CN112111162A - 可快速固化的双网络水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可快速固化的双网络水凝胶及其制备方法与应用。所述制备方法包括：将四臂聚乙二醇羧酸与四嗪盐酸盐混合反应，获得四臂聚乙二醇‑嗪聚合物；将四臂聚乙二醇胺与反式环辛烯‑聚乙二醇羧酸混合反应，获得四臂聚乙二醇‑环辛烯聚合物；以及，使包含丝素蛋白、四臂聚乙二醇‑嗪聚合物和四臂聚乙二醇‑环辛烯聚合物的均匀混合体系进行生物正交反应，形成第一重水凝胶网络，之后通过诱导丝素蛋白形成β折叠获得可快速固化的双网络水凝胶。本发明制备的双网络水凝胶固化时间短、内部孔隙分布均匀、机械性能显著增强、生物相容性好，能够为干细胞的存活和增殖提供良好的三维支撑生存环境，可广泛应用于细胞培养或组织工程等领域。

Description

可快速固化的双网络水凝胶及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种双网络水凝胶，具体涉及一种三维的干细胞的培养，并促使所述干细胞进行增殖和分化的、可快速固化的双网络水凝胶及其制备方法与应用，属于组织工程材料制备技术领域。
背景技术
因疾病、遗传和衰老等造成的组织、器官缺损和功能障碍是人类健康所面临的主要危害之一，也是人类疾病和死亡最主要的缘由。为了从根本上解决组织、器官缺损和功能障碍这一问题，人们提出了组织工程这一概念，它是指运用工程学和生命科学的原理和方法，研究正常和病理条件下组织结构与功能的关系，开发生物替代品，修复、维持和改善组织功能。随着近几十年的发展，组织工程技术超越了传统的“拆东墙补西墙”疗法，使组织损伤的修复步入“重建、再生、替代”组织器官的新时代，成为了继药物治疗和手术治疗之后的第三种有效治疗途径。
组织工程主要方法是将功能相关的活细胞接种于细胞外基质替代物上，这种替代物能为细胞提供一个空间结构，细胞能够在上面生长，通过体外培养一定时间后形成细胞与替代物的复合物，然后将得到的复合物移植到体内受损组织处，修复受损组织。近年来，组织工程的研究内容主要集中在开发研究生物材料、生长因子、种子细胞培养及细胞与支架材料的复合及塑形等方面。
目前组织工程中细胞接种的常用方法包括：细胞接种于支架材料上和细胞与材料共混成水凝胶支架，其中细胞与材料共混能更好的控制细胞的分布，而且在细胞粘附、增殖、迁移与立体结构方面有诸多优势；此外通过控制共混水凝胶支架的形状可以提高组织修复的精确度和准确度。但为了确保细胞的活性通常需要寻找具有较高生物相容性的材料。
干细胞具有高增殖率、多分化潜能以及低免疫原性等特性，是最理想的组织工程用种子细胞。组织工程常用的包埋细胞的水凝胶材料包括明胶、胶原、透明质酸、壳聚糖、海藻酸盐、聚乳酸、聚乙二醇、聚己内酯等。高分子化合物具有较多的活性官能团，可以对其进行化学修饰，从而用不同的方法形成水凝胶，另外，通过调节水凝胶支架的性质，例如在水凝胶支架中掺杂细胞外基质，可能会增加细胞的黏附和趋化宿主细胞的迁移，同时也可能会增加种子细胞的分化能力。但多数人工合成高分子材料生物相容性低，降解不彻底，而天然的高分子材料降解速率较快，机械性能较差；因此，寻找生物相容性好以及可降解的材料作为三维培养细胞的支架尤为重要。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种可快速固化的双网络水凝胶及其制备方法，以克服现有技术中的不足。
本发明的另一个目的在于提供所述可快速固化的双网络水凝胶的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明实施例提供了一种可快速固化的双网络水凝胶的制备方法，其包括：
(1)提供丝素蛋白；
(2)将四臂聚乙二醇羧酸与四嗪盐酸盐混合反应，获得四臂聚乙二醇-嗪聚合物；
(3)将四臂聚乙二醇胺与反式环辛烯-聚乙二醇羧酸混合反应，获得四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物；
(4)使包含丝素蛋白、四臂聚乙二醇-嗪聚合物和四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物的均匀混合体系进行生物正交反应，形成第一重水凝胶网络，之后通过诱导丝素蛋白形成β折叠获得可快速固化的双网络水凝胶。
本发明实施例还提供了由前述方法制备的可快速固化的双网络水凝胶，所述双网络水凝胶的机械强度为20～80KPa，并具有多孔结构，其中所含孔洞的孔径为100～200μm。
本发明实施例还提供了前述的可快速固化的双网络水凝胶于细胞培养或组织工程领域中的用途。
本发明实施例还提供了一种三维细胞培养载体，其包含前述的可快速固化的双网络水凝胶。
本发明实施例还提供了一种细胞培养方法，其包括：
以前述的可快速固化的双网络水凝胶作为三维细胞培养载体进行细胞的培养，并促使所述细胞进行增殖和分化。
较之现有技术，本发明的有益效果在于：
1)本发明提供的基于丝素蛋白和功能化聚乙二醇体系构建可快速固化的双网络水凝胶的方法，将其应用于细胞的增殖与血管分化研究，实现了与细胞共混凝胶化。首先，将生物正交反应官能团四嗪和反式环辛烯分别修饰到四臂聚乙二醇上，获得四臂聚乙二醇-嗪聚合物和四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物，构建第一重快速交联网络；与此同时，从蚕茧中提取丝素蛋白，利用超声诱导β折叠形成构建第二重缓慢交联网络；将二者混合后在生物正交反应和超声诱导下制备得到丝素蛋白/聚乙二醇双网络水凝胶；
2)本发明提供的可快速固化的双网络水凝胶，结合了物理超声和生物正交点击化学反应两种作用方式，其优点在于生物正交反应快速进行的特性使得水凝胶体系迅速固化；然后，随着时间的延长，β折叠逐渐形成以提高凝胶的机械性能，同时制备方法简单，可大量制备；
3)本发明的可快速固化的双网络水凝胶，将常用的人工合成材料聚乙二醇进行功能化修饰，获得四臂聚乙二醇-嗪聚合物和四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物，将天然蚕茧来源的丝素蛋白进行超声，然后作为溶剂分别溶解四臂聚乙二醇-嗪聚合物和四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物，得到两种前体溶液，之后与细胞共混，将丝素蛋白与四臂聚乙二醇-嗪聚合物和四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物相结合，一方面显著提升了该水凝胶体系的固化速度，另一方面增强了该水凝胶体系的机械性能，所获的双交联水凝胶的固化时间短、内部孔隙分布均匀、生物相容性好、毒性低，其内部孔径100-200μm，适合营养物质和细胞代谢废物的流通，为干细胞的存活和增殖提供良好的三维支撑生存环境，同时所述制备的双网络水凝胶采用内皮细胞与干细胞共培养的方法，通过加入促血管化生长因子(VEGF/bFGF)，有效促进干细胞分化成血管内皮细胞和血管平滑肌细胞以形成血管网络。
附图说明
图1是本发明一典型实施例中所获双网络水凝胶的制备机理示意图。
图2是本发明一典型实施例中所获双网络水凝胶的外观图和微观结构图。
图3a、图3b是本发明一典型实施例中所获双网络水凝胶的机械性能图。
图4a、图4b是本发明一典型实施例中所获双网络水凝胶的XRD图谱和FT-IR图谱。
图5是本发明一典型实施例中所获双网络水凝胶的溶胀图。
图6a、图6b分别是本发明一典型实施例中所获双网络水凝胶的体外降解图和体内降解图。
图7a-图7c、图7d、图7e、图7f分别是内皮细胞和干细胞在本发明一典型实施例中所获双网络水凝胶中的增殖图、生长共聚焦图、三维扫描图以及SEM扫描图。
图8a、图8b、图8c、图8d、图8e是内皮细胞和干细胞在本发明一典型实施例中所获双网络水凝胶中于体外培养条件下向血管内皮细胞和血管平滑肌细胞分化的mRNA表达水平图。
图9a、图9b、图9c是内皮细胞和干细胞在本发明一典型实施例中所获双网络水凝胶中于体内培养条件下向血管内皮细胞和血管平滑肌细胞分化的HE染色图和免疫荧光图。
具体实施方式
