CN112773932A - 一种具有定向孔结构的促血管化组织修复材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有定向孔结构的促血管化组织修复材料及其制备方法和应用，属于生物材料技术领域。本发明通过结构仿生设计，采用原位有机/无机复合和冷冻干燥技术制备了具有定向孔结构的促血管化组织或器官修复材料PVA/HA‑Si，在力学性能、结构取向性、降解性能和促血管化功能上均有改善，能广泛应用于组织工程和再生医学领域中，不仅可用于组织工程支架，还可用于软组织的损伤修复，在组织或器官的缺损治疗和修复等方面具有广阔的应用前景。另外，本发明采用‑80℃预冷铜板定向冷冻的方法改善了材料结构的定向性，得到更为接近天然ECM的竖直取向结构，更利于细胞的粘附，诱导细胞迁移和分化。

Description

一种具有定向孔结构的促血管化组织修复材料及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种具有定向孔结构的促血管化组织修复材料及其制备方法和应用。
背景技术
人体组织或器官损伤是临床常见疾病，毛细血管的新生与形成在组织或器官的再生过程中扮演着重要角色。随着新生血管的长入，氧气等营养物质随之被运输到损伤部位，为细胞的生长黏附和迁移提供养分。对于大面积的组织或器官损伤，新生血管形成的快慢直接影响其愈合的速度。近年来，随着材料科学与制备新技术的快速发展，具有不同拓扑结构和特定功能化的组织修复材料的研发也备受关注，现有的大多数组织或器官替代物在一定程度上可起保护支撑作用，对组织或器官的再生也有一定的促进作用，然而对比自体组织，其恢复效果能有一定差距，其中一个重要原因就是对损伤处新生血管的诱导能力存在不足。因此，促血管化微环境的构建是组织或器官修复材料的关键。
羟基磷灰石(HA)由于其良好的生物相容性和生物活性，是牙科骨科修复的首选材料。掺硅羟基磷灰石(HA-Si)不仅具有羟基磷灰石的稳定性及生物相容性，而且硅离子的加入可在一定程度上促进钙磷材料的降解，释放出来的钙、磷、硅离子等通过离子通道进入细胞，对胞内信号转导通路起到激活作用，可加快血管化的进程。在骨修复材料研究中发现，生物玻璃和掺硅羟基磷灰石等无机成分的加入对成骨和血管化有一定促进作用。血运的重建是组织再生的关键环节之一，因此，掺硅羟基磷灰石无机粒子作为促皮肤血管化支架材料有一定的应用价值。
聚乙烯醇(PVA)因其优异的生物相容性、稳定性、易于加工的优势，在组织工程基质、药物运输载体等方面获得越来越多的关注。PVA水溶液可以通过反复冻融过程中的微晶形成而转变为水凝胶，避免可能导致毒性化学交联剂的添加，且PVA具有良好的保湿性和可控的生物降解性能，作为皮肤替代物有广阔的应用前景。
目前，常用组织修复材料的制备方法有PVA与无机材料共混后液氮反复冻融和共混后减压脱泡静置等。这些方法的主要缺点是材料的孔结构较小且没有明显的取向结构。另外，由于冷冻干燥时不易控制温度，因此很难得到定向孔结构的材料。
基于上述理由，提出本申请。
发明内容
本发明针对现有技术在冷冻时热传递效率低和操作繁琐的不足，提供一种加工工艺稳定、支架结构可控的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料及其制备方法和应用。本发明的促血管化组织修复材料为支架材料，具有可控取向孔结构，有利于细胞的黏附、增殖、迁移和分化，具有促内皮细胞血管化的作用。
本发明通过结构仿生设计，采用原位有机/无机复合和冷冻干燥技术制备了具有定向孔结构的促血管化组织或器官修复材料PVA/HA-Si，在力学性能、结构取向性、降解性能和促血管化功能上均有改善，能广泛应用于组织工程和再生医学领域中，不仅可用于组织工程支架，还可用于软组织的损伤修复，在组织或器官的缺损治疗和修复等方面具有广阔的应用前景。
为了实现本发明的上述其中一个目的，本发明采用的技术方案如下：
一种具有定向孔结构的促血管化组织修复材料的制备方法，所述方法具体包括如下步骤：
1)常温下，将聚乙烯醇(PVA)在适量去离子水中搅拌至溶胀后，缓慢升温至70～90℃，继续搅拌至完全溶解，获得PVA溶液；
2)称取适量二水氯化钙(CaCl2·2H2O)，配置成CaCl2溶液，调节pH值至9～11后一次性全部加入到步骤1)获得的PVA溶液中，搅拌均匀，再将所得混合液在70～90℃条件下搅拌培育4h，获得PVA-CaCl2溶液；
3)常温下，将十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)溶于适量去离子水中，调节pH值至9～11后加入硅酸酯，混合均匀，搅拌水解10～60min，获得P/Si溶液；其中：所述十二水磷酸氢二钠与硅酸酯的摩尔比为11：1；
4)将步骤3)所述P/Si溶液逐滴加入到步骤2)所得PVA-CaCl2溶液中，滴加结束后，继续在70～90℃条件下搅拌并封口反应30min，反应完成后，搅拌冷却至常温，超声除气泡，获得PVA/HA-Si水溶液；
5)将步骤4)所述PVA/HA-Si水溶液转移至模具中，然后将所述模具放置在-80℃冰箱预冷的冷冻铜板上，待最上层溶液结冰时完成定向冷冻，最后冷冻干燥后倒出，获得所述的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si。
具体地，上述技术方案，步骤1)中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
进一步地，上述技术方案，步骤1)中所述PVA为麦克林1788型，分子量为110000～130000Da。
进一步地，上述技术方案，步骤1)中所述PVA溶液中，PVA的浓度为1～5wt％，较优选3wt％。
进一步地，上述技术方案，步骤1)中所述搅拌可采用磁力搅拌器进行搅拌，为防止PVA粘在烧瓶壁上，所述磁力搅拌器的转速优选为100～200r/min。
进一步地，上述技术方案，步骤2)中所述CaCl2溶液的浓度为0.1～1mol/L，较优选为0.5mol/L。
