CN114316162A

CN114316162A - 光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN114316162A
Application number: CN202210052022.7A
Authority: CN
Inventors: 孙勇; 樊渝江; 韩笑雯
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2022-01-18
Filing date: 2022-01-18
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2042-01-18
Also published as: CN114316162B

Abstract

本发明提供了一种光交联可注射纳米纤维‑水凝胶复合物及其制备方法，所述复合物由复合水凝胶和均匀分散在该复合水凝胶中的疏水改性的透明质酸纳米纤维组成；所述复合水凝胶由碳碳双键改性且可光聚合的明胶、碳碳双键改性且可光聚合的透明质酸以及碳碳双键改性且可光聚合的多巴胺在光引发剂和光照条件下聚合形成。本发明可在不降低材料孔隙率和比表面积的基础上，改善材料的力学性和组织黏附性能，提升材料的皮肤修复性能。本发明还提供了该光交联可注射纳米纤维‑水凝胶复合物在制备皮肤修复材料领域的应用。

Description

光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于医用生物材料技术领域，涉及一种光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物及其制备方法与应用。

背景技术

常见的皮肤修复策略主要包括功能性敷料治疗、生长因子/干细胞治疗以及人工皮肤三类。功能性敷料可提供有利于伤口修复的湿润环境，还可能具有抗菌、止血以及抗炎等生物学特性，然而其加速伤口愈合的临床证据有限，目前的功能性敷料只能作为提供局部愈合环境的辅助手段。伤口愈合过程受到多种生长因子的调控，模拟生理状态下组织修复的微环境，局部释放外源性生长因子促进伤口再生是一种有效的修复手段。然而，由于组织修复的复杂性，单一或少数几种生长因子的局部释放难以达到良好的疗效。近年来，虽然有各种基于生长因子控释的“生物活性”治疗策略被开发出来，但是，大多都还停留在动物实验阶段，其临床效果仍然有待验证。干细胞治疗面临着与生长因子治疗相似的困境，虽然各种载体已被设计出来用于负载干细胞，但仍然存在着干细胞干性和存活率不足的问题。人工皮肤虽然具有良好的临床修复效果，也有一些产品获得了FDA批准上市，但人工皮肤大多由胶原蛋白或脱细胞基质负载细胞组成，存在免疫原性和周期长的问题。

近年来，具有“仿生”皮肤细胞外基质(ECM-mimicking)的材料受到了广泛关注。这类仿生材料通过模拟生理的3D微环境支持细胞功能，可在不负载细胞和不外加活性物质的条件下实现组织修复。其中，水凝胶和静电纺丝纳米纤维膜在仿细胞外基质材料领域具有其他材料不可比拟的优势。

水凝胶因具有与皮肤组织相似的三维性质和亲水性，是十分受欢迎的组织再生材料。通过控制交联程度，可加强化学交联水凝胶的力学强度，因此它们可保持其独特的体积和形状以应对来自周围组织的物理压力，为细胞生长和营养输送提供三维空间。然而，这些弹性结构性能的实现是以提高交联密度和减小水凝胶网络的孔径为代价的，导致材料的细胞浸润性有限，进而会对修复效果造成不利影响。静电纺丝纤维膜具有与ECM类似的纤维网络结构，其高比表面积、高孔隙率和高通透性有利于细胞的生长和浸润。然而，这些网状基质不能注射，也不能提供皮肤修复所必须的体积及力学特性。因此，解决这两类仿细胞外基质材料在皮肤修复领域应用时存在的问题，开发具有高孔隙率、高比表面积，力学性能和组织黏附性能优异，可促进凝血和血管生成的皮肤修复材料在本领域仍然是一项挑战。

发明内容

针对现有用于皮肤修复的水凝胶难以兼顾力学性能和细胞浸润性，而现有的静电纺丝纤维膜虽然有利于细胞的生长和浸润但不能注射、不具备皮肤修复所需力学性能的不足，本发明提供了光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物及其制备方法，以及该复合物在皮肤修复领域的应用，以在不降低材料孔隙率和比表面积的基础上，改善材料的力学性和组织黏附性能，提升材料的皮肤修复性能。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物，该复合物由复合水凝胶和均匀分散在该复合水凝胶中的疏水改性的透明质酸纳米纤维组成；所述复合水凝胶由碳碳双键改性且可光聚合的明胶、碳碳双键改性且可光聚合的透明质酸以及碳碳双键改性且可光聚合的多巴胺在光引发剂和光照条件下聚合形成；疏水改性的透明质酸纳米纤维与复合水凝胶中高分子网络的质量比为(0.04～1):1。

