CN116284886A - 多重交联的凝胶体系及其产品、制备方法和应用 - Google Patents

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陆婷婷
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Abstract

本文涉及一种多重交联的凝胶体系及其产品、制备方法和应用。具体提供了一种多重交联凝胶体系的制备方法，其包括：在适合交联的条件下，使高分子化合物在长链交联剂的存在下发生第一交联反应，得到初步交联的凝胶网络；对所述初步交联的凝胶网络进行溶胀、沉淀和复溶，形成初步交联凝胶；在适合交联的条件下，使所述初步交联凝胶在短链交联剂和/或缩合剂的存在下发生第二交联反应，得到二次交联的凝胶网络；对所述二次交联的凝胶网络进行溶胀、沉淀和复溶，形成多重交联凝胶体系。还提供了多重交联凝胶体系及其产品在医疗、美容、生产、日化中的广泛应用。

Description

多重交联的凝胶体系及其产品、制备方法和应用
技术领域
本申请属于生物医药和高分子材料领域。本申请具体涉及可供医用(例如眼科、骨科、创伤修复和组织工程)、整形美容用、生产用或日用的高分子材料，更具体涉及多重交联的凝胶体系及其制备方法和应用。
背景技术
水凝胶在生物医药等领域具有很好的应用。水凝胶通常由天然高分子或合成高分子组成。天然高分子易于被体内的酶识别而降解，合成高分子在体内也会逐渐水解，通常采用交联的方法增加高分子水凝胶的稳定性。
最常见的交联方法采用单一的交联剂将高分子材料交联形成稳定的三维网络。交联技术发展至今，其功能不仅仅是延长水凝胶的降解时间，它还是调节水凝胶物理化学性质的有效手段。然而单一的交联剂难以通过控制交联条件，使水凝胶具有期望的多重性质，如兼具稳定性和内聚性、或兼具韧性和高强度。
近年来双网络或互穿网络的水凝胶可以具有高强度、高韧性的优点。目前的双网络水凝胶大多采用双组分的高分子材料，并对高分子进行甲基丙烯酰胺化改性，在光引发剂和紫外光的作用下形成交联。然而，光引发剂具有一定的毒性，对人体的安全性问题未知，而且高分子甲基丙烯酰胺化改性过程步骤繁琐。
其他方法还包括共价与非共价结合的交联，如CN 108864494 B公开了一种动态交联双网络水凝胶及其制备方法与应用，其动态交联双网络水凝胶由主网络和次网络于水性介质中经穿插缠结形成，主网络与所述次网络之间没有任何的相互作用，主网络为动态的共价键交联聚合物，次网络为离子键交联聚合物。然而离子交联的聚合物结构在体内由于离子的扩散而易于瓦解，同时由于主网络和次网络之间无相互作用，次网络瓦解后便无法长期存留，整体凝胶稳定性降低。
采用两种交联剂对双网络成分进行共价交联形成双重共价键，可以增加双网络的稳定性。CN 112334168 A公开了一种真皮填充剂及其应用，包含双交联的胶原和透明质酸，其采用不同的交联剂对两种材料进行交联，交联剂选自1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺甲碘化物(EDC)、Ν,Ν'-二环己基碳二亚胺(DCC)、Ν,Ν'-二异丙基碳二亚胺(DIC)、二乙烯基砜(DVS)或戊二醛。然而，上述交联剂均为短链小分子，除增加稳定性和粘弹性的优点外未显示出其他优点。
本领域中仍然需要开发出具有高稳定性、高强度、高内聚性的新型高分子材料及其制备方法。
发明内容
本申请中正是提供了一种新型的多重交联凝胶体系及其制备方法和应用。
在本申请的一些方面中，提供了一种多重交联凝胶体系的制备方法，其包括如下步骤：
(1)在适合交联的条件下，使高分子化合物在长链交联剂的存在下发生第一交联反应，得到初步交联的凝胶网络，其中，所述长链交联剂的分子量不低于400Da和/或具有不少于12个主链骨架原子的链长(例如当主链为烷烃链时，所述烷烃链包含12个或更多个主链碳原子(≥C12))；
(2)对所述初步交联的凝胶网络进行溶胀(例如充分溶胀)、沉淀和复溶，形成初步交联凝胶；
(3)在适合交联的条件下，使所述初步交联凝胶在短链交联剂和/或缩合剂的存在下发生第二交联反应，得到二次交联的凝胶网络，其中，所述短链交联剂的分子量低于400Da和/或具有少于12个主链骨架原子的链长(例如当主链为烷烃链时，所述烷烃链包含少于12个的主链碳原子(<C12))；
(4)对所述二次交联的凝胶网络进行溶胀(例如充分溶胀)、沉淀和复溶，形成多重交联凝胶体系。
本申请的方法中采用长链交联剂与短链交联剂和/或缩合剂的组合，对高分子化合物进行了多重交联，通过长链交联初步形成第一层疏松网络，赋予凝胶网络以一定的稳定性和柔性，并保持高分子一定程度的运动性；在此基础上，通过短链交联和/或自交联形成第二层密实网络，进一步提升稳定性，同时增加刚性、强度和内聚性。
在本申请的一些方面中，提供了采用本申请方法制备的多重交联凝胶体系。
在本申请的一些方面中，还提供了包含采用本申请方法制备的多重交联凝胶体系的制品。
在本申请的一些方面中，还提供了本申请的多重交联凝胶体系和制品的应用，其用于制备用于医疗、美容、生产、日化的产品。
在本申请的一些方面中，还提供了疾病治疗和/或美容的方法，所述方法包括给予有需要的对象治疗或美容有效量的本申请的多重交联凝胶体系或包含所述多重交联凝胶体系的产品或用品。
本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本发明的发明构思和保护范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。
图1：实施例1中第二次复溶前的沉淀的扫描电子显微镜照片。
图2：实施例1中双交联透明质酸凝胶的剪切粘度。
图3：实施例1中双交联透明质酸凝胶的光谱透过率。
图4：实施例1中双交联透明质酸凝胶涂覆于猪皮真皮，受各个方向的力后与猪皮组织的整合性。
图5：实施例2中双交联透明质酸凝胶注射入新西兰大白兔真皮层后24h、48h、72h和7天的外部观察照片。
图6：实施例2中双交联透明质酸凝胶注射入新西兰大白兔真皮层后7天时真皮层内侧的凝胶和组织观察照片。
图7：实施例2中双交联透明质酸凝胶注射入新西兰大白兔真皮层后7天时凝胶与皮肤组织的苏木精-伊红染色图片。
图8：实施例3中双交联透明质酸凝胶注射入新西兰大白兔眼玻璃体腔后16周内眼球的大体观察图片。
图9：实施例3中双交联透明质酸凝胶注射入新西兰大白兔眼玻璃体腔后16周时眼底照片。
图10：实施例3中双交联透明质酸凝胶注射入新西兰大白兔眼玻璃体腔后16周内的眼压检测。
图11：实施例3中双交联透明质酸凝胶注射入新西兰大白兔眼玻璃体腔后16周后视网膜的苏木精-伊红染色图片。
图12：实施例4中双交联羧甲基壳聚糖凝胶的扫描电子显微镜图片。
图13：实施例5中双交联透明质酸-胶原蛋白凝胶与成纤维细胞共培养7天后活-死染色图片。
图14：实施例6中双交联羧甲基壳聚糖凝胶-微球复合物的照片。
图15：实施例6中双交联羧甲基壳聚糖凝胶-微球复合物的扫描电子显微镜图片。
图16：实施例7中双交联羧甲基壳聚糖凝胶-微球复合物与成纤维细胞共培养7天后的显微镜图片。
图17：实施例8中双交联羧甲基壳聚糖凝胶-微球复合物植入新西兰大白兔真皮层1个月后的组织Masson三色染色图片。
图18：实施例8中双交联羧甲基壳聚糖凝胶-微球复合物植入新西兰大白兔真皮层1个月后的组织天狼星红染色图片。
图19：对比例1中劣溶剂置换过程中不施加梯度升温得到的沉淀的扫描电子显微镜图片。
具体实施方式
