CN108159502A - 柚皮苷微球丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合支架,制备原料包括柚皮苷、明胶微球、羟基磷灰石、丝素蛋白,复合支架由以下步骤制备而成:1)往明胶微球,滴加0.5‑1g/ml柚皮甘溶液,然后于2‑8℃中放置过夜后;进行冷冻干燥,便得到柚皮甘/明胶微球复合物;2)将羟基磷灰石、柚皮甘/明胶微球复合物与3.5wt%‑10wt%SF溶液混合后,注射于孔板中,随后,将该样品冷冻干燥,得到NG/GMs/HA/SF复合支架,本发明将应用传统的SF/HAp复合支架负载传统中药单体并应用符合骨微环境的明胶微球进行包裹,促进OVF的愈合且增强骨折椎体的力学强度,具有良好的流变性、易塑性、生物力学强度、以及较好的促成骨性能,从而能够适用于形状各异的骨缺损区,且效果持久,具有较强的骨组织修复能力,便于规模化推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程技术领域,具体涉及一种柚皮苷微球丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架及其制备方法。
背景技术
生物材料支架作为再生医学的三大要素之一,在骨重建过程中扮演着重要角色,因此在研究中常用于治疗OVF。在众多生物材料中,羟基磷灰石由于其较好的骨传导特性以及与骨组织类似的矿化过程和结构,在骨缺损再生研究方面备受关注。丝素蛋白是一类具有较高机械强度、可控生物降解能力、良好的生物相容性及易于处理等优点的天然生物高聚物。应用现代科学技术将丝素蛋白与羟基磷灰石制作成复合支架,既能集二者优点于一体,也避免了传统材料低承载压力、排斥反应、无法降解的缺点,是一类可用于OVF治疗的理想的、新型组织工程材料。近年来,中医药在防治OVF方面体现出其独特的优势,中药骨碎补具有补肾强骨,活血化瘀的功效,在临床常用于促进骨折愈合,柚皮苷是骨碎补主要有效成分之一,在促进骨形成,促进血管新生、抑制炎症效果显著。
聚甲基丙烯酸甲酯是常用的植入材料,尽管能够提供足够支撑强度和黏固作用,但也存在一些明显的缺点:在体内不能被降解吸收,生物相容性差,无生物活性,聚合时释放大量的热,未聚合单体有毒等,导致了在临床应用时常常会发生一些严重的并发症。为了提升患者的生活质量,寻找具有良好生物相容性并能提供足够支撑强度的生物材料是现阶段研究的热点。自体骨、硫酸钙、磷酸钙、硅酸钙等具有良好的可吸收性、生物相容性、骨传导性等特点,因而成为众多研究的焦点。自体骨移植仍然是当今促进骨折愈合的金标准材料,但因能移植的自体骨数量有限、骨供区的并发症而受到限制。羟基磷灰石(hydroxyapatite,HAp)是以磷酸钙为主要成分,因其具有较好的骨传导特性,并与生物骨组织矿化过程类似,与骨祖细胞等的整合素超家族表面分子相互作用具有一定骨诱导作用,故在再生医学领域作为理想支架备受关注。研究证实,在体内,HAp能促进大鼠细胞外基质提供胶原基质到细胞内,在细胞迁移、生长增殖、分化和细胞稳态维持发挥重要作用,从而促进骨再生;在体外,HAp与骨髓干细胞相互作用能诱导成骨因子(如Cabf1或Runx)释放从而促进干细胞增殖和成骨分化。但同时HAp抗压强度低、脆性大、吸收率较慢等的缺点也在很大程度上影响了它在临床上的应用。因此,为了更好地满足临床需求,以HA p为主要成分、与其他一种或多种材料复合改进性能的方式成为近年来的研究热点。丝素蛋白(silkfibro in,SF)是一种从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白结构与骨骼胶原相似,无明显抗原性,植入骨骼中不发生明显的排异反应,具有良好的生物相容性,并且有利于钙盐的沉积。研究发现,SF能刺激成骨分化因子的高表达,促进成骨细胞早期和晚期成骨分化,但体内实验观察仅发现提供宿主细胞增殖的环境,未发现明显的骨形成。研究表明,不同浓度丝素蛋白与HAp进行混合能不同程度增加复合材料的抗压强度,且SF/HAp复合支架较单纯HAp支架增加成骨细胞增殖和分化率,通过细胞-材料信号通路促进骨再生。因此,应用HAp/SF治疗OVF是较为理想的复合支架材料。