如前所述，鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。通过应连同所附图式一起阅读的以下具体实施方式将更完整地理解本发明。本文中揭示本发明的详细实施例；然而，应理解，所揭示的实施例仅具本发明的示范性，本发明可以各种形式来体现。因此，本文中所揭示的特定功能细节不应解释为具有限制性，而是仅解释为权利要求书的基础且解释为用于教示所属领域的技术人员在事实上任何适当详细实施例中以不同方式采用本发明的代表性基础。
作为本发明技术方案的一个方面，其所涉及的系一种可快速固化的双网络水凝胶的制备方法，其包括：
(1)提供丝素蛋白；
(2)将四臂聚乙二醇羧酸与四嗪盐酸盐混合反应，获得四臂聚乙二醇-嗪聚合物；
(3)将四臂聚乙二醇胺与反式环辛烯-聚乙二醇羧酸混合反应，获得四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物；
(4)使包含丝素蛋白、四臂聚乙二醇-嗪聚合物和四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物的均匀混合体系进行生物正交反应，形成第一重水凝胶网络，之后通过诱导丝素蛋白形成β折叠获得可快速固化的双网络水凝胶。
在一些实施方案中，步骤(1)具体包括：使包含质量体积比为1～3：10的天然丝素蛋白与中性盐溶液的第一混合反应体系于50～60℃反应4～6h，再经后处理，获得纯的可溶于水的丝素蛋白。
进一步地，步骤(1)还包括：在所述的反应结束后，将所获反应混合物透析1～3天，其中采用的透析袋的截留分子量为7～14KDa，之后冷冻干燥，获得纯的丝素蛋白。
进一步地，步骤(1)具体包括：将天然蚕茧脱胶，获得所述的天然丝素蛋白。
在一些优选的实施方案中，步骤(1)具体包括：将挑选干净的蚕茧加入0.02mol/LNa2CO3溶液中于100℃水浴锅中煮沸2遍，每次至少40min，用去离子水清洗多次并拧干以除去丝胶，60℃烘箱过夜干燥，随后将干燥后的丝素蛋白放入中性盐溶液中形成第一混合体系进行所述的反应，并维持反应体系的温度为50～60℃。
进一步地，所述中性盐溶液所含盐包括硝酸镁、氯化钙、溴化锂等中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。
进一步地，所述中性盐溶液的浓度为9～10mol/L。
进一步地，所述天然丝素蛋白与中性盐溶液的质量体积比为1～3：10w/v％。
在一些实施方案中，步骤(2)具体包括：使包含摩尔比为1：4～6的四臂聚乙二醇羧酸与四嗪盐酸盐的第二混合反应体系于室温反应10～30h，获得四臂聚乙二醇-嗪聚合物。
进一步地，所述四臂聚乙二醇-嗪聚合物的结构式如式(1)所示：
Figure BDA0002103087150000051
其中，n的取值为12～114。
进一步地，步骤(2)还包括：在所述的反应结束后，将所获反应混合物离心，纯化，之后冷冻干燥，获得四臂聚乙二醇-嗪聚合物。
进一步地，步骤(2)还具体包括：在所述的反应结束后，将所获反应混合物与无水乙醚按照1：10～20的体积比混合，8000rpm离心5min收集沉淀，旋干乙醚，然后溶于适量去离子水中，经G15葡聚糖凝胶柱除去小分子杂质，之后冷冻干燥，获得四臂聚乙二醇-嗪聚合物。
在一些较为优选的实施方案中，步骤(2)具体包括：
将四臂聚乙二醇羧酸溶于第一溶剂中，随后调节所获四臂聚乙二醇羧酸溶液的pH值为7～9并加入第一活化剂活化羧基；
将四嗪盐酸盐溶于第一溶剂中，随后调节所获四嗪盐酸盐溶液的pH值为7～9；
使所述四臂聚乙二醇羧酸溶液、四嗪盐酸盐溶液均匀混合，形成所述的第二混合反应体系。
进一步地，步骤(2)具体包括：将四臂聚乙二醇羧酸溶于二氯甲烷溶液中，随后调节溶液pH并加入活化剂于冰浴中反应15min活化羧基，之后将四嗪盐酸盐溶于二氯甲烷溶液中调节pH使其完全溶解，再将该混合物滴加到四臂聚乙二醇羧酸溶液中，形成第二混合反应体系并进行所述的反应。
进一步地，步骤(2)具体包括：以碱性物质调节所述反应体系的pH值为7～9。
进一步地，所述碱性物质包括N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，但不限于此。
进一步地，所述四臂聚乙二醇羧酸所含羧基与碱性物质的摩尔比为1：1～1.5。
进一步地，所述四嗪盐酸盐与碱性物质的摩尔比为1：1～1.5。
进一步地，所用的所述第一活化剂包括苯并三唑-1-羟基三吡咯烷基六氟磷酸盐(PyBOP)，但不限于此。
进一步地，所述四臂聚乙二醇羧酸所含羧基与第一活化剂的摩尔比为1：1～1.5。
进一步地，所述第一溶剂包括二氯甲烷，但不限于此。
在一些实施方案中，步骤(3)具体包括：使包含摩尔比为1：4～6的四臂聚乙二醇胺与反式环辛烯-聚乙二醇羧酸的第三混合反应体系于室温反应10～30h，获得四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物。
进一步地，所述四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物的结构式如式(2)所示：
Figure BDA0002103087150000061
其中，n的取值为12～114。
进一步地，步骤(3)还包括：在所述的反应结束后，将所获反应混合物离心，纯化，之后冷冻干燥，获得四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物。
进一步地，步骤(3)还具体包括：将反式环辛烯-聚乙二醇羧酸溶于第二溶剂中，并向所获反式环辛烯-聚乙二醇羧酸溶液加入第二活化剂活化羧基；
将四臂聚乙二醇胺溶于第二溶剂中，形成四臂聚乙二醇胺溶液；
使所述反式环辛烯-聚乙二醇羧酸溶液、四臂聚乙二醇胺溶液均匀混合，形成所述的第三混合反应体系。
在一些较为优选的实施方案中，步骤(3)具体包括：将反式环辛烯-聚乙二醇羧酸溶于无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中，并加入活化剂于冰浴中反应15min活化羧基，之后将四臂聚乙二醇胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再将该混合物滴加到反式环辛烯-聚乙二醇羧酸溶液中，形成第三混合反应体系并进行所述的反应。
进一步较为具体的实施方案中，步骤(3)还包括：在所述的反应结束后，将所获反应混合物与无水乙醚按照1：10～20的体积比混合，8000rpm离心5min收集沉淀，旋干乙醚，然后溶于适量去离子水中，经G15葡聚糖凝胶柱除去小分子杂质，之后冷冻干燥，获得四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物。
进一步地，所用的所述第二活化剂包括4-甲基吗啉(MMP)和异丁基氯化物(IBCF)的组合，但不限于此。
进一步地，所述反式环辛烯-聚乙二醇羧酸所含羧基与4-甲基吗啉的摩尔比为1：1～1.5。
进一步地，所述反式环辛烯-聚乙二醇羧酸所含羧基与异丁基氯化物的摩尔比为1：1～1.5。
在一些实施方案中，步骤(4)具体包括：
将丝素蛋白与磷酸缓冲盐溶液混合，形成丝素蛋白溶液；
将所述丝素蛋白溶液分别与四臂聚乙二醇-嗪聚合物、四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物混合，从而形成四臂聚乙二醇-嗪聚合物前体溶液、四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物前体溶液；以及，
使所述四臂聚乙二醇-嗪聚合物前体溶液、四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物前体溶液混合进行生物正交反应，形成第一重水凝胶网络，之后通过诱导丝素蛋白形成β折叠，获得可快速固化的双网络水凝胶。
在一些较为优选的实施方案中，步骤(4)具体包括：
将丝素蛋白溶解于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中形成浓度为5～10w/v％的溶液，随后将丝素蛋白溶液超声，作为溶剂分别溶解四臂聚乙二醇-嗪聚合物和四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物，获得两种前体溶液；