在以往的交联技术中，交联剂分子链的长短对凝胶性质的影响被忽视了。发明人通过长期而深入的研究出乎意料地发现交联剂分子链的长短会影响高分子的空间结构和运动性，进而对凝胶性质产生很大影响。将长、短链交联剂相结合对高分子化合物进行双交联，可使所得多重交联凝胶体系具有更佳的性能。
本文通过在高分子网络中引入长链交联与短链交联和/或自交联，形成多重交联网络，在提升凝胶稳定性和高强度的同时赋予凝胶柔韧性和内聚性。本文所提供的凝胶体系、制品及产品可应用于软组织修复、眼玻璃体填充、创伤修复领域，也可包覆细胞、生长因子、微球，从而可被广泛应用生物医药、美容整形、组织工程、日化等众多领域。
例如，透明质酸及其衍生物，如透明质酸钠，因具有良好的生物相容性和耐受性，自上世纪60年代以来被作为玻璃体替代物在人体内广泛测试。然而，由于透明质酸及其衍生物在体内易降解，停留时间短，不适合作为长期填充物使用，且在流变性能和力学性能上的不足也限制了其应用。通过本文所述的方法对透明质酸材料进行多重交联所得的凝胶具有明显改善的性能，例如改善的稳定性、强度和内聚性等，从而更适于作为玻璃体替代物应用。
本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
多重交联凝胶体系的制备方法
在本申请中提供了一种多重交联凝胶体系的制备方法，其包括如下步骤：
(1)在适合交联的条件下，使高分子化合物在长链交联剂的存在下发生第一交联反应，得到初步交联的凝胶网络，其中，所述长链交联剂的分子量不低于400Da和/或具有不少于12个主链骨架原子的链长(例如当主链为烷烃链时，所述烷烃链包含12个或更多个主链碳原子(≥C12))；
(2)对所述初步交联的凝胶网络进行溶胀(优选充分溶胀)、沉淀和复溶，形成初步交联凝胶；
(3)在适合交联的条件下，使所述初步交联凝胶在短链交联剂和/或缩合剂的存在下发生第二交联反应，得到二次交联的凝胶网络，其中，所述短链交联剂的分子量低于400Da和/或具有少于12个主链骨架原子的链长(例如当主链为烷烃链时，所述烷烃链包含少于12个的主链碳原子(<C12))；
(4)对所述二次交联的凝胶网络进行溶胀、沉淀和复溶，形成多重交联凝胶体系。
在一些实施方式中，高分子化合物的分子量不低于10,000Da。在一些实施方式中，高分子化合物的分子链不低于100kDa、300kDa、500kDa、800kDa、1000kDa、1500kDa、1800kDa、2000kDa，或其中的任何子范围或数值点。在一些实施方式中，高分子化合物的侧链包含两个以上的可交联性基团，例如羧基或氨基或羟基或它们的组合。
可用于本申请的高分子化合物包括但不限于选自下组中的一种或多种：透明质酸(如透明质酸钠)、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、几丁质、羧甲基几丁质、胶原蛋白、明胶、丝素蛋白、羧甲基葡聚糖、羧甲基纤维素、氨基聚乙二醇、羧基聚乙二醇。
在一些实施方式中，可采用单种高分子化合物作为起始材料。在一些实施方式中，也可采用两种或更多种高分子化合物的组合，例如透明质酸和胶原蛋白的组合。在两种或更多种高分子化合物的组合中，各成分间可通过共价交联键、氢键、静电引力等非共价键结合。
在一些实施方式中，将高分子化合物溶于水性溶液中，例如使其起始浓度为0.2重量％～10重量％，例如0.4重量％～8重量％。可根据需要对高分子化合物的起始浓度进行调整。
在一些实施方式中，可用于本方法的长链交联剂的分子量不低于400Da，例如不低于0.5kDa、1kDa、10kDa、50kDa、100kDa、300kDa、500kDa、600kDa、1000KDa、1500kDa、1800kDa、2000kDa，或其中的任何子范围或数值点。
在一些实施方式中，可用于本方法的长链交联剂具有不低于12个主链骨架原子的链长，例如具有不低于12、14、16、18、20、22、24、26、28、30个主链骨架原子的链长。在一些实施方式中，长链交联剂的主链可为饱和或不饱和的直链或支链或环状烃链。在一些实施方式中，长链交联剂的主链除了碳原子以外，还可包含选自N、O和S的一个或多个杂原子。在一些实施方式中，长链交联剂的主链可包含非C、N、O和S的其他原子，例如硅、铝、钛、硼等原子。在一些实施方式中，长链交联剂的主链可包含环状部分。
在一些实施方式中，可用于本方法的长链交联剂包括但不限于选自下组的长链交联剂：氨基聚乙二醇、羧基聚乙二醇、聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDE)、聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸以及它们的盐、单宁酸、原花青素，且所选交联剂的分子量不低于400Da和/或具有不少于12个主链骨架原子的链长。
在一些实施方式中，长链交联剂与高分子化合物中的交联反应性基团的摩尔比为1:10～1:2。
在一些实施方式中，可用于本方法的短链交联剂的分子量低于400Da，例如低于300Da、200Da、150Da、100Da、80Da、50Da，或其中的任何子范围或数值点。
在一些实施方式中，可用于本方法的短链交联剂具有低于12个主链骨架原子的链长，例如具有低于12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2个主链骨架原子的链长。在一些实施方式中，短链交联剂的主链可为饱和或不饱和的直链或支链或环状烃链。在一些实施方式中，短链交联剂的主链除了碳原子以外，还可包含选自N、O和S的一个或多个杂原子。在一些实施方式中，短链交联剂的主链可包含非C、N、O和S的其他原子，例如硅、铝、钛、硼等原子。在一些实施方式中，短链交联剂的主链可包含环状部分。
在一些实施方式中，可用于本方法的短链交联剂包括但不限于选自下组的短链交联剂：谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸以及它们的盐和聚合物，谷氨酰胺、二乙烯基砜(DVS)、丁二醇二缩水甘油基醚(BDDE)、聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDE)、二环氧辛烷(DEO)、胱胺及其盐、己二胺、对苯碳二亚胺(BCDI)、氨基聚乙二醇、羧基聚乙二醇、戊二醛、京尼平，且所选交联剂的分子量低于400Da和/或具有少于12个主链骨架原子的链长。
在一些实施方式中，短链交联剂与所述高分子化合物中的交联反应性基团的摩尔比为1:10～1:1。
在一些实施方式中，长链交联剂与短链交联剂的分子量差异1个～10个数量级，例如相差1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个数量级。在一些实施方式中，长链交联剂与短链交联剂的分子量差异大于0.5kDa、1kDa、10kDa、50kDa、100kDa、500kDa、1000KDa、1500kDa、2000kDa。
在一些实施方式中，长链交联剂与短链交联剂的主链骨架原子数差异1个～3个数量级，例如相差1个、2个或3个数量级。在一些实施方式中，长链交联剂与短链交联剂的主链骨架原子数差异大于2、4、6、8、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、500。
在一些实施方式中，交联剂可独立地选自：同型双功能交联剂、异型双功能交联剂、光反应交联剂。在一些实施方式中，交联剂的反应性末端可包括胺基、羧基、巯基、琥珀酰亚胺基、亚氨酸酯等活性基团。