进一步地，上述技术方案，步骤2)、步骤3)中pH值调节剂均优选为氨水。
更进一步地，上述技术方案，所述氨水优选将浓度为25wt％的浓氨水与去离子水按体积比1：1配制，配制所得氨水的浓度约为6mol/L。
进一步地，上述技术方案，步骤2)、步骤3)中pH值均优选调节至11。
具体地，上述技术方案，步骤2)中所述CaCl2溶液的加入方式为直接倒入。
进一步地，上述技术方案，步骤2)和步骤3)中所述搅拌采用的磁力搅拌器的转速均为300～400r/min。
进一步地，上述技术方案，步骤2)中所述聚乙烯醇与二水氯化钙的质量比为2～3：1。
进一步地，上述技术方案，步骤3)中所述硅酸酯为正硅酸甲酯、正硅酸四乙酯(TEOS)、正硅酸丙酯、正硅酸丁酯、聚硅酸乙酯中的一种或多种，其中聚硅酸乙酯SiO2质量分数为28％～40％。
更进一步地，上述技术方案，所述正硅酸四乙酯的密度为0.923～0.936g/mol(20℃)。
进一步地，上述技术方案，步骤4)中所述P/Si溶液的滴加速度为1～3滴/s。
进一步地，上述技术方案，步骤4)中所述超声除气泡的时间不限，其目的在于使气泡完全消除，超声时间一般为20～40min，较优选为30min。
进一步地，上述技术方案，步骤4)中所述搅拌采用的磁力搅拌器的转速均为600～800r/min，此步骤中，搅拌的目的在于防止PVA/HA-Si团聚。
进一步地，上述技术方案，步骤5)中所述模具优选为圆柱形，所述圆柱形模具的直径为2cm，高为0.5cm；所述模具优选采用PE材质。
进一步地，上述技术方案，步骤5)中所述铜板温度为-80℃，可根据所需孔径调整温度。
本发明的第二个目的在于提供上述所述方法制备的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si，其中：所述HA-Si分子式为Ca10(PO4)5.5(SiO4)0.5(OH)1.5。
进一步地，上述技术方案，所述促血管化组织修复材料PVA/HA-Si中，HA-Si质量为PVA质量的5～20％。较优选5％，10％，15％，20％。
本发明第三个目的在于提供上述所述方法制得的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料的应用，可用于组织工程支架、软组织损伤修复、组织或器官的缺损治疗和修复等。
本发明的原理如下：
本发明通过结构仿生设计，采用原位有机/无机复合和冷冻干燥技术制备了具有定向孔结构的促血管化组织或器官修复材料PVA/HA-Si，在力学性能、结构取向性、降解性能和促血管化功能上均有改善，能广泛应用于组织工程和再生医学领域中，不仅可用于组织工程支架，还可用于软组织的损伤修复，在组织或器官的缺损治疗和修复等方面具有广阔的应用前景。
本发明利用聚乙烯醇侧基上的羟基与钙离子相互作用，掺硅羟基磷灰石可以通过原位合成的方法在PVA的表面成核生长，均匀分散在PVA溶液中，减小HA-Si的团聚。由于PVA本身是半结晶聚合物，可在低温下通过链与链间氢键的形成微晶达到物理交联。定向冷冻过程中，随着冰晶的形成，PVA逐渐形成微晶完成物理交联，冷冻干燥之后形成相互联通的竖直通道。取向通道有助于细胞的长入，PVA表面的无机颗粒增强了细胞的黏附效果，随着材料降解，释放出来的钙离子、磷离子、硅离子等激活细胞内的血管化相关信号通路，调控细胞生长迁移和分化，诱导毛细血管的新生与形成。本发明制备的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si的力学性能优异，且本发明采用-80℃预冷铜板定向冷冻的方法改善了材料结构的定向性，得到更为接近天然ECM的竖直取向结构，更利于细胞的粘附，诱导细胞迁移和分化。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明制备的支架材料具备的定向多孔结构有利于内皮细胞的黏附，增殖和分化，材料降解释放出来的钙离子、磷离子、硅离子等为组织损伤的修复以及愈合提供细胞生长的微环境，诱导内皮细胞的血管化，促进血管生成的功能。加快血管的新生与血管网络的构建，为损伤修复提供养分，加快伤口的愈合。另外，本专利对材料力学性能适配性做了探讨，改善了力学性能，且对于骨髓间充质干细胞BMSCs和成纤维细胞L929，均体现出优良的细胞活性和粘附性(图8-11)。
2)由于掺硅羟基磷灰石良好的生物相容性以及稳定性，通过原位合成分散在PVA的表面，增强了力学性能，促进PVA的细胞黏附效果，促进细胞的黏附与生长，同时调节PVA降解时释放的酸性物质，维持微环境的稳定性。
3)利用铜的良好导热性，在铜板上缓慢定向冷冻，可控制备取向孔径的同时完成PVA的物理交联。相对于现有技术中使用液氮完成交联的方式，该发明工艺稳定，安全系数高，可控性高，且得到更为接近天然ECM的竖直取向结构，更利于细胞的粘附，诱导细胞迁移和分化。
附图说明
图1为本发明实施案例1制备的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si横截面SEM图；
图2为本发明实施案例1制备的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si纵截面SEM图；
图3为本发明实施案例1制备的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si中原位合成的HA-Si形貌SEM图；
图4为本发明实施案例1制备的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si、对比例1制备的未经Si掺杂的支架材料PVA/HA以及对比例5制备的PVA支架材料的FTIR图；
图5为本发明实施案例1制备的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si、对比例1制备的未经Si掺杂的支架材料PVA/HA以及对比例5制备的PVA支架材料的XRD图；
