CN115887758B - 负载外泌体促进糖尿病创面修复的共聚水凝胶 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种负载外泌体促进糖尿病创面修复的共聚水凝胶，通过2‑甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸与水凝胶混合后共聚，再与外泌体特异性结合得到。本发明公开了一种负载外泌体促进糖尿病创面修复的共聚水凝胶的制备方法。本发明拟针对糖尿病创面的病理特点，制备出一种共聚合水凝胶，利用两性离子MCP，MCP即为2‑甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸，通过其上的胆碱磷酸与外泌体上磷酸胆碱进行特异性结合，可有效负载外泌体并起到缓释作用，同时通过物理负载方法加载抗菌纳米粒子，将该水凝胶应用于糖尿病创面可有效起到抗菌以及促进血管生成的作用。

Description

负载外泌体促进糖尿病创面修复的共聚水凝胶

技术领域

本发明涉及一种共聚水凝胶。

背景技术

目前临床上针对糖尿病溃疡的传统治疗包括早期清创、注射胰岛素、提供外源生长因子、自体/异体皮肤移植以及改善微循环等，但这些方法往往效果单一，价格昂贵或是治疗周期过长，取得的效果并不理想。

对于糖尿病患者的创面修复，如何诱导巨噬细胞向M2极化和促进血管形成是两个需要在不同阶段关注的关键科学问题，以达到有效调控炎症反应、运送氧气/营养物质/免疫细胞等到达损伤部位，从而促进皮肤创面的愈合。

现有技术存在的待解决问题、缺陷或不足：

1.直接注射外泌体不能全面、均匀的覆盖于创区，会造成外泌体的流失和浪费，且不能起到缓释作用；

2.生长因子价格昂贵、效果单一；

3.干细胞移植有干细胞的突变致瘤性，异常分化、血管栓塞，以及潜在的免疫排斥风险等。

4.微针可能会造成创面二次损伤。

发明内容

本发明提出了一种负载外泌体促进糖尿病创面修复的共聚水凝胶及其制备方法，解决了现有技术中存在的问题。

本发明的技术方案是这样实现的：一种负载外泌体促进糖尿病创面修复的共聚水凝胶，通过2-甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸与水凝胶混合后共聚，再与外泌体特异性结合得到。

进一步，所述外泌体为脂肪源外泌体或内皮细胞外泌体。

一种负载外泌体促进糖尿病创面修复的共聚水凝胶的制备方法，包括以下步骤：步骤一，提取外泌体；步骤二，合成2-甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸；步骤三，共聚水凝胶制备：将2-甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸与水凝胶混合，再加入引发剂共聚；步骤四，将外泌体与2-甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸特异性结合。

进一步，提取外泌体的方法为：步骤a:干细胞的提取与培养，提取大鼠脂肪干细胞、人脐静脉内皮细胞，分离纯化、培养传代，步骤b：对外泌体进行鉴定。

进一步，2-甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸的合成方法包括以下步骤,步骤a:在烧瓶中加入甲醇和三乙胺，再加入四氢呋喃，将混合溶液置于冰盐浴中降温；步骤b:取2-氯-2-氧-1,3,2-二氧磷杂环戊烷与四氢呋喃混匀，滴加到烧瓶中；步骤c:低温反应后升至室温反应，反应结束后得到大量的白色沉淀为三乙胺盐酸盐，用四氢呋喃对三乙胺盐酸盐进行清洗，用减压抽滤的方式分开白色沉淀和浅黄色溶液，对浅黄色溶液减压旋蒸，得到黄色粘稠油状液体；步骤d:将黄色粘稠油状液体加入到乙腈中，加入阻聚剂对苯二酚，在冰水浴条件下，快速加入甲基丙烯酸二甲氨乙酯，反应后减压旋蒸至粘稠，在四氢呋喃溶液中沉淀得棕红色粘稠液体为2-甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸。

进一步，共聚水凝胶制备方法为：将2-甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸与水凝胶按照1/2-1/1摩尔比混合均匀，加入抗菌纳米粒子，再加入引发剂共聚。