在一些实施方式中，步骤(1)和/或步骤(3)中还可选地包括在交联反应体系中加入缩合剂。当所述高分子化合物的分子链中同时具有成对反应性基团成员(例如同时包含羧基和氨基反应性基团)时，交联反应体系中的缩合剂引起分子自交联。
在一些实施方式中，可用于本方法的缩合剂包括但不限于选自下组的缩合剂：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1,3-二环己基碳二亚胺(DCC)、谷氨酰胺转氨酶、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)、6-氯-2,4-二甲氧基1,3,5-三嗪(CDMT)。
在一些实施方式中，缩合剂与包含缩合剂的反应体系中的交联剂能够发生反应的基团摩尔比为1:5～2:1。
在一些实施方式中，步骤(1)还包括提供所述高分子化合物的水性溶液，并调整其pH至适于发生第一交联反应。在一些实施方式中，水性溶液选自：磷酸盐缓冲溶液、醋酸溶液、水溶液。在一些实施方式中，高分子化合物在溶液中的质量百分比浓度为0.4％～8％。在一些实施方式中，第一交联反应的反应温度为0～室温，例如2～30℃，5～25℃。在一些实施方式中，第一交联反应的反应时间为5～120小时，例如8～100小时、12～72小时、24～48小时。可根据需要对上述条件进行调整。
在一些实施方式中，步骤(2)和步骤(4)各自独立地包括：(a)调节前步所得凝胶网络的pH，例如：当体系中浓度最高的高分子化合物为透明质酸、丝素蛋白、羧甲基葡聚糖、羧甲基纤维素、羧基聚乙二醇时，调节pH值为7.5～14；当体系中浓度最高的高分子化合物为壳聚糖、羧甲基壳聚糖、几丁质、羧甲基几丁质、胶原蛋白、明胶、氨基聚乙二醇时，调节pH值为2～6.5。在一些实施方式中，步骤(2)和步骤(4)各自独立地包括(b)使凝胶网络在水性溶于中充分溶胀平衡。通过pH调节和充分溶胀长链交联网络，可使长链交联网络完全舒展并暴露未交联的基团，为后一步短链交联提供充足的空间。
在一些实施方式中，步骤(2)和步骤(4)各自独立地包括在包含充分溶胀的凝胶网络的水性溶液中加入劣溶剂并混合使凝胶网络沉淀。在一些实施方式中，在沉淀过程中对混合物进行梯度升温，例如从0℃逐步升温至50℃，如2～5℃下0.5～2小时→15～25℃下0.5～2小时→35～45℃下1～4小时。在一些实施方式中，劣溶剂选自：丙酮、乙醇、氯仿、乙醚、正己烷或其组合。在这些步骤中混合均匀后进行梯度升温，首先在温度较低的情况下使劣溶剂与高分子水相溶液充分混合，比较完全地置换出高分子沉淀，然后逐步升温，使残留在高分子沉淀中的劣溶剂挥发，从而高分子沉淀形成疏松多孔的结构，避免高分子结块，利于后续的复溶。
在一些实施方式中，对所得沉淀进行一次或多次清洗。在一些实施方式中，进一步包括在水性溶液中对部分或全部沉淀进行复溶，例如获得质量百分比浓度为1～10％(如1.5～8％)的凝胶溶液。
在一些实施方式中，步骤(3)包括：调节前步所得初步交联凝胶的pH。在一些实施方式中，步骤(3)包括：在交联反应过程中进行梯度稀释，例如反应8～72小时后进行1～5倍稀释→继续反应8～48小时后进行1～5倍稀释→继续反应8～24小时。
在一些实施方式中，由于短链交联剂参与的高分子交联过程中，高分子浓度较高则反应过快易于产生脆性，高分子浓度较低则反应效率很低，所以在高分子浓度较高时进行部分的短链交联，而后逐步稀释，一方面控制反应速率使反应易于控制，另一方面每一步的稀释有利于扩张交联网络，暴露未交联的基团，提升交联效率。
在一些实施方式中，第二交联反应的反应温度为0～室温，例如2～30℃。在一些实施方式中，第二交联反应的反应时间为5～120小时，例如8～100小时。
在一些实施方式中，本方法还包括：对所得多重交联凝胶体系进行纯化和/或灭菌等后处理。在一些实施方式中，所得多重交联凝胶体系中长链交联剂的修饰度为2％～40％，短链交联剂或自交联的修饰度为5％～40％。
在一些示例性的实施方式中，本方法可包括以下步骤：
(1')配制高分子化合物水性溶液，调节pH，加入长链交联剂，在缩合剂或无缩合剂的参与下进行第一步交联反应，得到初步交联的凝胶网络；
(2')调节pH，然后将步骤(1')中的凝胶网络置于水相溶液中充分溶胀平衡，加入劣溶剂，混合均匀后梯度升温，取沉淀反复清洗，复溶于水性溶液中，配制成一定浓度的初步交联凝胶；
(3')调节pH，向初步交联凝胶中加入短链交联剂和/或缩合剂进行第二步交联反应，反应过程中梯度稀释；
(4')取步骤(3')中得到的凝胶，调节pH，然后将步骤(3')中的凝胶网络置于水相溶液中充分溶胀平衡，加入劣溶剂，混合均匀后梯度升温，取沉淀反复清洗，复溶于水性溶液中得到多重交联的凝胶网络；
(5')可任选地，对所述多重交联的凝胶网络进行除杂、灭菌和/或包装。
在一些实施方式中，多重交联凝胶体系中的单体为透明质酸或其盐，长链交联剂为聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)，短链交联剂为二乙烯基砜(DVS)。在一些实施方式中，多重交联凝胶体系中的单体为羧甲基壳聚糖(CMCS)，长链交联剂为聚谷氨酸(例如分子量为1kDa～100kDa)，短链交联剂为胱胺。在一些实施方式中，多重交联凝胶体系中的单体为胶原蛋白，长链交联剂为聚赖氨酸(例如分子量为1kDa～100kDa)，短链交联剂为谷氨酰胺。在一些实施方式中，多重交联凝胶体系进一步与微球复合，所述微球可为例如羟基磷灰石微球。
多重交联凝胶体系
本文中还提供了一种多重交联凝胶体系，其中，该多重交联凝胶体系采用本文所述的方法制得。
在一些实施方式中，本文的多重交联凝胶体系包含通过长链交联剂交联和短链交联剂交联或自交联获得多重高分子化合物网络结构。在一些实施方式中，多重交联凝胶体系中长链交联剂的修饰度为2％～40％，短链交联剂或自交联的修饰度为5％～40％。
在一些实施方式中，本文的多重交联凝胶体系中所包含的高分子化合物部分的来源包括但不限于选自下组中的一种或多种：透明质酸(如透明质酸钠)、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、几丁质、羧甲基几丁质、胶原蛋白、明胶、丝素蛋白、羧甲基葡聚糖、羧甲基纤维素、氨基聚乙二醇、羧基聚乙二醇。在一些实施方式中，本文的多重交联凝胶体系包含单种高分子化合物部分。在一些实施方式中，本文的多重交联凝胶体系包含来源于两种或更多种高分子化合物的部分，例如透明质酸和胶原蛋白的组合。在两种或更多种高分子化合物的组合中，各成分间可通过共价交联键、氢键、静电引力等非共价键结合。
在一些实施方式中，本文的多重交联凝胶体系中所包含的长链交联部分的来源包括但不限于选自下组中的一种或多种长链交联剂：氨基聚乙二醇、羧基聚乙二醇、聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDE)、聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸以及它们的盐、单宁酸、原花青素。
在一些实施方式中，本文的多重交联凝胶体系中所包含的短链交联部分的来源包括但不限于选自下组中的一种或多种短链交联剂：谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸以及它们的盐和聚合物，谷氨酰胺、二乙烯基砜(DVS)、丁二醇二缩水甘油基醚(BDDE)、聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDE)、二环氧辛烷(DEO)、胱胺及其盐、己二胺、对苯碳二亚胺(BCDI)、氨基聚乙二醇、羧基聚乙二醇、戊二醛、京尼平。
