CN116607322A - 一种选择性去除活化白细胞的高分子生物材料 - Google Patents

一种选择性去除活化白细胞的高分子生物材料 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物材料领域，具体公开了一种选择性去除活化白细胞的高分子生物材料，它是包覆了PEG‑明胶复合水凝胶的无纺布；所述PEG‑明胶复合水凝胶是明胶溶液通过酶交联于无纺布，再将聚乙二醇双丙烯酸酯溶液通过光交联于无纺布制成的包覆在无纺布表面的水凝胶。本发明采用纤维材料表面包覆特定的超大分子PEG‑明胶复合水凝胶，使之在血液体外循环时，对活化白细胞具有良好的粘附性能，能够选择性去除活化白细胞，对未活化细胞无结合效应；具备良好的生物相容性，能避免引起凝血反应，对血小板、红细胞等影响小。解决目前血液体外循环时生物材料生物相容性差、粘附细胞特异性差、血流对粘附细胞的破坏等问题。

Description

一种选择性去除活化白细胞的高分子生物材料
技术领域
本发明属于生物材料领域，具体涉及一种选择性去除活化白细胞的高分子生物材料。
背景技术
体外循环（CPB）中离体血液与循环管路接触诱导白细胞活化、游走、粘附和浸入各个器官组织，引起全身性炎性反应综合症（SIRS）是患者术后发生并发症和死亡的重要原因。虽然术中采取一系列药物干预措施，但未解决细胞活化问题，由此导致的器官功能损伤直至死亡成为体外循环一项顽疾。
现有白细胞滤器利用生物材料的细胞筛作用，对激活和非激活白细胞无差别过滤，临床研究显示该类滤器对肺、肾、心、脑保护作用有限，因此，开发能够选择性去除活化白细胞是本领域的重要任务。
目前白细胞滤器的基材主要是聚酯或聚氨酯无纺布，所采用的表面改性的方法包括物理改性和化学改性。然而，传统的物理改性方法有诸多限制，如紫外光光效低、光强弱、加工速度慢、光束区域小、造价昂贵等，无法实现无纺布表面改性的工业化生产。采用丙烯酸及其衍生物、磺酸盐、聚氧化乙烯等化合物，通过接枝、涂覆、浸泡等化学改性方法使工业化生产成为可能。USP4880548中采用甲基丙烯酸羟乙酯辐照接枝改性聚酯纤维；JP4936998中采用表面接枝或涂敷在聚酯纤维表面改性；JP6251276中采用亲水性聚合物包括磺酸基或烷基磺酸盐，通过涂覆、浸泡、喷涂或旋涂对海绵状的聚氨酯进行改性；USP5795483中采用涂覆高分子量的聚氧化乙烯衍生物。虽然这些滤器在白细胞滤除方面取得了良好的效果，但无法选择性吸附活化细胞，并且材料表面的白细胞继续释放炎性介质，最终未能改善患者预后。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种选择性去除活化白细胞的高分子生物材料，它是包覆了PEG-明胶复合水凝胶的无纺布；
所述PEG-明胶复合水凝胶是明胶溶液通过酶交联于无纺布，再将聚乙二醇双丙烯酸酯溶液通过光交联于无纺布制成的包覆在无纺布表面的水凝胶。
进一步地，所述酶交联时明胶溶液的浓度为10-40g/L；光交联时聚乙二醇双丙烯酸酯溶液的浓度为10-40g/L；所述无纺布的重量为20-500克。
更进一步地，所述酶交联时明胶溶液的浓度为20g/L；光交联时聚乙二醇双丙烯酸酯溶液的浓度为20g/L；所述无纺布的重量为20克。
更进一步地，所述酶交联时交联剂为谷氨酰胺转氨酶、酪氨酸酶、儿茶酚氧化酶的一种或多种，优选谷氨酰胺转氨酶，酶用量为5~15U/g明胶，优选10U/g明胶，酶作用温度30-60℃，时间30-180分钟，优选温度为60℃，时间60分钟；所述光交联时交联剂包括Irgacure2959，Irgacure 2959用量为每升聚乙二醇双丙烯酸酯溶液1-5g，优选1g，光为紫外光，紫外光照时间1-20min，优选5min。