因此,本发明拟负载骨碎补柚皮苷明胶微球于丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架治疗OVF,一方面为开发及临床推广新型的应用型材料治疗OVF奠定基础,开辟组织工程的新方向,另一方面为实现中药局部缓释起效提供理论依据,丰富中医药现代理论。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种将骨碎补柚皮苷应用明胶微球包裹并负载于SF/HAp复合支架内,用于治疗骨质疏松性椎体骨折的复合支架。
为实现上述目的,所采取的技术方案:
一种复合支架,所述复合支架的制备原料包括柚皮苷、明胶微球、羟基磷灰石、丝素蛋白。
中药骨碎补具有补肾强骨、活血化瘀的功效,其治疗骨质疏松、促进骨折愈合的效果已经获得公认。其有效成分柚皮苷具有促进骨形成、血管新生、抑制炎症反应的作用,在体内系统给药能显著提高骨量,改善骨微细结构,降低骨折风险,体外能促进成骨细胞增殖、分化,抑制破骨形成。明胶微球具有的生物可降解性、生物相容性,是不可多得的载体材料,被广泛应用于不同领域,使用明胶微球包裹柚皮苷,具有控制药物释放、延长药物疗效的作用,从而提高药物的稳定性,降低药物的不良反应,同时其自身具有抗炎作用。研究表明,骨碎补柚皮苷明胶微球能显著增加成骨细胞粘附、增殖、分化和矿化,抑制破骨细胞的形成。SF能刺激成骨分化因子的高表达,促进成骨细胞早期和晚期成骨分化,但体内实验观察仅发现提供宿主细胞增殖的环境,未发现明显的骨形成。研究表明,不同浓度丝素蛋白与HAp进行混合能不同程度增加复合材料的抗压强度,且SF/HAp复合支架较单纯HAp支架增加成骨细胞增殖和分化率,通过细胞-材料信号通路促进骨再生为了进一步促进OVF的愈合且增强骨折椎体的力学强度,我们将骨碎补柚皮苷明胶微球负载于SF/HAp复合支架,该新型复合支架材料对治疗骨折具有显著作用。
优选地,所述柚皮苷、明胶微球、羟基磷灰石、丝素蛋白的质量比为(2-4):(1-2):(1-2):(7-20)。
优选地,所述复合支架由以下步骤制备而成:
1)往明胶微球,滴加0.5-1g/ml柚皮甘溶液,然后于2-8℃中放置过夜后;进行冷冻干燥,便可以得到柚皮甘/明胶微球复合物;
2)将羟基磷灰石、柚皮甘/明胶微球复合物与3.5wt%-10wt%SF溶液混合后,注射于孔板中,随后,将该样品冷冻干燥,得到NG/GMs/HA/SF复合支架。
一种所述的复合支架的制备方法,包括以下步骤:
1)往明胶微球,滴加0.5-1g/ml柚皮甘溶液,然后于2-8℃中放置过夜后;进行冷冻干燥,便可以得到柚皮甘/明胶微球复合物;
2)将羟基磷灰石、柚皮甘/明胶微球复合物与3.5wt%-10wt%SF溶液混合后,注射于孔板中,随后,将该样品冷冻干燥,得到NG/GMs/HA/SF复合支架。
优选地,所述明胶微球的球径为20-40μm。
优选地,所述步骤1)中明胶微球采用以下方法制备:将0.05~0.1g山梨糖醇酐油酸酯加到盛有100ml植物油的烧瓶中于40-60℃水浴加热搅拌0.5-2h,混合均匀后。滴加10ml 5-10wt%明胶水溶液,持续搅拌3h后,将混合溶液转移至冰浴搅拌30min。然后加入0.1-1ml,2.5-25wt%戊二醛水溶液,继续搅拌2-4h后,加入30-100ml,4℃的丙酮,搅拌30min后,静置,过滤,便可以得到明胶微球;将微球泡在10-50ml丙酮中,放置于4℃的冰箱中,固化24h后用1mol/L氨基乙酸浸泡30min;然后,离心,取沉淀,洗涤沉淀物,将清洗后得到的明胶微球置于去离子水中,于浸泡过夜,冷冻干燥,得到明胶微球。
优选地,所述丝素蛋白溶液由蚕茧中提取。
优选地,所述柚皮苷溶液的制备方法为将柚皮苷溶解于1ml的乙醇中,得到浓度为0.5-1g/ml的柚皮苷/乙醇溶液。
优选地,所述羟基磷灰石的制备方法为:将100ml,0.3mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到100ml0.5mol/L的硝酸钙溶液中,机械搅拌,并且同时60-80℃水浴加热/2h。在搅拌反应过程中,pH值维持在10,反应结束后,在室温下陈化24h,然后通过离心收集,并且用去离子水清洗,最后,将收集到的纳米颗粒,进行冷冻干燥,便可以得到纳米羟基磷灰石颗粒。
优选地,所述步骤1)中冷冻干燥条件为-60℃冷冻干燥24h。
本发明的有益效果:
1、本发明将应用传统的SF/HAp复合支架负载传统中药单体(中药骨碎补具有补肾强骨、活血化瘀的功效,其治疗骨质疏松、促进骨折愈合的效果已经获得公认。其有效成分柚皮苷具有促进骨形成、血管新生、抑制炎症反应的作用,在体内系统给药能显著提高骨量,改善骨微细结构,降低骨折风险,体外能促进成骨细胞增殖、分化,抑制破骨形成,并应用符合骨微环境的明胶微球进行包裹,促进OVF的愈合且增强骨折椎体的力学强度。