本文的多重交联凝胶体系长链交联剂与短链交联剂或自交联相结合，具有长链交联的第一层疏松网络，赋予凝胶网络以一定的稳定性和柔性，并保持高分子一定程度的运动性；同时也具有短链交联或自交联形成第二层密实网络，进一步提升稳定性，同时增加刚性和强度。本文的多重交联的凝胶体系，通过交联剂分子链的长短及其比例的调控，可控制凝胶强度、柔韧性和内聚性，同时提升凝胶的耐降解性，延长体内存留时间。
如本文所用，“内聚性”可采用如下方式测定(例如可参考：Dermatol Surg 2015；41Suppl 1:S365-372)：将样品装入1mL规格的玻璃注射器中，通过2500～3000rpm，5～10分钟离心除去凝胶中的空气。将18G针头(内径为0.9mm)和推杆安装在注射器上。使用拉力实验机以7.5mm/min的恒定速度挤出凝胶，当显示力值稳定后，收集后10滴挤出的凝胶并称重，计算每滴凝胶的平均值。如本文所用，“良好的内聚性”是指通过上述方法进行测试时，每滴凝胶的平均质量不低于40毫克。本申请多重交联凝胶体系具有良好的内聚性，即通过上述方法进行测试时，每滴凝胶的平均质量不低于40毫克，例如不低于45、50、55、60、65、70、80、90、100毫克，或其中的任何数值点或数值范围。
产品及应用
鉴于本文多重交联凝胶体系的优异性能，该材料具有广泛的应用前景。由此，本文中还提供了包含本文多重交联凝胶体系的产品及其应用。
在一些实施方式中，本文的多重交联凝胶和制品可应用于制备用于医疗、美容、生产、日化中的产品。在一些实施方式中，本文提供了包含多重交联凝胶体系的产品，所述产品包括但不限于选自下组的产品：医疗用品、美容用品、生产用品、日化用品。在一些实施方式中，产品选自：眼玻璃体填充物或替代物、软组织或软骨修复物或填充物、整形填充物、创伤敷料或修复物、药物(例如化药、生物药)载体或载药系统、细胞(如干细胞、免疫细胞)生长或培养载体或系统、组织工程产品、个人护理用品。
在一些实施方式中，产品为或包含多重交联凝胶-微球复合物，其中所述微球包括选自下组中的一种或多种：羟基磷灰石微球、聚己内酯微球、聚乳酸微球、聚乙交酯丙交酯微球、聚羟基脂肪酸酯微球、透明质酸微球、壳聚糖微球、胶原微球、明胶微球、脂质体纳米微球、荧光微球。
在一些实施方式中，产品为或包含负载细胞和/或药物和/或生长因子的多重交联的凝胶体系，其中，所述细胞和/或药物和/或生长因子直接包覆于凝胶体系中，或包覆于微球中再与凝胶体系均匀混合，例如，所述微球包括选自下组中的一种或多种：羟基磷灰石微球、聚己内酯微球、聚乳酸微球、聚乙交酯丙交酯微球、聚羟基脂肪酸酯微球、透明质酸微球、壳聚糖微球、胶原微球、明胶微球、脂质体纳米微球、荧光微球。
本文的多重交联的凝胶体系及其产品，兼具良好的内聚性和稳定性，用于软组织填充时不易弥散，发挥长期的填充效果。由于其良好的内聚性，可包覆细胞或微球，使之在人体内不移位、不散开，长期填充于所需部位。该凝胶体系也可包覆生长因子，具有长期缓释的效果。
本文的多重交联的凝胶体系及其产品，用于眼玻璃体填充时溶胀率很低，不会造成眼压升高；缓慢降解，体内存留时间长，可实现玻璃体的长期填充；降解后不崩解成小颗粒，不堵住房角。
相应地，本文中还提供了本文的多重交联凝胶体系在疾病治疗或美容整形中的应用，以及用于疾病治疗或美容整形中的方法。该方法包括给予有需要的对象治疗有效量或美容整形有效量的本文的多重交联凝胶体系或产品。
示例性实施方式
本申请中提供过了如下的示例性实施方式。应理解，在阅读了本申请的内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
在本申请的一些方面中提供了一种多重交联凝胶体系的制备方法，其包括如下步骤：
(1)在适合交联的条件下，使高分子化合物在长链交联剂的存在下发生第一交联反应，得到初步交联的凝胶网络，其中，所述长链交联剂的分子量不低于400Da和/或具有不少于12个主链骨架原子的链长；
(2)对所述初步交联的凝胶网络进行溶胀、沉淀和复溶，形成初步交联凝胶；
(3)在适合交联的条件下，使所述初步交联凝胶在短链交联剂和/或缩合剂的存在下发生第二交联反应，得到二次交联的凝胶网络，其中，所述短链交联剂的分子量低于400Da和/或具有少于12个主链骨架原子的链长；
(4)对所述二次交联的凝胶网络进行溶胀、沉淀和复溶，形成多重交联凝胶体系。
在一些实施方式中，所用高分子化合物的分子量不低于10,000Da，且侧链包含两个以上的羧基或氨基或羟基或它们的组合。
在一些实施方式中，所用高分子化合物为选自下组中的一种或多种：透明质酸(如透明质酸钠)、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、几丁质、羧甲基几丁质、胶原蛋白、明胶、丝素蛋白、羧甲基葡聚糖、羧甲基纤维素、氨基聚乙二醇、羧基聚乙二醇。
在一些实施方式中，所用高分子化合物在水相溶液中的起始浓度为0.2％～10％，例如0.4％～8％。
在一些实施方式中，所用长链交联剂选自下组：氨基聚乙二醇、羧基聚乙二醇、聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDE)、聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸以及它们的盐、单宁酸、原花青素，且其分子量不低于400Da和/或具有不少于12个主链骨架原子的链长。在一些实施方式中，所用长链交联剂与高分子化合物中的交联反应性基团的摩尔比为1:10～1:2。
在一些实施方式中，所用短链交联剂选自下组：谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸以及它们的盐和聚合物，谷氨酰胺、二乙烯基砜(DVS)、丁二醇二缩水甘油基醚(BDDE)、聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDE)、二环氧辛烷(DEO)、胱胺及其盐、己二胺、对苯碳二亚胺(BCDI)、氨基聚乙二醇、羧基聚乙二醇、戊二醛、京尼平，且其分子量低于400Da和/或具有少于12个主链骨架原子的链长。在一些实施方式中，所用短链交联剂与所述高分子化合物中的交联反应性基团的摩尔比为1:10～1:1。
在一些实施方式中，所用步骤(1)和/或步骤(3)中还可选地包括在交联反应体系中加入缩合剂。在一些实施方式中，所用缩合剂选自下组：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1,3-二环己基碳二亚胺(DCC)、谷氨酰胺转氨酶、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)、6-氯-2,4-二甲氧基1,3,5-三嗪(CDMT)。在一些实施方式中，所用缩合剂与包含缩合剂的反应体系中的交联剂能够发生反应的基团摩尔比为1:5～2:1。在一些实施方式中，所用高分子化合物的分子链中同时具有羧基和氨基反应性基团时，交联反应体系中的缩合剂引起分子自交联。
在一些实施方式中，步骤(1)还包括提供所述高分子化合物的水性溶液(例如磷酸盐缓冲溶液、水溶液)，并调整其pH至适于发生第一交联反应。在一些实施方式中，所用水性溶液选自：磷酸盐缓冲溶液、醋酸溶液、水溶液。在一些实施方式中，所用高分子化合物在溶液中的质量百分比浓度为0.4％～8％。在一些实施方式中，第一交联反应的反应温度为0～室温，例如2～30℃。在一些实施方式中，第一交联反应的反应时间为5～120小时，例如8～100小时。
在一些实施方式中，步骤(2)和步骤(4)各自可任选地、独立地包括选自下组的一项或多项：