图6为本发明实施案例2制备的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si、对比例2制备的未经Si掺杂的支架材料PVA/HA以及对比例5制备的PVA支架材料的压缩模量和压缩强度对比图；
图7为本发明实施案例1制备的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si、对比例1制备的未经Si掺杂的支架材料PVA/HA以及对比例5制备的PVA，以及空白组的的毒性柱状图(HUVECs细胞)；
图8为本发明实施案例3制备的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si、对比例3制备的未经Si掺杂的支架材料PVA/HA以及对比例5制备的PVA支架材料的毒性柱状图(BMSCs细胞)；
图9为本发明实施案例3制备的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si、对比例3制备的未经Si掺杂的支架材料PVA/HA以及对比例5制备的PVA支架材料的毒性柱状图(L929细胞)；
图10为本发明实施案例3制备的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si、对比例3制备的未经Si掺杂的支架材料PVA/HA以及对比例5制备的PVA支架材料的核膜染色对比图(BMSCs细胞)；
图11为本发明实施案例3制备的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si、对比例3制备的未经Si掺杂的支架材料PVA/HA以及对比例5制备的PVA支架材料的核膜染色对比图(L929细胞)。
具体实施方式
下面通过实施案例对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施案例。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
下述实施例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市购等商业途径得到的原料和试剂。
实施例1
本实施例的一种具有定向孔结构的促血管化组织修复材料的制备方法，所述方法具体包括如下步骤：
1)常温下，量取47mL去离子水，加入1.5465g聚乙烯醇(PVA)，在常温下搅拌30min直至溶胀，然后放入水浴锅中在20min内缓慢升温至85℃，继续搅拌直至全部溶解，获得PVA溶液；其中：所述PVA为麦克林1788型，分子量为110000～130000Da；所述PVA溶液中PVA的浓度为3wt％，搅拌采用的磁力搅拌器转速为200r/min；
2)称取3.6755g(0.025mol)二水氯化钙(CaCl2·2H2O)，加入50mL去离子水，常温下搅拌溶解，配置成CaCl2溶液；吸取1.5mL所述CaCl2溶液用氨水调节pH值至11后一次性全部加入到步骤1)所得PVA溶液中，搅拌均匀，再将所得混合液在70～90℃条件下搅拌培育4h，获得PVA-CaCl2溶液；其中：所述氨水的浓度约为6mol/L，是由25％浓氨水与去离子水按体积比1：1配制而成；所述CaCl2溶液的浓度为0.5mol/L；所述搅拌采用的磁力搅拌器转速为300r/min；
3)称取4.9244g十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，加入50mL的去离子水，常温下搅拌溶解，得到十二水磷酸氢二钠溶液，吸取1.5mL所述十二水磷酸氢二钠溶液用氨水调节pH值至11；然后加入0.95uL正硅酸四乙酯(TEOS)，搅拌水解30min，获得P/Si溶液；其中：所述氨水为25％浓氨水与去离子水按体积比为1：1配制，所述氨水的浓度约为6mol/L，所述正硅酸四乙酯的密度为0.923～0.936g/mol(20℃)；所述硅、磷的摩尔比为1：11；所述搅拌采用的磁力搅拌器转速为300r/min；
4)将步骤3)所述P/Si溶液逐滴加入到步骤2)所得PVA-CaCl2溶液中，滴加完毕后，继续在70～90℃条件下磁力搅拌并封口反应30min，反应完成后，将反应体系从水浴锅中取出，常温下搅拌30min至室温，超声去除气泡30min，获得PVA/HA-Si水溶液；其中：所述P/Si溶液的滴加速度为1滴/s；所述搅拌采用的磁力搅拌器转速为600r/min；所述PVA/HA-Si水溶液中，HA-Si的质量为PVA质量的5％；
5)将步骤4)所述PVA/HA-Si水溶液转移至模具中，然后将所述模具放置在-80℃冰箱预冷的冷冻铜板上，待最上层溶液结冰时完成定向冷冻，最后冷冻干燥后倒出，获得所述的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si；其中：所述铜板冷冻时间为1h。
实施例2
本实施例的一种具有定向孔结构的促血管化组织修复材料的制备方法，所述方法具体包括如下步骤：
1)常温下，量取43mL去离子水，加入1.5465g聚乙烯醇(PVA)，在常温下搅拌30min直至溶胀，然后放入水浴锅中在20min内缓慢升温至85℃，继续搅拌直至全部溶解，获得PVA溶液；其中：所述PVA为麦克林1788型，分子量为110000～130000Da；所述PVA溶液中PVA的浓度为3wt％，搅拌采用的磁力搅拌器转速为200r/min；
2)称取3.6755g(0.025mol)二水氯化钙(CaCl2·2H2O)，加入50mL去离子水，常温下搅拌溶解，配置成CaCl2溶液；吸取3.5mL所述CaCl2溶液用氨水调节pH值至11后一次性全部加入到步骤1)所得PVA溶液中，搅拌均匀，再将所得混合液在70～90℃条件下搅拌培育4h，获得PVA-CaCl2溶液；其中：所述氨水的浓度约为6mol/L，是由25％浓氨水与去离子水按体积比1：1配制而成；所述CaCl2溶液的浓度为0.5mol/L；所述搅拌采用的磁力搅拌器转速为300r/min；