进一步，所述抗菌纳米粒子为铜纳米粒子。

进一步，通过一锅法使外泌体与2-甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸特异性结合。

本发明的有益效果为：本发明拟针对糖尿病创面的病理特点，制备出一种共聚合水凝胶，利用两性离子MCP，MCP即为2-甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸，通过其上的胆碱磷酸与外泌体上磷酸胆碱进行特异性结合，可有效负载外泌体并起到缓释作用，同时通过物理负载方法加载抗菌纳米粒子，将该水凝胶应用于糖尿病创面可有效起到抗菌以及促进血管生成的作用。抗菌纳米粒子能够有效抵抗糖尿病创面早期的细菌感染；脂肪干细胞来源的外泌体在促进慢性伤口血管生成方面也有良好的效果，可以参与血管形成中的信号通路，影响血管的发生，发展以及成熟。

胆碱磷酸(CP)是与细胞膜表面的磷酸胆碱(PC)具有相反的化学结构和电荷的分布的两性离子，不同于以往传统的两性离子，这种新型的两性离子CP能够与PC形成两组独特N-P配对，与细胞膜产生很强的结合作用，本发明将CP与外泌体膜进行结合，提取的两种外泌体(脂肪源外泌体与内皮细胞外泌体)，两种外泌体均可与CP进行特异性结合。这种特异性结合可使水凝胶可控负载外泌体(通过调节MCP含量与浓度)，与外泌体结合力加强，从而可在创面修复时起到缓慢释放的作用，同时还可以黏附内皮细胞，加速创面愈合。

本发明能够特异性负载外泌体，减少外泌体浪费，并起到长期缓释作用，同时没有干细胞突变等风险，并且促进血管生成效果更好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的外泌体进入细胞后的示意图；

图2为本发明的甲基丙烯酸化水凝胶(GELMA)的结构示意图；

图3为本发明的甲基丙烯酸化水凝胶(GELMA)的另一结构示意图；

图4为本发明的GELMA/MCP共聚水凝胶(其中GELMA与MCP的摩尔比1：1)的结构示意图；

图5为本发明的GELMA/MCP共聚水凝胶(其中GELMA与MCP的摩尔比1：1)的另一结构示意图；

图6为本发明的GELMA/MCP共聚水凝胶(其中GELMA与MCP的摩尔比1：2)的结构示意图；

图7为本发明的GELMA/MCP共聚水凝胶(其中GELMA与MCP的摩尔比1：2)的另一结构示意图；

图8为本发明的各种水凝胶对细胞存活率的影响结果示意图；

图9为本发明的各种水凝胶对细胞增值的影响结果示意图。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。

实施例

1.外泌体提取：

1)干细胞的提取与培养

提取大鼠脂肪干细胞(ADSCs)、人脐静脉内皮细胞(HUVECS)，分离纯化、培养传代。

2)

a.外泌体提取：当干细胞在培养皿中细胞汇合率达到80％后，弃去培养基，

加入无外泌体血清的培养基继续培养48h；收集细胞培养基上清液于离心管中，低速离心(离心力2000g，温度4℃，时间30min)；将上清液转移至新的离心管中，高速离心(离心力12000g，温度4℃，时间45min)；取上清，经0.45μm滤膜过滤，收集过滤液；将滤液转移至新的离心管中，超速离心(离心力110000g，温度4℃，时间70min)，弃去上清液，所获的沉淀即为外泌体；得到脂肪源外泌体和人脐静脉内皮细胞外泌体。

b.外泌体的鉴定：通过TEM检测外泌体的形态；纳米颗粒跟踪分析(NTA)检测外泌体的粒径和浓度；DLS检测外泌体粒径的分布；通过流式细胞仪、Westernblotting对外泌体膜表面蛋白表达进行鉴定。通过BCA法对外泌体进行定量；根据需要用红色荧光染料PKH-26对外泌体进行标记。

脂肪源外泌体与内皮细胞外泌体在表征上并没有差别，TEM均表现为双层膜“杯状”结构，NTA检测粒径均在50～150nm左右，在Westernblotting检测时也都表达类似的标志性膜蛋白。只是两者所起到的生物学作用有一定的差别。但在应用于糖尿病创面时两者均可加速细胞增殖、迁移和血管生成。而相对于脂肪源外泌体，内皮细胞外泌体目前应用更少。如图1所示，外泌体能成功进入细胞，并聚集在细胞核周围，从而发挥生物学功能。