进一步地，所述明胶为药用级明胶，175 bloom，数均分子量为50000-100000；所述聚乙二醇双丙烯酸酯的数均分子量为2000-8000，优选8000；所述无纺布为PBT无纺布、PET无纺布或PP无纺布。
本发明还提供了一种制备前述高分子生物材料的方法，它包括如下步骤：
1）取明胶粉末，加水溶解混匀，得明胶溶液；取聚乙二醇双丙烯酸酯粉末，加水溶解，得PEGDA溶液。
2）取无纺布浸入步骤1）所得明胶溶液中，加入酶反应，反应后的无纺布浸入步骤1）所得PEGDA溶液中，加入光交联剂，紫外光照后，用水清洗无纺布，即得。
进一步地，步骤1）所述明胶粉末，加去离子水膨胀20min，再50-60℃水浴加热1h，混匀，得10-40g/L的明胶溶液，优选20g/L的明胶溶液；所述PEGDA溶液中聚乙二醇双丙烯酸酯浓度10-40g/L，优选20g/L。
进一步地，步骤2）所述酶为谷氨酰胺转氨酶、酪氨酸酶、儿茶酚氧化酶的一种或多种，优选谷氨酰胺转氨酶，酶用量为5~15U/g明胶，优选10U/g明胶；反应的温度为30-60℃，时间30-180分钟，优选温度为60℃，时间60分钟。
进一步地，步骤2）所述光交联剂包括Irgacure 2959，Irgacure 2959用量为每升聚乙二醇双丙烯酸酯溶液1-5g，优选1g；所述紫外波长365nm，光照时间1-20min，优选5min。
本发明最后提供了一种前述高分子生物材料在制备具有选择性去除活化白细胞作用的材料中的用途。
本发明的有益效果为：
本发明采用纤维材料表面包覆特定的超大分子PEG-明胶复合水凝胶，使之在血液体外循环时，对活化白细胞具有良好的粘附性能，能够选择性去除活化白细胞，对未活化细胞无结合效应；具备良好的生物相容性，能避免引起凝血反应，对血小板、红细胞等影响小。解决目前血液体外循环时生物材料生物相容性差、粘附细胞特异性差、血流对粘附细胞的破坏等问题，避免生物材料对血小板的吸附和对凝血反应、炎性反应的激活作用，减少潜在的免疫抑制、出血风险。
本发明在制备生物材料时还通过改变反应条件，调控多功能水凝胶在超细纤维表面的覆盖和分布，既改善了材料表面亲水性及表面粗糙度，让血液快速浸润通过的同时，利用明胶富含的RGD多肽对白细胞的粘附性实现对白细胞的选择性去除，使之得到的高分子生物材料对活化白细胞的去除率高，对血小板、红细胞影响小，生物相容性佳，具备实际推广应用价值。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1 不同浓度PEGDA和明胶包覆无纺布材料的扫描电镜图片，放大倍数均为2000倍。A 未改性聚酯无纺布；B 10g/L明胶和10g/L PEGDA；C 20g/L明胶和20g/L PEGDA；D40g/L明胶和40g/L PEGDA。
图2 活化细胞去除器体外去除循环血液内活化细胞的图。A：电镜放大600倍，可见超细纤维（直径3-7 u）复层结构结合多量细胞；B：放大8000倍，可见纤维结合细胞伪足形成，确定为活化细胞（白色箭头）。
具体实施方式
本发明具体实施方式中的原料和设备均可通过市售购买获得，其中明胶为药用级明胶，175 bloom，数均分子量为50000-100000。
实施例1 选择性去除活化白细胞的生物材料的制备
1）准确称量2.00g明胶，加入到100mL去离子水中，室温膨胀20min，50℃水浴加热1h，混匀得20g/L的明胶溶液；准确称量2.00g PEGDA（数均分子量8000），加入到100mL去离子水中，室温搅拌2h，得到20g/L的PEGDA溶液；
