CN111214710B - 一种促进皮肤再生的复合支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种促进皮肤再生的复合支架的制备方法，包括以下步骤：(1)将丝素蛋白溶于氯化钙三元溶解体系中，形成丝素蛋白溶液；(2)将壳聚糖溶于乙酸中，形成壳聚糖溶液；(3)将氯化锂溶于醋酸溶液中，形成氯化锂溶液；(4)将丝素蛋白溶液与壳聚糖溶液混合，然后加入至氯化锂溶液中搅拌孵育；(5)孵育结束后，中和反应液，冷冻、干燥，即得促进皮肤再生的复合支架。本发明的复合支架具有相互连通的孔隙、高孔隙率、高溶胀比、降解受控、无细胞毒性等优点，可以防止细菌感染，减少更换次数，促进再生上皮化和再生真皮，参与整个皮肤修复过程的调控，是一种很有前途的无菌创面辅料，为开发新型创面敷料提供了新的思路。

Description

一种促进皮肤再生的复合支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种促进皮肤再生的复合支架及其制备方法，属于生物医学工程材料领域。
背景技术
哺乳动物的皮肤，由表皮和真皮组成，覆盖全身。作为外部环境的保护屏障，烧伤或创伤引起的全层皮肤缺损通常以疤痕愈合。大面积的全层皮肤缺损可导致严重的感染和休克等临床问题。因此，促进伤口愈合和减少疤痕的形成是皮肤再生医学的关键。
近年来，使用补充外源性干细胞或修复细胞为治疗难治性疾病、促进组织修复和再生时一种新的治疗手段。然而，这种治疗手段需要在体外大量扩增和培养细胞，并进一步诱导分化和鉴定。鉴于经济和安全问题，这种治疗手段非常受限。随着药物筛选平台的发展，小分子的使用不仅可以促进细胞分化和重组，还能刺激内源性组织的修复和再生。小分子常被装入生物材料中，该方法可在组织直接修复中实现靶向性、持续性的分子释放，然而，用于伤口治疗的小分子组织工程支架才刚刚兴起。
Li是食品和药物管理局(FDA)批准的心境稳定剂，也是Wnt信号通路的激活剂。此外，LiCl可以调节多种生物过程，如促进增殖、血管生成、神经生成、间充质干细胞迁移、抑制细胞凋亡和炎症。
丝素蛋白(SF)和壳聚糖(CS)具有良好的生物相容性和可降解性，然而单一组分的SF和CS支架材料的诸多缺点限制了其在组织工程研究中应用。CS/SF复合材料克服单一组分SF和CS支架的缺点，具有力学性能优良、可塑性好、孔隙率及孔径可调和组分优势互补等特点。CS/SF复合材料被用于骨、软骨、皮肤、神经、脂肪、心脏和角膜等组织工程或损伤修复的研究中。目前，国内外对于CS/SF复合材料在组织工程中的研究尚处于起步阶段。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种促进皮肤再生的复合支架及其制备方法，该复合支架具有相互连通的孔隙、高孔隙率、高溶胀比、降解受控、无细胞毒性、促进再生上皮化和再生真皮等优点。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种促进皮肤再生的复合支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)将丝素蛋白(SF)溶于氯化钙三元溶解体系中，形成丝素蛋白溶液；
(2)将壳聚糖(CS)溶于乙酸中，形成壳聚糖溶液；
(3)将氯化锂溶于醋酸溶液中，形成氯化锂溶液；
(4)将丝素蛋白溶液与壳聚糖溶液混合，然后加入至氯化锂(LiCl)溶液中搅拌孵育；
(5)孵育结束后，中和反应液，冷冻、干燥，即得促进皮肤再生的复合支架。
本发明将氯化锂(LiCl)加载到壳聚糖/丝素蛋白(CS/SF)水凝胶中，通过冷冻干燥法制备无菌且生物相容性良好的海绵状复合支架CS/SF/LiCl。CS/SF基质呈均匀多孔网状结构，该结构可以很好的吸收伤口渗出液，保持合适的水分环境，增加伤口与外界氧气的接触面积，促进伤口愈合。另外，LiCl可以调节各种生物过程，促进增殖，血管生成，减少炎症。因此，CS/SF/LiCl可成为一种新的促进皮肤再生的组织工程材料。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，所述丝素蛋白溶液的浓度为4％；所述步骤(2)中，所述壳聚糖溶液的浓度为2.5％～3.6％。