2、本发明提供的柚皮苷/明胶微球/纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合支架,具有良好的流变性、易塑性、生物力学强度、以及较好的促成骨性能,从而能够适用于形状各异的骨缺损区,且效果持久,具有较强的骨组织修复能力,便于规模化推广应用。
3、OVF造成的经济损失是全世界所面临和关注的最大难题之一,据报道在美国,每年需要花费131亿美元治疗OVF,而在我国,尽管没有具体的数据统计,但作为老年化趋势的发展中国家,所承载的经济损失也是不可忽视的。因而促进骨折愈合是降低OVF致残率、致死率,改善OVF患者生活质量,减少国民经济负担的关键点。本发明研制负载骨碎补柚皮苷明胶微球于丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架治疗OVF,对于改善OVF患者生活质量,减少国民经济负担意义重大。
附图说明
图1是本发明在100um扫描电镜下观察结构图;
图2为本发明在20um扫描电镜下观察结构图;
图3为本发明的缓释效果图;
图4为本发明治疗骨缺损的疗效图。
具体实施方式
以下结合具体实施例,对本发明作进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。故凡依本发明专利申请范围所述的方法原理所做的等效变化或修改,均包括于本发明专利申请范围内。
本发明的负载骨碎补微球丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架的制备方法,包括以下步骤:
(1)丝素蛋白溶液的制备
将蚕茧剪碎后,放置于浓度为0.5wt%的碳酸氢钠溶液中,加热煮沸0.5-2h,然后用去离子水清洗,去除胶质,重复此步骤三次。将去除胶质的丝素蛋白,放置于50℃的烘箱中干燥24h,去除丝素蛋白中的水分。
将干燥后的丝素蛋白,剪碎,随后放置于浓度为9.3mol/L的溴化锂溶液中,其中丝素蛋白与溴化锂溶液的比例为(1-3):10(m:v),40-60℃水浴加热5-8h。待丝素蛋白完全溶解于溴化锂溶液中后,将所得到的混合溶液,放置于截留分子量为10KD的透析袋中,随后用去离子水中,室温条件下进行透析,换水频率为每天换水一次,透析时间为三天。将透析后得到的溶液,在5000-10000rpm进行离心5-10min,,取上清液,重复该步骤3次,便可以得到浓度为3.5-10wt%SF溶液,并放置于4摄氏度的冰箱中,保存备用。需要时制备SF时,再将适量的溶液倒入模具中,随后放入-20℃冰箱冷冻过夜,最后放入冷冻干燥机进行冻干,冷冻干燥条件为:-60℃/24h,即可制得SF支架。
(2)纳米羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)的制备
将100ml 0.3mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到100ml 0.5mol/L的硝酸钙溶液中,滴加过程中,机械搅拌,搅拌速度为400-800rpm,并且同时在60℃水浴加热2h。在搅拌反应过程中,通过滴加氨水将反应溶液的pH值维持在10;反应结束后,在室温下陈化24h,然后通过5000-10000rpm离心5-10min收集,并且用去离子水清洗5遍。最后,将收集到的纳米颗粒,在-60℃/24h的条件下,进行冷冻干燥,便可以得到纳米羟基磷灰石颗粒(HA)。
(3)柚皮甘/明胶微球复合物的制备
将0.05-0.1g山梨糖醇酐油酸酯(斯盘-80,Span80)加到盛有100ml植物油的烧瓶中,于40-60℃、400-800rpm水浴加热搅拌0.5-2h,混合均匀后;将10ml5-10wt%明胶水溶液滴加入到植物油中,持续搅拌3h后,将混合溶液转移至冰浴,继续搅拌30min。然后加入0.1-1ml 2.5-25wt%戊二醛水溶液,继续搅拌2-4h后,加入30-100ml 4℃的丙酮,搅拌30min后,静置,过滤,便得到明胶微球;将微球泡在10-50ml丙酮中,放置于4℃的冰箱中,固化24h后用1mol/L氨基乙酸浸泡30min/25℃,去除未反应的戊二醛。然后于5000-10000rpm离心5-10min,取沉淀物,用乙醇和异丙醇交替洗涤沉淀物,交替重复清洗3次。将清洗后得到的明胶微球置于去离子水中,于4℃浸泡过夜。最后,将其进行冷冻干燥,得到明胶微球。本实施例的明胶微球粒径为25μm。
