CN102218160A - 神经组织基质源性组织工程支架材料的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种神经组织基质源性组织工程支架材料的制备及其应用。以神经组织为原料，通过药物膨胀、机械粉碎、酶解处理、透析收集等手段提取出利于神经再生的基质成分(包括纳米级胶原微丝、纤粘蛋白微丝和层粘蛋白微丝)，去除了不利于神经再生的免疫原性成分(包括雪旺细胞、磷脂和轴突)。所制备出的神经组织基质源性材料单独或配以其他高分子材料可进一步通过定向结晶、冷冻干燥和交联制备成三维多孔取向支架，或者利用电纺丝技术制备纳米级别薄膜，再缠绕形成神经再生导管。本发明方法制备的组织工程用支架或导管有利于种子细胞粘附、增殖、迁移，促进神经再生，可用于神经缺损修复。

Description

神经组织基质源性组织工程支架材料的制备及其应用

技术领域

本发明属于组织工程材料制备技术领域，涉及周围神经组织工程生物支架材料制备技术，尤其涉及一种引导周围神经组织再生的神经组织工程用周围神经基质材料的制备方法，以及利用该周围神经基质材料制备三维多孔取向支架和神经再生导管的方法和相应的支架产品。

背景技术

周围神经缺损的修复与重建是当前周围神经损伤领域的一大难题。目前在临床治疗过程中解决神经缺损的手段依然以自体神经移植为标准手术，但由于自体神经来源有限且造成供区较多的并发症，故多年来医学界不断寻找替代自体神经移植的生物材料。这些材料包括天然材料以及人工合成聚合物材料两大类。天然材料有自体静脉、自体骨骼肌、异体或异种神经、羊膜、藻酸盐、壳聚糖、胶原等；人工合成材料主要有硅胶、PLA、PGA等。静脉、骨骼肌等天然生物活性材料存在管壁塌陷、再生不良、疤痕组织增生及粘连等问题，且来源均比较有限，不适于大批量生产，而且具有一定的免疫原性。人工合成不可降解材料在力学性能、降解和吸收速度、降解后酸性物质对神经再生的负面影响等方面还存在许多问题，主要表现在与周围神经的组成成分不一致，生物相容性欠佳，降解产物存在炎性反应等不足。理想的周围神经缺损修复材料应该具有与周围神经的基底膜管类似的结构和类似的成分。近年来，相关的研究结果表明，神经基质的主要成分层粘蛋白(Laminin)和纤粘蛋白(Fibronectin)等具有促神经再生的功能。Saito等认为神经的组织基质具有诱导神经再生的作用(Saito I，Oka Y，Odaka M.Promoting nerve regeneration through long gapsusing a small nerve tissue graft.Surg Neurol.2003，59(3)：148-54.)。Hari等研究证明神经营养因子与组织基质的蛋白(Laminin、Fibronectin等)相互作用对感觉神经的定向生长起调节作用(Hari A，Djohar B，Skutella T，et al.Neurotrophins and extracellular matrix moleculesmodulate sensory axon outgrowth.Int J Dev Neurosci.2004，22(2)：113-7.)。

天然组织基质是组织工程的一个重要内容，一方面作为细胞生长与组织再生的支架，为细胞生长提供适宜的微环境；另一方面，自身会逐步降解吸收。组织基质移植物最终会被新生组织所替代，实现器官结构与功能的重建。天然组织基质是由细胞自身分泌组成的并围绕在细胞周围，主要含有胶原蛋白、纤粘蛋白、层粘蛋白、层粘素、蛋白多糖等生物活性大分子。天然组织基质不仅为细胞提供了支持结构和附着位点，而且本身包含许多生物信息，能够提供细胞所需的信号，对细胞的粘附、迁移、增殖、分化以及基因表达的调控有重要作用和显著影响。天然组织基质凭借其良好的特性，可与高强度、可降解的合成材料混合，形成新型的复合组织工程支架，对于神经组织工程的构建来讲，是一种有前途的细胞载体。已经有将皮肤、膀胱、心脏瓣膜组织去抗原后用于临床疾病治疗的报道，并展示了良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的首先是提供一种组织工程用神经基质源性支架材料的制备方法，进一步的，利用该支架材料构建三维多孔取向支架和神经再生导管，作为组织工程神经的支架和周围神经缺损的修复材料。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