2）取20g PBT无纺布浸入步骤1）所得明胶溶液中，加入谷氨酰胺转氨酶（mTG）（10U/g明胶），放入60℃干燥箱中交联1小时，再将反应后的无纺布加入到100mL 步骤1）所得PEGDA溶液中，加入0.1g光交联剂Irgacure 2959，紫外光照反应5分钟，反应结束后，使用蒸馏水清洗PBT无纺布，即得。
实施例2 选择性去除活化白细胞的生物材料的制备
1）准确称量1.00g明胶，溶解在100mL水溶液中，得到10g/L的明胶溶液；准确称量1.00g PEGDA（数均分子量6000），加入到100mL去离子水中，室温搅拌2h，得到10g/L的PEGDA溶液；
2）取20g PBT无纺布浸入步骤1）所得明胶溶液中，加入谷氨酰胺转氨酶（mTG）（10U/g明胶），放入60℃干燥箱中交联2小时，再将反应后的无纺布加入到100mL 步骤1）所得PEGDA溶液中，加入0.1g光交联剂Irgacure 2959，紫外光照反应10分钟，反应结束后，使用蒸馏水清洗PBT无纺布，即得。
实施例3 选择性去除活化白细胞的生物材料的制备
1）准确称量4.00g明胶，溶解在100mL水溶液中，得到40g/L的明胶溶液；准确称量4.00g PEGDA（数均分子量4000），加入到100mL去离子水中，室温搅拌2h，得到40g/L的PEGDA溶液；
2）取20g PBT无纺布浸入步骤1）所得明胶溶液中，加入谷氨酰胺转氨酶（mTG）（10U/g明胶），放入60℃干燥箱中交联3小时，再将反应后的无纺布加入到100mL 步骤1）所得PEGDA溶液中，加入0.1g光交联剂Irgacure 2959，紫外光照反应2分钟，反应结束后，使用蒸馏水清洗PBT无纺布，即得。
以下通过试验例进一步说明本发明的有益效果
试验例1 选择性去除活化白细胞的生物材料研究
1、实验方法
1.1制备选择性去除活化白细胞的生物材料
1.1.1 生物材料的制备过程
使用电子天平准确称量2.00g明胶，溶解在100mL水溶液中，得到20g/L的明胶溶液。使用电子天平准确称量2.00g 聚乙二醇双丙烯酸酯（PEGDA，数均分子量8000），加入到100mL去离子水中，室温搅拌2h，得到20g/L的PEGDA溶液。将20g PBT无纺布浸入上述明胶溶液中，加入谷氨酰胺转氨酶（mTG）（10U/g明胶），放入60℃干燥箱中交联1小时。再将反应后的无纺布加入到100mL PEGDA溶液中，加入0.1g光交联剂Irgacure 2959，紫外光照反应5分钟。反应结束后，使用蒸馏水清洗PBT无纺布，得到PEG-明胶复合水凝胶的聚酯无纺布备用。
1.1.2 不同浓度的PEGDA和明胶水凝胶包覆无纺布材料
改变明胶（10g/L，20g/L，40g/L）和PEGDA（10g/L，20g/L，40g/L）的浓度，其余步骤同 “1.1.1 生物材料的制备过程”，制备得到PEGDA和明胶双交联水凝胶包覆的聚酯材料，评价材料的表面形貌、亲水性、粗糙度、对活化白细胞的去除效果及血液相容性。
1.1.3 不同反应时间制备得到的材料
改变明胶和PBT无纺布交联反应的时间（1h、2h、3h），其余步骤同“1.1.1 生物材料的制备过程”，制备得到PEGDA和明胶双交联水凝胶包覆的聚酯材料，评价材料对活化白细胞的去除效果。
1.1.4 不同PEGDA分子量制备得到的选择性去除活化白细胞的材料
改变PEGDA的分子量（4000、6000、8000），其余步骤同“1.1.1 生物材料的制备过程”，制备得到PEGDA和明胶双交联水凝胶包覆的聚酯材料，评价材料对活化白细胞的去除效果。