3)称取4.9244g十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，加入50mL的去离子水，常温下搅拌溶解，得到十二水磷酸氢二钠溶液；然后吸取3.5mL所述十二水磷酸氢二钠溶液用氨水调节pH值至11，加入1.95uL正硅酸四乙酯(TEOS)，搅拌水解30min，获得P/Si溶液；其中：所述氨水为25％浓氨水与去离子水按体积比为1：1配制，所述氨水的浓度约为6mol/L，所述正硅酸四乙酯的密度为0.923～0.936g/mol(20℃)；所述硅、磷的摩尔比为1：11；所述搅拌采用的磁力搅拌器转速为300r/min；
4)将步骤3)所述P/Si溶液逐滴加入到步骤2)所得PVA-CaCl2溶液中，滴加完毕后，继续在70～90℃条件下磁力搅拌并封口反应30min，反应完成后，将反应体系从水浴锅中取出，常温下搅拌30min至室温，超声去除气泡30min，获得PVA/HA-Si水溶液；其中：所述P/Si溶液的滴加速度为1滴/s；所述PVA/HA-Si水溶液中，HA-Si的质量为PVA质量的10％；所述搅拌采用的磁力搅拌器转速为600r/min；
5)将步骤4)所述PVA/HA-Si水溶液转移至模具中，然后将所述模具放置在-80℃冰箱预冷的冷冻铜板上，待最上层溶液结冰时完成定向冷冻，最后冷冻干燥后倒出，获得所述的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si；其中：所述铜板冷冻时间为1h。
实施例3
本实施例的一种具有定向孔结构的促血管化组织修复材料的制备方法，所述方法具体包括如下步骤：
1)常温下，量取39mL去离子水，加入1.5465g聚乙烯醇(PVA)，在常温下搅拌30min直至溶胀，然后放入水浴锅中在20min内缓慢升温至85℃，继续搅拌直至全部溶解，获得PVA溶液；其中：所述PVA为麦克林1788型，分子量为110000～130000Da；所述PVA溶液中PVA的浓度为3wt％，搅拌采用的磁力搅拌器转速为200r/min；
2)称取3.6755g(0.025mol)二水氯化钙(CaCl2·2H2O)，加入50mL去离子水，常温下搅拌溶解，配置成CaCl2溶液；吸取5.5mL所述CaCl2溶液用氨水调节pH值至11后一次性全部加入到步骤1)所得PVA溶液中，搅拌均匀，再将所得混合液在70～90℃条件下搅拌培育4h，获得PVA-CaCl2溶液；其中：所述氨水的浓度约为6mol/L，是由25％浓氨水与去离子水按体积比1：1配制而成；所述CaCl2溶液的浓度为0.5mol/L；所述搅拌采用的磁力搅拌器转速为300r/min；
3)称取4.9244g十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，加入50mL的去离子水，常温下搅拌溶解，得到十二水磷酸氢二钠溶液；然后吸取5.5mL所述十二水磷酸氢二钠溶液用氨水调节pH值至11，加入3.1uL正硅酸四乙酯(TEOS)，搅拌水解30min，获得P/Si溶液；其中：所述氨水为25％浓氨水与去离子水按体积比为1：1配制，所述氨水的浓度约为6mol/L，所述正硅酸四乙酯的密度为0.923～0.936g/mol(20℃)；所述硅、磷的摩尔比为1：11；所述搅拌采用的磁力搅拌器转速为300r/min；
4)将步骤3)所述P/Si溶液逐滴加入到步骤2)所得PVA-CaCl2溶液中，滴加完毕后，继续在70～90℃条件下磁力搅拌并封口反应30min，反应完成后，将反应体系从水浴锅中取出，常温下搅拌30min至室温，超声去除气泡30min，获得PVA/HA-Si水溶液；其中：所述P/Si溶液的滴加速度为1滴/s；所述PVA/HA-Si水溶液中，HA-Si的质量为PVA质量的15％；所述搅拌采用的磁力搅拌器转速为600r/min；
5)将步骤4)所述PVA/HA-Si水溶液转移至模具中，然后将所述模具放置在-80℃冰箱预冷的冷冻铜板上，待最上层溶液结冰时完成定向冷冻，最后冷冻干燥后倒出，获得所述的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si；其中：所述铜板冷冻时间为1h。
实施例4
本实施例的一种具有定向孔结构的促血管化组织修复材料的制备方法，所述方法具体包括如下步骤：
1)常温下，量取34mL去离子水，加入1.5465g聚乙烯醇(PVA)，在常温下搅拌30min直至溶胀，然后放入水浴锅中在20min内缓慢升温至85℃，继续搅拌直至全部溶解，获得PVA溶液；其中：所述PVA为麦克林1788型，分子量为110000～130000Da；所述PVA溶液中PVA的浓度为3wt％，搅拌采用的磁力搅拌器转速为200r/min；
2)称取3.6755g(0.025mol)二水氯化钙(CaCl2·2H2O)，加入50mL去离子水，常温下搅拌溶解，配置成CaCl2溶液；吸取8mL所述CaCl2溶液用氨水调节所述CaCl2溶液的pH值至11后一次性全部加入到步骤1)所得PVA溶液中，搅拌均匀，再将所得混合液在70～90℃条件下搅拌培育4h，获得PVA-CaCl2溶液；其中：所述氨水的浓度约为6mol/L，是由25％浓氨水与去离子水按体积比1：1配制而成；所述CaCl2溶液的浓度为0.5mol/L；所述搅拌采用的磁力搅拌器转速为300r/min；
3)称取4.9244g十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，加入50mL的去离子水，常温下搅拌溶解，得到十二水磷酸氢二钠溶液；然后吸取8mL所述十二水磷酸氢二钠溶液用氨水调节pH值至11，加入4.4uL正硅酸四乙酯(TEOS)，搅拌水解30min，获得P/Si溶液；其中：所述氨水为25％浓氨水与去离子水按体积比为1：1配制，所述氨水的浓度约为6mol/L，所述正硅酸四乙酯的密度为0.923～0.936g/mol(20℃)；所述硅、磷的摩尔比为1：11；所述搅拌采用的磁力搅拌器转速为300r/min；