优选地，壳聚糖溶液的浓度为3％。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，所述氯化锂溶液的浓度为20～40mmol/L。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述氯化锂溶液的浓度为30mmol/L。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(4)中，丝素蛋白溶液、壳聚糖溶液和氯化锂溶液的体积比为(0.5～2)：(1～2)：(3～5)。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述丝素蛋白溶液、壳聚糖溶液和氯化锂溶液的体积比为1:1:4。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)的具体操作为：将丝素蛋白溶于氯化钙三元溶解体系，水浴加热，搅拌溶解，然后冷却；冷却后倒入透析袋中透析，将透析液抽滤、离心、烘干，即得丝素蛋白溶液。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述氯化钙三元溶解体系为氯化钙、乙醇、水按体积比1:2:8混合而得，所述水浴加热的温度为70～90℃，所述搅拌时间为0.8～1.2h，所述透析袋的截留分子量为8000～14000Da，所述透析时间为3～5天。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)的具体操作为：将10g丝素蛋白加入按比例配制好的(摩尔比CaCl2：C2H5OH:H2O＝1:2:8)氯化钙三元溶解体系中，70～90℃水浴加热，搅拌0.8～1.2h溶解；将冷却后的丝素蛋白溶液倒入透析袋中(8000～14000Da)，常温下自来水透析3～5天，去除混合溶液中含有的小分子物质；将透析液抽滤、离心、烘干，得到浓度约4％的丝素蛋白溶液。
优选地，水浴加热的温度为80℃，搅拌时间为1h，透析时间为4天。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)的具体操作为：将1.8g壳聚糖加入50～70mL的0.2mmol/L的乙酸溶液，搅拌3h后得到浅黄色粘稠度的壳聚糖溶液。优选地，乙酸溶液的用量为60mL。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(3)的具体操作为：将LiCl加入1％的醋酸溶液中，形成浓度为20～40mmol/L的氯化锂溶液。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(5)的具体操作为：孵育结束后，用0.8～1.2％的NaOH溶液中和反应液，均质化的化合物转移到48孔板中，通过冷冻干燥得到促进皮肤再生的复合支架。
优选地，NaOH溶液的浓度为1％。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(4)中，混合时间为15～25min，孵育时间为2.5～3.5h。
优选地，混合时间为20min，孵育时间为3h。
第二方面，本发明提了一种促进皮肤再生的复合支架，所述复合支架是根据上述制备方法制得的。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的复合支架以壳聚糖/丝素蛋白为基质，克服了单一组分支架的缺点，具有力学性能优良、可塑性好、孔隙率及孔径可调、组分优势互补等特点；同时，将小分子氯化锂装入生物材料中可直接在组织修复中实现靶向性、持续性的分子释放。
(2)本发明的复合支架具有相互连通的孔隙、高孔隙率、高溶胀比、降解受控、无细胞毒性等优点，可以防止细菌感染，减少更换次数，促进再生上皮化和再生真皮，参与整个皮肤修复过程的调控，是一种很有前途的无菌创面辅料，为开发新型创面敷料提供了新的思路。
附图说明
图1为本发明实施1～3制备的复合支架的吸水率统计图。
图2为本发明实施1～3制备的复合支架的孔隙率统计图。
图3为本发明实施2制备的复合支架的扫描电镜图。
图4为本发明实施4～6制备的复合支架的降解性能统计图。
图5为本发明实施4～6制备的复合支架的细胞存活率统计图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种CS/SF(0.5:1)复合支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)将10g丝素蛋白加入按比例配制好的(摩尔比CaCl2：C2H5OH:H2O＝1:2:8)氯化钙三元溶解体系中，80℃水浴加热，搅拌1h溶解；将冷却后的丝素蛋白溶液倒入透析袋中(8000～14000Da)，常温下自来水透析4天，去除混合溶液中含有的小分子物质；将透析液抽滤、离心、烘干，得到浓度约4％的丝素蛋白溶液；