1.1.5 不同紫外光照时间制备得到的选择性去除活化白细胞的材料
改变紫外光照时间（2min、5min、10min），其余步骤同“1.1.1 生物材料的制备过程”，制备得到PEGDA和明胶双交联水凝胶包覆的聚酯材料，评价材料对活化白细胞的去除效果。
1.2、制备的生物材料的表征和效果评价
1.2.1 材料性能表征实验
1.2.1.1 扫描电镜
将PEG-明胶复合水凝胶的聚酯无纺布材料喷金后，采用扫描电镜对改性聚酯材料的表面形貌进行观察。
1.2.1.2 粗糙度、亲水性
采用表面粗糙度仪对改性材料的表面粗糙度进行检测，采用表面张力法对改性材料表面亲水性进行检测，具体方法如下：分别配制不同浓度（1%-5%）的甲酸、氯化钠及氯化钙溶液，采用自动液体表面张力仪检测溶液的表面张力。用注射器将不同浓度的液体滴在试样表面，以10分钟内液滴完全铺展的数目来进行衡量。静置10分钟后，在第10分钟至11分钟内进行观察。如10滴中仅有1滴或更少的液滴未浸湿多孔介质，则认为该种表面张力的液体浸湿了介质材料；如10滴中有2滴或更多的液滴未浸湿或不被吸收，则认为该种表面张力的液体不能浸湿该介质材料。表面张力越大，亲水性越好。
1.2.2 全血过滤实验：
富含活化白细胞全血的制备：取血液中心制备的新鲜全血300mL（由德阳中心血站提供），将1mL 0.03mg/mL的脂多糖-生理盐水溶液加入到全血中，使终浓度为1×10-4mg/mL，放置于37℃恒温振荡培养箱中，52rpm振荡24h后得到富含活化白细胞的全血。
将改性材料装载到活化白细胞去除器中，为节约全血使用量，全血用量为50mL，并按临床使用量等比例缩小活化白细胞去除器，将活化白细胞去除器与蠕动泵管连接，与装有50mL富含活化白细胞全血的离心管组成一个循环系统，选择产品临床使用条件—流速500mL/min，37±7℃水浴中循环2h，得到全血浸提液。采用血细胞计数仪分别检测循环前后血液样本的白细胞数、红细胞数、血小板数等。此外，将去除器中的材料取出，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后，再加入0.25%戊二醛（PBS配制，pH=7.4），室温放置2小时固定。再依次采用25%、50%、70%、75%、90%、100%的乙醇梯度脱水，自然干燥后再喷金采用扫描电镜观察活化白细胞黏附情况。
1.2.3 材料生物相容性实验——PEG-明胶复合水凝胶的聚酯改性材料对血液系统的影响
1.2.3.1. 改性材料对血小板功能的影响
(1)富血小板血浆（PRP）的制备
取血液中心制备的新鲜全血200mL（由德阳中心血站提供），采用800g离心力离心20min，取上层即为富血小板血浆。
(2)接触材料的血小板浸提液的制备
按GBT16886.12-2000《医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品》，聚酯材料与PRP的比例为3cm2/mL，将材料剪成1.5×1.5cm-21片，共4.5cm2，放入12孔板中，再加入1.5mL PRP，放入37℃恒温摇床中振荡1小时后，将材料取出，剩下的PRP分别进行血小板低渗休克相对变化率、血小板最大聚集率以及CD62p表达率的检测。
1.2.3.2. 溶血率测定
按GB/T16886.12的原则，将60cm2的改性材料放入10mL生理盐水浸提液中，与37℃浸提1h。分为实验组、阴性对照组、阳性对照各3管，分别加样品浸提液、生理盐水、蒸馏水5mL/管。全部试管加稀释血液0.1 mL(1mL全血加入5mL生理盐水)，轻轻混匀后置于37℃水浴保温60min，倒出各管内液体，2500g离心5min，吸取上清液，用分光光度计在545nm处测定吸光度。阴性对照≤0.03，阳性对照应为0.8±0.3。溶血率计算公式为［(DS－Dn)/(Dp－Dn)］×100%，其中DS代表测试样品的吸光度，Dn代表阴性对照的吸光度，DP代表阳性对照的吸光度。