将所述前体溶液等体积混合均匀后转移到模具中，形成初步固化成型的水凝胶，再于培养箱内放置30min，通过诱导丝素蛋白缓慢形成β折叠，获得二次固化的双网络水凝胶。
进一步地，所述丝素蛋白溶液中丝素蛋白的浓度为5～10w/v％。
进一步地，所述超声的条件为：超声功率为180～240W，超声时间为2～5s，暂停2～5s，循环6～10次。
进一步地，所述四臂聚乙二醇-嗪聚合物与四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物的摩尔比为1：1～3。
其中，本发明采用生物正交反应快速固化成型，进一步采用物理超声诱导丝素蛋白形成β折叠。
进一步地，光引发剂包括光引发剂I2959，即2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮。
在一些更为具体的实施例之中，所述可快速固化的双网络水凝胶的制备方法包括以下步骤：
(1)至少将天然蚕茧脱胶，然后与溴化锂混合反应获得丝素蛋白；
(2)至少将四臂聚乙二醇羧酸与四嗪盐酸盐混合反应，获得四臂聚乙二醇-嗪聚合物；
(3)至少将四臂聚乙二醇胺与反式环辛烯-聚乙二醇羧酸混合反应，获得四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物；
(4)至少将丝素蛋白超声后分别溶解四臂聚乙二醇-嗪聚合物和四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物，获得两种前体溶液；
(5)至少将所述两种前体溶液混合均匀通过生物正交反应形成第一重水凝胶网络，之后于培养箱内放置30min，通过诱导丝素蛋白形成β折叠获得双网络水凝胶。
本发明实施例的另一个方面还提供了由前述方法制备的可快速固化的双网络水凝胶，所述双网络水凝胶的机械强度为20～80KPa，并具有多孔结构，其中所含孔洞的孔径为100～200μm。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的可快速固化的双网络水凝胶于细胞培养或组织工程领域中的用途。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种三维细胞培养载体，其包含前述的可快速固化的双网络水凝胶。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种细胞培养方法，其包括：
以前述的可快速固化的双网络水凝胶作为三维细胞培养载体进行细胞的培养，并促使所述细胞进行增殖和分化。
在一些实施方案中，所述细胞为人源脐静脉内皮细胞或人源脐带间充质干细胞。
在一些实施方案中，两种细胞于所述双网络水凝胶上的负载量为100～1000万个/mL。
藉由上述技术方案，本发明的双网络水凝胶将常用的人工合成材料聚乙二醇进行功能化修饰，获得四臂聚乙二醇-嗪聚合物和四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物，将天然蚕茧来源的丝素蛋白进行超声，然后作为溶剂分别溶解四臂聚乙二醇-嗪聚合物和四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物，得到两种前体溶液，之后与细胞共混，将丝素蛋白与四臂聚乙二醇-嗪和四臂聚乙二醇-环辛烯相结合，一方面显著提升了该水凝胶体系的固化速度，另一方面增强了该水凝胶体系的机械性能，所获的双交联水凝胶的固化时间短、内部孔隙分布均匀、生物相容性好、毒性低，其内部孔径100-200μm，适合营养物质和细胞代谢废物的流通，为干细胞的存活和增殖提供良好的三维支撑生存环境，同时所述制备的双网络水凝胶采用内皮细胞与干细胞共培养的方法，通过加入促血管化生长因子(VEGF/bFGF)，有效促进干细胞分化成血管内皮细胞和血管平滑肌细胞。同时制备方法简单，可大量制备。
下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例中采用的实施条件可以根据实际需要而做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1
步骤一：将挑选干净的蚕茧加入0.02mol/LNa2CO3溶液中于100℃水浴锅中煮沸2遍，每次至少40min，用去离子水清洗多次并拧干以除去丝胶，60℃烘箱过夜干燥，随后将干燥后的丝素蛋白放入LiBr溶液中形成第一混合反应体系进行所述的反应，并维持反应体系的温度为60℃，反应4h，其中，LiBr溶液浓度为9.3mol/L，LiBr与丝素蛋白的质量比为10：1。
步骤一反应结束后用7KDa截留量透析除去杂质，-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥3天，获得纯的丝素蛋白。
步骤二：将四臂聚乙二醇羧酸溶于二氯甲烷溶液中，随后调节溶液pH并加入活化剂于冰浴中反应15min活化羧基，之后将四嗪盐酸盐溶于二氯甲烷溶液中调节pH使其完全溶解，再将该混合物滴加到聚乙二醇溶液中，形成第二混合反应体系并进行所述的反应，四臂聚乙二醇羧酸与四嗪盐酸盐的摩尔比为1：4，室温反应10h。其中所述的碱性物质为DIEA溶液；所述反应体系的pH值为8；所述羧基与DIEA的摩尔比为1：1.2，四嗪盐酸盐与DIEA的摩尔比为1：1.2；所述的活化剂为苯并三唑-1-羟基三吡咯烷基六氟磷酸盐(PyBOP)；所述羧基与PyBOP的摩尔比为1：1.2。
步骤二的反应结束后，在15倍体积的无水乙醇中沉淀，得到白色絮状沉淀，8000rpm离心5min收集沉淀，旋干乙醚，用去离子水溶解上述沉淀，随后经G15葡聚糖凝胶柱除去小分子杂质，-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥3天，获得四臂聚乙二醇-嗪聚合物，四臂聚乙二醇-嗪聚合物的结构式如式(1)所示：
Figure BDA0002103087150000101
其中，n的取值为114。
这种四臂聚乙二醇-嗪聚合物是一种由四嗪盐酸盐修饰的化合物，四臂聚乙二醇-嗪聚合物主要是在人工合成的聚乙二醇高分子上修饰上生物正交反应官能团嗪，用于快速交联成胶。
步骤三：将反式环辛烯-聚乙二醇羧酸溶于无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中，并加入活化剂于冰浴中反应15min活化羧基，之后将四臂聚乙二醇胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再将该混合物滴加到反式环辛烯溶液中，形成第三混合反应体系并进行所述的反应，四臂聚乙二醇胺与反式环辛烯-聚乙二醇羧酸的摩尔比为1：4，室温反应10h。其中所述的活化剂为4-甲基吗啉(MMP)和异丁基氯化物(IBCF)；所述羧基与MMP的摩尔比为1：1.2，所述羧基与IBCF的摩尔比为1：1.2。
步骤二的反应结束后，在15倍体积的无水乙醇中沉淀，得到白色絮状沉淀，8000rpm离心5min收集沉淀，旋干乙醚，用去离子水溶解上述沉淀，随后经G15葡聚糖凝胶柱除去小分子杂质，-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥3天，获得四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物，四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物的结构式如式(2)所示：
Figure BDA0002103087150000102
其中，n的取值为114。
这种四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物是一种由反式环辛烯-聚乙二醇羧酸修饰的化合物，四臂聚乙二醇-环辛烯主要是在人工合成的聚乙二醇高分子上修饰上生物正交反应官能团反式环辛烯，用于快速交联成胶。