4)将步骤3)所述P/Si溶液逐滴加入到步骤2)所得PVA-CaCl2溶液中，滴加完毕后，继续在70～90℃条件下磁力搅拌并封口反应30min，反应完成后，将反应体系从水浴锅中取出，常温下搅拌30min至室温，超声去除气泡30min，获得PVA/HA-Si水溶液；其中：所述P/Si溶液的滴加速度为1滴/s；所述PVA/HA-Si水溶液中，HA-Si的质量为PVA质量的20％；所述搅拌采用的磁力搅拌器转速为600r/min；
5)将步骤4)所述PVA/HA-Si水溶液转移至模具中，然后将所述模具放置在-80℃冰箱预冷的冷冻铜板上，待最上层溶液结冰时完成定向冷冻，最后冷冻干燥后倒出，获得所述的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si；其中：所述铜板冷冻时间为1h。
对比例1
本对比例的一种未经Si掺杂的支架材料PVA/HA的制备方法，所述方法与实施例1基本相同，区别在于：本对比例步骤3)中十二水磷酸氢二钠的用量为5.3721g，且不添加正硅酸四乙酯。
本对比例所述方法具体包括如下步骤：
1)常温下，量取47mL去离子水，加入1.5465g聚乙烯醇(PVA)，在常温下搅拌30min直至溶胀，然后放入水浴锅中在20min内缓慢升温至85℃，继续搅拌直至全部溶解，获得PVA溶液；其中：所述PVA为麦克林1788型，分子量为110000～130000Da；所述PVA溶液中PVA的浓度为3wt％，搅拌采用的磁力搅拌器转速为200r/min；
2)称取3.6755g(0.025mol)二水氯化钙(CaCl2·2H2O)，加入50mL去离子水，常温下搅拌溶解，配置成CaCl2溶液；吸取1.5mL所述CaCl2溶液用氨水调节pH值至11后一次性全部加入到步骤1)所得PVA溶液中，搅拌均匀，再将所得混合液在70～90℃条件下搅拌培育4h，获得PVA-CaCl2溶液；其中：所述氨水的浓度约为6mol/L，是由25％浓氨水与去离子水按体积比1：1配制而成；所述CaCl2溶液的浓度为0.5mol/L；所述搅拌采用的磁力搅拌器转速为300r/min；
3)称取5.3721g十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，加入50mL的去离子水，常温下搅拌溶解，得到十二水磷酸氢二钠溶液，吸取1.5mL所述十二水磷酸氢二钠溶液用氨水调节pH值至11，获得P溶液；其中：所述氨水为25％浓氨水与去离子水按体积比为1：1配制，所述氨水的浓度约为6mol/L，所述搅拌采用的磁力搅拌器转速为300r/min；
4)将步骤3)所述P溶液逐滴加入到步骤2)所得PVA-CaCl2溶液中，滴加完毕后，继续在70～90℃条件下磁力搅拌并封口反应30min，反应完成后，将反应体系从水浴锅中取出，常温下搅拌30min至室温，超声去除气泡30min，获得PVA/HA水溶液；其中：所述P溶液的滴加速度为1滴/s；所述搅拌采用的磁力搅拌器转速为600r/min；所述PVA/HA水溶液中，HA的质量为PVA质量的5％；
5)将步骤4)所述PVA/HA水溶液转移至模具中，然后将所述模具放置在-80℃冰箱预冷的冷冻铜板上，待最上层溶液结冰时完成定向冷冻，最后冷冻干燥后倒出，获得所述的未经Si掺杂的支架材料PVA/HA；其中：所述铜板冷冻时间为1h。
对比例2
本对比例的一种未经Si掺杂的支架材料PVA/HA的制备方法，所述方法与实施例2基本相同，区别在于：本对比例步骤3)中十二水磷酸氢二钠的用量为5.3721g，且不添加正硅酸四乙酯。
本对比例所述方法具体包括如下步骤：
1)常温下，量取43mL去离子水，加入1.5465g聚乙烯醇(PVA)，在常温下搅拌30min直至溶胀，然后放入水浴锅中在20min内缓慢升温至85℃，继续搅拌直至全部溶解，获得PVA溶液；其中：所述PVA为麦克林1788型，分子量为110000～130000Da；所述PVA溶液中PVA的浓度为3wt％，搅拌采用的磁力搅拌器转速为200r/min；
2)称取3.6755g(0.025mol)二水氯化钙(CaCl2·2H2O)，加入50mL去离子水，常温下搅拌溶解，配置成CaCl2溶液；吸取3.5mL所述CaCl2溶液用氨水调节pH值至11后一次性全部加入到步骤1)所得PVA溶液中，搅拌均匀，再将所得混合液在70～90℃条件下搅拌培育4h，获得PVA-CaCl2溶液；其中：所述氨水的浓度约为6mol/L，是由25％浓氨水与去离子水按体积比1：1配制而成；所述CaCl2溶液的浓度为0.5mol/L；所述搅拌采用的磁力搅拌器转速为300r/min；
3)称取5.3721g十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，加入50mL的去离子水，常温下搅拌溶解，得到十二水磷酸氢二钠溶液；然后吸取3.5mL所述十二水磷酸氢二钠溶液用氨水调节pH值至11，获得P溶液；其中：所述氨水为25％浓氨水与去离子水按体积比为1：1配制，所述氨水的浓度约为6mol/L，所述搅拌采用的磁力搅拌器转速为300r/min；
4)将步骤3)所述P溶液逐滴加入到步骤2)所得PVA-CaCl2溶液中，滴加完毕后，继续在70～90℃条件下磁力搅拌并封口反应30min，反应完成后，将反应体系从水浴锅中取出，常温下搅拌30min至室温，超声去除气泡30min，获得PVA/HA水溶液；其中：所述P溶液的滴加速度为1滴/s；所述PVA/HA水溶液中，HA的质量为PVA质量的10％；所述搅拌采用的磁力搅拌器转速为600r/min；
5)将步骤4)所述PVA/HA水溶液转移至模具中，然后将所述模具放置在-80℃冰箱预冷的冷冻铜板上，待最上层溶液结冰时完成定向冷冻，最后冷冻干燥后倒出，获得所述的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA；其中：所述铜板冷冻时间为1h。