上述光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物的技术方案中，碳碳双键改性且可光聚合的明胶中，碳碳双键接枝率优选为30％～100％，进一步优选为50％～80％；碳碳双键改性且可光聚合的透明质酸中，碳碳双键的接枝率优选为30％～100％，进一步优选为50％～80％。进一步地，所述碳碳双键改性且可光聚合的明胶、碳碳双键改性且可光聚合的透明质酸以及碳碳双键改性且可光聚合的多巴胺中，含碳碳双键且可光聚合的基团通常可以是丙烯酰基、丙烯基、乙烯基硫醚基以及顺丁烯二酸基等。更进一步地，所述碳碳双键改性且可光聚合的明胶优选为甲基丙烯酰化明胶，碳碳双键改性且可光聚合的透明质酸优选为甲基丙烯酰化透明质酸，碳碳双键改性且可光聚合的多巴胺优选为甲基丙烯酰化多巴胺。

上述光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物的技术方案中，疏水改性的透明质酸纳米纤维由疏水改性的透明质酸制备而成，疏水改性的透明质酸中疏水基团的接枝率为70％～90％，疏水改性的透明质酸纳米纤维的直径为100～500nm、长度为100～3000μm。更进一步地，疏水改性的透明质酸纳米纤维优选为透明质酸-苄酯纳米纤维。

上述光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物的技术方案中，所述复合水凝胶由碳碳双键改性且可光聚合的明胶、碳碳双键改性且可光聚合的透明质酸以及碳碳双键改性且可光聚合的多巴胺按照(5～15):(0.5～2):(0.2～1)的质量比聚合形成。在聚合反应过程中，碳碳双键改性且可光聚合的明胶、碳碳双键改性且可光聚合的透明质酸以及碳碳双键改性且可光聚合的多巴胺的碳碳双键的基团进行聚合反应，纳米纤维不参与复合水凝胶的聚合反应过程，纳米短纤维与复合水凝胶之间具有氢键相互作用。

上述光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物的技术方案中，疏水改性的透明质酸纳米纤维与复合水凝胶中高分子网络的质量比优选为(0.04～0.5):1。

上述光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物的技术方案中，一种可行的透明质酸-苄酯纳米纤维的制备方法为：

(1)将透明质酸钠溶解于去离子水中，加入Dowex树脂后，加入四丁基氢氧化铵，冷冻干燥得到四丁基铵透明质酸；将四丁基铵透明质酸溶于二甲基亚砜，加入苄溴，在20～30℃反应10～14h后，在乙酸乙酯中析出产物，真空干燥，即得透明质酸-苄酯；

透明质酸钠、四丁基氢氧化铵与苄溴的摩尔比根据苄酯的接枝率进行确定，透明质酸钠与四丁基氢氧化铵摩尔比应大于1:1.25，四丁基铵透明质酸与苄溴摩尔比应大于1:1.5；

(2)将透明质酸-苄酯溶于合适的有机试剂中得到纺丝液，静电纺丝得到透明质酸-苄酯纳米纤维膜，真空干燥；

(3)将干燥后的透明质酸-苄酯纳米纤维膜置于水中，搅拌分散3～10min，干燥得到透明质酸-苄酯纳米纤维。

上述光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物的技术方案中，所述甲基丙烯酰化明胶、甲基丙烯酰化透明质酸以及甲基丙烯酰化多巴胺，可购买市售商品，也可以按照现有技术自行合成。例如：

一种可行的甲基丙烯酰化明胶的制备方法：将明胶溶于碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液中，加入甲基丙烯酸酐在40～50℃充分反应，透析、冷冻干燥即得；明胶、甲基丙烯酸酐的摩尔比按照对甲基丙烯酸的接枝率要求进行确定。

一种可行的甲基丙烯酰化透明质酸的制备方法：将透明质酸钠溶于去离子水中，在冰浴条件下向透明质酸钠水溶液中滴加甲基丙烯酸酐，控制反应体系的pH值弱碱性，充分反应，透析、冷冻干燥即得；透明质酸钠、甲基丙烯酸酐的摩尔比按照对甲基丙烯酸的接枝率要求进行确定。