步骤四：将丝素蛋白溶解于PBS中形成浓度为5w/v％的溶液，随后将丝素蛋白溶液超声(功率240w，超声5s，暂停5s，循环6次)，作为溶剂分别溶解四臂聚乙二醇-嗪聚合物和四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物，获得两种前体溶液(5％SF/2％PEG-Tz溶液和5％SF/4％PEG-TCO)，然后将所述前体溶液等体积混合均匀后转移到模具中，初步固化成型，再于培养箱内放置30min，通过诱导丝素蛋白缓慢形成β折叠，获得二次固化的双网络水凝胶。
实施例2
步骤一：将挑选干净的蚕茧加入0.02mol/LNa2CO3溶液中于100℃水浴锅中煮沸2遍，每次至少40min，用去离子水清洗多次并拧干以除去丝胶，60℃烘箱过夜干燥，随后将干燥后的丝素蛋白放入LiBr溶液中形成第一混合反应体系进行所述的反应，并维持反应体系的温度为60℃，反应5h；其中，LiBr溶液浓度为9.3mol/L，LiBr与丝素蛋白的质量比为10：1。
步骤一反应结束后用7KDa截留量透析除去杂质，-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥3天，获得纯的丝素蛋白。
步骤二：将四臂聚乙二醇羧酸溶于二氯甲烷溶液中，随后调节溶液pH并加入活化剂于冰浴中反应15min活化羧基，之后将四嗪盐酸盐溶于二氯甲烷溶液中调节pH使其完全溶解，再将该混合物滴加到聚乙二醇溶液中，形成第二混合反应体系并进行所述的反应，四臂聚乙二醇羧酸与四嗪盐酸盐的摩尔比为1：4，室温反应10h。其中所述的碱性物质为DIEA溶液；所述反应体系的pH值为8；所述羧基与DIEA的摩尔比为1：1.2，嗪与DIEA的摩尔比为1：1.2；所述的活化剂为苯并三唑-1-羟基三吡咯烷基六氟磷酸盐(PyBOP)；所述羧基与PyBOP的摩尔比为1：1.2。
步骤二的反应结束后，在15倍体积的无水乙醇中沉淀，得到白色絮状沉淀，8000rpm离心5min收集沉淀，旋干乙醚，用去离子水溶解上述沉淀，随后经G15葡聚糖凝胶柱除去小分子杂质，-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥3天，获得四臂聚乙二醇-嗪聚合物，四臂聚乙二醇-嗪聚合物的结构式如式(1)所示：
Figure BDA0002103087150000121
其中，n的取值为114。
这种四臂聚乙二醇-嗪聚合物是一种由四嗪盐酸盐修饰的化合物，四臂聚乙二醇-嗪主要是在人工合成的聚乙二醇高分子上修饰上生物正交反应官能团嗪，用于快速交联成胶。
步骤三：将反式环辛烯-聚乙二醇羧酸溶于无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中，并加入活化剂于冰浴中反应15min活化羧基，之后将四臂聚乙二醇胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再将该混合物滴加到反式环辛烯溶液中，形成第三混合反应体系并进行所述的反应，四臂聚乙二醇胺与反式环辛烯-聚乙二醇羧酸的摩尔比为1：4，室温反应10h。其中所述的活化剂为4-甲基吗啉(MMP)和异丁基氯化物(IBCF)；所述羧基与MMP的摩尔比为1：1.2，所述羧基与IBCF的摩尔比为1：1.2。
步骤二的反应结束后，在15倍体积的无水乙醇中沉淀，得到白色絮状沉淀，8000rpm离心5min收集沉淀，旋干乙醚，用去离子水溶解上述沉淀，随后经G15葡聚糖凝胶柱除去小分子杂质，-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥3天，获得四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物，四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物的结构式如式(2)所示：
Figure BDA0002103087150000122
其中，n的取值为114。
这种四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物是一种由反式环辛烯-聚乙二醇羧酸修饰的化合物，四臂聚乙二醇-环辛烯主要是在人工合成的聚乙二醇高分子上修饰上生物正交反应官能团反式环辛烯，用于快速交联成胶。
步骤四：将丝素蛋白溶解于PBS中形成浓度为5w/v％的溶液，随后将丝素蛋白溶液超声(功率180w，超声5s，暂停5s，循环6次)，作为溶剂分别溶解四臂聚乙二醇-嗪聚合物和四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物，获得两种前体溶液(5％SF/2％PEG-Tz溶液和5％SF/4％PEG-TCO)，然后将所述前体溶液等体积混合均匀后转移到模具中，初步固化成型，再于培养箱内放置30min，通过诱导丝素蛋白缓慢形成β折叠，获得二次固化的双网络水凝胶。
实施例3
步骤一：将挑选干净的蚕茧加入0.02M Na2CO3溶液中于100℃水浴锅中煮沸2遍，每次至少40min，用去离子水清洗多次并拧干以除去丝胶，60℃烘箱过夜干燥，随后将干燥后的丝素蛋白放入LiBr溶液中形成第一混合体系进行所述的反应，并维持反应体系的温度为60℃，反应4h；其中，LiBr溶液浓度为9.3mol/L，LiBr与丝素蛋白的质量比为10：1。
步骤一反应结束后用7KDa截留量透析除去杂质，-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥3天，获得纯的丝素蛋白。
步骤二：将四臂聚乙二醇羧酸溶于二氯甲烷溶液中，随后调节溶液pH并加入活化剂于冰浴中反应15min活化羧基，之后将四嗪盐酸盐溶于二氯甲烷溶液中调节pH使其完全溶解，再将该混合物滴加到聚乙二醇溶液中，形成第二混合反应体系并进行所述的反应，四臂聚乙二醇羧酸与四嗪盐酸盐的摩尔比为1：4，室温反应10h。其中所述的碱性物质为DIEA溶液；所述反应体系的pH值为8；所述羧基与DIEA的摩尔比为1：1.2，嗪与DIEA的摩尔比为1：1.2；所述的活化剂为苯并三唑-1-羟基三吡咯烷基六氟磷酸盐(PyBOP)；所述羧基与PyBOP的摩尔比为1：1.2。
步骤二的反应结束后，在15倍体积的无水乙醇中沉淀，得到白色絮状沉淀，8000rpm离心5min收集沉淀，旋干乙醚，用去离子水溶解上述沉淀，随后经G15葡聚糖凝胶柱除去小分子杂质，-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥3天，获得四臂聚乙二醇-嗪聚合物，四臂聚乙二醇-嗪聚合物的结构式如式(1)所示：
Figure BDA0002103087150000131
Figure BDA0002103087150000141
其中，n的取值为28。
这种四臂聚乙二醇-嗪聚合物是一种由四嗪盐酸盐修饰的化合物，四臂聚乙二醇-嗪主要是在人工合成的聚乙二醇高分子上修饰上生物正交反应官能团嗪，用于快速交联成胶。
步骤三：将反式环辛烯-聚乙二醇羧酸溶于无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中，并加入活化剂于冰浴中反应15min活化羧基，之后将四臂聚乙二醇胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再将该混合物滴加到反式环辛烯溶液中，形成第三混合反应体系并进行所述的反应，四臂聚乙二醇胺与反式环辛烯-聚乙二醇羧酸的摩尔比为1：4，室温反应10h。其中所述的活化剂为4-甲基吗啉(MMP)和异丁基氯化物(IBCF)；所述羧基与MMP的摩尔比为1：1.2，所述羧基与IBCF的摩尔比为1：1.2。
步骤二的反应结束后，在15倍体积的无水乙醇中沉淀，得到白色絮状沉淀，8000rpm离心5min收集沉淀，旋干乙醚，用去离子水溶解上述沉淀，随后经G15葡聚糖凝胶柱除去小分子杂质，-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥3天，获得四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物，四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物的结构式如式(2)所示：