将一定量的柚皮甘溶解于1ml的乙醇中,得到浓度为0.5-1g/ml的柚皮甘/乙醇溶液。随后往5-10mg的明胶微球,滴加10-40ul 0.5g/ml的柚皮甘/乙醇溶液,然后放置于4℃中,过夜。最后,将其进行冷冻干燥,便可以得到柚皮甘/明胶微球(NG/GMs)复合物。
(4)柚皮甘/明胶微球/纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合支架(NG/GMs/HA/SF)的制备
将HA、NG/GMs与SF溶液混合后,注射于48孔板中,随后,将该样品在-60℃冷冻干燥24h,便可以得到NG/GMs/HA/SF复合支架。
本发明中的所述柚皮苷、明胶微球、羟基磷灰石、丝素蛋白的质量比为(2-4):(1-2):(1-2):(7-20)。
实施例1
本实施例的负载骨碎补微球丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架的制备方法,包括以下步骤:
(1)丝素蛋白溶液的制备
将蚕茧剪碎后,放置于浓度为0.5wt%的碳酸氢钠溶液中,加热煮沸0.5h,然后用去离子水清洗,去除胶质,重复此步骤三次。将去除胶质的丝素蛋白,放置于50℃的烘箱中干燥24h,去除丝素蛋白中的水分。
将干燥后的丝素蛋白,剪碎,随后放置于浓度为9.3mol/L的溴化锂溶液中,其中丝素蛋白与溴化锂溶液的比例为1:10(m:v),60℃水浴加热5h。待丝素蛋白完全溶解于溴化锂溶液中后,将所得到的混合溶液,放置于截留分子量为10KD的透析袋中,随后用去离子水中,室温条件下进行透析,换水频率为每天换水一次,透析时间为三天。将透析后得到的溶液,在5000rpm进行离心10min,,取上清液,重复该步骤3次,便可以得到浓度为3.5wt%SF溶液,并放置于4摄氏度的冰箱中,保存备用。需要时制备SF时,再将适量的溶液倒入模具中,随后放入-20℃冰箱冷冻过夜,最后放入冷冻干燥机进行冻干,冷冻干燥条件为:-60℃/24h,即可制得SF支架。
(2)纳米羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)的制备
将100ml 0.3mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到100ml 0.5mol/L的硝酸钙溶液中,滴加过程中,机械搅拌,搅拌速度为400rpm,并且同时在60℃水浴加热2h。在搅拌反应过程中,通过滴加氨水将反应溶液的pH值维持在10;反应结束后,在室温下陈化24h,然后通过5000rpm离心10min收集,并且用去离子水清洗5遍。最后,将收集到的纳米颗粒,在-60℃/24h的条件下,进行冷冻干燥,便可以得到纳米羟基磷灰石颗粒(HA)。
(3)柚皮甘/明胶微球复合物的制备
将0.1g山梨糖醇酐油酸酯(斯盘-80,Span80)加到盛有100ml植物油的烧瓶中,于60℃、400rpm水浴加热搅拌0.5h,混合均匀后;将10ml 10wt%明胶水溶液滴加入到植物油中,持续搅拌3h后,将混合溶液转移至冰浴,继续搅拌30min。然后加入0.1ml 25wt%戊二醛水溶液,继续搅拌2h后,加入30ml 4℃的丙酮,搅拌30min后,静置,过滤,便得到明胶微球;将微球泡在10ml丙酮中,放置于4℃的冰箱中,固化24h后用1mol/L氨基乙酸浸泡30min/25℃,去除未反应的戊二醛。然后于5000rpm离心10min,取沉淀物,用乙醇和异丙醇交替洗涤沉淀物,交替重复清洗3次。将清洗后得到的明胶微球置于去离子水中,于4℃/浸泡过夜。最后,将其进行冷冻干燥,得到明胶微球。本实施例的明胶微球粒径为25μm。
将0.5g的柚皮甘溶解于1ml的乙醇中,得到浓度为0.5g/ml的柚皮甘/乙醇溶液。随后往10mg的明胶微球,滴加40ul 0.5g/ml的柚皮甘/乙醇溶液,然后放置于4℃中,过夜。最后,将其进行冷冻干燥,便可以得到柚皮甘/明胶微球(NG/GMs)复合物。
(4)柚皮甘/明胶微球/纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合支架(NG/GMs/HA/SF)的制备
将5mgHA、5mgNG/GMs与1ml 3.5wt%SF溶液混合后,注射于48孔板中,随后,将该样品在-60℃冷冻干燥24h,便可以得到NG/GMs/HA/SF复合支架。