一种可行的甲基丙烯酰化多巴胺的制备方法：将盐酸多巴胺溶于硼砂-碳酸氢钠缓冲溶液，将甲基丙烯酸酐溶于四氢呋喃溶液，在氮气保护下，向多巴胺溶液中滴加甲基丙烯酸酐溶液，控制反应体系的pH值弱碱性，充分反应，调节反应体系的pH值为弱酸性，用合适有机溶剂萃取后重结晶即得。

上述技术方案中，所采用的透明质酸钠的分子量优选为340～8000KDa，所采用的明胶优选为B型明胶。

本发明还提供了上述光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物的制备方法，该方法包括以下步骤：

在避光条件下将碳碳双键改性且可光聚合的明胶、碳碳双键改性且可光聚合的透明质酸、碳碳双键改性且可光聚合的多巴胺和光引发剂溶于去离子水中得到原料混合液，然后在避光条件下将疏水改性的透明质酸纳米纤维充分分散在原料混合液中，得到凝胶前驱液，在可见光照射下，引发碳碳双键改性且可光聚合的明胶、碳碳双键改性且可光聚合的透明质酸以及碳碳双键改性且可光聚合的多巴胺发生交联反应，得到纳米纤维-水凝胶复合物。

上述制备方法的技术方案中，所述凝胶前驱液中，光引发剂的用量优选为碳碳双键改性且可光聚合的明胶质量的1％～5％。

上述制备方法的技术方案中，凝胶前驱液中疏水改性的透明质酸纳米纤维与碳碳双键改性且可光聚合的明胶的质量比优选为(0.05～0.5):1。

上述制备方法的技术方案中，所采用的光引发剂为本领域的常用光引发剂，例如可以是苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐等，通过可见光引发聚合反应时，所采用的可见光的波长与应与所采用的光引发剂的种类相匹配。

本发明通过实验证实：(1)本发明提供的光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物具有优异的力学性能，其拉伸模量与人类真皮层的拉伸模量相匹配，具有优异的力学性，可避免拉伸模量较低容易引起在术后的活动中导致凝胶断裂等情况发生，有利于伤口修复；(2)相比于不含纳米纤维的纯水凝胶，本发明提供的光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物的溶胀性能更好，有利于提高复合物吸收渗液的能力；(3)本发明提供的光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物具有优异的凝血性能和血细胞及血小板黏附能力；(4)本发明提供的光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物具有良好的细胞相容性和促进成血管的性能。

本发明还通过动物皮肤修复实验证实，该光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物可促进皮肤创面愈合，具有良好的促进伤口愈合的能力。

基于以上实验结果，本发明提供了所述光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物在制备皮肤修复材料领域的应用，具体可作为促进皮肤修复的伤口敷料或/和组织替代物来应用。具体应用时，先配制凝胶前驱液，然后将凝胶前驱液注射至需要修复或填充的部位，再施加光照引发聚合反应使凝胶前驱液转变为凝胶状态即可。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案产生了以下有益的技术效果：

1.本发明提供了光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物，该复合物由复合水凝胶和均匀分散在该复合水凝胶中的疏水改性的透明质酸纳米纤维组成，所述复合水凝胶由碳碳双键改性且可光聚合的明胶、碳碳双键改性且可光聚合的透明质酸以及碳碳双键改性且可光聚合的多巴胺在光引发剂和光照条件下聚合形成。本发明通过在复合水凝胶中分散纳米纤维，能够在不牺牲复合水凝胶孔径和孔隙率的条件下，增强复合水凝胶的力学性能，使其力学性能与皮肤组织的力学性能相匹配。在复合水凝胶微孔网络中引入纳米纤维，能更好地模拟ECM结构。同时，该复合物通过光引发聚合，在应用时可先将凝胶前驱液注射至待修复部位，然后通过光引发聚合即可转变成凝胶状态。本发明可以解决现有用于皮肤修复的水凝胶难以兼顾力学性能和细胞浸润性的问题，还可以克服现有的静电纺丝纤维膜虽然有利于细胞的生长和浸润但不能注射、也不具备皮肤修复所要求的力学性能的不足。