Figure BDA0002103087150000142
其中，n的取值为28。
这种四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物是一种由反式环辛烯-聚乙二醇羧酸修饰的化合物，四臂聚乙二醇-环辛烯主要是在人工合成的聚乙二醇高分子上修饰上生物正交反应官能团反式环辛烯，用于快速交联成胶。
步骤四：将丝素蛋白溶解于PBS中形成浓度为10w/v％的溶液，随后将丝素蛋白溶液超声(功率240w，超声2s，暂停2s，循环8次)，作为溶剂分别溶解四臂聚乙二醇-嗪聚合物和四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物，获得两种前体溶液(10％SF/2％PEG-Tz溶液和10％SF/4％PEG-TCO)，然后将所述前体溶液等体积混合均匀后转移到模具中，初步固化成型，再于培养箱内放置30min，通过诱导丝素蛋白缓慢形成β折叠，获得二次固化的双网络水凝胶。
实施例4
步骤一：将挑选干净的蚕茧加入0.02M Na2CO3溶液中于100℃水浴锅中煮沸2遍，每次至少40min，用去离子水清洗多次并拧干以除去丝胶，60℃烘箱过夜干燥，随后将干燥后的丝素蛋白放入LiBr溶液中形成第一混合反应体系进行所述的反应，并维持反应体系的温度为55℃，反应5h；其中，LiBr溶液浓度为9mol/L，丝素蛋白与溴化锂的质量体积比为2:10(w/v,％)。
步骤一反应结束后用14KDa截留量透析除去杂质，-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥3天，获得纯的可溶于水的丝素蛋白。
步骤二：将四臂聚乙二醇羧酸溶于二氯甲烷溶液中，随后调节溶液pH并加入活化剂于冰浴中反应15min活化羧基，之后将四嗪盐酸盐溶于二氯甲烷溶液中调节pH使其完全溶解，再将该混合物滴加到聚乙二醇溶液中，形成第二混合反应体系并进行所述的反应，四臂聚乙二醇羧酸与四嗪盐酸盐的摩尔比为1：5，室温反应20h。其中所述的碱性物质为DIEA溶液；所述反应体系的pH值为7；所述羧基与DIEA的摩尔比为1：1，嗪与DIEA的摩尔比为1：1；所述的活化剂为苯并三唑-1-羟基三吡咯烷基六氟磷酸盐(PyBOP)；所述羧基与PyBOP的摩尔比为1：1。
步骤二的反应结束后，在15倍体积的无水乙醇中沉淀，得到白色絮状沉淀，8000rpm离心5min收集沉淀，旋干乙醚，用去离子水溶解上述沉淀，随后经G15葡聚糖凝胶柱除去小分子杂质，-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥3天，获得四臂聚乙二醇-嗪聚合物，四臂聚乙二醇-嗪聚合物的结构式如式(1)所示：
Figure BDA0002103087150000151
其中，n的取值为12。
这种四臂聚乙二醇-嗪聚合物是一种由四嗪盐酸盐修饰的化合物，四臂聚乙二醇-嗪主要是在人工合成的聚乙二醇高分子上修饰上生物正交反应官能团嗪，用于快速交联成胶。
步骤三：将反式环辛烯-聚乙二醇羧酸溶于无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中，并加入活化剂于冰浴中反应15min活化羧基，之后将四臂聚乙二醇胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再将该混合物滴加到反式环辛烯溶液中，形成第三混合反应体系并进行所述的反应，四臂聚乙二醇胺与反式环辛烯-聚乙二醇羧酸的摩尔比为1：5，室温反应20h。其中所述的活化剂为4-甲基吗啉(MMP)和异丁基氯化物(IBCF)；所述羧基与MMP的摩尔比为1：1，所述羧基与IBCF的摩尔比为1：1。
步骤二的反应结束后，在15倍体积的无水乙醇中沉淀，得到白色絮状沉淀，8000rpm离心5min收集沉淀，旋干乙醚，用去离子水溶解上述沉淀，随后经G15葡聚糖凝胶柱除去小分子杂质，-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥3天，获得四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物，四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物的结构式如式(2)所示：
Figure BDA0002103087150000161
其中，n的取值为12。
这种四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物是一种由反式环辛烯-聚乙二醇羧酸修饰的化合物，四臂聚乙二醇-环辛烯主要是在人工合成的聚乙二醇高分子上修饰上生物正交反应官能团反式环辛烯，用于快速交联成胶。
步骤四：将丝素蛋白溶解于PBS中形成浓度为10w/v％的溶液，随后将丝素蛋白溶液超声(功率200w，超声3s，暂停3s，循环6次)，作为溶剂分别溶解四臂聚乙二醇-嗪聚合物和四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物，获得两种前体溶液(5％SF/2％PEG-Tz溶液和5％SF/2％PEG-TCO)，然后将所述前体溶液等体积混合均匀后转移到模具中，初步固化成型，再于培养箱内放置30min，通过诱导丝素蛋白缓慢形成β折叠，获得二次固化的双网络水凝胶。
实施例5
步骤一：将挑选干净的蚕茧加入0.02mol/L Na2CO3溶液中于100℃水浴锅中煮沸2遍，每次至少40min，用去离子水清洗多次并拧干以除去丝胶，60℃烘箱过夜干燥，随后将干燥后的丝素蛋白放入LiBr溶液中形成第一混合反应体系进行所述的反应，并维持反应体系的温度为50℃，反应6h；其中，LiBr溶液浓度为10mol/L，丝素蛋白与溴化锂的质量体积比为3:10(w/v,％)。
步骤一反应结束后用10KDa截留量透析除去杂质，-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥1天，获得纯的丝素蛋白。
步骤二：将四臂聚乙二醇羧酸溶于二氯甲烷溶液中，随后调节溶液pH并加入活化剂于冰浴中反应15min活化羧基，之后将四嗪盐酸盐溶于二氯甲烷溶液中调节pH使其完全溶解，再将该混合物滴加到聚乙二醇溶液中，形成第二混合反应体系并进行所述的反应，四臂聚乙二醇羧酸与四嗪盐酸盐的摩尔比为1：6，室温反应30h。其中所述的碱性物质为DIEA溶液；所述反应体系的pH值为9；所述羧基与DIEA的摩尔比为1：1.5，嗪与DIEA的摩尔比为1：1.5；所述的活化剂为苯并三唑-1-羟基三吡咯烷基六氟磷酸盐(PyBOP)；所述羧基与PyBOP的摩尔比为1：1.5。
步骤二的反应结束后，在15倍体积的无水乙醇中沉淀，得到白色絮状沉淀，8000rpm离心5min收集沉淀，旋干乙醚，用去离子水溶解上述沉淀，随后经G15葡聚糖凝胶柱除去小分子杂质，-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥3天，获得四臂聚乙二醇-嗪聚合物，四臂聚乙二醇-嗪聚合物的结构式如式(1)所示：
Figure BDA0002103087150000171
其中，n的取值为56。
这种四臂聚乙二醇-嗪聚合物是一种由四嗪盐酸盐修饰的化合物，四臂聚乙二醇-嗪主要是在人工合成的聚乙二醇高分子上修饰上生物正交反应官能团嗪，用于快速交联成胶。
步骤三：将反式环辛烯-聚乙二醇羧酸溶于无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中，并加入活化剂于冰浴中反应15min活化羧基，之后将四臂聚乙二醇胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再将该混合物滴加到反式环辛烯溶液中，形成第三混合反应体系并进行所述的反应，四臂聚乙二醇胺与反式环辛烯-聚乙二醇羧酸的摩尔比为1：6，室温反应30h。其中所述的活化剂为4-甲基吗啉(MMP)和异丁基氯化物(IBCF)；所述羧基与MMP的摩尔比为1：1.5，所述羧基与IBCF的摩尔比为1：1.5。