(a)调节前步所得凝胶网络的pH，例如：
当体系中浓度最高的高分子化合物为透明质酸、丝素蛋白、羧甲基葡聚糖、羧甲基纤维素、羧基聚乙二醇时，调节pH值为7.5～14；
当体系中浓度最高的高分子化合物为壳聚糖、羧甲基壳聚糖、几丁质、羧甲基几丁质、胶原蛋白、明胶、氨基聚乙二醇时，调节pH值为2～6.5；
(b)所述溶胀包括：在水性溶液中充分溶胀平衡所得凝胶网络；
(c)所述沉淀包括：在包含充分溶胀的凝胶网络的水性溶液中加入劣溶剂并混合使凝胶网络沉淀，例如：
在沉淀过程中对混合物进行梯度升温，例如从0℃逐步升温至50℃，如2～
5℃下0.5～2小时→15～25℃下0.5～2小时→35～45℃下1～4小时；
所述劣溶剂选自：丙酮、乙醇、氯仿、乙醚、正己烷或其组合；
(d)可任选地，对所得沉淀进行一次或多次清洗；和/或
(e)所述复溶包括：在水性溶液中对部分或全部沉淀进行复溶，例如获得质量百分比浓度为1～10％(如1.5～8％)的凝胶溶液。
在一些实施方式中，本申请的方法中包括在用劣溶剂沉淀凝胶网络时进行梯度升温。在一些实施方式中，梯度升温为从0℃逐步升温至50℃，如2～5℃下0.5～2小时→15～25℃下0.5～2小时→35～45℃下1～4小时。
在一些实施方式中，步骤(3)包括调节前步所得初步交联凝胶的pH。在一些实施方式中，步骤(3)包括在交联反应过程中进行梯度稀释。在一些实施方式中，梯度稀释为例如反应8～72小时后进行1～5倍稀释→继续反应8～48小时后进行1～5倍稀释→继续反应8～24小时。
在一些实施方式中，第二交联反应的反应温度为0～室温，例如2～30℃。在一些实施方式中，第二交联反应的反应时间为5～120小时，例如8～100小时。
在一些实施方式中，本文多重交联凝胶体系的制备方法还包括：对所得多重交联凝胶体系进行纯化和/或灭菌。在一些实施方式中，本文多重交联凝胶体系中长链交联剂的修饰度为2％～40％，短链交联剂或自交联的修饰度为5％～40％。
在一些实施方式中，本文多重交联凝胶体系的制备包括以下步骤：
(1')配制高分子化合物水性溶液，调节pH，加入长链交联剂，在缩合剂或无缩合剂的参与下进行第一步交联反应，得到初步交联的凝胶网络；
(2')调节pH，然后将步骤(1')中的凝胶网络置于水相溶液中充分溶胀平衡，加入劣溶剂，混合均匀后梯度升温，取沉淀反复清洗，复溶于水性溶液中，配制成初步交联凝胶；
(3')调节pH，向初步交联凝胶中加入短链交联剂和/或缩合剂进行第二步交联反应，反应过程中进行梯度稀释；
(4')取步骤(3')中得到的凝胶，调节pH，然后将步骤(3')中的凝胶网络置于水相溶液中充分溶胀平衡，加入劣溶剂，混合均匀后梯度升温，取沉淀反复清洗，复溶于水性溶液中，得到多重交联的凝胶网络；
(5')可任选地，对所述多重交联的凝胶网络进行除杂、灭菌和/或包装。
在一些实施方式中，本文多重交联凝胶体系的制备方法还包括对长链交联剂与短链交联剂的长度和/或用量比例进行选择以控制多重交联凝胶网络的交联修饰度。
在本文的一些方面中提供了一种多重交联凝胶体系，其中，所述多重交联凝胶体系采用本申请的方法制得。
在本文的一些方面中提供了一种多重交联凝胶体系，其中，所述多重交联凝胶体系包含：通过采用长链交联剂的交联获得的第一层网络；以及，通过采用短链交联剂或自交联获得的第二层网络，其中所述第一层网络的密实度低于所述第二层网络。
在一些实施方式中，通过如下方式测定，本文的多重交联凝胶体系具有每滴凝胶的平均质量不低于40毫克的内聚性：将样品装入1mL规格的玻璃注射器中，通过2500～3000rpm，5～10分钟离心除去凝胶中的空气；将内径为0.9mm的18G针头和推杆安装在注射器上；使用拉力实验机以7.5mm/min的恒定速度挤出凝胶，当显示力值稳定后，收集后10滴挤出的凝胶并称重，计算每滴凝胶的平均值。
在本文的一些方面中，还提供了包含本文所述多重交联凝胶体系的制品。
在一些实施方式中，制品中的多重交联凝胶体系以单独的凝胶体系、组合物或复合物的形式存在，例如包含所述多重交联凝胶体系和与其复合的颗粒、微球、金属/氧化物、纤维、无纺布、薄膜的复合物；包含所述多重交联凝胶体系和负载于其上或其中的药物、因子或细胞的组合物。
在本文的一些方面中，还提供了一种产品，其包含本文的多重交联凝胶体系或制品。
在本文的一些方面中，还提供了本文的多重交联凝胶体系或制品在制备用于医疗、美容、生产、日化产品中的应用。
在一些实施方式中，产品选自：眼玻璃体填充物或替代物、软组织或软骨修复物或填充物、整形填充物、创伤敷料或修复物、药物(例如化药、生物药)载体或载药系统、细胞(如干细胞、免疫细胞)生长或培养载体或系统、组织工程产品、个人护理用品。
在一些实施方式中，产品为或包含多重交联凝胶-微球复合物，其中所述微球包括选自下组中的一种或多种：羟基磷灰石微球、聚己内酯微球、聚乳酸微球、聚乙交酯丙交酯微球、聚羟基脂肪酸酯微球、透明质酸微球、壳聚糖微球、胶原微球、明胶微球、脂质体纳米微球、荧光微球。
在一些实施方式中，产品为或包含负载细胞和/或药物和/或生长因子的多重交联的凝胶体系，其中，所述细胞和/或药物和/或生长因子直接包覆于凝胶体系中，或包覆于微球中再与凝胶体系均匀混合，例如，所述微球包括选自下组中的一种或多种：羟基磷灰石微球、聚己内酯微球、聚乳酸微球、聚乙交酯丙交酯微球、聚羟基脂肪酸酯微球、透明质酸微球、壳聚糖微球、胶原微球、明胶微球、脂质体纳米微球、荧光微球。
在本文的一些方面中，还提供了一种制备本文制品或产品的方法，其包括：提供本文的多重交联凝胶体系；对所述多重交联凝胶体系进行包装、组合和/复合。
有益效果
本文的方法、产品产生了诸多有益的效果，包括：
1.将长链交联剂与短链交联剂或自交联相结合，长链交联初步形成第一层疏松网络，赋予凝胶网络以一定的稳定性和柔性，并保持高分子一定程度的运动性；在此基础上，短链交联或自交联形成第二层密实网络，进一步提升稳定性，同时增加刚性和强度。
2.本发明提供的多重交联的凝胶体系，由长短链交联剂结合形成双交联，提升凝胶强度、柔韧性和内聚性，同时提升凝胶的耐降解性，延长体内存留时间。
3.本发明提供的多重交联的凝胶体系，兼具良好的内聚性和稳定性，用于软组织填充时不易弥散，发挥长期的填充效果。由于其良好的内聚性，可包覆细胞或微球，使之在人体内不移位、不散开，长期填充于所需部位。该凝胶体系也可包覆生长因子，具有长期缓释的效果。
4.本发明提供的多重交联的凝胶体系，兼具良好的内聚性和稳定性，用于眼玻璃体填充时溶胀率很低，不会造成眼压升高；缓慢降解，体内存留时间长，可实现玻璃体的长期填充；降解后不崩解成小颗粒，不堵住房角。
5.本发明提供的多重交联的凝胶体系，兼具良好的内聚性和稳定性，可作为敷料用于皮肤创伤修复中，良好的组织整合性使之不易移位，负载生长因子或药物时具有缓释作用，达到长效给药的目的。
6.本发明方法简便易行，适合放大生产。
实施例与比较例
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
主要材料来源
Figure BDA0004173365860000171
实施例1.双交联透明质酸凝胶的制备
取1800kDa透明质酸钠溶解于磷酸盐缓冲液(起始pH为6.5中，调节pH至13(所用调节剂为氢氧化钠)，配制成2.5％质量浓度(W透明质酸/W磷酸盐缓冲液)的溶液，加入聚乙二醇二丙烯酸酯(polyethylene glycol diacrylate，PEGDA，分子量20kDa)混合均匀，PEGDA:透明质酸钠单体的摩尔比为1:10，2～8℃下反应48小时形成初步交联的透明质酸网络。