1.2.3.3. 凝血功能测定
按GBT16886.12-2000《医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品》，聚酯材料与PPP的比例为3cm2/mL，将材料剪成1.5×1.5cm-21片，共4.5cm2，放入12孔板中，再加入1.5mL PPP，放入37℃恒温摇床中振荡1小时后，取出材料，PPP分别进行PT/APTT/TT/FVIII/FIX/FXI的测定。
2、结果
2.1、不同浓度的PEGDA和明胶水凝胶对生物材料影响
不同浓度的PEGDA和明胶水凝胶包覆无纺布材料后的表面形貌见图1，从图1可见：未改性聚酯无纺布纤维表面未见明显覆盖物，直径较细，交织孔径较大。随明胶和PEGDA浓度的增加，可见纤维表面有明显水凝胶包裹，纤维直径变粗，交织孔径变小。
亲水性和粗糙度结果见表1，对活化白细胞的去除效果见表2和图2，血液相容性的结果见表3~4。
由表1可知，未改性聚酯无纺布表面粗糙度较高，随着PEGDA和明胶浓度增加，聚酯材料表面粗糙度随之下降。表面张力结果显示，未改性聚酯无纺布表面张力较低，其表面较为疏水；随着PEGDA和明胶浓度增加，水凝胶包覆在材料表面的量随之增加，表面张力增加，材料表面亲水性增加。以上表征结果说明通过PEGDA和明胶双交联水凝胶已成功包覆到了聚酯材料表面。
由表2和图2结果可知，当改变PEGDA和明胶的浓度时，制备得到的聚酯材料对活化白细胞的去除和血小板的回收效果不同，且随着PEGDA和明胶浓度的增加，活化白细胞的去除率也有所增加，但当浓度增加到40g/L时，血小板回收率下降明显。
注：对照组为未孵育材料的血小板
由表3结果可知，未改性的聚酯无纺布对血小板功能和红细胞溶血的影响最大。当改变PEGDA和明胶的浓度时，制备得到的聚酯材料对血小板功能和红细胞的影响不同。当PEGDA和明胶浓度为20g/L时，血小板低渗休克和血小板聚集明显高于其他组，且CD62p表达率和红细胞溶血率明显低于其他材料组，说明该材料对血小板功能和红细胞的影响最小。
由表4结果可知，未改性的聚酯无纺布对凝血系统的影响最大，表现为APTT和TT时间延长，内源性凝血因子FVIII、FIX、FXI活性降低。当改变PEGDA和明胶的浓度时，制备得到的聚酯材料对凝血系统的影响不同。当PEGDA和明胶浓度为20g/L时，材料对凝血系统无显著影响。
2.2、不同反应时间制备得到的材料对活化白细胞的去除效果
具体活化白细胞的去除效果见表5。
由表5的结果可知，当改变明胶交联反应时间时，制备得到的聚酯材料对活化白细胞的去除和血小板的回收效果不同，且随着反应时间的增加，活化白细胞的去除率变化不大，但红细胞和血小板回收率明显下降。
2.3、不同PEGDA分子量制备得到的材料对活化白细胞的去除效果
具体活化白细胞的去除效果见表6。
由表6的结果可知，当改变PEGDA分子量时，制备得到的聚酯材料对活化白细胞的去除和血小板的回收效果不同，且随着PEGDA分子量的增加，活化白细胞的去除率、红细胞回收率和血小板回收率也随之增加。
2.4、不同紫外光照时间得到的材料对活化白细胞的去除效果
具体活化白细胞的去除效果见表7。
由表7的结果可知，当改变紫外光照时间时，制备得到的聚酯材料对活化白细胞的去除和血小板的回收效果不同，且随着光照时间的增加，活化白细胞的去除率随之增加，但当光照时间增加到10min时，红细胞回收率和血小板回收率明显下降。