对比例3
本对比例的一种未经Si掺杂的支架材料PVA/HA的制备方法，所述方法与实施例3基本相同，区别在于：本对比例步骤3)中十二水磷酸氢二钠的用量为5.3721g，且不添加正硅酸四乙酯。
本对比例所述方法具体包括如下步骤：
1)常温下，量取39mL去离子水，加入1.5465g聚乙烯醇(PVA)，在常温下搅拌30min直至溶胀，然后放入水浴锅中在20min内缓慢升温至85℃，继续搅拌直至全部溶解，获得PVA溶液；其中：所述PVA为麦克林1788型，分子量为110000～130000Da；所述PVA溶液中PVA的浓度为3wt％，搅拌采用的磁力搅拌器转速为200r/min；
2)称取3.6755g(0.025mol)二水氯化钙(CaCl2·2H2O)，加入50mL去离子水，常温下搅拌溶解，配置成CaCl2溶液；吸取5.5mL所述CaCl2溶液用氨水调节pH值至11后一次性全部加入到步骤1)所得PVA溶液中，搅拌均匀，再将所得混合液在70～90℃条件下搅拌培育4h，获得PVA-CaCl2溶液；其中：所述氨水的浓度约为6mol/L，是由25％浓氨水与去离子水按体积比1：1配制而成；所述CaCl2溶液的浓度为0.5mol/L；所述搅拌采用的磁力搅拌器转速为300r/min；
3)称取5.3721g十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，加入50mL的去离子水，常温下搅拌溶解，得到十二水磷酸氢二钠溶液；然后吸取5.5mL所述十二水磷酸氢二钠溶液用氨水调节pH值至11，获得P溶液；其中：所述氨水为25％浓氨水与去离子水按体积比为1：1配制，所述氨水的浓度约为6mol/L，所述搅拌采用的磁力搅拌器转速为300r/min；
4)将步骤3)所述P溶液逐滴加入到步骤2)所得PVA-CaCl2溶液中，滴加完毕后，继续在70～90℃条件下磁力搅拌并封口反应30min，反应完成后，将反应体系从水浴锅中取出，常温下搅拌30min至室温，超声去除气泡30min，获得PVA/HA水溶液；其中：所述P溶液的滴加速度为1滴/s；所述PVA/HA水溶液中，HA的质量为PVA质量的15％；所述搅拌采用的磁力搅拌器转速为600r/min；
5)将步骤4)所述PVA/HA水溶液转移至模具中，然后将所述模具放置在-80℃冰箱预冷的冷冻铜板上，待最上层溶液结冰时完成定向冷冻，最后冷冻干燥后倒出，获得所述的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA；其中：所述铜板冷冻时间为1h。
对比例4
本对比例的一种未经Si掺杂的支架材料PVA/HA的制备方法，所述方法与实施例4基本相同，区别在于：本对比例步骤3)中十二水磷酸氢二钠的用量为5.3721g，且不添加正硅酸四乙酯。
本对比例所述方法具体包括如下步骤：
1)常温下，量取34mL去离子水，加入1.5465g聚乙烯醇(PVA)，在常温下搅拌30min直至溶胀，然后放入水浴锅中在20min内缓慢升温至85℃，继续搅拌直至全部溶解，获得PVA溶液；其中：所述PVA为麦克林1788型，分子量为110000～130000Da；所述PVA溶液中PVA的浓度为3wt％，搅拌采用的磁力搅拌器转速为200r/min；
2)称取3.6755g(0.025mol)二水氯化钙(CaCl2·2H2O)，加入50mL去离子水，常温下搅拌溶解，配置成CaCl2溶液；吸取8mL所述CaCl2溶液用氨水调节所述CaCl2溶液的pH值至11后一次性全部加入到步骤1)所得PVA溶液中，搅拌均匀，再将所得混合液在70～90℃条件下搅拌培育4h，获得PVA-CaCl2溶液；其中：所述氨水的浓度约为6mol/L，是由25％浓氨水与去离子水按体积比1：1配制而成；所述CaCl2溶液的浓度为0.5mol/L；所述搅拌采用的磁力搅拌器转速为300r/min；
3)称取5.3721g十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，加入50mL的去离子水，常温下搅拌溶解，得到十二水磷酸氢二钠溶液；然后吸取8mL所述十二水磷酸氢二钠溶液用氨水调节pH值至11，获得P溶液；其中：所述氨水为25％浓氨水与去离子水按体积比为1：1配制，所述氨水的浓度约为6mol/L，所述搅拌采用的磁力搅拌器转速为300r/min；
4)将步骤3)所述P溶液逐滴加入到步骤2)所得PVA-CaCl2溶液中，滴加完毕后，继续在70～90℃条件下磁力搅拌并封口反应30min，反应完成后，将反应体系从水浴锅中取出，常温下搅拌30min至室温，超声去除气泡30min，获得PVA/HA水溶液；其中：所述P溶液的滴加速度为1滴/s；所述PVA/HA水溶液中，HA的质量为PVA质量的20％；所述搅拌采用的磁力搅拌器转速为600r/min；
5)将步骤4)所述PVA/HA水溶液转移至模具中，然后将所述模具放置在-80℃冰箱预冷的冷冻铜板上，待最上层溶液结冰时完成定向冷冻，最后冷冻干燥后倒出，获得所述的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA；其中：所述铜板冷冻时间为1h。
对比例5
本对比例的一种PVA支架材料的制备方法，所述方法具体包括如下步骤：
1)常温下，量取50mL去离子水，加入1.5465g聚乙烯醇(PVA)，在常温下搅拌30min直至溶胀，然后放入水浴锅中在20min内缓慢升温至85℃，继续搅拌直至全部溶解，获得PVA溶液；其中：所述PVA为麦克林1788型，分子量为110000～130000Da；所述PVA溶液中PVA的浓度为3wt％，搅拌采用的磁力搅拌器转速为200r/min；
2)用氨水调节步骤1)中所述PVA溶液的pH值至11后，将所得混合液在70～90℃条件下搅拌4.5h，其中：所述氨水的浓度约为6mol/L，是由25％浓氨水与去离子水按体积比1：1配制而成；所述搅拌采用的磁力搅拌器转速为300r/min；