在本发明的第一方面，提供了一种神经组织基质源性组织工程支架材料的的制备方法，依次包括以下步骤：

1-1.以神经组织为原料，在去除神经周围的脂肪和结缔组织后进行低渗漂洗；

1-2.在含有蛋白酶抑制剂的缓冲液中将神经组织机械粉碎为小块；

1-3.对神经组织小块进行药物膨胀，然后低渗漂洗去除药物；

1-4.在蛋白酶抑制剂存在的条件下用细胞裂解液处理，随后用缓冲液漂洗；

1-5.DNA酶和RNA酶消化一段时间；

1-6.加入尿素溶液浸泡，随后再次进行机械粉碎；

1-7.离心去除未溶解物质，上清液经透析除去尿素得到神经基质源性浆料。

所得神经基质源性浆料可进一步经冷冻干燥得到神经基质源性粉末。

具体的，上述步骤1-1和1-3中所述的低渗漂洗通常是用无菌蒸馏水漂洗多次(例如2-3次)，每次3-5分钟。

上述步骤1-2中所述含有蛋白酶抑制剂的缓冲液一般是含有0.005％～0.1％PMSF和0.01％～1％EDTA的缓冲液(注：这里的百分含量单位是g/mL，例如0.1％即0.001g/mL，指100mL溶液中含有0.1g溶质，这是生化领域中将固体物质配制成溶液试剂时通用的浓度表示方法，下同，不再赘述)。其中所述缓冲液一般是常用的pH7.2-7.4磷酸缓冲液(PBS)。

上述步骤1-3中膨胀所用药物一般是柠檬酸盐缓冲液，.用pH3-5的柠檬酸盐缓冲液，浸泡神经组织小块，4℃条件下持续振荡24～72小时。然后无菌蒸馏水漂洗多次去除柠檬酸盐。

上述步骤1-4中所述的细胞裂解液一般是含有0.5％～2％Triton X-100的6-14mM的Tris-HCL缓冲液(pH7.19-9.10)，而蛋白酶抑制剂是指0.005％～0.1％的苯甲基磺酰氟(PMSF)和0.01％～1％的乙二胺四乙酸(EDTA)。处理方式是在细胞裂解液中4℃条件下持续振荡24～72小时，然后离心，沉淀用PBS冲洗多次。

上述步骤1-5是用DNA酶和RNA酶37℃下消化6～48h。

上述步骤1-6中尿素浓度为1-4M，浸泡48～72h，随后机械粉碎。

上述步骤1-7通常是2500-5500g离心20min去除未溶解物质，上清液透析得到神经基质源性浆料。

上述方法将天然神经组织中利于神经再生的基质成分提取出来，而去除了不利于神经再生的免疫原性成分(包括雪旺细胞、磷脂和轴突)。所制备的神经组织基质源性组织工程材料(浆料或粉末)的成分与天然神经基质组成相似，主要包括纳米级胶原微丝、纤粘蛋白微丝和层粘蛋白微丝，便于接种细胞和周围神经缺损修复。

在本发明的第二方面，利用上述方法制备的神经组织基质源性组织工程支架材料可进一步制备出神经基质源性三维多孔取向支架，即将上述方法制备的神经基质源性浆料单独或与其它有机高分子材料一起制成悬液注入模具，或者将神经基质源性粉末单独或与其它有机高分子材料一起制成悬液注入模具，冷冻干燥后将支架从模具中取出，进行交联，得到三维多孔取向支架。