(2)将1.8g壳聚糖加入60mL的0.2mmol/L的乙酸溶液，搅拌3h后得到浅黄色粘稠度的壳聚糖溶液；
(3)将丝素蛋白溶液与壳聚糖溶液按体积比0.5:1混合搅拌20min，倒入四孔的聚四氟乙烯模具，放入冰箱-80℃冷冻24h后，放入干燥器冷冻干燥48h；
(4)取出样品，甲醇浸泡8h后，冷冻干燥48h除去剩下的甲醇，最终制备出CS/SF(0.5:1)支架。
实施例2
一种CS/SF(1:1)复合支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)将10g丝素蛋白加入按比例配制好的(摩尔比CaCl2：C2H5OH:H2O＝1:2:8)氯化钙三元溶解体系中，80℃水浴加热，搅拌1h溶解；将冷却后的丝素蛋白溶液倒入透析袋中(8000～14000Da)，常温下自来水透析4天，去除混合溶液中含有的小分子物质；将透析液抽滤、离心、烘干，得到浓度约4％的丝素蛋白溶液；
(2)将1.8g壳聚糖加入60mL的0.2mmol/L的乙酸溶液，搅拌3h后得到浅黄色粘稠度的壳聚糖溶液；
(3)将丝素蛋白溶液与壳聚糖溶液按体积比1:1混合搅拌20min，倒入四孔的聚四氟乙烯模具，放入冰箱-80℃冷冻24h后，放入干燥器冷冻干燥48h；
(4)取出样品，甲醇浸泡8h后，冷冻干燥48h除去剩下的甲醇，最终制备出CS/SF(1:1)支架。
实施例3
一种CS/SF(2:1)复合支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)将10g丝素蛋白加入按比例配制好的(摩尔比CaCl2：C2H5OH:H2O＝1:2:8)氯化钙三元溶解体系中，80℃水浴加热，搅拌1h溶解；将冷却后的丝素蛋白溶液倒入透析袋中(8000～14000Da)，常温下自来水透析4天，去除混合溶液中含有的小分子物质；将透析液抽滤、离心、烘干，得到浓度约4％的丝素蛋白溶液；
(2)将1.8g壳聚糖加入60mL的0.2mmol/L的乙酸溶液，搅拌3h后得到浅黄色粘稠度的壳聚糖溶液；
(3)将丝素蛋白溶液与壳聚糖溶液按体积比2:1混合搅拌20min，倒入四孔的聚四氟乙烯模具，放入冰箱-80℃冷冻24h后，放入干燥器冷冻干燥48h；
(4)取出样品，甲醇浸泡8h后，冷冻干燥48h除去剩下的甲醇，最终制备出CS/SF(2:1)支架。
实施例4
一种CS/SF/LiCl(20)复合支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)将10g丝素蛋白加入按比例配制好的(摩尔比CaCl2：C2H5OH:H2O＝1:2:8)氯化钙三元溶解体系中，80℃水浴加热，搅拌1h溶解；将冷却后的丝素蛋白溶液倒入透析袋中(8000～14000Da)，常温下自来水透析4天，去除混合溶液中含有的小分子物质；将透析液抽滤、离心、烘干，得到浓度约4％的丝素蛋白溶液；
(2)将1.8g壳聚糖加入60mL的0.2mmol/L的乙酸溶液，搅拌3h后得到浅黄色粘稠度的壳聚糖溶液；
(3)将LiCl加入1％的醋酸溶液中，形成浓度为20mmol/L的氯化锂溶液；
(4)将丝素蛋白溶液与壳聚糖溶液按体积比1:1混合搅拌20min，然后加入至氯化锂(LiCl)溶液中搅拌孵育3h，氯化锂溶液与丝素蛋白溶液、壳聚糖溶液的体积比为4:1:1；
(5)孵育结束后，用1％的NaOH溶液中和反应液，均质化的CS/SF/LiCl(20)化合物转移到48孔板中，通过冷冻干燥得到CS/SF/LiCl(20)复合支架。
实施例5
一种CS/SF/LiCl(30)复合支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)将10g丝素蛋白加入按比例配制好的(摩尔比CaCl2：C2H5OH:H2O＝1:2:8)氯化钙三元溶解体系中，80℃水浴加热，搅拌1h溶解；将冷却后的丝素蛋白溶液倒入透析袋中(8000～14000Da)，常温下自来水透析4天，去除混合溶液中含有的小分子物质；将透析液抽滤、离心、烘干，得到浓度约4％的丝素蛋白溶液；
(2)将1.8g壳聚糖加入60mL的0.2mmol/L的乙酸溶液，搅拌3h后得到浅黄色粘稠度的壳聚糖溶液；
(3)将LiCl加入1％的醋酸溶液中，形成浓度为30mmol/L的氯化锂溶液；
(4)将丝素蛋白溶液与壳聚糖溶液按体积比1:1混合搅拌20min，然后加入至氯化锂(LiCl)溶液中搅拌孵育3h，氯化锂溶液与丝素蛋白溶液、壳聚糖溶液的体积比为4:1:1；
