫碱或酰胺键交联的水凝胶。最后将两种交联方式结合在一起，可以得到双重交联、力学性能增强的可注射水凝胶。本发明所得的复合水凝胶具有光照快速成胶、细胞生物相容性好等优点，并且在大鼠尾椎模型中证明该水凝胶具有良好的椎间盘保护作用。总之，该发明为构建原位组织再生水凝胶提供新思路。

在一实施例中，本发明提供一种快速光交联的壳聚糖水凝胶制备方法及应用，通过引入席夫碱或酰胺键交联以提升光交联水凝胶的力学性能。为达到上述目的，本发明利用甲基丙烯酸化对壳聚糖分子式中的氨基或者羟基进行取代，得到水溶性双键修饰的壳聚糖(ChiMA)。由于其同时存在丙烯酸基和氨基，因此可以进行光交联和醛基或琥珀酰亚胺酯修饰的聚乙二醇反应，得到力学性能增强、凝胶速度快的双重交联壳聚糖基可注射水凝胶。

在一实施例中，本发明采用的技术方案包括以下步骤：

1.分别制备甲基丙烯酸化的壳聚糖(式I)和改性的聚乙二醇(式II～VII)作为水凝胶的前驱体；(1)甲基丙烯酸化的壳聚糖合成方法包括以下步骤：将壳聚糖粉末溶解在稀醋酸溶液中，随后加入甲基丙烯酸酐在室温下机械搅拌反应过夜，然后对反应液进行透析，冷冻干燥后得到双键修饰的壳聚糖(ChiMA)。其中，壳聚糖分子量10～100kDa，甲基丙烯酸在壳聚糖分子上的接枝率为10～30％。(2)对羧基苯甲醛或N-琥珀酰亚胺酯改性的聚乙二醇合成方法包括以下步骤：将聚乙二醇、对羧基苯甲醛或N,N'-琥珀酰亚胺基碳酸酯、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶溶于二氯甲烷中，在氮气保护下室温过夜反应，随后依次用盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水反复洗涤，合并有机层干燥后得到醛基或琥珀酰亚胺酯修饰的聚乙二醇(PEG-DA，式I～III或PEG-NHS，式IV～VI)。

2.水凝胶前驱液配制方法包括以下步骤：将甲基丙烯酸化的壳聚糖(ChiMA)溶于含有0.2wt％苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)的去离子水或者pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液中配制得到ChiMA溶解质量分数为1wt％～3wt％的溶液A，同时配制含有0.2wt％苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)以及1wt％～12wt％对羧基苯甲醛或N-琥珀酰亚胺酯改性的聚乙二醇的溶液B。

3.双重交联可注射壳聚糖-聚乙二醇水凝胶的制备方法包括以下步骤：使用步骤2中的前驱液，将等体积的溶液A和溶液B分别装入双料注射器的管筒中，通过混合注射头挤出得到席夫碱或酰胺键交联的水凝胶，若施加以405nm、功率为12W、光强度为25～30Mw/cm²的蓝光光照，即可得到双重交联网络的壳聚糖-聚乙二醇原位水凝胶。

在一实施例中，本发明的具有以下有益效果：

1.在光交联壳聚糖水凝胶前驱液中先引入聚乙二醇进行席夫碱或酰胺键交联，可以有效地提升壳聚糖水凝胶的压缩模量，并且能够赋予壳聚糖水凝胶的可注射性。同时复合水凝胶具有光照快速成胶效果，能够作为原位组织再生水凝胶进行应用。

2.壳聚糖-聚乙二醇复合水凝胶具有良好的细胞相容性，体外对椎间盘髓核细胞的三维培养实验证明，该水凝胶能有效地维持细胞的活性，能够作为椎间盘髓核摘除的术后填充胶材料。