调节pH为10，加入过量的磷酸盐缓冲液(pH为7.2)，使凝胶充分分散、溶胀，加入乙醇(95％)，混合均匀后于5℃下搅拌0.5小时，然后于20℃下搅拌0.5小时，40℃下2小时。取沉淀反复清洗(清洗液与沉淀用溶剂相同，即为95％乙醇，复溶于磷酸盐缓冲溶液(pH为7.2)中，配制成2.5％(W透明质酸/W磷酸盐缓冲液)的初步交联的凝胶。
调节pH为13，加入二乙烯基砜(DVS)，DVS:透明质酸单体的摩尔比为1:5，交联温度为2～8℃，反应48小时后，对倍稀释继续反应18小时，继续对倍稀释反应8小时。
调节pH为10，加入过量的磷酸盐缓冲液(pH为7.2)，使凝胶充分分散、溶胀，加入乙醇，混合均匀后于5℃下搅拌1小时，然后于20℃下搅拌1小时，40℃下2小时。取沉淀反复清洗，复溶于磷酸盐缓冲溶液(pH为7.2)中，配制成2.0％的双交联透明质酸凝胶。磷酸盐缓冲溶液透析5天(pH为7.2)，湿热灭菌15分钟。
性能测试：
1.取第二次复溶前的沉淀，真空干燥，采用扫描电子显微镜观察沉淀的形貌。如图1所示，沉淀呈现出疏松多孔的形貌。
2.复溶时，发现沉淀在10分钟内完全溶胀，具有较快的溶解速率。
3.取灭菌后的双交联透明质酸凝胶，通过流变仪测试其剪切粘度。如图2所示，双交联透明质酸凝胶具有良好的粘弹性。
4.通过紫外分光光度计测试双交联透明质酸凝胶的透光率。如图3所示，双交联透明质酸凝胶在波长300～800nm范围内光谱透过率＞98％，证明该凝胶具有优异的透光度。
5.采用折光计测试双交联透明质酸凝胶的折光率，结果为1.334，与天然玻璃体(1.3345-1.3348)相似。
6.将双交联透明质酸凝胶染色，涂覆于猪皮真皮层，随即任意折叠、扭转，凝胶仍牢固地贴附于猪皮表面(图4)，不移位、不散开。该结果证明了双交联透明质酸凝胶具有优异的内聚性和组织整合性。
实施例2.双交联透明质酸凝胶的皮内植入试验
将实施例1中得到的经透析和灭菌的2.0％双交联透明质酸凝胶注射入新西兰大白兔背部真皮层，每个植入点0.2mL。植入后24h、48h、72h、7天观察植入点的皮肤反应。7天时处死兔子，皮内观察凝胶和周围皮肤组织状态，取样切片，进行苏木精-伊红染色。
结果显示，7天内大白兔皮肤外观和真皮层内侧均未见红肿、焦痂(图5～6)，第7天的植入点组织切片苏木精-伊红染色未见炎症细胞浸润(图7)，证明双交联透明质酸凝胶具有良好的生物相容性。并且，与常见的颗粒状的组织填充剂会与皮肤组织产生明显的界面相比，双交联透明质酸凝胶渗透到真皮组织的间隙中，在照片中几乎辨识不到凝胶与真皮组织的边界，证明了双交联透明质酸凝胶与真皮组织的高融合度，具有优异的组织整合性。
实施例3.双交联透明质酸凝胶的动物眼玻璃体腔植入试验
将实施例1中得到的双交联透明质酸凝胶注射入新西兰大白兔眼玻璃体腔，具体试验方法为：测定试验兔双侧的眼压并记录，然后用复方托吡卡胺滴眼液散大瞳孔。麻醉动物后用聚维酮碘消毒结膜囊以及眼周毛发，手术区周围铺无菌洞巾，使用开睑器撑开眼睑。距离角膜缘1mm-1.5mm，使用23G玻切穿刺刀制作三个平坦部巩膜开口，放入灌注头，打开灌注开关，并用胶布固定好灌注管，避免灌注头损伤晶状体。角膜表面放置玻切用角膜接触镜辅助术中观察。手术显微镜下行常规玻璃体切割术，术中使用曲安奈德染色显示玻璃体。后极部玻璃体切除完成后进行气液交换，用笛针吸除后极部和视杯内残留的液体。完成玻璃体切除后，注入双交联透明质酸凝胶充填满玻璃体腔。可吸收缝线缝合巩膜穿刺口，术后3天每日1次结膜囊涂妥布霉素眼膏。
定期行大体观察，用眼压计测量兔眼眼压。16周后眼底照相，无痛处死兔子，取眼球固定，切片，苏木精-伊红染色，观察视网膜结构。
如图8～9所示，术后16周期间眼球未见明显肿胀、炎症与发白，16周时未见视网膜异常。兔眼眼压(图10)测试结果显示眼压始终维持在正常范围内(兔正常眼压范围为10-21mmHg)。16周后的视网膜染色结果(图11)显示，视网膜结构正常、清晰，未见明显变性。
上述结果证明，双交联透明质酸凝胶植入眼玻璃体腔后具有良好的生物相容性，不会引起眼压升高和周围组织变性或炎症；并且双交联凝胶还具有足够的粘度、表面张力和强度，使其适于眼内填充(例如在视网膜手术中填充于眼内)，有利于打开视网膜褶皱，稳定视网膜。由此，本申请的双交联凝胶可以作为玻璃体填充物，应用于玻璃体切除术等眼底手术中。
实施例4.双交联羧甲基壳聚糖凝胶的制备
取300kDa羧甲基壳聚糖(CMCS，羧甲基取代度80％)溶解于磷酸盐缓冲液中，调节pH至6.5，配制成4％质量浓度的溶液，加入聚谷氨酸(分子量10kDa)、耦合试剂DMTMM(活化羧基)混合均匀，聚谷氨酸单体:羧甲基壳聚糖单体:DMTMM的摩尔比为1:5:1，10℃下反应24小时形成初步交联的羧甲基壳聚糖网络。
调节pH为6.5，加入过量的磷酸盐缓冲液，使凝胶充分分散、溶胀，加入丙酮，混合均匀后于5℃下搅拌1小时，然后于20℃下搅拌1小时，40℃下2小时。取沉淀反复清洗，复溶于磷酸盐缓冲溶液中，配制成3％的初步交联的凝胶。
调节pH为6.5，加入胱胺盐酸盐和DMTMM，胱胺:羧甲基壳聚糖单体:DMTMM的摩尔比为1:4:2，交联温度为2～8℃，反应72小时后，对倍稀释继续反应18小时，继续对倍稀释反应8小时。
调节pH为6.5，加入过量的磷酸盐缓冲液，使凝胶充分分散、溶胀，加入丙酮，混合均匀后于5℃下搅拌1小时，然后于20℃下搅拌1小时，40℃下2小时。取沉淀反复清洗，复溶于磷酸盐缓冲溶液中，配制成2.2％的双交联羧甲基壳聚糖凝胶。透析，湿热灭菌15分钟。
取双交联羧甲基壳聚糖凝胶，冻干后采用扫描电子显微镜观察其形貌。如图12所示，与常规单交联凝胶结构不同，双交联的羧甲基壳聚糖具有致密的多层网络结构，且同时存在大孔和小孔。本申请的上述结构具有通透性好、孔隙结构发达、比表面积大，韧性好等优点，可作为敷料等，有助于更快吸收液体(例如作为止血或吸液材料使用)。
实施例5.双交联透明质酸-胶原蛋白凝胶的制备
取600kDa的透明质酸钠和300kDa的胶原蛋白溶解于2％的醋酸溶液中，调节pH至4.5，透明质酸钠质量浓度为1.2％，胶原蛋白质量浓度为4％。加入聚赖氨酸(分子量4kDa)、DMTMM混合均匀，聚赖氨酸:透明质酸钠单体:DMTMM的摩尔比为1:2:0.6，2～8℃下反应8小时形成初步交联的透明质酸-胶原网络。
调节pH为5，加入过量的磷酸盐缓冲液，使凝胶充分分散、溶胀，加入丙酮，混合均匀后于2℃下搅拌0.5小时，然后于15℃下搅拌0.5小时，35℃下2小时。取沉淀反复清洗，复溶于磷酸盐缓冲溶液中，配制成透明质酸钠质量浓度为1.2％，胶原蛋白质量浓度为4％的初步交联的凝胶。
调节pH为7，加入谷氨酰胺和谷氨酰胺转氨酶，谷氨酰胺与谷氨酰胺转氨酶的质量浓度分别为1％和0.5％，交联温度为20℃，反应8小时后，对倍稀释继续反应18小时，继续对倍稀释反应24小时。
调节pH为5，加入过量的磷酸盐缓冲液，使凝胶充分分散、溶胀，加入丙酮，混合均匀后于2℃下搅拌0.5小时，然后于15℃下搅拌0.5小时，35℃下2小时。取沉淀反复清洗，复溶于磷酸盐缓冲溶液中，配制成透明质酸钠质量浓度为1.2％，胶原蛋白质量浓度为4％的双交联凝胶。透析。
将凝胶与成纤维细胞(购自中国科学院细胞库，接种密度为3×104个/cm2)共培养(培养条件37℃、5％CO2培养箱,含10％胎牛血清和1％双抗的高糖培养基)，培养7天时采用活-死细胞染色考察细胞的活力。如图13所示，细胞在凝胶中可正常生长(图中浅色部分为绿色的活细胞)，培养7天时细胞具有良好的活力。
实施例6.双交联羧甲基壳聚糖凝胶-微球复合物的制备