步骤二的反应结束后，在15倍体积的无水乙醇中沉淀，得到白色絮状沉淀，8000rpm离心5min收集沉淀，旋干乙醚，用去离子水溶解上述沉淀，随后经G15葡聚糖凝胶柱除去小分子杂质，-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥3天，获得四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物，四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物的结构式如式(2)所示：
Figure BDA0002103087150000181
其中，n的取值为56。
这种四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物是一种由反式环辛烯-聚乙二醇羧酸修饰的化合物，四臂聚乙二醇-环辛烯主要是在人工合成的聚乙二醇高分子上修饰上生物正交反应官能团反式环辛烯，用于快速交联成胶。
步骤四：将丝素蛋白溶解于PBS中形成浓度为8w/v％的溶液，随后将丝素蛋白溶液超声(功率220w，超声5s，暂停5s，循环10次)，作为溶剂分别溶解四臂聚乙二醇-嗪聚合物和四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物，获得两种前体溶液(5％SF/2％PEG-Tz溶液和5％SF/6％PEG-TCO)，然后将所述前体溶液等体积混合均匀后转移到模具中，初步固化成型，再于培养箱内放置30min，通过诱导丝素蛋白缓慢形成β折叠，获得二次固化的双网络水凝胶。
上述步骤一至步骤四可通过图1表示。
性能测试一
在场环扫描电镜测试仪上测试本实施例所获双网络水凝胶内部结构及孔径大小，其操作方法包括：
将上述双网络水凝胶液氮冷冻，-50℃冷冻干燥24h，0.2mA喷金3min，扫描电镜观察水凝胶微观形貌图(如图2所示)。通过扫描电镜可以看出，该双网络水凝胶微观结构多孔，孔径约100～200μm。
性能测试二
将上述丝素蛋白溶解于PBS中形成浓度为5w/v％的溶液，随后将丝素蛋白溶液超声(功率240w，超声5s，暂停5s，循环6次)，作为溶剂分别溶解四臂聚乙二醇-嗪聚合物和四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物，获得两种前体溶液(5％SF/2％PEG-Tz溶液和5％SF/6％PEG-TCO)，然后将所述前体溶液等体积混合均匀后转移到模具中，初步固化成型，再于培养箱内放置30min，通过诱导丝素蛋白缓慢形成β折叠，获得二次固化的双网络水凝胶。将上述双网络水凝胶在流变测试仪上测试本实施例所获双网络水凝胶的储能模量，通过流变结果图3a可以看出，G’>G”且呈线性关系，说明已成凝胶状态，而且G’在20KPa左右；将上述双网络水凝胶材料试验机检测本实施例所获双网络水凝胶的压缩性能，通过压缩性能结果图3b可以看出，将水凝胶压缩至35％时，水凝胶的压缩应力约为80kPa。
性能测试三
通过X-射线衍射仪和傅里叶红外光谱仪测试本实施例所获双网络水凝胶的构象结构，其操作方法包括：
将上述双网络水凝胶液氮冷冻，-50℃冷冻干燥24h，采用X-射线粉末衍射仪进行晶体结构分析。使用单色CuKa射线为靶材，电流30mA，电压40kV，扫描速度为0.5o/min，衍射角范围为10o-50o，通过图4a可以看出2θ＝22.5o附近的吸收峰，代表β-sheet结构。将上述双网络水凝胶液氮冷冻，-50℃冷冻干燥24h，按照样品与KBr以1:100的质量比于红外光下混合研磨，压片机压制成透明薄片在500-4500cm-1扫描范围内检测，通过图4b可以看出上述双网络水凝胶支架的酰胺Ⅱ带位于1540cm-1处，酰胺Ⅲ带位于1240cm-1处，皆为无规则卷曲构象特征峰，酰胺Ⅰ带位于1630-1640cm-1处，代表β-sheet结构。
性能测试四
将该水凝胶浸泡于2mLPBS中于37℃温和振荡，然后从PBS中提取水凝胶(n＝3)，在24h内不同时间点用滤纸快速擦拭水凝胶表面。然后，测量各水凝胶的湿重(Wt)，并与初始湿重(W0)进行比较，研究所制备的水凝胶的溶胀动力学，通过溶胀结果图5发现该水凝胶的溶胀率随时间的增长逐渐增加，72h后趋于溶胀平衡，溶胀率约为175％。
性能测试五
将上述双网络水凝胶浸入2mLPBS、1U/mL蛋白酶XIV和2U/mL蛋白酶XIV中于37℃温和振荡，并且每24h换液，体外降解72h，每周从PBS中取出水凝胶(n＝3)，于液氮中冷冻，随后-50℃冷冻干燥24h，分别于12h、24h、48h和72h取出样品，PBS漂洗三遍，冷冻干燥后测量各水凝胶的干重(W2)，并与初始干重(W1)进行比较，研究所制备的水凝胶在体外降解速率，通过体外降解结果图6a可以看出上述双网络水凝胶在PBS中基本不降解；加入1U/mL蛋白酶XIV，水凝胶快速降解，72h后基本完全降解；加入2U/mL蛋白酶XIV，水凝胶降解速率加快。
将上述双网络水凝胶移植到裸鼠皮下8W，分别于2W、4W和8W时取出样品，PBS漂洗三遍，冷冻干燥后测量各水凝胶的干重(W3)，并与初始干重(W4)进行比较。通过体内降解结果图6b可以看出上述双网络水凝胶在体内缓慢降解，8W时降解率约为20％左右。
性能测试六
本实施例所获双网络水凝胶对细胞增殖检测
用钙黄绿素染色法和四唑盐比色法(WST法)来测定本实施例双网络水凝胶中包埋的人源脐静脉内皮细胞和人源脐带间充质干细胞(HUVEC和UCMSC)的存活和细胞增殖情况，其操作方法包括：
将丝素蛋白溶解于PBS中形成浓度为5w/v％的溶液，随后将丝素蛋白溶液超声(功率240w，超声5s，暂停5s，循环6次)，作为溶剂分别溶解四臂聚乙二醇-嗪聚合物和四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物，获得两种前体溶液(5％SF/2％PEG-Tz溶液和5％SF/6％PEG-TCO)，将基础培养基培养的第4-6代UCMSC细胞和处于对数生长期的HUVEC细胞消化、计数、1000rpm离心3min；分别与上述两种前体溶液混合均匀确保每种细胞浓度为2×106个/mL；取上述共混液各50μL于模具中混合均匀，形成初步固化成型的水凝胶，再于培养箱内放置30min，通过诱导丝素蛋白缓慢形成β折叠，获得二次固化的分别负载HUVEC、UCMSC、HUVEC/UCMSC的双网络水凝胶，细胞与本实施例的双网络水凝胶共混，将该水凝胶转移至24孔板中，加入基础培养基，放入5％CO2、37℃培养箱中培养。
培养1天、3天和7天后后将培养基取出，PBS清洗3次，利用Live/dead试剂盒测定，在激光共聚焦488/561nm激发下观察细胞活性；活细胞被钙黄绿素染色发出绿色荧光，死细胞被染色发出红色荧光。
如图7a-图7f所示，鼠源的骨髓干细胞在本实施例所获光固化水凝胶中存活较好并显示三维结构和明显增殖，表明本发明对细胞增殖无影响且能为细胞提供三维生长环境。
培养1天、3天和7天后将培养基取出，每孔加入450μL新鲜培养基，加入50μLWST-1充分混匀，放入5％CO2、37℃培养箱中孵育4h，取100μL于96孔板中酶标仪450nm处测试OD值。
如图7a-图7f所示HUVEC和UCMSC与本实施例所获双网络水凝胶共混后，培养1天细胞存活较好，培养7天细胞呈现明显增殖，表明本实施例所获双网络水凝胶毒性低、生物相容性好。
性能测试七
人源脐带间充质干细胞在本实施例所获双网络水凝胶中向血管内皮细胞和血管平滑肌细胞分化检测
用RT-PCR检测血管生成相关基因mRNA的表达水平来判断干细胞的是否分化。
第4-6代UCMSC细胞和处于对数生长期的HUVEC细胞分为三组：
第一组将第4-6代UCMSC细胞与本实施例所获双网络水凝胶共混后于血管分化培养基培养作为对照组；
第二组将处于对数生长期的HUVEC细胞与本实施例所获双网络水凝胶共混后于血管分化培养基培养作为对照组；
第三组将第4-6代UCMSC细胞和处于对数生长期的HUVEC细胞与本实施例所获双网络水凝胶共混后于血管分化培养基培养作为实验组；