3.该复合水凝胶由天然的壳聚糖和生物安全性好的聚乙二醇构成，在体内不会产生毒害作用，有望能用于退化椎间盘的治疗。

在一实施例中，本发明提供一种双重交联可注射壳聚糖-聚乙二醇水凝胶的制备及其在椎间盘退化治疗中的应用。

在一实施例中，本发明提一种原位可注射壳聚糖双重交联水凝胶的制备方法与应用。

实施例1：甲基丙烯酸化的壳聚糖的合成

配制99.0g质量浓度为1wt％的冰醋酸水溶液，随后加入1.0g壳聚糖粉末(分子量为100kDa，脱乙酰度大于95％)，充分搅拌使其溶解成清亮的透明溶液。向壳聚糖溶液中逐滴加入370μL甲基丙烯酸酐，并继续在室温下搅拌反应过夜，反应结束后用截留分子量为8000的透析袋透析3天去除溶剂醋酸以及反应物甲基丙烯酸酐。在-50℃、0.01mbar条件下冷冻干燥7天后得到海绵状的甲基丙烯酸化的壳聚糖，避光干燥保存备用，产率约90％。

实施例2：醛基或琥珀酰亚胺酯改性的聚乙二醇的合成

称取3.26g的线性聚乙二醇(分子量为2000Da)、0.489g的对羧基苯甲醛或0.835gN,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯、0.625g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和0.199g的4-二甲氨基吡啶于250mL的圆底烧瓶中，随后加入100mL二氯甲烷溶解上述化合物，持续通入氮气30分钟排尽烧瓶内的空气，在氮气保护室温下反应24h。反应结束后用0.1M的HCl、饱和NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液充分洗涤，收集合并有机层，用无水MgSO₄干燥并过滤，旋转蒸发掉二氯甲烷后得到双端醛基或琥珀酰亚胺酯改性的线性聚乙二醇(式II,PEG₂-DA，或式V,PEG₂-NHS；n均为44，PEG₂分子量为2000Da)，产率约80％。

将上述线性聚乙二醇分别换成四臂或者八臂聚乙二醇，用同样的合成方法制备得到醛基或琥珀酰亚胺酯改性的四臂或八臂-聚乙二醇(式III,PEG₄-DA，或式IV,PEG₈-DA，或式VI,PEG₄-NHS，或式VII,PEG₈-NHS；PEG₄中n均为28，分子量为5000Da，PEG₈中n均为12，分子量为5000Da)，产率约60％。

实施例3：双重交联壳聚糖-聚乙二醇壳聚糖水凝胶的制备

将实施例1和2中制备的双键修饰的壳聚糖和醛基改性的线性聚乙二醇分别溶于含有0.2wt％光引发剂LAP的PBS(pH＝7.4)中，含量分别为2wt％(ChiMA)即A液和4wt％(PEG₂-DA)即B液。分别将A液和B液等体积混合，或A液体与含有0.2wt％的PBS等体积混合，随后给予405nm的蓝光引发聚合，制备得到三种不同凝胶方式的壳聚糖-聚乙二醇水凝胶：即仅存在光交联作用壳聚糖水凝胶(ChiMA+L)，仅存在席夫碱交联的壳聚糖-聚乙二醇水凝胶(ChiMA+PEG₂-DA)，和同时存在光交联和席夫碱交联的壳聚糖-聚乙二醇水凝胶(ChiMA+PEG₂-DA+L)。通过水凝胶倒置实验来评估各种凝胶方式成胶所需的时间，结果如图1所示，席夫碱交联的凝胶时间需要60秒，但给予450nm蓝光照射引入双键交联后，凝胶时间缩短至10秒，证明复合水凝胶相比席夫碱水凝胶具有更快的交联速度。通过调节甲基丙烯酸基在壳聚糖分子链上的接枝率，得到不同双键接枝率的壳聚糖(ChiMA1，10％；ChiMA2，20％；ChiMA3，30％)，可以控制水凝胶光交联程度，结果如图2的左图所示，低双键接枝率的壳聚糖(ChiMA1)凝胶效果较差，难以形成固定的形状。通过将A液和B液混合注射来判断水凝胶的可注射性，结果如图2的右图所示，共混后的水凝胶具有良好的可注射性，能自由书写成“SUST”字样并且在数分钟内可形成稳定的凝胶。