具体的，上述三维多孔取向支架的制备方法可包括下述步骤：

2-1.将神经基质源性浆料或神经基质源性粉末的乙酸溶液单独注入模具，或者配以其它天然的或人工合成的有机高分子材料一起制成悬液注入模具；

2-2.先垂直放置在-20℃～-160℃的冷冻金属板上预冻，完全冻结后于-40℃放置至少24小时；

2-3.转移到真空冷冻干燥机中冷冻干燥；

2-4.室温下平衡温度后，将冻干支架从模具中取出，先采用紫外线交联，再采用碳化二亚胺或京尼平交联；

2-5.洗去交联剂，再次冷冻干燥后Co⁶⁰消毒，密封保存。

优选的，上述步骤2-1中以pH＝2.5-4.0的乙酸为溶剂溶解神经基质源性粉末，单独或者将其与壳聚糖、PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物，poly(lactic-co-glycolic acid))、胶原、透明质酸等有机高分子材料以一定比例配比(例如神经基质源性粉末与其它有机高分子材料的质量比为5∶1-1∶10)制成乳状悬液，充分搅拌混匀后离心去除气泡，4℃放置过夜后再注入模具。

上述步骤2-4中，紫外线交联时，支架距离光源5～10cm，光源波长258nm，交联2～8h；碳化二亚胺交联是将支架置于碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的乙醇溶液中(浓度为：EDC 50mM；NHS 20mM)4℃下交联24h；京尼平交联是在0.5％～2％京尼平溶液中交联24～48h。

上述步骤步骤2-5，碳化二亚胺交联得到的支架的清洗方法一般是直接用三蒸水进行多次漂洗。京尼平交联后则用去离子水对支架材料进行反复振摇清洗5遍，每遍10分钟，洗去残留的交联剂。

在本发明的第三方面，利用本发明制备的神经组织基质源性组织工程支架材料可进一步制备神经基质源性神经再生导管，将神经基质源性粉末加入六氟异丙醇(HFP)中溶解或加入聚氧化乙烯(PEO)中制备悬液，或者再混以其它有机高分子材料，利用电纺丝仪器制备成薄膜，将该薄膜直接或交联后缠绕在不同直径规格的涂有聚乙二醇(PEG)的轴上，制备出不同直径的神经再生导管。

在制备电纺丝薄膜之前往往需要通过抽真空去除溶液中的气泡，然后再将溶液添加到电纺丝仪器的注射器内，调整电纺丝设备电压、针头同接收装置的距离以及溶液流速，制备粗细均匀的微丝形成薄膜。根据电纺丝设备的接收装置不同，可制备出具有一定方向性的(即有序的)或无序的电纺丝薄膜。

通常，上述方法中单纯采用神经基质源性材料制备的电纺丝薄膜需进行交联，交联方法同上，先进行紫外线交联，再采用碳化二亚胺或京尼平交联。而神经基质源性材料同PLGA、PPC等高分子材料按一定质量比混合(例如神经基质源性粉末与其它有机高分子材料的质量比为5∶1-1∶10)后制备的薄膜，无需交联。

本发明制备神经基质源性材料的神经组织来源可以是人、猪、牛、羊、犬等动物的周围神经和脊髓马尾。

本发明所制备的神经基质源性支架材料其成分与天然神经基质组成相似，主要是纳米级胶原微丝、纤粘蛋白(Fibronectin)微丝和层粘蛋白(Laminin)微丝。由于保留了天然神经基质源性成分，该支架材料有利于细胞的粘附和细胞-支架的相互作用，为雪旺细胞生长提供了最接近自然状态的细胞外微环境，利于种子细胞的增殖和迁移。

本发明中神经基质源性三维多孔取向支架可通过预制模型的不同形状大小而得到不同的支架形状和大小，从而提供一定宏观和微观形态以适用于组织工程的需要(如一干多支的面神经、臂丛神经等)。所制备的三维多孔取向支架不仅保留了神经组织的天然成分，具有良好的生物相容性，无免疫排斥反应；而且，该支架的制备是通过在一定浓度神经基质源性材料的溶液中建立纵向的单轴温度梯度，从而使冰晶定向生长，冰晶升华后获得具有定向取向纤维的多孔结构，孔隙分布均匀且相互贯通，孔径可控，与天然神经结构类似，利于引导种子细胞的排列取向，实现细胞外基质分泌的有序排列，使新生的组织更类似于自然神经。