2.本发明提供的光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物中的凝胶基体由明胶基生物材料、透明质酸基生物材料以及多巴胺基生物材料在光引发剂和光照条件下聚合形成。明胶和透明质酸基生物材料具有良好的生物相容性，不具有免疫原性，二者在伤口修复的不同阶段相互配合，可有效促进伤口愈合。在凝血和免疫期，二者可促进伤口凝血，召募中性粒细胞；在增殖期，二者可促进成纤维细胞、角质形成细胞等的黏附和迁移；在重塑期，二者可促进胶原纤维沉积和ECM重建。而多巴胺基生物材料的引入可增加材料与创面的匹配和整合度，进而降低微生物入侵伤口和感染的可能性，具体地，其具有组织粘附性，它的邻苯二酚基团能够参与形成多种非共价键，且易被氧化成醌与组织中的氨基发生Schiff碱反应，其还能增强血细胞/血小板粘附和活化，提高血凝能力，其还原性基团可通过平衡伤口微环境的氧化/还原来促进伤口愈合过程。本发明通过合理匹配三者在复合凝胶中的比例关系并引入适量的纳米纤维，使所得复合物不仅能更好地模拟细胞外基质，还能促进细胞浸润和生长，同时为组织修复提供足够地力学支撑。

3.本发明提供的光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物的拉伸模量与人类真皮层的拉伸模量相匹配，其溶胀性能、凝血性能，血细胞和血小板黏附性能、以及细胞相容性良好，这些因素可避免拉伸模量较低容易引起在术后的活动中导致凝胶断裂等情况发生，还有利于提高材料吸收渗液和止血能力，有利于伤口修复。本发明通过体外细胞实验证实本发明提供的材料具有优异的促进成血管的性能。本发明还通过动物皮肤修复实验证实，本发明提供的材料可有效促进皮肤创面愈合，具有良好的促进伤口愈合的能力。

4.本发明还提供了上述光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物的制备方法，该方法的工艺简单，可控性好，原料成本低廉，有利于推广应用。

5.本发明还提供了光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物在制备皮肤修复材料领域的应用，具体可作为促进皮肤修复的伤口敷料或/和组织替代物来应用。由于本发明对明胶、透明质酸和多巴胺进行了功能化改性，使得它们能在可见光引发下快速原位成胶。基于这一特性，使得本发明的材料在应用时十分便利，在具体应用时，先配制凝胶前驱液，然后将凝胶前驱液注射至需要修复或填充的部位，再施加光照引发聚合反应使凝胶前驱液转变为凝胶状态即可。可用于填充任意形状的组织缺损，也适用于用于不规则创口的修复，在在皮肤组织修复和填充领域具有重要的应用价值。

附图说明

图1是实施例1制备的HA-Bn的核磁共振氢谱。

图2是实施例2制备的GelMA、HAMA和Dopa-MA的核磁共振氢谱。

图3是对比对比例1制备的水凝胶I、实施例3制备的复合物III和复合物IV的SEM图。

图4是水凝胶I、水凝胶II、复合物III和复合物IV的力学性能测试结果。

图5是水凝胶I、复合物III和复合物IV的溶胀比随时间的变化曲线。

图6是水凝胶I、医用明胶止血海绵、将复合物III和复合物IV的凝血系数测试结果。

图7是水凝胶I、医用明胶止血海绵、将复合物III和复合物IV表面血细胞和血小板黏附后在不同放大倍数下的SEM图。

图8是水凝胶I、复合物III和复合物IV的细胞相容性测试结果。

图9是空白对照组、水凝胶I组和复合物IV组在培养后的显微镜图片和激光共聚焦图片。

图10是空白对照组、水凝胶I组和复合物IV组在培养后的成管数和成管总长度的统计结果。

图11是空白对照组、水凝胶I组和复合物IV组经过不同时间的修复后创面处的照片以及创面面积统计结果。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明提供的光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物及其制备方法与应用作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例中，制备透明质酸-苄酯(HA-Bn)纳米纤维，步骤如下：

(1)将分子量为1000kDa的透明质酸钠溶于去离子水中，形成浓度为10mg/mL的透明质酸钠溶液，向该溶液中加入Dowex树脂反应4h至pH值稳定，离心去除Dowex树脂，然后向所得液相中加入四丁基氢氧化铵至pH值稳定不变后，将所得反应液冷冻干燥，得到四丁基铵透明质酸，记作HA-TBA。