综上，本发明高分子生物材料，能够选择性去除活化白细胞，对未活化细胞无结合效应；具备良好的生物相容性，避免引起凝血反应，对血小板、红细胞等影响小。解决目前血液体外循环时生物材料生物相容性差、粘附细胞特异性差、血流对粘附细胞的破坏等问题，避免生物材料对血小板的吸附和对凝血反应、炎性反应的激活作用，减少潜在的免疫抑制、出血风险，具备实际推广应用价值。

Claims (10)

1.一种选择性去除活化白细胞的高分子生物材料，其特征在于：它是包覆了PEG-明胶复合水凝胶的无纺布；
所述PEG-明胶复合水凝胶是明胶溶液通过酶交联于无纺布，再将聚乙二醇双丙烯酸酯溶液通过光交联于无纺布制成的包覆在无纺布表面的水凝胶。
2.根据权利要求1所述的高分子生物材料，其特征在于：所述酶交联时明胶溶液的浓度为10-40g/L；光交联时聚乙二醇双丙烯酸酯溶液的浓度为10-40g/L；所述无纺布的重量为20-500克。
3.根据权利要求2所述的高分子生物材料，其特征在于：所述酶交联时明胶溶液的浓度为20g/L；光交联时聚乙二醇双丙烯酸酯溶液的浓度为20g/L；所述无纺布的重量为20克。
4.根据权利要求1~3任一项所述的高分子生物材料，其特征在于：所述酶交联时交联剂为谷氨酰胺转氨酶、酪氨酸酶、儿茶酚氧化酶的一种或多种，酶用量为5~15U/g明胶，酶作用温度30-60℃，时间30-180分钟；所述光交联时交联剂包括Irgacure 2959，Irgacure 2959用量为每升聚乙二醇双丙烯酸酯溶液1-5g，光为紫外光，波长365nm，光照时间1-20min。
5.根据权利要求1所述的高分子生物材料，其特征在于：所述明胶为药用级明胶，175bloom，数均分子量为50000-100000；所述聚乙二醇双丙烯酸酯的数均分子量为2000-8000；所述无纺布为PBT无纺布、PET无纺布或PP无纺布。
6.一种制备权利要求1~5任一项所述高分子生物材料的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
1）取明胶粉末，加水溶解混匀，得明胶溶液；取聚乙二醇双丙烯酸酯粉末，加水溶解，得PEGDA溶液；
2）取无纺布浸入步骤1）所得明胶溶液中，加入酶反应，反应后的无纺布浸入步骤1）所得PEGDA溶液中，加入光交联剂，紫外光照后，用水清洗无纺布，即得。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤1）所述明胶粉末，加去离子水膨胀20min，再50-60℃水浴加热1h，混匀，得10-40g/L的明胶溶液；所述PEGDA溶液中聚乙二醇双丙烯酸酯浓度10-40g/L。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤2）所述酶为谷氨酰胺转氨酶、酪氨酸酶、儿茶酚氧化酶的一种或多种，酶用量为5~15U/g明胶；反应的温度为30-60℃，时间30-180分钟。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤2）所述光交联剂包括Irgacure 2959，Irgacure 2959用量为每升聚乙二醇双丙烯酸酯溶液1-5g；所述紫外波长365nm，光照时间1-20min。
10.权利要求1~5任一项所述高分子生物材料在制备具有选择性去除活化白细胞作用的材料中的用途。
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