实施例4：水凝胶的力学测试

对实施例3中三种凝胶方式的水凝胶(ChiMA+L,ChiMA+PEG₂-DA,ChiMA+PEG₂-DA+L)进行机械压缩测试，考察水凝胶的力学性能。压缩测试所使用的仪器为INSTRON 68TM-5，压力传感器为100N，压缩速度2mm/min。各种凝胶制备成高度为12.5mm、直径5.0mm的圆柱状，随后进行压缩测试。对三种凝胶方式的水凝胶，以及不同双键接枝率的壳聚糖水凝胶进行了表征，计算压缩模量(compressive modulus)时选取各组样品前20％形变进行统计，结果如图3所示。低双键接枝率的单一光交联壳聚糖水凝胶无法成型(ChiMA1+L)，因此未能有数据输出。可以看出，席夫碱交联的壳聚糖-聚乙二醇水凝胶(ChiMA+PEG₂-DA)相比光交联的水凝胶(ChiMA+L)具有明显的力学性能提升，当壳聚糖的双键接枝率增加时这种变化不明显；同时存在光交联和席夫碱交联的壳聚糖-聚乙二醇水凝胶(ChiMA+PEG₂-DA+L)相比光交联(ChiMA+L)或席夫碱交联的水凝胶(ChiMA+PEG₂-DA)具有明显的力学性能提升。这种现象归因于水凝胶中光交联结构提供稳定的框架，席夫碱交联能起到力学耗散的作用。

实施例5：水凝胶的形貌表征

对实施例3中三种凝胶方式的水凝胶(ChiMA+L,ChiMA+PEG₂-DA,ChiMA+PEG₂-DA+L)进行形貌观察，考察水凝胶的形貌结构与其力学性能的关系。扫描电子显微镜所使用的仪器为Regulus 8100，测试前喷金处理，加速电压5kV，放大倍数为50倍和500倍。测试前对水凝胶进行冷冻干燥处理，并用液氮脆断，选取内部截面进行数据采集，结果如图4所示。低接枝率的双键改性壳聚糖水凝胶孔隙较大，与聚乙二醇形成双重交联水凝胶网络时也具备较大的空隙结构；当双键的接枝率增大时，水凝胶的网络变得更为密集。对于中等接枝率和高等接枝率的壳聚糖-聚乙二醇水凝胶而言，引入席夫碱交联后的水凝胶比光交联水凝胶的网络更为密集，此时影响水凝胶的空隙结构与席夫碱交联程度相关性更大，因此压缩性能也具有明显地提升。此外，上述各种方式形成的水凝胶均具有较大的空隙结构，有利于细胞的黏附和增殖。

实施例6：细胞相容性评估

选取实施例3中的中等接枝率的双键壳聚糖(ChiMA2)所形成的三种水凝胶进行细胞毒性测试，评估水凝胶对大鼠椎间盘髓核细胞的活性影响。首先预制备三种水凝胶，在37℃，60rpm摇床中用基础培养基DMEM浸泡24小时，过0.22μm微孔滤膜并添加10％FBS和1％青霉素-链霉素，浸提液浓度为100mg/mL。在96孔板中每孔加入5x10³细胞、200μL浸提液，然后将培养板放入37℃、5％CO₂(v/v)的细胞培养箱分别培养1天、2天、3天。孔板中的培养基每24小时更换一次，采用CCK-8试剂盒检测孔板中细胞增殖的情况。具体操作如下：培养时间结束时，吸出孔板中的培养基，另加100μL含有10μL CCK-8试剂的完全培养基，37℃、5％CO₂培养箱中继续孵育1小时，用Microplate Reader(Tecan)直接读取各孔板中液体在450nm处的吸光度，并计算各组细胞的存活率。对照组为不加浸提液的完全培养基。细胞活性＝[OD₄₅₀(样品组)－OD₄₅₀(空白组)]/[OD₄₅₀(对照组)－OD₄₅₀(空白组)]×100％，结果如图5所示，图5中，每一天的统计结果中，从左往右依次为Blank、ChiMA+L、ChiMA+PEG-DA、ChiMA+PEG-DA+L，纵坐标为细胞活性(Cell viability)，横坐标为时间(天)，各组水凝胶浸提液对髓核细胞没有明显的毒害作用，并且培养时间延长细胞增值数变多，表明水凝胶对细胞具有良好的活性。