如图1和2所示,为本发明的NG/GMs/HA/SF复合支架的分别在100um和20um扫描电镜下观察得到的结构。
实施例2
本实施例的负载骨碎补微球丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架的制备方法,包括以下步骤:
(1)丝素蛋白溶液的制备
将蚕茧剪碎后,放置于浓度为0.5wt%的碳酸氢钠溶液中,加热煮沸1h,然后用去离子水清洗,去除胶质,重复此步骤三次。将去除胶质的丝素蛋白,放置于50℃的烘箱中干燥24h,去除丝素蛋白中的水分。
将干燥后的丝素蛋白,剪碎,随后放置于浓度为9.3mol/L的溴化锂溶液中,其中丝素蛋白与溴化锂溶液的比例为2:10(m:v),40℃水浴加热6h。待丝素蛋白完全溶解于溴化锂溶液中后,将所得到的混合溶液,放置于截留分子量为10KD的透析袋中,随后用去离子水中,室温条件下进行透析,换水频率为每天换水一次,透析时间为三天。将透析后得到的溶液,在10000rpm离心5min,取上清液,重复该步骤3次,得到浓度为5wt%SF溶液,并放置于4摄氏度的冰箱中,保存备用。需要时制备SF时,再将适量的溶液倒入模具中,随后放入-20℃冰箱冷冻过夜,最后放入冷冻干燥机进行冻干,冷冻干燥条件为:-60℃/24h,即可制得SF支架。
(2)纳米羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)的制备
将100ml 0.3mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到100ml 0.5mol/L的硝酸钙溶液中,滴加过程中,机械搅拌,搅拌速度为600rpm,并且同时在80℃水浴加热2h。在搅拌反应过程中,通过滴加氨水将反应溶液的pH值保持10;反应结束后,在室温下陈化24h,然后8000rpm离心8min收集,并且用去离子水清洗5遍。最后,将收集到的纳米颗粒,在-60℃/24h的条件下,进行冷冻干燥,便可以得到纳米羟基磷灰石颗粒(HA)。
(3)柚皮甘/明胶微球复合物的制备
将0.05g山梨糖醇酐油酸酯(斯盘-80,Span80)加到盛有100ml植物油的烧瓶中,于40℃、600rpm水浴加热搅拌2h,混合均匀后;将10ml 5wt%明胶水溶液滴加入到植物油中,持续搅拌3h后,将混合溶液转移至冰浴,保持转速不变,继续搅拌30min。然后加入0.5ml20wt%戊二醛水溶液,继续搅拌2h后,加入50ml 4℃的丙酮,搅拌30min后,静置,过滤,便得到明胶微球;将微球泡在30ml丙酮中,放置于4℃的冰箱中,固化24h后用1mol/L氨基乙酸浸泡30min/25℃,去除未反应的戊二醛。然后于10000rpm离心5min,取沉淀物,用乙醇和异丙醇交替洗涤沉淀物,交替重复清洗3次。将清洗后得到的明胶微球置于去离子水中,于4℃/浸泡过夜。最后,将其进行冷冻干燥,得到明胶微球。本实施例的明胶微球粒径为30μm。
将1g的柚皮甘溶解于1ml的乙醇中,得到浓度为1g/ml的柚皮甘/乙醇溶液。随后往5mg的明胶微球,滴加10ul 1g/ml的柚皮甘/乙醇溶液,然后放置于2℃中,过夜。最后,将其进行冷冻干燥,便可以得到柚皮甘/明胶微球(NG/GMs)复合物。
(4)柚皮甘/明胶微球/纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合支架(NG/GMs/HA/SF)的制备
将10mgHA、2mgNG/GMs与1ml10wt%SF溶液混合后,注射于48孔板中,随后,将该样品在-60℃冷冻干燥24h,便可以得到NG/GMs/HA/SF复合支架。
实施例3
本实施例的负载骨碎补微球丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架的制备方法,包括以下步骤:
(1)丝素蛋白溶液的制备
将蚕茧剪碎后,放置于浓度为0.5wt%的碳酸氢钠溶液中,加热煮沸2h,然后用去离子水清洗,去除胶质,重复此步骤三次。将去除胶质的丝素蛋白,放置于50℃的烘箱中干燥24h,去除丝素蛋白中的水分。
将干燥后的丝素蛋白,剪碎,随后放置于浓度为9.3mol/L的溴化锂溶液中,其中丝素蛋白与溴化锂溶液的比例为3:10(m:v),50℃水浴加热8h。待丝素蛋白完全溶解于溴化锂溶液中后,将所得到的混合溶液,放置于截留分子量为10KD的透析袋中,随后用去离子水中,室温条件下进行透析,换水频率为每天换水一次,透析时间为三天。将透析后得到的溶液,在8000rpm离心8min,取上清液,重复该步骤3次,得到浓度为10wt%SF溶液,并放置于4℃的冰箱中,保存备用。需要时制备SF时,再将适量的溶液倒入模具中,随后放入-20℃冰箱冷冻过夜,最后放入冷冻干燥机进行冻干,冷冻干燥条件为:-60℃/24h,即可制得SF支架。