3)将步骤2)的混合液从水浴锅中取出，常温下搅拌30min至室温，超声去除气泡30min，获得PVA水溶液；其中：所述搅拌采用的磁力搅拌器转速为600r/min；
4)将步骤3)所述PVA水溶液转移至模具中，然后将所述模具放置在-80℃冰箱预冷的冷冻铜板上，待最上层溶液结冰时完成定向冷冻，最后冷冻干燥后倒出，获得所述的PVA支架材料；其中：所述铜板冷冻时间为1h。
图1为本发明实施案例1制备的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si横截面SEM图。由图1可以看出，该材料孔隙率大于90％且孔径(100um左右)均一，利于营养物质的运输和细胞的迁移。
图2为本发明实施案例1制备的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si纵截面SEM图。由图2可以看出，该材料结构更为接近天然ECM的竖直取向结构，更利于细胞的粘附，诱导细胞迁移和分化。
图3为本发明实施案例1制备的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si中原位合成的HA-Si形貌SEM图。可以看出，HA-Si颗粒均匀分散在竖直取向结构的壁上，降解的钙、硅等离子不仅可中和PVA降解产物的酸性还可以通过离子通道参与细胞的生长、增殖、迁移和分化过程。
图4为本发明实施案例1制备的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si、对比例1制备的未经Si掺杂的支架材料PVA/HA以及对比例5制备的PVA支架材料的FTIR图。可以看出，在3320cm-1波数处可观察到PVA中-OH形成氢键的特征峰，当有HA、HA-Si组分加入时，在1143cm-1波数处出现钙离子与PVA作用的特征峰，表明HA、HA-Si纳米颗粒的存在。
图5为本发明实施案例1制备的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si、对比例1制备的未经Si掺杂的支架材料PVA/HA以及对比例5制备的PVA支架材料的XRD图。可以看出，图中出现了HA的特征峰，且相比于对比例1中未掺硅的PVA/HA，实施例1中制备的掺硅的PVA/HA-Si结晶度更高，且掺硅更有利于PVA的结晶。
图6为本发明实施案例2制备的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si、对比例2制备的未经Si掺杂的支架材料PVA/HA以及对比例5制备的PVA支架材料的压缩模量和压缩强度对比图。力学性能检测方法：柱状样品直径大约控制在20mm，高度约为6mm，压缩测试时，加载速度为2mm/min，样品压缩至原始高度的80％～90％后，停止加载。根据数据点绘制应力-应变曲线。压缩模量(E)的定义是应力-应变曲线初始线性部分(15％～30％)的斜率；压缩强度定义为20％应变处所对应的应力。由图6掺HA和掺硅HA的PVA材料力学性能检测图可以看出，随着无机成分的引入，压缩模量和压缩强度均有一定程度加强，掺硅HA的PVA材料力学性能与PVA和PVA/HA相比有显著性增强(*、#:P>0.05)，力学性能的可控性改善有利于增强材料的力学适配性，匹配应用于不同组织的修复。
本发明还对制备的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si、未经Si掺杂的支架材料PVA/HA以及PVA对细胞的毒性、对细胞的生长进行了研究：
细胞毒性实验具体方法如下：
用浓度为0.1M的PBS缓冲液(pH＝7.4)浸没材料使其溶胀，紫外照射12h。取出材料并清洗表面后加入培养液浸泡12h，将材料取出加入到5ml培养液中，放入37℃摇床中浸提24h。用材料浸提液分别培养人脐静脉血管内皮细胞(hUVECs)、骨髓间充质干细胞(BMSCs)和小鼠成纤维细胞(L929)细胞，对照组为细胞培养液，置于37℃，5％CO2的培养箱中，分别在24h和72h时采用CCK-8法测试细胞活性。
CCK-8法测试细胞活性方法如下：1.在96孔板中接种细胞悬液(10000个细胞/孔)，放在孵箱中培养12～24h；2.在每一孔中加入含不同材料的培养液；3.将培养板在培养箱孵育24h和72h；4.在每孔加入10μL的CCK-8溶液；5.将培养板置于培养箱内孵育1～6h；6.用酶标仪测定在450nm处及600nm处的吸光度(OD值)。
图7为本发明实施案例1制备的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si、对比例1制备的未经Si掺杂的支架材料PVA/HA以及对比例5制备的PVA，以及空白组(未添加任何材料)的的毒性柱状图(HUVECs细胞)。可以看出，与空白对照组相比，各组材料作用后内皮细胞的存活率无显著性差异，证明各组材料生物相容性良好，材料组中，掺杂HA-Si后OD值最高，说明PVA/HA-Si材料对血管内皮细胞的生物活性有较好的促进作用，有利于进一步刺激血管内皮细胞分泌血管生成相关因子，达到促血管化效果。
图8为本发明实施案例3制备的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si、对比例3制备的未经Si掺杂的支架材料PVA/HA以及对比例5制备的PVA支架材料的毒性柱状图(BMSCs细胞)。可以看出，与空白对照组相比，各组材料作用后BMSCs的存活率无显著性差异，证明各组材料生物相容性良好，掺杂无机材料后对BMSCs的生长生存没有影响(72h)。
图9为本发明实施案例3制备的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si、对比例3制备的未经Si掺杂的支架材料PVA/HA以及对比例5制备的PVA支架材料的毒性柱状图(L929细胞)。可以看出，与空白对照组相比，各组材料作用后L929细胞的存活率无显著性差异，证明各组材料生物相容性良好，材料组中，掺杂HA-Si后OD值最高，与空白对照组持平，说明PVA/HA-Si材料对L929细胞的生物活性有较好的促进作用，有利于进一步刺激该细胞分泌血管生成相关因子，达到促血管化效果。