该步骤中，Dowex树脂的加入量为透明质酸钠质量的3倍，四丁基氢氧化铵的加入量为透明质酸钠质量的2.2倍。

(2)将HA-TBA溶于无水二甲基亚砜(DMSO)中，形成浓度为10mg/mL的HA-TBA溶液，向该溶液中加入苄溴，在30℃反应12h，将所得反应液缓慢滴加至大量乙酸乙酯中，收集沉淀并用乙酸乙酯洗三次，真空干燥，得到HA-Bn。

该步骤中，苄溴的加入量为HA-TBA质量的0.55倍。

(3)将HA-Bn溶于六氟异丙醇中，得到浓度为100mg/mL的溶液，以该溶液作为纺丝液，在接收距离为10cm、流速为2mL/h、电压为21kV的纺丝条件下静电纺丝，得到HA-Bn纳米纤维膜，真空干燥24h。

(4)将干燥后的HA-Bn纳米纤维膜置于水中，用搅拌分散机在10k rpm的转速下分散5min，干燥去除水分后得到HA-Bn纳米纤维，记作A1。

图1是本实施例制备的HA-Bn的核磁共振氢谱，经过测试发现，HA-Bn中，苄酯的接枝率为77％。本实施例制备的HA-Bn纳米纤维的长度约为200μm，直径约为200nm，通过调整静电纺丝的参数，可以调整HA-Bn纳米纤维的直径在100～500nm之间。

实施例2

本实施例中，分别制备甲基丙烯酰化明胶(GelMA)、甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)、和甲基丙烯酰化多巴胺(Dopa-MA)，步骤如下：

(1)称取100g明胶溶于1.5L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，向所得溶液中滴加40mL甲基丙烯酸酐，在50℃反应4h，将所得反应液透析后冷冻干燥，得到GelMA。

(2)称取25g分子量为1000kDa的透明质酸钠溶于1L去离子水中，将所得溶液置于冰浴上，用1mol/L的NaOH溶液调节溶液的pH值大于8.5，向其中缓慢滴加56.25mL甲基丙烯酸酐，在滴加过程中用1mol/L的NaOH溶液维持反应体系的pH值大于8.5，反应4h后去掉冰浴，继续反应12h，将所得反应液透析后冷冻干燥，得到HAMA。

(3)称取10g盐酸多巴胺溶于200mL四硼酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，同时取9.4mL甲基丙烯酸酐溶于50mL四氢呋喃中。将多巴胺溶液置于氮气保护下，向其中缓慢滴加甲基丙烯酸酐溶液，在滴加过程中用1mol/L的NaOH溶液调节反应体系的pH值大于8，反应12h后，用3mol/L的HCl溶液调节pH值至小于2以终止反应。将所得反应液用乙酸乙酯萃取三次后，用正己烷重结晶，真空干燥，得到Dopa-MA。

图2的(A)(B)(C)图分别是本实施例制备的GelMA、HAMA和Dopa-MA的核磁共振氢谱，经过测试发现，GelMA中碳碳双键的接枝率为60％，HAMA中碳碳双键的接枝率为70％。

对比例1

本对比例中，制备不含HA-Bn纳米纤维的空白水凝胶。

(1)在避光条件下将GelMA、HAMA、Dopa-MA和光引发剂苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP)溶于去离子水中得到凝胶前驱液I，在405nm的激发光下照射1min，引发GelMA、HAMA以及Dopa-MA发生交联反应，得到空白水凝胶，记作水凝胶I。

GelMA、HAMA、Dopa-MA与LAP的质量比为10:1:0.5:0.5，凝胶前驱液I中GelMA的浓度为0.01g/mL。

(2)在避光条件下将GelMA、HAMA、Dopa-MA和光引发剂LAP溶于去离子水中得到凝胶前驱液II，在405nm的激发光下照射1min，引发GelMA、HAMA以及Dopa-MA发生交联反应，得到空白水凝胶，记作水凝胶II。

GelMA、HAMA、Dopa-MA与LAP的质量比为15:1:0.5:0.5，凝胶前驱液II中GelMA的浓度为0.015g/mL。

实施例3

本实施例中，制备光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物。

(1)在避光条件下将GelMA、HAMA、Dopa-MA和光引发剂LAP溶于去离子水中得到原料混合液，然后在避光条件下将HA-Bn纳米纤维在超声作用下充分分散在原料混合液中，得到凝胶前驱液III，在405nm的激发光下照射1min，引发GelMA、HAMA以及Dopa-MA发生交联反应，得到纳米纤维-水凝胶复合物，记作复合物III。