(2)纳米羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)的制备
将100ml 0.3mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到100ml 0.5mol/L的硝酸钙溶液中,滴加过程中,机械搅拌,搅拌速度为800rpm,并且同时在80℃水浴加热2h。在搅拌反应过程中,通过滴加氨水将反应溶液的pH值保持10;反应结束后,在室温下陈化24h,然后10000rpm离心5min收集,并且用去离子水清洗5遍。最后,将收集到的纳米颗粒,在-60℃/24h的条件下,进行冷冻干燥,便可以得到纳米羟基磷灰石颗粒(HA)。
(3)柚皮甘/明胶微球复合物的制备
将0.08g山梨糖醇酐油酸酯(斯盘-80,Span80)加到盛有100ml植物油的烧瓶中,于50℃、800rpm水浴加热搅拌1h,混合均匀后;将10ml 10wt%明胶水溶液滴加入到植物油中,持续搅拌3h后,将混合溶液转移至冰浴,保持转速不变,继续搅拌30min。然后加入0.5ml20wt%戊二醛水溶液,继续搅拌3h后,加入100ml 4℃的丙酮,搅拌30min后,静置,过滤,便得到明胶微球;将微球泡在50ml丙酮中,放置于4℃的冰箱中,固化24h后用1mol/L氨基乙酸25℃浸泡30min,去除未反应的戊二醛。然后于8000rpm离心8min,取沉淀物,用乙醇和异丙醇交替洗涤沉淀物,交替重复清洗3次。将清洗后得到的明胶微球置于去离子水中,于4℃/浸泡过夜。最后,将其进行冷冻干燥,得到明胶微球。本实施例的明胶微球粒径为40μm。
将0.8g的柚皮甘溶解于1ml的乙醇中,得到浓度为0.8g/ml的柚皮甘/乙醇溶液。随后往5mg明胶微球,滴加20ul 0.8g/ml的柚皮甘/乙醇溶液,然后放置于6℃中,过夜。最后,将其进行冷冻干燥,便可以得到柚皮甘/明胶微球(NG/GMs)复合物。
(4)柚皮甘/明胶微球/纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合支架(NG/GMs/HA/SF)的制备
将5mgHA、5mgNG/GMs与1ml 5wt%SF溶液混合后,注射于48孔板中,随后,将该样品在-60℃冷冻干燥24h,便可以得到NG/GMs/HA/SF复合支架。
实施例4
本实施例的负载骨碎补微球丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架的制备方法,包括以下步骤:
(1)丝素蛋白溶液的制备
将蚕茧剪碎后,放置于浓度为0.5wt%的碳酸氢钠溶液中,加热煮沸2h,然后用去离子水清洗,去除胶质,重复此步骤三次。将去除胶质的丝素蛋白,放置于50℃的烘箱中干燥24h,去除丝素蛋白中的水分。
将干燥后的丝素蛋白,剪碎,随后放置于浓度为9.3mol/L的溴化锂溶液中,其中丝素蛋白与溴化锂溶液的比例为1:10(m:v),60℃水浴加热8h。待丝素蛋白完全溶解于溴化锂溶液中后,将所得到的混合溶液,放置于截留分子量为10KD的透析袋中,随后用去离子水中,室温条件下进行透析,换水频率为每天换水一次,透析时间为三天。将透析后得到的溶液,在10000rpm离心5min,取上清液,重复该步骤3次,得到浓度为10wt%SF溶液,并放置于4℃的冰箱中,保存备用。需要时制备SF时,再将适量的溶液倒入模具中,随后放入-20℃冰箱冷冻过夜,最后放入冷冻干燥机进行冻干,冷冻干燥条件为:-60℃/24h,即可制得SF支架。
(2)纳米羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)的制备
将100ml 0.3mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到100ml 0.5mol/L的硝酸钙溶液中,滴加过程中,机械搅拌,搅拌速度为800rpm,并且同时在60℃水浴加热2h。在搅拌反应过程中,通过滴加氨水将反应溶液的pH值保持10;反应结束后,在室温下陈化24h,然后10000rpm离心5min收集,并且用去离子水清洗5遍。最后,将收集到的纳米颗粒,在-60℃/24h的条件下,进行冷冻干燥,便可以得到纳米羟基磷灰石颗粒(HA)。