(5)孵育结束后，用1％的NaOH溶液中和反应液，均质化的CS/SF/LiCl(30)化合物转移到48孔板中，通过冷冻干燥得到CS/SF/LiCl(30)复合支架。
实施例6
一种CS/SF/LiCl(40)复合支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)将10g丝素蛋白加入按比例配制好的(摩尔比CaCl2：C2H5OH:H2O＝1:2:8)氯化钙三元溶解体系中，80℃水浴加热，搅拌1h溶解；将冷却后的丝素蛋白溶液倒入透析袋中(8000～14000Da)，常温下自来水透析4天，去除混合溶液中含有的小分子物质；将透析液抽滤、离心、烘干，得到浓度约4％的丝素蛋白溶液；
(2)将1.8g壳聚糖加入60mL的0.2mmol/L的乙酸溶液，搅拌3h后得到浅黄色粘稠度的壳聚糖溶液；
(3)将LiCl加入1％的醋酸溶液中，形成浓度为40mmol/L的氯化锂溶液；
(4)将丝素蛋白溶液与壳聚糖溶液按体积比1:1混合搅拌20min，然后加入至氯化锂(LiCl)溶液中搅拌孵育3h，氯化锂溶液与丝素蛋白溶液、壳聚糖溶液的体积比为4:1:1；
(5)孵育结束后，用1％的NaOH溶液中和反应液，均质化的CS/SF/LiCl(40)化合物转移到48孔板中，通过冷冻干燥得到CS/SF/LiCl(40)复合支架。
效果例
(1)实施例1～3的吸水率测试
测试方法：用天平称量支架的重量，记为Mo，将支架置于PBS(10mmol/L，pH＝7.4)溶液中，30min后快速用滤纸吸去表面的水分，称重记录样品质量为Mw。每个样品平行做三次实验，求其平均值，样品吸水率按照公式(4-1)计算：
Figure BDA0002359405180000081
其中，Mo为干支架的重量(g)；Mw为吸水后支架的重量(g)；X为支架的吸水率(％)。
实施例1～3制备的复合支架的吸水率统计图如图1所示。可以看出，实施例1制备的CS/SF(0.5:1)支架的吸水率为2013.4±112.4，实施例2制备的CS/SF(1:1)支架的吸水率为2238.9±99.3，实施例3制备的CS/SF(2:1)支架的吸水率为2178.4±60.56，表明实施1～3制备的复合支架具有良好的吸水性。
(2)实施1～3的孔隙率
测试方法：用介质饱和法测定样品的孔隙率，用天平称量支架的重量，记为W1，将支架浸泡于无水乙醇中，至样品吸附饱和后，两面附以滤纸一定压力吸收30s后，迅速称重记为W2，每个样品平行做三次实验，求其平均值，样品孔隙率按照公式计算：
Figure BDA0002359405180000082
其中，ρ为无水乙醇的密度，0.79g/cm3；V为待测支架的体积，cm3。
实施例1～3制备的复合支架的孔隙率统计图如图2所示。可以看出，实施例1制备的CS/SF(0.5:1)支架的孔隙率为84.3±2.45％，实施例2制备的CS/SF(1:1)支架的孔隙率为91.4±1.99％，实施例3制备的CS/SF(2:1)支架的孔隙率为88.4±2.13％，是具有较好功能性的支架。高孔隙率的性质有助于吸收伤口表面大量的渗出液，保持创面周围环境卫生，防止伤口恶化。对比实施例1～3制备的复合支架的吸水率和孔隙率结果，优选CS/SF(1:1)为最佳配比来与氯化锂进行结合。
(3)扫描电镜观察
实施例2制备的复合支架的扫描电镜图如图3所示。可以看出，该支架表面呈现疏松多孔的结构，有助于营养物质的分散和伤口内外空气的交换，使细胞更好地生长，促进伤口愈合。
(4)实施例4～6的机械性能
表1
水凝胶 断裂伸长率(％) 拉伸强度(MPa)
实施例4 8.3±1.37 0.874±0.0746
实施例5 9.7±1.35 1.0233±0.2131
实施例6 7.1±1.25 0.934±0.1366
实施例4～6的机械性能如表1所示。可以看出，实施例4制备的CS/SF/LiCl(20)支架的断裂伸长率为9.7±1.35，在5％～15％之间，抗拉强度为0.874±0.0746，在范围0.8～1.4MPa内。实施例5制备的CS/SF/LiCl(30)支架的断裂伸长率为8.3±1.37，在5％～15％之间，抗拉强度为1.0233±0.2131，在范围0.8～1.4MPa内。实施例6制备的CS/SF/LiCl(40)支架的断裂伸长率为7.1±1.25，在5％～15％之间，抗拉强度为0.934±0.1366，在范围0.8～1.4MPa内。
(5)实施例4～6的降解性能