GelMA、HAMA、Dopa-MA、LAP与HA-Bn纳米纤维的质量比为10:1:0.5:0.5:1，凝胶前驱液III中GelMA的浓度为0.01g/mL。

(2)在避光条件下将GelMA、HAMA、Dopa-MA和光引发剂LAP溶于去离子水中得到原料混合液，然后在避光条件下将HA-Bn纳米纤维在超声作用下充分分散在原料混合液中，得到凝胶前驱液IV，在405nm的激发光下照射1min，引发GelMA、HAMA以及Dopa-MA发生交联反应，得到纳米纤维-水凝胶复合物，记作复合物IV。

GelMA、HAMA、Dopa-MA、LAP与HA-Bn纳米纤维的质量比为10:1:0.5:0.5:2，凝胶前驱液IV中GelMA的浓度为0.01g/mL。

实施例4

本实施例中，通过扫描电镜(SEM)对比对比例1制备的水凝胶I和实施例3制备的复合物III和复合物IV的微观形貌。

对比例1制备的水凝胶I和实施例3制备的复合物III和复合物IV冷冻干燥，然后喷金，在SEM下观察微观形貌，结果如图3所示。图3的(A)图是对比例1制备的水凝胶I在冷冻干燥后的SEM图，其平均孔径为73.7μm，(B)图是实施例3制备的复合物III在冷冻干燥后的SEM图，其平均孔径为70.1μm，(C)(D)两图是实施例3制备的复合物IV在冷冻干燥后在不同放大倍数下的SEM图，其平均孔径为72.3μm。说明在水凝胶中引入纳米纤维后，材料的孔隙并未发生减小，且随着纳米纤维含量的增加，复合物微观结构呈现出越来越明显的类似ECM的纤维结构。

实施例5

本实施例中，测试对比例1和实施例3制备的水凝胶I、水凝胶II、复合物III和复合物IV的力学性能。

分别将凝胶前驱液I、凝胶前驱液II、凝胶前驱液III和凝胶前驱液IV加入哑铃形模具中，在405nm的激发光下照射1min，制成哑铃形的凝胶样品用于测试。分别将制备的各哑铃形的凝胶样品置于动态热机械分析机(DMA)下测量各样品的拉伸模量和形变量，结果如图4所示，由图4可知，在加入HA-Bn纳米纤维后形成的复合物III和复合物IV的拉伸模量得到了有效的提升，即由7.45kPa分别提高到了11.33kPa和18.35kPa，该拉伸模量与人类真皮层的拉伸模量相匹配，这有利于避免拉伸模量较低容易引起在术后的活动中导致凝胶断裂等情况发生，更有利于伤口修复。同时，水凝胶II的拉伸模量超过35kPa，且其断裂拉伸率不到50％。

实施例6

本实施例中，测试对比例1和实施例3制备的水凝胶I、复合物III和复合物IV的溶胀性能。

分别取水凝胶I、复合物III和复合物IV，称重，然后浸没于去离子水中，置于室温吸水溶胀36h，每隔一段时间取出称重，计算溶胀比，结果如图5所示。

由图5可知，在去离子水中浸泡24h后，各样品均达到了溶胀平衡，溶胀比最大的是复合物IV，约为2.5，溶胀比最小的是水凝胶I，约为2.0。该实验结果表明在空白水凝胶的基础上引入HA-Bn纳米纤维，可提高溶胀性能，具有更好的吸收渗液的能力。

实施例7

本实施例中，测试实施例3制备的复合物III和复合物IV的体外凝血性能和血细胞黏附能力，以对比例1制备的水凝胶I以及医用明胶止血海绵作为对照。

(1)将复合物III、复合物IV、水凝胶I以及医用明胶止血海绵分别制成直径8mm、高2mm的圆柱体样品。

(2)将20μL的再钙化全血溶液分别滴加在事先于37℃预热过的各圆柱体样品上，在37℃孵育1分钟，用5mL的去离子水轻轻冲洗样品表面未凝结的血液并收集在EP管中。随后在540nm处测定所收集的液体的吸光度值，计算凝血系数BCI值，结果如图6所示。