(3)柚皮甘/明胶微球复合物的制备
将0.1g山梨糖醇酐油酸酯(斯盘-80,Span80)加到盛有100ml植物油的烧瓶中,于50℃、600rpm水浴加热搅拌2h,混合均匀后;将10ml 10wt%明胶水溶液滴加入到植物油中,持续搅拌3h后,将混合溶液转移至冰浴,保持转速不变,继续搅拌30min。然后加入0.1ml25wt%戊二醛水溶液,继续搅拌3h后,加入50ml 4℃的丙酮,搅拌30min后,静置,过滤,便得到明胶微球;将微球泡在20ml丙酮中,放置于4℃的冰箱中,固化24h后用1mol/L氨基乙酸25℃浸泡30min,去除未反应的戊二醛。然后于8000rpm离心8min,取沉淀物,用乙醇和异丙醇交替洗涤沉淀物,交替重复清洗3次。将清洗后得到的明胶微球置于去离子水中,于4℃/浸泡过夜。最后,将其进行冷冻干燥,得到明胶微球。本实施例的明胶微球粒径为25μm。
将1g的柚皮甘溶解于1ml的乙醇中,得到浓度为1g/ml的柚皮甘/乙醇溶液。随后往10mg明胶微球,滴加20ul 1g/ml的柚皮甘/乙醇溶液,然后放置于8℃中,过夜。最后,将其进行冷冻干燥,便可以得到柚皮甘/明胶微球(NG/GMs)复合物。
(4)柚皮甘/明胶微球/纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合支架(NG/GMs/HA/SF)的制备
将10mgHA、5mgNG/GMs与1ml 5wt%SF溶液混合后,注射于48孔板中,随后,将该样品在-60℃冷冻干燥24h,便可以得到NG/GMs/HA/SF复合支架。该支架在使用之前,都先经过90%(v/v)的甲醇溶液处理,即在室温下,将支架浸泡在甲醇中,半小时,然后再放置于温度为37℃的烘箱中进行烘干,以备后用。
对比例1
HA/SF复合支架的制备
本对比例制备HA/SF复合支架,其制备方法与本实施例1相同,分别包括HA的制备、SF的制备,以及将HA、SF溶液混合后,注射于48孔板中,随后,将样品在-60℃冷冻干燥24h,便可以得到HA/SF复合支架,另外,为了得到非水溶性的SF复合支架,支架在使用之前,都先经过90%(v/v)的甲醇溶液处理,即在室温下,将支架浸泡在甲醇中,半小时,然后再放置于温度为37℃的烘箱中进行烘干,以备后用。
对比例2
NG/HA/SF复合支架制备,其包括以下步骤:
1)SF的制备
SF的制备方法与实施例1相同,在此不做描述。
2)纳米羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)的制备,其与实施例1中步骤2)中相同。
2)NG/HA/SF复合支架制备
将1g的柚皮甘溶解于1ml的乙醇中,得到浓度为1g/ml的柚皮甘/乙醇溶液,将5mgHA、5mgNG与1ml 3.5wt%SF溶液混合后,注射于48孔板中,随后,将该样品在-60℃冷冻干燥24h,便可以得到NG/HA/SF复合支架。另外,支架在使用之前,都先经过90%(v/v)的甲醇溶液处理,即在室温下,将支架浸泡在甲醇中,半小时,然后再放置于温度为37℃的烘箱中进行烘干,以备后用。
对比例3
SF支架的制备,其与实施例1中步骤1)相同,在此不做描述,该支架在使用之前,都先经过90%(v/v)的甲醇溶液处理,即在室温下,将支架浸泡在甲醇中,半小时,然后再放置于温度为37℃的烘箱中进行烘干,以备后用。
对比例4
柚皮甘/明胶微球(NG/GMs)复合物制备,其与实施例1中步骤3)相同。
效果实施例
1、缓释效果
分别将对比例2、对比例4与本发明实施例1进行缓释效果实验,得到图2所示,该图为该材料缓释效果,横坐标代表缓释时间,纵坐标代表材料释放率,NG/GMs/HA/SF缓释时间较长,约为140h,缓释效果较好。而NG/HA/SF缓释效果仅为50h,NG/GMs为70h,缓释效果差,本发明NG/GMs/HA/SF缓释时间更长,缓释效果更佳。
2、治疗骨缺损的疗效
为验证该材料的促成骨能力,设计了动物实验。实验共纳入30只SD大鼠,分为五个组,分别为:空白对照组(Control)、丝素蛋白组(SF)、羟基磷灰石/丝素蛋白组(HA/SF)、负载骨碎补柚皮苷/羟基磷灰石/丝素蛋白组(NG/HA/SF)和柚皮苷/明胶微球/纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合支架组(NG/GMs/HA/SF)。Control组不填充任何材料,作空白对照;将等体积的SF、HA/SF、NG/HA/SF和NG/GMs/HA/SF四种材料分别填充至大鼠第六腰椎椎体骨大约直径3mm,高3mm的圆柱型骨缺损内,并于4月后取大鼠骨缺损植入取进行X线和micro-CT检查,观察对比四种材料对骨缺损的修复效果。