2.MCP通过简单的两步法合成。玻璃仪器在做化学合成反应之前都用火焰枪干燥并氩气保护。在25mL的圆底烧瓶中加入8mmol的甲醇和8mmol的三乙胺，再加入5mL色谱级的四氢呋喃(THF)，然后将混合溶液置于冰盐浴中使溶液温度降至-20℃。取8mmol的2-氯-2-氧-1,3,2-二氧磷杂环戊烷(COP)与5mL的色谱级四氢呋喃混匀，以针头注射器滴加的方式缓慢的滴加到圆底烧瓶中，滴加1h左右。滴加完成后，将混合溶液在-20℃条件下继续反应3h，然后将溶液温度缓慢上升到室温，另外再反应4h。反应结束后得到大量的白色沉淀为三乙胺盐酸盐，用THF对三乙胺盐酸盐进行清洗，用减压抽滤的方式分开白色沉淀和浅黄色溶液，对浅黄色溶液减压旋蒸，得到黄色粘稠油状液体。

将旋蒸得到的黄色液体加入到10mL色谱级的乙腈中，加入阻聚剂对苯二酚(55mg)，在冰水浴条件下，快速加入甲基丙烯酸二甲氨乙酯DMAEMA(8mmol,氢化钙CaH2除水)，0℃条件下反应3h，转入55℃条件下反应24h。反应结束后，将溶液在不高于30℃的条件下减压旋蒸至粘稠，在色谱级四氢呋喃溶液中沉淀得棕红色粘稠液体为单体MCP。

得到的MCP单体按0.5mg/mL的浓度溶解在甲醇溶液中，置于-20℃保存；在用于ATRP反应之前，MCP甲醇溶液过碱性AL2O2柱子除去阻聚剂。

3.共聚水凝胶制备：将取代度为90％的甲基丙烯酸化水凝胶(GELMA)配置为浓度为10％的前体溶液，即在50-60℃下搅拌溶解，按GELMA与MCP的摩尔比1：1或者1:2加入浓度为80mg/ml的MCP溶液再次在50℃下搅拌，由于GELMA和MCP均具有双键，加入光引发剂后双键将进行自由基共聚反应，然后在紫外光的激发下形成GELMA/MCP共聚水凝胶；

4.载药处理：通过一锅法使外泌体与MCP基于“CP-PC”的作用特异性结合，从而使水凝胶负载具有促进血管生成的外泌体以及抗菌的纳米粒子。

基于糖尿病创面血管生成困难和细菌感染两大难题，提出采用具有良好促血管生成的脂肪源外泌体以及良好抗菌效果的铜纳米粒子，同时为了使两种物质起到长期的作用效果，提出采用水凝胶作为药物载体。MCP可以与外泌体进行“CP-PC”的特异性结合，从而制备了一种共聚水凝胶。

1.成功提取到外泌体，并进行了一系列表征；

2.成功制备共聚水凝胶，通过表征该水凝胶具有良好的力学性能和生物相容性；如图2-7所示，各组水凝胶随着MCP加入胶内部形貌变得致密，多孔结构孔隙变小。

3.水凝胶负载外泌体后也能有效促进细胞增殖迁移，促进血管生成功能也得到了初步验证。如图8所示，各组水凝胶均无细胞毒性，且MCP加入可一定程度促进细胞生长。如图9所示，各组均能在一段时间内有效促进细胞增殖，说明各组别水凝胶均具有良好生物相容性。

GELMA也称为光交联明胶，因其优异的生物相容性、生物降解性和成型性而经常用于生物医学应用。GelMA可根据其特性构建为各种形式的支架，如3D支架、注射凝胶、生物打印支架等。这些支架可以通过光交联精确构建，在此过程中，GelMA上的可光交联官能团与其他聚合物、有机小分子和无机颗粒交联形成具有增强的机械性能和额外特性(例如，更好的成型性和生物相容性)的交联网络。这可用于伤口敷料、软骨再生和骨再生。

MCP(2-(甲基丙烯酰氧基)磷酸胆碱乙酯)：有防污功能的生物相容性两性离子聚合物，其带正电荷和带负电荷的基团可以形成致密的水合层，从而有效地防止非特异性蛋白质的吸附以及细菌和哺乳动物细胞的粘附；同时其可以模仿细胞膜中磷脂酰胆碱亲水性头基的磷脂酰胆碱侧链，与外泌体膜进行“CP-PC”的特异性结合，从而加载外泌体；