将三组细胞负载的水凝胶放入5％CO2、37℃培养箱中培养，隔天换新鲜培养基，培养28天，弃去培养基，PBS洗3次，在每个时间点通过TRIzol Plus RNA纯化试剂盒从分别负载HUVEC、UCMSC、HUVEC/UCMSC的双网络水凝胶中提取总细胞RNA。使用A260/280nm评估RNA的纯度。之后，使用PrimeScriptTM RT试剂盒将500ng RNA逆转录成cDNA。使用SYBR GreenI PCR试剂盒RT-PCR检测。将培养皿中没有经过血管分化培养基培养的第4-6代UCMSC细胞和处于对数生长期的HUVEC细胞设为校准品对照，并通过非调节参考基因表达(Gapdh)将目标基因表达标准化。
如图8a-图8e所示，所有标志物的表达量均呈现逐步增长的现象，但在初始阶段(<14天)各基因表达量较低，21天时可以观察到各基因表达量的显著上调，到第28天表达量达到最高。对于CD31和TEK，HUVECs-UCMSCs共培养时的基因表达量(CD31超过1200倍，TEK超过1000倍)明显高于单独负载的HUVECs(CD31约120倍，TEK超过150倍)，对于MyoD1、α-ActinSMA和Desmin，HUVECs-UCMSCs共培养时的各基因表达量(MyoD1超过150倍，α-Actin SMA超过200倍，Desmin超过160倍)明显高于单独负载UCMSCs的水凝胶(MyoD1约30倍，α-ActinSMA约20倍，Desmin超过40倍)。这些结果提示HUVECs-UCMSCs于本实施例所获双网络水凝胶内共培养时能有效促进各标志基因的表达，即HUVECs-UCMSCs于本实施例所获双网络水凝胶内共培养时能有效促进人源脐带间充质干细胞在本实施例所获双网络水凝胶中向血管内皮细胞和血管平滑肌细胞分化，这些分化的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞分化具有独特的表型和生物合成活性。
性能测试八
人源脐带间充质干细胞在本实施例所获双网络水凝胶中向血管内皮细胞和血管平滑肌细胞分化检测
用HE染色和免疫荧光染色检测血管内皮细胞和血管平滑肌细胞相关标志物的表达来判断干细胞的是否分化。
第4-6代UCMSC细胞和处于对数生长期的HUVEC细胞分为三组：
第一组将第4-6代UCMSC细胞与本实施例所获双网络水凝胶共混后移植于裸鼠背部作为对照组；
第二组将处于对数生长期的HUVEC细胞与本实施例所获双网络水凝胶共混后移植于裸鼠背部作为对照组；
第三组将第4-6代UCMSC细胞和处于对数生长期的HUVEC细胞与本实施例所获双网络水凝胶共混后移植于裸鼠背部作为实验组；
体内培养2W和4W后取出通过石蜡包埋后切片，按照规定程序进行HE染色和免疫荧光染色检测血管内皮细胞标志物(CD31)和血管平滑肌细胞相关标志物(α-SMA)的表达以及相关血管网络的形成和分布情况。
如图9a所示，蓝色为细胞核，红色为细胞质，标记位置为血管样结构，在植入2周后于负载HUVECs-UCMSCs的水凝胶中目视观察到更多血管样结构，且管径较大，而单独负载HUVECs或UCMSCs的水凝胶内部形成的血管样结构较少，管径较小。与第2周相比，植入4周后在负载HUVECs-UCMSCs的水凝胶中目视观察到形态和管径更良好的血管样结构，而单独负载HUVECs和UCMSCs的水凝胶内部的血管样结构较少，表明HUVECs-UCMSCs共培养时新血管形成速度更快且随着时间的增长形成的血管样结构更成熟。
结果如图9b、图9c所示，蓝色为细胞核，红色为CD31，绿色为α-SMA，体内培养2W后，单独负载HUVECs的水凝胶内部仅有部分红色管状结构且管径较小，即只有少量内皮细胞形成的毛细血管；单独负载UCMSCs的水凝胶内部有部分红色管状结构以及少量绿色荧光包裹于红色荧光外围，表明UCMSCs成功分化成内皮细胞以及平滑肌细胞，并形成血管结构；而共载HUVECs-UCMSCs的水凝胶内部形成的红色管状结构较多且能明显观察到绿色荧光完整包围于红色荧光外围，表明UCMSCs成功分化为平滑肌细胞且血管新生能力明显强于其他两组。与第2周相比，体内培养4周后，负载HUVECs的水凝胶内部红色荧光明显变少，负载UCMSCs的水凝胶内部可见部分完整血管结构，而负载HUVECs-UCMSCs的水凝胶内部形成的红色管状结构面积增大且能明显观察到更成熟的血管结构。该结果进一步说明HUVECs-UCMSCs共混负载于水凝胶内可明显增强血管形成能力，促进组织再生。这些结果提示HUVECs-UCMSCs于本实施例所获双网络水凝胶内共培养时能显著增强血管形成能力，促进组织再生。
对照例1
一般情况下，利用纯的丝素蛋白形成高强度水凝胶时需要借助有机化学试剂，但有机试剂具有细胞毒性，不利于细胞包埋，从而限制了其在生物医学中的应用。
与对照例1相比，本发明实施例1-5所获水凝胶采用简单的物理超声诱导丝素蛋白形成β折叠进而固化形成高强度水凝胶，较上述方法而言，采用物理超声交联形成的水凝胶有更广泛的生物应用，例如，本发明实现与细胞共混凝胶化，较上述三维支架材料更易于细胞包埋。
对照例2
一般情况下，利用纯的丝素蛋白采用简单的物理超声诱导丝素蛋白形成β折叠进而固化形成高强度水凝胶的速度较慢，根据超声的强度，其成胶时间从几十分钟到几小时，甚至数天不等，不利于支架的快速形成以及共混负载细胞，此外纯的丝素蛋白形成的水凝胶内部孔径较小，不利于营养物质以及代谢废物的交换。
与对照例2相比，本发明实施例1-5所获双网络水凝胶，利用生物正交的快速交联得到快速固化的第一重水凝胶网络，进一步通过诱导丝素蛋白β折叠的缓慢形成，构建第二重水凝胶网络，提升水凝胶的性能以满足血管化需求，形成的双网络水凝胶有更强的力学性能，更适宜的孔径和三维微环境以及生物学应用，例如，本发明结合了单一网络水凝胶的优点构建了即可快速固化又具有较强力学性能的双网络水凝胶，且实现与细胞共混凝胶化，较上述三维支架材料交联速度更快，性能更好。
对照例3
一般情况下，利用单纯的生物正交反应可快速交联形成水凝胶，但形成的水凝胶机械性能较低，从而限制了其在生物医学中的应用。
与对照例3相比，本发明实施例1-5所获双网络水凝胶，利用生物正交的快速交联得到快速固化的第一重水凝胶网络，进一步通过诱导丝素蛋白β折叠的缓慢形成，构建第二重水凝胶网络，提升水凝胶的机械性能以满足血管化需求，形成的双网络水凝胶有更强的力学性能以及生物学应用，例如，本发明结合了单一网络水凝胶的优点构建了即可快速固化又具有较强力学性能的双网络水凝胶，且实现与细胞共混凝胶化，较上述三维支架材料交联速度更快性能更好。
对照例4
一般情况下，采用单一干细胞进行血管分化研究，分化形成的血管内皮细胞具有良好的生物学性能，但单独存在时不能形成成熟的血管网络，从而限制了其在组织工程中的应用。因此在本实验中采用了UCMSC细胞和HUVEC细胞与本实施例所获双网络水凝胶共混包埋的方法。
与对照例4相比，本发明实施例1-5所获水凝胶对采用了UCMSC细胞和HUVEC细胞与本实施例所获双网络水凝胶共混包埋的方法，能有效增强干细胞的分化能力以及血管形成能力，促进组织再生。
综上所述，藉由本发明的上述技术方案，本发明的双网络水凝胶的固化时间短、水凝胶内部孔隙分布均匀，生物相容性好、毒性低、可给细胞提供三维生存环境，提高干细胞在三维支架上的粘附和增殖，并且实现向血管内皮细胞分化；同时制备方法简单，可大量制备。
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。
在本发明案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。
除非另外具体陈述，否则术语“包含(include、includes、including)”、“具有(have、has或having)”的使用通常应理解为开放式的且不具限制性。
除非另外具体陈述，否则本文中单数的使用包含复数(且反之亦然)。此外，除非上下文另外清楚地规定，否则单数形式“一(a、an)”及“所述(the)”包含复数形式。另外，在术语“约”的使用在量值之前之处，除非另外具体陈述，否则本发明教示还包括特定量值本身。