实施例7：水凝胶与细胞三维共培养

选取实施例3中的中等接枝率的双键壳聚糖(ChiMA2)所形成的双重交联水凝胶与细胞进行三维共培养，评估大鼠椎间盘髓核细胞在水凝胶内生长的情况。采用Calcein-AM/PI试剂对水凝胶内部细胞进行活死染色，并在ZEISS激光共聚焦显微镜下拍取三维立体照片。具体操作如下：在2cm共聚焦培养皿中加入250μL改性壳聚糖溶液，然后加入250μL含有髓核细胞的改性聚乙二醇，充分混合后，采用405nm蓝光照射2～5min，得到含有髓核细胞的双重交联壳聚糖-聚乙二醇水凝胶；加入1mL完全培养基使水凝胶完全浸没，放置在培养箱中孵育5～10min后，换1mL培养基孵育24小时；配制2μM Calcein-AM和4.5μM PI，取1mL加入到共聚焦小皿中孵育30分钟后拍照观察，结果如图6所示。可见，绝大部分髓核细胞在水凝胶内部均是存活状态，仅少数几个是死亡状态，表明双交联复合水凝胶对细胞具有良好的生物安全性。

实施例8：大鼠尾椎椎间盘退化治疗实验

选取12只八周龄的SD雄性大鼠并随机分为两组，在异氟烷麻醉下对其尾部椎间盘进行手术暴露，分别取第3至第4节、第4至第5节、第5至第6节、第6至第7节为假手术组(Sham)、注射水凝胶组(Gel)、缺损对照组(Defect)和正常对照组(Normal)。其中除正常对照组不做任何处理外，假手术组需剪断椎盘外层的韧带结构，注射水凝胶组和缺损对照组在破坏韧带后用1mL注射器针头穿刺椎间盘的纤维环，360°旋转2min后拔出，再注射或不注射上述实施例3中的光交联水凝胶(ChiMA2+PEG₂-DA+L)100μL，用405nm蓝光光照数分钟后再用6-0缝合线缝合皮肤。用微型计算机断层扫描仪(Micro-CT)和磁共振成像仪(MRI)分别观察4周(4W)和8周(8W)后大鼠尾部椎间盘退化的情况，并采用Pfirrmann评分方法来判断该水凝胶对针刺椎间盘退化模型的治疗作用，椎间隙高度指数(DHI)常用于评估椎间盘退化情况，其具体计算公式为：椎间隙高度指数(DHI，Disc Height Index)＝侧位椎间隙前缘高度(A+B+C)与后缘高度(A+B+C)之和/相邻椎体(D+E+F和G+H+I)高度之和。结果如图7和图8所示，具体地，从图7可见，4周后，虽然注射水凝胶组与缺损对照组的DHI均与空白对照组有显著性差异，但8周后，注射水凝胶组的DHI远高于缺损对照组，与空白对照组和正常对照组无显著性差异。从图8可见，4周后，注射水凝胶组的Pfirrmann评分低于缺损对照组，接近空白对照组，8周后，注射水凝胶组的Pfirrmann评分降低，而缺损对照组的Pfirrmann评分显著升高。图7和8的结果证实水凝胶封堵治疗组(即注射水凝胶组)能有效阻止针刺穿孔的椎间盘退化。

实施例9

实施例9与实施例3制备双重交联壳聚糖-聚乙二醇壳聚糖水凝胶过程相同，区别在于：加入的B液为醛基改性的四臂-聚乙二醇(PEG₄-DA)，凝胶时间约为40秒，给予蓝光照射后凝胶时间约为8秒。