BCI(％)＝1-(Is-I₀)/(Ir-I₀)×100％

其中，Is表示样品的吸光度值，I₀表示去离子水的吸光度值，Ir表示20μL全血和5mL去离子水的吸光度值。

由图6可知，水凝胶I的凝血系数略低于医用明胶止血海绵的凝血系数，当在水凝胶I的基础上引入HA-Bn纳米纤维之后，形成的复合物III和复合物IV的凝血系数都显著高于医用明胶止血海绵的凝血系数，止血效果得到了有效的提升。

(3)将20μL富血小板血浆(PRP)滴在各圆柱体样品表面，在37℃孵育1h，冲洗掉未凝血液，用2.5％戊二醛固定后临界点干燥，然后在SEM下观察血细胞和血小板黏附情况。

图7是各样品表面血细胞和血小板黏附后在不同放大倍数下的SEM图，其中的(A1)(A2)两图代表医用明胶止血海绵，(B1)(B2)两图代表水凝胶I，(C1)(C2)两图代表复合物III，(D1)(D2)两图代表复合物IV。由图7可知，相较于医用明胶止血海绵，水凝胶I、复合物III和复合物IV的表面能黏附更多的血细胞和血小板，且血小板伸展出带刺的伪足，表明血小板处于激活状态。而相对于水凝胶I，复合物III和复合物IV对血细胞和血小板的粘附能力更强。

实施例8

本实施例中，测试对比例1和实施例3制备的水凝胶I、复合物III和复合物IV的细胞相容性。

(1)将水凝胶I、复合物III以及复合物IV分别制成直径8mm、高2mm的圆柱体样品并灭菌。

(2)在灭菌后的各圆柱体样品的表面接种1×10⁵个NIH-3T3细胞，添加完全培养基，在在37℃、5％的CO₂条件下培养3天，然后用CCK-8试剂在37℃孵育2h，在405nm处测定吸光度值。所述完全培养基为添加10％胎牛血清(Gibco)和1％青霉素和链霉素(Hyclone)的DMEM培养基(Gibco)。测试结果如图8所示。

由图8可知，复合物III、复合物IV、水凝胶I均未表现出细胞毒性，且相对于水凝胶I组，复合物III组和复合物IV组的细胞增殖还得到了提高。

实施例9

本实施例中，通过体外成小管实验考察对比例1和实施例3制备的水凝胶I和复合物IV的促进成血管性能。

(1)将水凝胶I和复合物IV分别制成直径8mm、高2mm的圆柱体样品并灭菌。

(2)将灭菌后的各圆柱体样品置于24孔板transwell小室内，在24孔板底部加入250μL的Matrigel凝胶，然后在其上以50000个/孔密度接种HUVEC细胞。培养24h，在显微镜下观察成管结果并用多聚甲醛固定后，用鬼笔环太-DAPI对细胞骨架进行染色处理后在激光共聚焦下观察细胞形态。以不添加上述水凝胶样品的情况作为空白对照组。

图9是空白对照组、水凝胶I组和复合物IV组在培养后的显微镜图片和激光共聚焦图片，其中的(A1)(A2)两图分别代表空白对照组、(B1)(B2)两图分别代表水凝胶I组、(C1)(C2)两图分别代表复合物IV组，(A1)～(C1)图是显微镜图片，(A2)～(C2)图是激光共聚焦图片。图10是空白对照组、水凝胶I组和复合物IV组在培养后的成管数和成管总长度的统计结果。由图9～10可知，相比于空白对照组，水凝胶I组和复合物IV组的细胞均表现出良好的成管现象，且复合物IV组的成管总长度和管数都明显更高，说明复合物IV具有良好的促血管生成能力。

实施例10

本实施例中，通过小鼠背部全层伤口夹板模型试验考察对比例1和实施例3制备的水凝胶I和复合物IV的皮肤修复能力。

(1)将小鼠背部脱毛、麻醉后，用直径5mm的皮肤活检打孔器在背部制造全层伤口。

(2)将自制的环形硅胶板用速干胶粘在伤口周围，然后分别将凝胶前驱液I和混合了HA-Bn纳米纤维的凝胶前驱液IV注射到伤口处，在405nm的可见光下照射1min后成胶。用3M透明敷贴和自粘弹性绷带完全覆盖伤口和材料。空白对照组的伤口仅用3M透明敷贴和绷带覆盖。观察各组的皮肤修复情况，统计伤口创面面积。