本发明中神经基质源性神经再生导管的制备方法是通过电纺丝技术将一定浓度神经基质源性材料溶液或悬液在电场中拉伸制备薄膜，缠绕在不同规格的轴上获得。

人、猪、牛、羊、犬等的神经基质源性材料、以及其与PLGA、壳聚糖等多种生物材料的共混物，都可以依照本发明所述的方法制备出多孔取向支架和神经再生导管，用于神经缺损的修复。

附图说明

图1显示了实施例1神经基质源性浆料冰冻切片的I型胶原免疫荧光染色结果。

图2显示了实施例1神经基质源性浆料冰冻切片的层粘蛋白免疫荧光染色结果。

图3显示了实施例1神经基质源性浆料冰冻切片的纤粘蛋白免疫荧光染色结果。

图4显示了实施例1神经基质源性浆料冰冻切片的天狼猩红染色结果。

图5显示了实施例1神经基质源性浆料冰冻切片的甲苯胺蓝染色结果。

图6显示了实施例1神经基质源性浆料冰冻切片的番红O染色结果。

图7显示了实施例2三维多孔取向支架的纵向切面。

图8是实施例3制备的有序薄膜的扫描电镜照片。

图9是实施例3制备的无序薄膜的扫描电镜照片。

图10显示了实施例制备的不同直径和长短的神经再生导管。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步描述本发明，应当理解的是，这些实施例仅用于例证目的，绝不限制本发明的范围。

实施例1：神经基质源性支架材料的制备

取犬坐骨神经，去除神经周围的肌肉和脂肪组织，无菌蒸馏水漂洗2-3次，每次3-5分钟；加入含有蛋白酶抑制物0.005～0.1％PMSF和0.01～1％EDTA的磷酸缓冲液中，经粉碎机粉碎成小块；用柠檬酸钠缓冲液(pH3-5)膨胀组织，在4℃条件下持续振荡24～72小时；用无菌蒸馏水洗2-3次，每次3-5分钟；4℃下加入0.5～2％Triton X-100的10mM/L的Tris-HCL缓冲液(pH7.5)中，该缓冲液内同样含有蛋白酶抑制物0.005～0.1％PMSF和0.01～1％EDTA，持续振荡24～72h去除细胞成分；离心后用PBS反复冲洗；37℃下用DNA酶和RNA酶消化6～48h；加入2M尿素溶液中溶解48～72h，之后再次机械粉碎；6000rpm离心20min去除未溶解物质，上清液透析得到神经基质源性浆料，冷冻干燥后得到神经基质源性粉末。

组织化学染色观察：

神经基质源性浆料冰冻切片免疫荧光染色结果见图1～图3，I型胶原(图1)、层粘蛋白(图2)、纤粘蛋白(图3)阳性；天狼猩红染色提示胶原成分主要为I型和IV型(见图4)；甲苯胺蓝染色(图5)和番红O染色(图6)阳性；Hoechst33258染色提示去细胞完全。

实施例2：三维多孔取向支架的制备

以pH＝3.2的稀乙酸为溶剂将神经基质源性粉末配成3％浓度的悬液，充分搅拌均匀，离心去气泡，然后将离心后的浆料注入模具中，垂直放置在-40℃的冷冻金属板上预冻，完全冻结后于-40℃放置至少24小时，然后转移到冷冻干燥机中升华干燥。冰相在真空下(＜100mTorr)升华24-48h。室温下平衡后，支架从模具中取出，距离光源5～10cm波长258nm紫外线交联2～8h。在碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)95％乙醇溶液中(浓度为：EDC 50mM；NHS 20mM)4℃下交联24h后，直接用三蒸水漂洗6次，冷冻干燥，Co⁶⁰消毒后密封4℃下保存。

理化性能检测：在光学显微镜下可见支架孔径均匀一致，孔隙相互贯通(见图7)。通过扫描电镜观察，可见支架孔径大小及分布较均匀，并且空隙相互贯通，孔径为200-300微米。