实施例10

实施例10与实施例3制备双重交联壳聚糖-聚乙二醇壳聚糖水凝胶过程相同，区别在于：加入的B液为醛基改性的八臂-聚乙二醇(PEG₈-DA)，凝胶时间约为20秒，给予蓝光照射后凝胶时间约为5秒。

实施例11

实施例11与实施例3制备双重交联壳聚糖-聚乙二醇壳聚糖水凝胶过程相同，区别在于：加入的B液为琥珀酰亚胺酯改性的线性聚乙二醇(PEG₂-NHS)，凝胶时间约为60秒，给予蓝光照射后凝胶时间约为10秒。

实施例12

实施例12与实施例3制备双重交联壳聚糖-聚乙二醇壳聚糖水凝胶过程相同，区别在于：加入的B液为琥珀酰亚胺酯改性的四臂-聚乙二醇(PEG₄-NHS)，凝胶时间约为40秒，给予蓝光照射后凝胶时间约为8秒。

实施例13

实施例13与实施例3制备双重交联壳聚糖-聚乙二醇壳聚糖水凝胶过程相同，区别在于：加入的B液为琥珀酰亚胺酯改性的八臂-聚乙二醇(PEG₈-NHS)，凝胶时间约为20秒，给予蓝光照射后凝胶时间约为5秒。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims

1.一种水溶性壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶是由甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖和改性聚乙二醇交联得到，所述改性聚乙二醇为琥珀酰亚胺改性的聚乙二醇，所述改性聚乙二醇的分子式为式V~VII中的至少一种；

式V

式VI

式VII

式V~VII中，n为12~110的自然数。

2.如权利要求1所述的水溶性壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，所述壳聚糖的分子量为10~100 kDa，脱乙酰度大于95%。

3.如权利要求1所述的水溶性壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，所述壳聚糖的双键接枝率为10~30%。

4.如权利要求1所述的水溶性壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，所述壳聚糖的溶解质量分数为1wt%~3wt%。

5.如权利要求1所述的水溶性壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，式V~VII中，n为12~100的自然数。

6.如权利要求1所述的水溶性壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，式V~VII中，n为12~80的自然数。

7.如权利要求1所述的水溶性壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，式V~VII中，n为12~70的自然数。

8.如权利要求1所述的水溶性壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，式V~VII中，n为12~60的自然数。

9.如权利要求1所述的水溶性壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，式V~VII中，n为12~50的自然数。

10.如权利要求1所述的水溶性壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的凝胶时间为5~60秒。

11.如权利要求10所述的水溶性壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的凝胶时间为5~50秒。

12.如权利要求10所述的水溶性壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的凝胶时间为5~40秒。

13.如权利要求10所述的水溶性壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的凝胶时间为5~20秒。

14.如权利要求1所述的水溶性壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的压缩模量为0.1 kPa~100 kPa。

15.如权利要求14所述的水溶性壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的压缩模量为10 kPa~100 kPa。

16.如权利要求14所述的水溶性壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的压缩模量为50 kPa~100 kPa。

17.如权利要求14所述的水溶性壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的压缩模量为80 kPa~100 kPa。

18.如权利要求1所述的水溶性壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的压缩强度为16~60 kPa。

19.如权利要求18所述的水溶性壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的压缩强度为25~60 kPa。

20.如权利要求18所述的水溶性壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的压缩强度为35~60 kPa。

21.如权利要求18所述的水溶性壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的压缩强度为50~60 kPa。

22.如权利要求1~21任意一项所述水溶性壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的制备方法包括：将甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖和琥珀酰亚胺改性的聚乙二醇混合，反应得到所述水溶性壳聚糖复合水凝胶。

23.如权利要求22所述的水溶性壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，所述制备方法包括：将甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖和琥珀酰亚胺改性的聚乙二醇混合，在光引发剂存在的条件下，光照，得到所述水溶性壳聚糖复合水凝胶。

24.如权利要求22所述的水溶性壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，所述光引发剂包括LAP、Irgacure2959、α-酮戊二酸中的至少一种。