本发明对制备的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si、未经Si掺杂的支架材料PVA/HA以及PVA支架材料对细胞的生长进行了研究，具体核膜染色实验如下：
材料在浓度为0.1M的PBS缓冲液(pH＝7.4)中溶胀，紫外照射12h后于培养液中浸泡12h。用培养液将BMSCs和L929细胞分别与材料共培养于48孔板中，同时设置空白对照组，然后置于37℃，5％CO2的培养箱中，培养12h后将培养液吸出，用PBS浸洗3次，每次3min；用4％的多聚甲醛固定15min，PBS浸洗3次，每次3min；滴加稀释好的鬼笔环肽染液(5μg/mL)，37℃孵育1h，PBST清洗3次，每次3min；滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST5min，4次洗去多余的DAPI；最后在荧光显微镜下观察材料表面细胞形态。
图10为本发明实施案例3制备的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si、对比例3制备的未经Si掺杂的支架材料PVA/HA以及对比例5制备的PVA支架材料的核膜染色对比图(BMSCs细胞)。可以看出，与纯PVA相比，加入HA、HA-Si的支架材料后BMSCs细胞生长和铺展均得到了显著提升，HA-Si组的细胞数量更多，铺展更好，说明掺杂Si对BMSCs细胞的生长和增殖有显著性提高，有利于进一步刺激该细胞作为种子细胞在皮肤修复应用中分泌促血管化相关因子，达到促血管化效果。
图11为本发明实施案例3制备的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si、对比例3制备的未经Si掺杂的支架材料PVA/HA以及对比例5制备的PVA支架材料的核膜染色对比图(L929细胞)。可以看出，与纯PVA相比，加入HA、HA-Si的支架材料后L929细胞生长和铺展均得到了显著提升，HA-Si组的细胞数量更多，铺展更好，说明掺杂Si对L929细胞的生长和增殖有显著性提高，有利于进一步刺激该细胞在作为种子细胞在皮肤修复应用中分泌血管生成相关因子，达到促血管化效果。

Claims (9)

1.一种具有定向孔结构的促血管化组织修复材料的制备方法，其特征在于：所述方法具体包括如下步骤：
1)常温下，将聚乙烯醇在适量去离子水中搅拌至溶胀后，缓慢升温至70～90℃，继续搅拌至完全溶解，获得PVA溶液；
2)称取适量二水氯化钙，配置成CaCl2溶液，调节pH值至9～11后一次性全部加入到步骤1)获得的PVA溶液中，搅拌均匀，再将所得混合液在70～90℃条件下搅拌培育4h，获得PVA-CaCl2溶液；
3)常温下，将十二水磷酸氢二钠溶于适量去离子水中，调节pH值至9～11后加入硅酸酯，混合均匀，搅拌水解10～60min，获得P/Si溶液；其中：所述十二水磷酸氢二钠与硅酸酯的摩尔比为11：1；
4)将步骤3)所述P/Si溶液逐滴加入到步骤2)所得PVA-CaCl2溶液中，滴加结束后，继续在70～90℃条件下搅拌并封口反应30min，反应完成后，搅拌冷却至常温，超声除气泡，获得PVA/HA-Si水溶液；
5)将步骤4)所述PVA/HA-Si水溶液转移至模具中，然后将所述模具放置在-80℃冰箱预冷的冷冻铜板上，待最上层溶液结冰时完成定向冷冻，最后冷冻干燥后倒出，获得所述的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si。
2.根据权利要求1所述的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述PVA溶液中，PVA的浓度为1～5wt％。
3.根据权利要求1所述的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述CaCl2溶液的浓度为0.1～1mol/L。
4.根据权利要求1所述的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述聚乙烯醇与二水氯化钙的质量比为2～3：1。
5.根据权利要求1所述的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料的制备方法，其特征在于：步骤3)中所述硅酸酯为正硅酸甲酯、正硅酸四乙酯、正硅酸丙酯、正硅酸丁酯、聚硅酸乙酯中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料的制备方法，其特征在于：步骤5)中所述铜板温度为-80℃。
7.权利要求1～6任一项所述的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料的制备方法制备得到的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si，其中：所述PVA/HA-Si中，HA-Si分子式为Ca10(PO4)5.5(SiO4)0.5(OH)1.5。
8.根据权利要求7所述的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料，其特征在于：所述促血管化组织修复材料PVA/HA-Si中，HA-Si质量为PVA质量的5～20％。
9.权利要求1～6任一项所述方法制备得到的具有定向孔结构的促血管化组织修复材料PVA/HA-Si在组织工程支架、软组织损伤修复、组织或器官的缺损治疗和修复中的应用。
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