应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。此外，除非具体陈述，否则术语第一、第二等的任何使用不表示任何次序或重要性，而是使用术语第一、第二等来区分一个元素与另一元素。

Claims (20)

1.一种可快速固化的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于包括：
(1)提供丝素蛋白；
(2)将四臂聚乙二醇羧酸与四嗪盐酸盐混合反应，获得四臂聚乙二醇-嗪聚合物；
(3)将四臂聚乙二醇胺与反式环辛烯-聚乙二醇羧酸混合反应，获得四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物；
(4)使包含丝素蛋白、四臂聚乙二醇-嗪聚合物和四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物的均匀混合体系进行生物正交反应，形成第一重水凝胶网络，之后通过诱导丝素蛋白形成β折叠获得可快速固化的双网络水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体包括：使包含天然丝素蛋白与中性盐溶液的第一混合反应体系于50～60℃反应4～6h，再经后处理，获得纯的可溶于水的丝素蛋白。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)还包括：在所述的反应结束后，将所获反应混合物透析1～3天，其中采用的透析袋的截留分子量为7～14KDa，之后冷冻干燥，获得纯的丝素蛋白。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体包括：将天然蚕茧脱胶，获得所述的天然丝素蛋白；和/或，所述中性盐溶液所含盐包括硝酸镁、氯化钙、溴化锂中的任意一种或两种以上的组合；和/或，所述中性盐溶液的浓度为9～10mol/L；和/或，所述天然丝素蛋白与中性盐溶液的质量体积比为1～3：10w/v％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)具体包括：使包含摩尔比为1：4～6的四臂聚乙二醇羧酸与四嗪盐酸盐的第二混合反应体系于室温反应10～30h，获得四臂聚乙二醇-嗪聚合物。
6.根据权利要求1或5所述的制备方法，其特征在于，所述四臂聚乙二醇-嗪聚合物的结构式如式(1)所示：
Figure FDA0002103087140000021
其中，n的取值为12～114。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)还包括：在所述的反应结束后，将所获反应混合物离心，纯化，之后冷冻干燥，获得四臂聚乙二醇-嗪聚合物。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)包括：
将四臂聚乙二醇羧酸溶于第一溶剂中，随后调节所获四臂聚乙二醇羧酸溶液的pH值为7～9并加入第一活化剂活化羧基；
将四嗪盐酸盐溶于第一溶剂中，随后调节所获四嗪盐酸盐溶液的pH值为7～9；
使所述四臂聚乙二醇羧酸溶液、四嗪盐酸盐溶液均匀混合，形成所述的第二混合反应体系。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括：以碱性物质调节所述反应体系的pH值为7～9；优选的，所述碱性物质包括N,N-二异丙基乙胺；和/或，所述四臂聚乙二醇羧酸所含羧基与碱性物质的摩尔比为1：1～1.5；和/或，所述四嗪盐酸盐与碱性物质的摩尔比为1：1～1.5；和/或，所述第一活化剂包括苯并三唑-1-羟基三吡咯烷基六氟磷酸盐；和/或，所述四臂聚乙二醇羧酸所含羧基与第一活化剂的摩尔比为1：1～1.5；和/或，所述第一溶剂包括二氯甲烷。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)具体包括：使包含摩尔比为1：4～6的四臂聚乙二醇胺与反式环辛烯-聚乙二醇羧酸的第三混合反应体系于室温反应10～30h，获得四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物。
11.根据权利要求1或10所述的制备方法，其特征在于，所述四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物的结构式如式(2)所示：
Figure FDA0002103087140000031
其中，n的取值为12～114。
12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)还包括：在所述的反应结束后，将所获反应混合物离心，纯化，之后冷冻干燥，获得四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物。
13.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)具体包括：
将反式环辛烯-聚乙二醇羧酸溶于第二溶剂中，并向所获反式环辛烯-聚乙二醇羧酸溶液加入第二活化剂活化羧基；
将四臂聚乙二醇胺溶于第二溶剂中，形成四臂聚乙二醇胺溶液；
使所述反式环辛烯-聚乙二醇羧酸溶液、四臂聚乙二醇胺溶液均匀混合，形成所述的第三混合反应体系。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于：所述第二活化剂包括4-甲基吗啉和异丁基氯化物的组合；优选的，所述反式环辛烯-聚乙二醇羧酸所含羧基与4-甲基吗啉的摩尔比为1：1～1.5；优选的，所述反式环辛烯-聚乙二醇羧酸所含羧基与异丁基氯化物的摩尔比为1：1～1.5。
15.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)具体包括：
将丝素蛋白与磷酸缓冲盐溶液混合，形成丝素蛋白溶液；
将所述丝素蛋白溶液分别与四臂聚乙二醇-嗪聚合物、四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物混合，从而形成四臂聚乙二醇-嗪聚合物前体溶液、四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物前体溶液；以及，
使所述四臂聚乙二醇-嗪聚合物前体溶液、四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物前体溶液混合进行生物正交反应，形成第一重水凝胶网络，之后通过诱导丝素蛋白形成β折叠，获得可快速固化的双网络水凝胶。
16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于：所述丝素蛋白溶液中丝素蛋白的浓度为5～10w/v％；和/或，所述制备方法包括：将四臂聚乙二醇-嗪聚合物、四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物分别超声分散于所述丝素蛋白溶液中；优选的，所述超声的条件为：超声功率为180～240W，超声时间为2～5s，暂停2～5s，循环6～10次；和/或，所述四臂聚乙二醇-嗪聚合物与四臂聚乙二醇-环辛烯聚合物的摩尔比为1：1～3。
17.由权利要求1-16中任一项所述方法制备的可快速固化的双网络水凝胶，所述双网络水凝胶的机械强度为20～80KPa，并具有多孔结构，其中所含孔洞的孔径为100～200μm。
18.权利要求17所述的可快速固化的双网络水凝胶于细胞培养或组织工程领域中的用途。
19.一种三维细胞培养载体，其特征在于包含权利要求17所述的可快速固化的双网络水凝胶。
20.一种细胞培养方法，其特征在于包括：
以权利要求17所述的可快速固化的双网络水凝胶作为三维细胞培养载体进行细胞的培养，并促使所述细胞进行增殖和分化；优选的，所述细胞为人源脐静脉内皮细胞或人源脐带间充质干细胞；优选的，细胞于所述双网络水凝胶上的负载量为100～1000万个/mL。
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