图11是各组经过不同时间的修复后创面处的照片以及创面面积统计结果，由图11可以看出，水凝胶I组和复合物IV组的创面面积均随着表皮的形成而逐渐减小，而复合物IV组相较空白对照组和水凝胶I组的创面愈合速度明显更快。统计各组的伤口创面面积和伤口闭合面积可知：在治疗7天后，复合物IV组的创面面积仅剩44％，明显小于空白对照组的66％和水凝胶I组的60％；在治疗21天后，复合物IV组的创面基本愈合，平均创面面积约为4％，明显低于空白对照组和水凝胶I组的创面面积。以上结果说明复合物IV具有良好的促进伤口愈合的能力。

实施例11

本实施例中，制备光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物。

(1)参照实施例2的方法制备碳碳双键接枝率为80％的GelMA，碳碳双键接枝率为50％HAMA，以及Dopa-MA。

(2)参照实施例1的方法制备苄酯的接枝率约为89％，长度约为1000μm，直径约为300nm的HA-Bn纳米纤维。

(3)在避光条件下将步骤(1)制备的GelMA、HAMA、Dopa-MA和光引发剂LAP溶于去离子水中得到原料混合液，然后在避光条件下将步骤(2)制备的HA-Bn纳米纤维在超声作用下充分分散在原料混合液中，得到凝胶前驱液，在405nm的激发光下照射1min，引发GelMA、HAMA以及Dopa-MA发生交联反应，得到纳米纤维-水凝胶复合物。

GelMA、HAMA、Dopa-MA、LAP与HA-Bn纳米纤维的质量比为10:1:0.5:0.1:0.5，凝胶前驱液中GelMA的浓度为0.01g/mL。

实施例12

本实施例中，制备光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物。

(1)参照实施例2的方法制备碳碳双键接枝率为50％的GelMA，碳碳双键接枝率为80％HAMA，以及Dopa-MA。

(2)参照实施例1的方法制备苄酯的接枝率约为71％，长度约为600μm，直径约为100nm的HA-Bn纳米纤维。

GelMA、HAMA、Dopa-MA、LAP与HA-Bn纳米纤维的质量比为10:1:0.5:0.1:5，凝胶前驱液中GelMA的浓度为0.01g/mL。

Claims

1.一种光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物，其特征在于，该复合物由复合水凝胶和均匀分散在该复合水凝胶中的疏水改性的透明质酸纳米纤维组成；所述复合水凝胶由碳碳双键改性且可光聚合的明胶、碳碳双键改性且可光聚合的透明质酸以及碳碳双键改性且可光聚合的多巴胺在光引发剂和光照条件下聚合形成；疏水改性的透明质酸纳米纤维与复合水凝胶中高分子网络的质量比为(0.04～1):1。

2.根据权利要求1所述光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物，其特征在于，碳碳双键改性且可光聚合的明胶中，碳碳双键的接枝率为30％～100％；碳碳双键改性且可光聚合的透明质酸中，碳碳双键的接枝率为30％～100％。

3.根据权利要求2所述光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物，其特征在于，碳碳双键改性且可光聚合的明胶为甲基丙烯酰化明胶，碳碳双键改性且可光聚合的透明质酸为甲基丙烯酰化透明质酸，碳碳双键改性且可光聚合的多巴胺为甲基丙烯酰化多巴胺。

4.根据权利要求1所述光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物，其特征在于，疏水改性的透明质酸中疏水基团的接枝率为70％～90％，疏水改性的透明质酸纳米纤维的直径为100～500nm、长度为100～3000μm。

5.根据权利要求4所述光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物，其特征在于，疏水改性的透明质酸纳米纤维为透明质酸-苄酯纳米纤维。

6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物，其特征在于，所述复合水凝胶由碳碳双键改性且可光聚合的明胶、碳碳双键改性且可光聚合的透明质酸以及碳碳双键改性且可光聚合的多巴胺按照(5～15):(0.5～2):(0.2～1)的质量比聚合形成。

7.权利要求1至6中任一权利要求所述光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物的制备方法，其特征在于，凝胶前驱液中，光引发剂的用量为碳碳双键改性且可光聚合的明胶质量的1％～5％。

9.根据权利要求7或8所述光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物的制备方法，其特征在于，凝胶前驱液中疏水改性的透明质酸纳米纤维与碳碳双键改性且可光聚合的明胶的质量比为(0.05～0.5):1。

10.权利要求1至6中任一权利要求所述光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物在制备皮肤修复材料领域的应用。