25.如权利要求22所述的水溶性壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，光照时使用的光的波长为365~405nm。

26.如权利要求25所述的水溶性壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，光照时使用的光的波长为405nm。

27.如权利要求1~26任意一项所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的制备方法，其特征在于，将甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖和琥珀酰亚胺改性的聚乙二醇混合，反应得到所述水溶性壳聚糖复合水凝胶。

28.如权利要求27所述的制备方法，其特征在于，包括：将甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖和琥珀酰亚胺改性的聚乙二醇混合，在光引发剂存在的条件下，光照，得到所述水溶性壳聚糖复合水凝胶。

29.一种原位组织再生水凝胶，其特征在于，包含如权利要求1~26任意一项所述水溶性壳聚糖复合水凝胶。

30.如权利要求1~26任意一项所述水溶性壳聚糖复合水凝胶在制备椎间盘摘除手术髓核填充水凝胶中的应用。

31.一种水溶性壳聚糖复合水凝胶在制备椎间盘摘除手术髓核填充水凝胶中的应用，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶是由甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖和改性聚乙二醇交联得到，所述改性聚乙二醇为醛基改性的聚乙二醇；

醛基改性的聚乙二醇的分子式为式II~IV中的至少一种：

式II

式III

式IV

式II~IV中，n为12~110的自然数。

32.如权利要求31所述的应用，其特征在于，所述壳聚糖的分子量为10~100 kDa，脱乙酰度大于95%。

33.如权利要求31所述的应用，其特征在于，所述壳聚糖的双键接枝率为10~30%。

34.如权利要求31所述的应用，其特征在于，所述壳聚糖的溶解质量分数为1wt%~3wt%。

35.如权利要求31所述的应用，其特征在于，式II~IV中，n为12~100的自然数。

36.如权利要求31所述的应用，其特征在于，式II~IV中，n为12~80的自然数。

37.如权利要求31所述的应用，其特征在于，式II~IV中，n为12~70的自然数。

38.如权利要求31所述的应用，其特征在于，式II~IV中，n为12~60的自然数。

39.如权利要求31所述的应用，其特征在于，式II~IV中，n为12~50的自然数。

40.如权利要求31所述的应用，其特征在于，式II~IV中，n为12~44的自然数。

41.如权利要求31所述的应用，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的凝胶时间为5~60秒。

42.如权利要求41所述的应用，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的凝胶时间为5~50秒。

43.如权利要求41所述的应用，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的凝胶时间为5~40秒。

44.如权利要求41所述的应用，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的凝胶时间为5~20秒。

45.如权利要求31所述的应用，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的压缩模量为0.1 kPa~100 kPa。

46.如权利要求45所述的应用，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的压缩模量为10 kPa~100 kPa。

47.如权利要求45所述的应用，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的压缩模量为50 kPa~100 kPa。

48.如权利要求45所述的应用，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的压缩模量为80 kPa~100 kPa。

49.如权利要求31所述的应用，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的压缩强度为16~60 kPa。

50.如权利要求49所述的应用，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的压缩强度为25~60 kPa。

51.如权利要求49所述的应用，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的压缩强度为35~60 kPa。

52.如权利要求49所述的应用，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的压缩强度为50~60 kPa。

53.如权利要求31~52任意一项所述应用，其特征在于，所述水溶性壳聚糖复合水凝胶的制备方法包括：将甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖和醛基改性的聚乙二醇混合，反应得到所述水溶性壳聚糖复合水凝胶。

54.如权利要求53所述的应用，其特征在于，所述制备方法包括：将甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖和醛基改性的聚乙二醇混合，在光引发剂存在的条件下，光照，得到所述水溶性壳聚糖复合水凝胶。

55.如权利要求54所述的应用，其特征在于，所述光引发剂包括LAP、Irgacure2959、α-酮戊二酸中的至少一种。

56.如权利要求54所述的应用，其特征在于，光照时使用的光的波长为365~405nm。

57.如权利要求56所述的应用，其特征在于，光照时使用的光的波长为405nm。