脂肪间充质干细胞(ADSC)衍生的外泌体可通过调节炎症反应、加速血管生成、增加角质形成细胞和成纤维细胞的迁移和增殖以及激活成纤维细胞的胶原和弹性蛋白合成来促进伤口愈合。此外，ADSC衍生的外泌体也通过调节细胞外基质重塑来减少瘢痕形成并能通过上调PI3K/AKT和MAPK/ERK通路，增强HUVECs的管形成和血管生成，促进全层皮肤创面愈合。但外泌体应用于创面修复时的给药途径会极大影响其在体内的分布和滞留时间。

GELMA上富含氨基和双键，MCP上也含有氨基和双键，双键之间可通过自由基聚合反应结合在一起，形成水凝胶网络。采用双键取代度为90％的GELMA，通过计算使GELMA和MCP按照双键摩尔比为1：1，配制为10％的水凝胶前体溶液。具体步骤：称量0.1g GELMA，加入RO水，再按照比例加入MCP，将混合物放入50-60℃的水浴锅充分溶解，然后用涡旋振荡仪进行振荡，使水凝胶前体溶液混合均匀，此时将抗菌纳米颗粒按照0.2mg/ml的浓度加入100ul，再次进行涡旋振荡，最后加入引发剂，用紫外灯照射交联成胶。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种负载外泌体促进糖尿病创面修复的共聚水凝胶，其特征在于:通过2-甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸与水凝胶混合后共聚，再与外泌体特异性结合得到。

2.如权利要求1所述的负载外泌体促进糖尿病创面修复的共聚水凝胶，其特征在于:所述外泌体为脂肪源外泌体或内皮细胞外泌体。

3.一种如权利要求1所述的负载外泌体促进糖尿病创面修复的共聚水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，提取外泌体；步骤二，合成2-甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸；步骤三，共聚水凝胶制备：将2-甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸与水凝胶混合，加入引发剂共聚；步骤四，将外泌体与2-甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸特异性结合。

4.如权利要求3所述的负载外泌体促进糖尿病创面修复的共聚水凝胶的制备方法，其特征在于：提取外泌体的方法为：步骤a:干细胞的提取与培养，提取大鼠脂肪干细胞、人脐静脉内皮细胞，分离纯化、培养传代，步骤b：对外泌体进行鉴定。

5.如权利要求3所述的负载外泌体促进糖尿病创面修复的共聚水凝胶的制备方法，其特征在于，2-甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸的合成方法包括以下步骤,步骤a:在烧瓶中加入甲醇和三乙胺，再加入四氢呋喃，将混合溶液置于冰盐浴中降温；步骤b:取2-氯-2-氧-1,3,2-二氧磷杂环戊烷与四氢呋喃混匀，滴加到烧瓶中；步骤c:低温反应后升至室温反应，反应结束后得到大量的白色沉淀为三乙胺盐酸盐，用四氢呋喃对三乙胺盐酸盐进行清洗，用减压抽滤的方式分开白色沉淀和浅黄色溶液，对浅黄色溶液减压旋蒸，得到黄色粘稠油状液体；步骤d:将黄色粘稠油状液体加入到乙腈中，加入阻聚剂对苯二酚，在冰水浴条件下，快速加入甲基丙烯酸二甲氨乙酯，反应后减压旋蒸至粘稠，在四氢呋喃溶液中沉淀得棕红色粘稠液体为2-甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸。

6.如权利要求3所述的负载外泌体促进糖尿病创面修复的共聚水凝胶的制备方法，其特征在于，共聚水凝胶制备方法为：将2-甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸与水凝胶按照1/2-1/1摩尔比混合均匀，加入抗菌纳米粒子，再加入引发剂共聚。

7.如权利要求6所述的负载外泌体促进糖尿病创面修复的共聚水凝胶的制备方法，其特征在于：所述抗菌纳米粒子为铜纳米粒子。

8.如权利要求4所述的负载外泌体促进糖尿病创面修复的共聚水凝胶的制备方法，其特征在于：通过一锅法使外泌体与2-甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸特异性结合。