结果如图4所示,箭头所指为腰6椎体骨缺损区域,4月后X线和micro-CT三维重建结果均可见Control组骨缺损未见明显愈合(见图4-1,图4-6),SF、HA/SF、NG/HA/SF组骨缺损可见部分愈合(分别见图4-2,4-7/4-3,4-8/4-4,4-9),NG/GMs/HA/SF组骨缺损已基本愈合(见图4-5,4-10),其愈合效果优于SF、HA/SF、NG/HA/SF组。说明该支架材料具有良好的促成骨能力,可作为有潜力的骨组织工程材料,相对于其他仅使用其中几种材料的复合材料相比,其缓释效果,治疗效果均有明显的增加。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明保护的范围之内。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明保护的范围之内。
Claims (10)
1.一种复合支架,其特征在于,所述复合支架的制备原料包括柚皮苷、明胶微球、羟基磷灰石、丝素蛋白。
2.根据权利要求1所述的复合支架,其特征在于,所述柚皮苷、明胶微球、羟基磷灰石、丝素蛋白的质量比为(2-4):(1-2):(1-2):(7-20)。
3.根据权利要求1所述的复合支架,其特征在于,所述复合支架由以下步骤制备而成:
1)往明胶微球,滴加0.5-1g/ml柚皮甘溶液,然后于2-8℃中放置过夜后;进行冷冻干燥,得到柚皮甘/明胶微球复合物;
2)将羟基磷灰石、柚皮甘/明胶微球复合物与3.5wt%-10wt%SF溶液混合后,注射于孔板中,随后,将该样品冷冻干燥,得到NG/GMs/HA/SF复合支架。
4.一种如权利要求1至3任一项所述的复合支架的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)往明胶微球,滴加0.5-1g/ml柚皮甘溶液,然后于2-8℃中放置过夜后;进行冷冻干燥,得到柚皮甘/明胶微球复合物;
2)将羟基磷灰石、柚皮甘/明胶微球复合物与3.5wt%-10wt%SF溶液混合后,注射于孔板中,随后,将该样品冷冻干燥,得到NG/GMs/HA/SF复合支架。
5.根据权利要求4所述的复合支架的制备方法,其特征在于,所述明胶微球的球径为20-40μm。
6.根据权利要求4所述的复合支架的制备方法,其特征在于,所述步骤1)中明胶微球采用以下方法制备:将0.05~0.1g山梨糖醇酐油酸酯加到盛有100ml植物油的烧瓶中于40-60℃水浴加热搅拌0.5-2h,混合均匀后。滴加10ml 5-10wt%明胶水溶液,持续搅拌3h后,将混合溶液转移至冰浴搅拌30min。然后加入0.1-1ml,2.5-25wt%戊二醛水溶液,继续搅拌2-4h后,加入30-100ml,4℃的丙酮,搅拌30min后,静置,过滤,便可以得到明胶微球;将微球泡在10-50ml丙酮中,放置于4℃的冰箱中,固化24h后用1mol/L氨基乙酸浸泡30min;然后,离心,取沉淀,洗涤沉淀物,将清洗后得到的明胶微球置于去离子水中,于浸泡过夜,冷冻干燥,得到明胶微球。
7.根据权利要求4所述的复合支架的制备方法,其特征在于,所述丝素蛋白溶液由蚕茧中提取。
8.根据权利要求4所述复合支架的制备方法,其特征在于,所述柚皮苷溶液的制备方法为将柚皮苷溶解于1ml的乙醇中,得到浓度为0.5-1g/ml的柚皮苷/乙醇溶液。
9.根据权利要求4所述复合支架的制备方法,其特征在于,所述羟基磷灰石的制备方法为:将100ml,0.3mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到100ml0.5mol/L的硝酸钙溶液中,机械搅拌,并且同时60-80℃水浴加热/2h。在搅拌反应过程中,pH值维持在10,反应结束后,在室温下陈化24h,然后通过离心收集,并且用去离子水清洗,最后,将收集到的纳米颗粒,进行冷冻干燥,便可以得到纳米羟基磷灰石颗粒。
10.根据权利要求4所述的复合支架的制备方法,其特征在于,所述步骤1)中冷冻干燥条件为-60℃冷冻干燥24h。
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