取实施例4中双交联羧甲基壳聚糖凝胶，加入羟基磷灰石微球，凝胶与微球的质量比为4:1。缓慢搅拌混合均匀，得到双交联羧甲基壳聚糖凝胶-微球复合物。
如图14所示，复合物具有良好的粘弹性和提拉性。
将复合物冻干，采用扫描电子显微镜观察其微观形貌，可见微球镶嵌在凝胶网络中(图15)。凝胶良好的内聚性可以将微球很好地包覆于凝胶网络中，不易弥散、移位。
实施例7.双交联羧甲基壳聚糖凝胶-微球复合物的细胞相容性
取实施例5中双交联羧甲基壳聚糖凝胶-微球复合物，与L929成纤维细胞共培养(同实施例5)。7天后通过光学显微镜观察细胞形态。如图16所示，细胞粘附于微球表面，呈良好的铺展状态。
实施例8.双交联羧甲基壳聚糖凝胶-微球复合物作为软组织填充剂的动物试验
取实施例6中双交联羧甲基壳聚糖凝胶-微球复合物，注射入新西兰大白兔背部真皮深层，每个植入点0.5mL。常规饲养1个月后，取凝胶和周围皮肤组织样本，切片，分别采用Masson三色染色和天狼星红染色。
如图17所示，复合物植入真皮1个月后生成部分的胶原纤维，胶原纤维分布在凝胶缝隙和微球表面，天狼星红染色(图18)可见I型和III型胶原平行排布于微球间隙之间。
上述结果证明了双交联羧甲基壳聚糖凝胶-微球复合物可作为软组织填充剂，用于真皮层植入，具有良好的生物相容性和促进胶原再生能力。
对比例1.短链交联剂单交联的透明质酸凝胶的制备
取1800kDa透明质酸钠溶解于磷酸盐缓冲液中，调节pH至13，配制成2.5％质量浓度的溶液，加入DVS，DVS:透明质酸单体的摩尔比为1:4，5～15℃下反应48小时。在本对比例中，为了增强单交联剂的交联作用，提高了交联剂DVS相对于透明质酸单体的用量(从实施例1中DVS:HA＝1:5提高到1:4)。加入过量的磷酸盐缓冲液，使凝胶充分分散、溶胀，加入乙醇，混合均匀后室温下搅拌3小时。取沉淀反复清洗，复溶于磷酸盐缓冲溶液中，配制成2.0％的单交联的凝胶。透析，湿热灭菌15分钟。
对比例2.长链交联剂单交联的透明质酸凝胶的制备
取1800kDa透明质酸钠溶解于磷酸盐缓冲液中，调节pH至13，配制成2.5％质量浓度的溶液，加入PEGDA(分子量20kDa)，PEGDA:透明质酸单体的摩尔比为1:5，2～8℃下反应48小时。在本对比例中，为了增强单交联剂的交联作用，提高了交联剂PEGDA相对于透明质酸单体的用量(从实施例1中PEGDA:HA＝1:10提高到1:5)。加入过量的磷酸盐缓冲液，使凝胶充分分散、溶胀，加入乙醇，混合均匀后室温下搅拌3小时。取沉淀反复清洗，复溶于磷酸盐缓冲溶液中，配制成2.0％的单交联的凝胶。透析，湿热灭菌15分钟。
对比例3.单交联透明质酸混合凝胶的制备
取对比例1和2中灭菌后的单交联的透明质酸钠凝胶，等质量混合均匀，形成DVS单交联和PEGDA单交联的物理混合凝胶。
对比例4.双交联的透明质酸凝胶与单交联的透明质酸凝胶的内聚性对比
取实施例1、对比例2-4中的凝胶，通过Dermatol Surg 2015；41:S365–S372中公开的内聚性测试方法对内聚性进行评估。
将样品装入1mL规格的玻璃注射器中，通过离心机(2500～3000rpm)离心(5～10)分钟除去凝胶中的空气。将18G针头(内径为0.9mm)和推杆安装在注射器上。使用拉力实验机以7.5mm/min的恒定速度挤出凝胶，当显示力值稳定后，收集后10滴挤出的凝胶并称重，计算每滴凝胶的平均值。
根据该方法，凝胶质量越大，内聚性越强。测试结果如下表所示：
样品分组 平均每滴凝胶质量(毫克)
实施例1(长短链交联剂双交联) 65
对比例2(短链交联剂单交联) 32
对比例3(长链交联剂单交联) 38
对比例4(单交联凝胶物理混合) 25
从上述结果可知，双交联的透明质酸钠凝胶的内聚性明显优于单交联的凝胶，证明长短链交联剂组合交联高分子凝胶有助于提升凝胶的内聚性。同时，将透明质酸钠通过长链交联剂和短链交联剂分别交联，后经物理混合制得的混合凝胶，其内聚性较单交联和双交联凝胶更低，这可能是由于长链交联剂和短链交联剂分别单交联形成了不同的相态，物理混合后打破了原各自相态中的氢键，形成了不互溶的双相，导致整体凝胶的分子内作用力降低。
对比例5.双交联透明质酸凝胶的制备和比较
在本对比例中，通过同实施例1相同的方法制备双交联透明质酸凝胶，但在第一次和第二次交联之后的劣溶剂置换过程中均不施加梯度升温程序。在短链交联剂交联后，调节pH为10，加入过量的磷酸盐缓冲液，使凝胶充分分散、溶胀，加入乙醇，混合均匀后于室温下搅拌4小时。取沉淀反复清洗，复溶于磷酸盐缓冲溶液中，配制成2.0％的双交联透明质酸凝胶。
取复溶前的沉淀，真空干燥，采用扫描电子显微镜观察沉淀的形貌。
如图19所示，劣溶剂置换过程中不施加梯度升温得到的沉淀，为很多小颗粒聚集形成结块。这与实施例1中呈现的多孔形貌不同。
复溶时，发现沉淀需16小时才可完全溶胀，溶解速率明显低于实施例1中的结果。
在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本申请的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (20)

1.一种多重交联凝胶体系的制备方法，其包括如下步骤：
(1)在适合交联的条件下，使高分子化合物在长链交联剂的存在下发生第一交联反应，得到初步交联的凝胶网络，其中，所述长链交联剂的分子量不低于400Da和/或具有不少于12个主链骨架原子的链长；
(2)对所述初步交联的凝胶网络进行溶胀、沉淀和复溶，形成初步交联凝胶；
(3)在适合交联的条件下，使所述初步交联凝胶在短链交联剂和/或缩合剂的存在下发生第二交联反应，得到二次交联的凝胶网络，其中，所述短链交联剂的分子量低于400Da和/或具有少于12个主链骨架原子的链长；
(4)对所述二次交联的凝胶网络进行溶胀、沉淀和复溶，形成多重交联凝胶体系。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述高分子化合物的分子量不低于10,000Da，且侧链包含两个以上的羧基或氨基或羟基或它们的组合，
例如，所述高分子化合物为选自下组中的一种或多种：透明质酸(如透明质酸钠)、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、几丁质、羧甲基几丁质、胶原蛋白、明胶、丝素蛋白、羧甲基葡聚糖、羧甲基纤维素、氨基聚乙二醇、羧基聚乙二醇；和/或
所述高分子化合物在水相溶液中的起始浓度为0.2％～10％，例如0.4％～8％。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述长链交联剂选自下组：氨基聚乙二醇、羧基聚乙二醇、聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDE)、聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸以及它们的盐、单宁酸、原花青素，且其分子量不低于400Da和/或具有不少于12个主链骨架原子的链长；和/或
所述长链交联剂与所述高分子化合物中的交联反应性基团的摩尔比为1:10～1:2。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述短链交联剂选自下组：谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸以及它们的盐和聚合物，谷氨酰胺、二乙烯基砜(DVS)、丁二醇二缩水甘油基醚(BDDE)、聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDE)、二环氧辛烷(DEO)、胱胺及其盐、己二胺、对苯碳二亚胺(BCDI)、氨基聚乙二醇、羧基聚乙二醇、戊二醛、京尼平，且其分子量低于400Da和/或具有少于12个主链骨架原子的链长；和/或