实施例3：神经再生导管的制备

将实施例1冷冻干燥后得到神经基质源性粉末加入六氟异丙醇(HFP)中溶解，充分搅拌制备溶液，抽真空去除气泡后添加到电纺丝仪器的注射器内。调整电纺丝设备电压、针头同接收装置距离和溶液流速，制备粗细均匀的微丝形成薄膜。根据电纺丝设备的接收装置不同，可制备出有一定方向性或无序的薄膜。将制备的电纺丝薄膜从模具中取出距离光源5～10cm波长258nm紫外线交联2～8h；碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)95％乙醇溶液中(浓度为：EDC 50mM；NHS 20mM)4℃下交联24h后，三蒸水漂洗6次，冷冻干燥。将制备出的有序或无序薄膜缠绕在不同直径规格涂有聚乙二醇(PEG)的轴上，在三蒸水中浸泡2-4h，小心取下神经再生导管，再用三蒸水漂洗6次制备出不同直径的神经再生导管，Co⁶⁰消毒后密封4℃下保存。

通过扫描电镜观察，可见有方向性的神经基质源性薄膜(图8)；无序的神经基质源性薄膜(图9)。图10是所制备的不同规格(直径和长短)的神经再生导管的照片。

Claims (10)

1.一种神经组织基质源性组织工程支架材料的制备方法，包括如下步骤：

1-1.以神经组织为原料，在去除神经周围的脂肪和结缔组织后进行低渗漂洗；

1-2.在含有蛋白酶抑制剂的缓冲液中将神经组织机械粉碎为小块；

1-3.对神经组织小块进行药物膨胀，然后低渗漂洗去除药物；

1-4.在蛋白酶抑制剂存在的条件下用细胞裂解液处理，随后用缓冲液漂洗；

1-5.DNA酶和RNA酶消化一段时间；

1-6.加入尿素溶液中浸泡，随后再次进行机械粉碎；

1-7.离心去除未溶解物质，上清液经透析除去尿素得到神经基质源性浆料。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤1-7后将神经基质源性浆料冷冻干制得神经基质源性粉末。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤1-2和1-4中所述蛋白酶抑制剂是指终浓度为0.005％～0.1％的苯甲基磺酰氟和0.01％～1％的乙二胺四乙酸。

4.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1-3是将神经组织小块浸泡于pH3-5的柠檬酸盐缓冲液，4℃条件下持续振荡24～72小时，然后用无菌蒸馏水漂洗多次。

5.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤1-4中所述的细胞裂解液是含有0.5％～2％Triton X-100的6-14mM pH7.19-9.10的Tris-HCL缓冲液，在细胞裂解液中4℃条件下持续振荡24～72小时，然后离心，沉淀用磷酸缓冲液漂洗多次。

6.一种神经组织基质源性三维多孔取向支架的制备方法，将权利要求1制备的神经基质源性浆料单独或与其它有机高分子材料一起制成悬液注入模具，或者将权利要求2制备的神经基质源性粉末单独或与其它有机高分子材料一起制成悬液注入模具，冷冻干燥后将支架从模具中取出，进行交联，得到三维多孔取向支架.

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

2-1.将神经基质源性浆料或神经基质源性粉末的乙酸溶液单独注入模具，或者配以其它天然的或人工合成的有机高分子材料一起制成悬液注入模具；

2-2.将模具先垂直放置在-20℃～-160℃的冷冻金属板上预冻，完全冻结后于-40℃放置至少24小时；

2-3.转移到真空冷冻干燥机中冷冻干燥；

2-4.室温下平衡温度后，将冻干支架从模具中取出，先采用紫外线交联，再采用碳化二亚胺或京尼平交联；

2-5.洗去交联剂，再次冷冻干燥后Co⁶⁰消毒，密封保存。

8.一种神经组织基质源性神经再生导管的制备方法，将权利要求2制备的神经基质源性粉末加入六氟异丙醇中溶解或加入聚氧化乙烯中制备悬液，单独或者再混以其它有机高分子材料，利用电纺丝仪器制备成有序或无序的薄膜，将该薄膜交联后或直接缠绕在不同直径规格的涂有聚乙二醇的轴上，制备出不同直径的神经再生导管。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，对于单纯采用神经基质源性粉末材料形成的电纺丝薄膜，先进行紫外线交联，再采用碳化二亚胺或京尼平交联。

10.根据权利要求1～9的方法制备的神经组织基质源性组织工程用产品。

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