CN111214709A - 一种新型双层神经导管及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新型双层神经导管，由电纺脱细胞猪神经基质导管层，和设置在电纺脱细胞猪神经基质导管外层的PLCL层组成。同时提供了上述新型双层神经导管的制备方法，包括以下步骤：（1）猪神经预处理，（2）猪神经脱细胞处理，（3）脱细胞神经粉碎干燥处理，（4）静电纺丝双层神经导管层（5）双层神经导管层后处理。经过本发明方法制备出的新型双层神经导管，具有较好的生物相容性好、良好的机械支撑；内层脱细胞基质含有各种不同类的功能蛋白，包括胶原蛋白、蛋白多糖、糖胺聚糖和神经生长因子，能促进雪旺细胞增殖、迁移和轴突生长；外层PLCL的存在也有效防止纤维结缔组织的增生和周围组织侵入。

Description

一种新型双层神经导管及其制备方法
技术领域
本发明属于生物材料和神经修复技术领域，涉及组织基质材料制备，尤其涉及一种新型双层神经导管及其制备方法。
背景技术
周围神经损伤会导致运动功能部分或全部的丧失，神经性疼痛和感官损伤，尽管显微外科技术迅速提高，但周围神经治疗后功能的完全恢复仍然是一个巨大挑战。
根据最近国内外研究的神经修复方法，当无神经缺损间隙或神经两端缺损间隙较短时，断端吻合是最理想的治疗方法，但是，这种治疗方法的局限性是断端间隙距离最大为5mm。对于较长间隙的神经损伤时，自体神经移植被认为是修复周围神经损伤的黄金标准。自体神经移植治疗的成功很大程度上是由于雪旺细胞和基底层神经内膜管的存在，它们提供神经营养因子和神经内膜管表面粘附分子来促进轴突的再生。但是，这种治疗方法的局限性包括：二次手术获得供体神经，供体神经来源有限，供体部位出现神经功能障碍，难以从患者获得合适大小的神经，供体部位易感染以及神经瘤的形成。为了克服这些障碍，人们开发了各种各样的人工神经导管，包括可降解的合成聚合物和天然生物聚合物神经导管，例如，聚乙二醇酸导管，聚氨酯导管，聚乳酸导管，胶原蛋白导管，壳聚糖导管，海藻酸盐导管，明胶导管和丝素导管等。虽然上述神经导管为神经提供了一个相对隔离的具有机械支撑的环境引导新生轴突进入远端神经残端，有效防止纤维结缔组织的增生和侵入；但由于这类导管缺乏生物相容性且导管内不含有细胞外基质成分，以至于这类人工神经导管导致再生速度缓慢。为了克服以上的存在的问题，自然衍生的生物材料(细胞外基质ECM)得以发展。
近年来，纯化的细胞外基质(ECM)复合材料被用于制备人工神经导管，有证据表明来源于猪神经的细胞外基质成功维持了天然神经细胞外基质的完整性，在解剖学上与人类神经极为相似，脱完细胞后的猪神经免疫抗原性刺激较低。此外，脱细胞的猪神经含有各种不同类的功能蛋白，包括胶原蛋白、蛋白多糖、糖胺聚糖和神经生长因子，这些蛋白能促进雪旺细胞增殖、迁移和轴突生长。然而，细胞外基质导管的局限性包括以下三点：(1)缺乏足够的机械支撑，易受周围组织压迫；(2)在脱细胞化学试剂浸泡时间过长导致脱细胞后天然猪神经细胞外基质网架结构受损；(3)已固定形态和尺寸大小的猪神经难以与神经损伤处恰好匹配。
发明内容
鉴于现有技术存在的缺陷，本发明的第一目的是提供一种新型双层神经导管，是通过静电纺丝技术，以冰醋酸作为电纺溶剂，电纺脱细胞猪神经基质和PLCL分别作为导管内层和外层形成的新型双层神经导管；其中PLCL作为外层有效解决了机械支撑不足的缺点，同时利用静电纺丝技术也有效解决了天然猪神经细胞外基质结构受损以及细胞外基质导管尺寸大小的问题。联合两种材料制备成双层神经导管，直接植入坐骨神经缺损处，为神经修复提供一个具有机械支撑，生物相容性良好的微环境，有效防止神经与周围组织粘连，内层脱细胞基质分泌神经生长因子从而促进神经修复。