所述短链交联剂与所述高分子化合物中的交联反应性基团的摩尔比为1:10～1:1。
5.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)和/或步骤(3)中还可选地包括在交联反应体系中加入缩合剂，
例如，所述缩合剂选自下组：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1,3-二环己基碳二亚胺(DCC)、谷氨酰胺转氨酶、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)、6-氯-2,4-二甲氧基1,3,5-三嗪(CDMT)；和/或
所述缩合剂与包含所述缩合剂的反应体系中的交联剂能够发生反应的基团摩尔比为1:5～2:1；和/或
在所述高分子化合物的分子链中同时具有羧基和氨基反应性基团时，交联反应体系中的缩合剂引起分子自交联。
6.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)还包括提供所述高分子化合物的水性溶液(例如磷酸盐缓冲溶液、水溶液)，并调整其pH至适于发生第一交联反应，例如：
所述水性溶液选自：磷酸盐缓冲溶液、醋酸溶液、水溶液；和/或
所述高分子化合物在溶液中的质量百分比浓度为0.4％～8％；和/或
所述第一交联反应的反应温度为0～室温，例如2～30℃；和/或
所述第一交联反应的反应时间为5～120小时，例如8～100小时。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(2)和步骤(4)各自独立地包括选自下组的一项或多项：
(a)调节前步所得凝胶网络的pH，例如：
当体系中浓度最高的高分子化合物为透明质酸、丝素蛋白、羧甲基葡聚糖、羧甲基纤维素、羧基聚乙二醇时，调节pH值为7.5～14；
当体系中浓度最高的高分子化合物为壳聚糖、羧甲基壳聚糖、几丁质、羧甲基几丁质、胶原蛋白、明胶、氨基聚乙二醇时，调节pH值为2～6.5；
(b)所述溶胀包括：在水性溶液中充分溶胀平衡所得凝胶网络；
(c)所述沉淀包括：在包含充分溶胀的凝胶网络的水性溶液中加入劣溶剂并混合使凝胶网络沉淀，例如：
在沉淀过程中对混合物进行梯度升温，例如从0℃逐步升温至50℃，如2～5℃下0.5～2小时→15～25℃下0.5～2小时→35～45℃下1～4小时；
所述劣溶剂选自：丙酮、乙醇、氯仿、乙醚、正己烷或其组合；
(d)可任选地，对所得沉淀进行一次或多次清洗；和/或
(e)所述复溶包括：在水性溶液中对部分或全部沉淀进行复溶，例如获得质量百分比浓度为1～10％(如1.5～8％)的凝胶溶液。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(3)包括：
调节前步所得初步交联凝胶的pH；和/或
在交联反应过程中进行梯度稀释，例如反应8～72小时后进行1～5倍稀释→继续反应8～48小时后进行1～5倍稀释→继续反应8～24小时；和/或
所述第二交联反应的反应温度为0～室温，例如2～30℃；和/或
所述第二交联反应的反应时间为5～120小时，例如8～100小时。
9.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括：对所得多重交联凝胶体系进行纯化和/或灭菌；和/或
所得多重交联凝胶体系中长链交联剂的修饰度为2％～40％，短链交联剂或自交联的修饰度为5％～40％。
10.如权利要求1所述的方法，其包括以下步骤：
(1')配制高分子化合物水性溶液，调节pH，加入长链交联剂，在缩合剂或无缩合剂的参与下进行第一步交联反应，得到初步交联的凝胶网络；
(2')调节pH，然后将步骤(1')中的凝胶网络置于水相溶液中充分溶胀平衡，加入劣溶剂，混合均匀后梯度升温，取沉淀反复清洗，复溶于水性溶液中，配制成初步交联凝胶；
(3')调节pH，向初步交联凝胶中加入短链交联剂和/或缩合剂进行第二步交联反应，反应过程中进行梯度稀释；
(4')取步骤(3')中得到的凝胶，调节pH，然后将步骤(3')中的凝胶网络置于水相溶液中充分溶胀平衡，加入劣溶剂，混合均匀后梯度升温，取沉淀反复清洗，复溶于水性溶液中，得到多重交联的凝胶网络；
(5')可任选地，对所述多重交联的凝胶网络进行除杂、灭菌和/或包装。
11.如权利要求1～10中任一项所述的方法，所述方法还包括对长链交联剂与短链交联剂的长度和/或用量比例进行选择以控制多重交联凝胶网络的交联修饰度。
12.一种多重交联凝胶体系，其中，所述多重交联凝胶体系采用权利要求1～11中任一项所述的方法制得。
13.一种多重交联凝胶体系，其中，所述多重交联凝胶体系包含：
通过采用长链交联剂的交联获得的第一层网络；以及
通过采用短链交联剂或自交联获得的第二层网络，
其中所述第一层网络的密实度低于所述第二层网络。
14.如权利要求12或13所述的多重交联凝胶体系，其中，通过如下方式测定，所述多重交联凝胶体系具有每滴凝胶的平均质量不低于40毫克的内聚性：
将样品装入1mL规格的玻璃注射器中，通过2500～3000rpm，5～10分钟离心除去凝胶中的空气；将内径为0.9mm的18G针头和推杆安装在注射器上；使用拉力实验机以7.5mm/min的恒定速度挤出凝胶，当显示力值稳定后，收集后10滴挤出的凝胶并称重，计算每滴凝胶的平均值。
15.包含权利要求12-14中任一项所述多重交联凝胶体系的制品。
16.如权利要求15所述的制品，其中，所述制品中的多重交联凝胶体系以单独的凝胶体系、组合物或复合物的形式存在，例如包含所述多重交联凝胶体系和与其复合的颗粒、微球、金属/氧化物、纤维、无纺布、薄膜的复合物；包含所述多重交联凝胶体系和负载于其上或其中的药物、因子或细胞的组合物。
17.一种产品，其包含权利要求12-14中任一项所述的多重交联凝胶体系或包含权利要求15或16所述的制品。
18.如权利要求12-14中任一项所述多重交联凝胶体系或如权利要求15或16所述的制品在制备用于医疗、美容、生产、日化产品中的应用。
19.如权利要求17所述的产品或如权利要求18所述的应用，其中，所述产品选自：眼玻璃体填充物或替代物、软组织或软骨修复物或填充物、整形填充物、创伤敷料或修复物、药物(例如化药、生物药)载体或载药系统、细胞(如干细胞、免疫细胞)生长或培养载体或系统、组织工程产品、个人护理用品；和/或
所述产品为或包含多重交联凝胶-微球复合物，其中所述微球包括选自下组中的一种或多种：羟基磷灰石微球、聚己内酯微球、聚乳酸微球、聚乙交酯丙交酯微球、聚羟基脂肪酸酯微球、透明质酸微球、壳聚糖微球、胶原微球、明胶微球、脂质体纳米微球、荧光微球；和/或
所述产品为或包含负载细胞和/或药物和/或生长因子的多重交联的凝胶体系，其中，所述细胞和/或药物和/或生长因子直接包覆于凝胶体系中，或包覆于微球中再与凝胶体系均匀混合，例如，所述微球包括选自下组中的一种或多种：羟基磷灰石微球、聚己内酯微球、聚乳酸微球、聚乙交酯丙交酯微球、聚羟基脂肪酸酯微球、透明质酸微球、壳聚糖微球、胶原微球、明胶微球、脂质体纳米微球、荧光微球。
20.一种制备如权利要求15或16所述制品的方法，其包括：提供如权利要求12-14中任一项所述的多重交联凝胶体系；对所述多重交联凝胶体系进行包装、组合和/复合。
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