采用溶菌酶降解法评价支架降解情况，所有的脚手架都称重，支架初始重量记为Wi。随后，将支架浸入含有溶菌酶(10000U mL-1)的PBS中，37℃保存。然后从含有溶菌酶的PBS中取出支架，在第7、14、21和28天用去离子水清洗三次，冻干称重记为Wt，降解率按公式计算：
降解率(％)＝(W1-Wt)/Wi×100％。
模拟体外环境研究实施例4～6制备的复合支架的生物降解，降解速率如图4所示。可以看出，实施例4制备的CS/SF/LiCl(20)支架的重量随着孵育时间的增加而逐渐减少，前两周内的降解速率比后两周的明显要快；但一个月内仍有52.2％未完全降解，说明该支架有良好的稳定性。实施例5制备的CS/SF/LiCl(30)支架的重量在一个月内随着孵育时间的增加稳定降解；但一个月内仍有48.4％未完全降解，说明该支架有良好的稳定性。实施例6制备的CS/SF/LiCl(40)支架的重量随着孵育时间的增加而逐渐减少，前两周内的降解速率比后两周的明显要快；但一个月内仍有53.4％未完全降解，说明该支架有良好的稳定性。
(6)实施例4～6的细胞存活率
无菌后的支架用无菌PBS冲洗3次，在含有5％CO2的潮湿环境中，支架在DMEM浸湿12小时，温度为37℃，然后置于密度为4000个/孔的96孔细胞培养板中，在含10％胎牛血清的DMEM中37℃培养箱中培养。培养72h后，在使用CCK8试剂进行检测并用酶标仪读数。重复三次。
采用CCK-8法定量检测实施例4～6的复合支架的细胞活力和增殖率，测试结果如图5所示。可以看出，实施例4制备的CS/SF/LiCl(20)支架的细胞存活率与对照组相比略有提高，细胞贴壁后，随着培养时间的延长发生了迁移和增殖，在培养72h后细胞增殖缓慢，细胞存活率较对照组略低，但该差异无参考意义；说明CS/SF/LiCl(20)支架具有良好的生物相容性，有利于人真皮成纤维细胞(HDF)的生长和增殖。实施例5制备的CS/SF/LiCl(30)支架的细胞存活率与对照组相比略有提高，说明CS/SF/LiCl(30)支架具有良好的生物相容性，有利于人真皮成纤维细胞(HDF)的生长和增殖。实施例6制备的CS/SF/LiCl(40)支架的细胞存活率与对照组相比在72h内都较高，说明CS/SF/LiCl(40)支架具有良好的生物相容性，有利于人真皮成纤维细胞(HDF)的生长和增殖。
综合比较机械性能、降解率和细胞存活率实验结果，实施例6制备的CS/SF/LiCl(40)支架具有最佳的性能。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种促进皮肤再生的复合支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将丝素蛋白溶于氯化钙三元溶解体系中，形成丝素蛋白溶液；所述丝素蛋白溶液的浓度为4％；
(2)将壳聚糖溶于乙酸中，形成壳聚糖溶液；所述壳聚糖溶液的浓度为2.5％～3.6％；
(3)将氯化锂溶于醋酸溶液中，形成氯化锂溶液；所述氯化锂溶液的浓度为20～40mmol/L；
(4)将丝素蛋白溶液与壳聚糖溶液混合，然后加入至氯化锂溶液中搅拌孵育；
(5)孵育结束后，中和反应液，冷冻、干燥，即得促进皮肤再生的复合支架；
所述丝素蛋白溶液、壳聚糖溶液和氯化锂溶液的体积比为1:1:4。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氯化锂溶液的浓度为30mmol/L。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体操作为：将丝素蛋白溶于氯化钙三元溶解体系，水浴加热，搅拌溶解，然后冷却；冷却后倒入透析袋中透析，将透析液抽滤、离心、烘干，即得丝素蛋白溶液。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述氯化钙三元溶解体系为氯化钙、乙醇、水按体积比1:2:8混合而得，所述水浴加热的温度为70～90℃，所述搅拌时间为0.8～1.2h，所述透析袋的截留分子量为8000～14000Da，所述透析时间为3～5天。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，混合时间为15～25min，孵育时间为2.5～3.5h。
6.一种促进皮肤再生的复合支架，其特征在于，所述复合支架是根据权利要求1～5任一项所述的制备方法制得的。
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