本发明的第二目的为是提供上述新型双层神经导管的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种新型双层神经导管，由电纺脱细胞猪神经基质导管层，和设置在电纺脱细胞猪神经基质导管外层的PLCL层组成。
一种新型双层神经导管的制备方法，包括以下步骤：
(1)猪神经预处理
(2)猪神经脱细胞处理
(3)脱细胞神经粉碎干燥处理
脱细胞神经粉碎至1-20μm，然后干燥，得神经细胞外基质；
(4)静电纺丝双层神经导管层
将神经细胞外基质和PLCL分别溶于冰醋酸，经磁力搅拌机搅拌得到质量体积为10％-20％的脱细胞基质纺丝液和质量体积为10％PLCL的纺丝液；然后通过静电纺丝技术制备脱细胞猪神经基质导管层，再在脱细胞猪神经基质导管层喷涂PLCL层，得双层神经导管层；
(5)双层神经导管层后处理
双层神经导管层经碱中和、洗涤和冷冻干燥，即得双层神经导管。
所述猪神经预处理，包括以下步骤：将新鲜猪神经，剥离附属脂肪后碎制1-10cm；然后用水洗涤，经反复冻融后，备用。
所述冻融为，在-80℃冷冻30min-1h，再37℃水浴30min-1h。
所述冻融过程需进行两次到三次。
所述猪神经脱细胞处理，包括以下步骤：(1)预处理的猪神经用Triton X-100浸泡；(2)蒸馏水清洗，洗涤三次；(3)然后再用脱氧胆酸钠浸泡；(4)蒸馏水重复清洗，洗涤三次。
所述猪神经脱细胞处理中的步骤(1)到(4)重复两次到三次。所述脱细胞神经粉碎干燥处理，可以将脱细胞神经置于模具中，经-80℃用水包埋固定，然后将其切碎为1-20μm厚度。
所述脱细胞神经粉碎干燥处理，其使用的切碎设备可以为冰冻切片机。
所述脱细胞神经粉碎干燥处理，干燥时间为12h-24h；干燥设备可以为冷冻干燥机。
所述静电纺丝双层神经导管层，将所述神经细胞外基质溶于冰醋酸，经搅拌直至溶液呈均一，粘稠的乳白色；搅拌时间为12h-48h。
所述静电纺丝双层神经导管层，将所述PLCL溶于冰醋酸，经搅拌直至溶液呈清澈，粘稠的透明色；搅拌时间为4h-12h。
所述静电纺丝双层神经导管层中，静电纺丝喷丝脱细胞猪神经基质导管层的电纺时间为6h-12h；脱细胞猪神经基质导管层喷涂PLCL层的电纺时间为2h-6h。
所述双层神经导管层后处理中，碱溶液为0.1mol/L的NaOH；然后用水洗涤直至pH成中性；置于冷冻干燥机中干燥除水。
与现有技术相比，本发明的区别和优势如下：
(1)本发明创造性的提出将脱细胞后猪神经粉碎后，用冰醋酸溶解成为电纺溶剂，电纺脱细胞猪神经基质和PLCL分别作为导管内层和外层形成的新型双层神经导管。经过本发明方法制备出的新型双层神经导管，不仅具有生物相容性好，还有良好的机械支撑。由于内层脱细胞基质含有各种不同类的功能蛋白，包括胶原蛋白、蛋白多糖、糖胺聚糖和神经生长因子，这些蛋白能促进雪旺细胞增殖、迁移和轴突生长。同时，因为外层PLCL的存在也有效防止纤维结缔组织的增生和周围组织侵入。
(2)本发明脱细胞后猪神经是通过冰冻切片机进行粉碎，可以将猪神经粉粹更彻底，从而得到更加均一的纺丝溶液。
(3)本发明中使用了纯冰醋酸将脱细胞基质和PLCL溶解，配成静电纺丝的纺丝液，其效果优于使用三氟乙醇、六氟异丙醇；并最后用碱中和已成型导管中残余的冰醋酸，使导管无毒性，不易引起体内炎症反应。
(4)本发明利用静电纺丝技术可以通过调节参数获得任意尺寸大小的神经导管，以匹配受损神经尺寸大小。
(5)本发明通过静电纺丝技术将脱细胞基质纺成导管内层，且其电纺后脱细胞基质结构与天然细胞外基质类似，这有助于细胞增殖，迁移。
(6)本发明的供体来源广泛，不易受到限制。
附图说明
图1为本发明制备双层脱细胞基质导管流程图。
图2为脱细胞基质导管的图，A图为表征图，B图为体试镜图。
图3为双层脱细胞基质导管的图，A图为表征图，B图为体试镜图，C图为扫描电镜图。
图4为脱细胞基质导管HE染色图。
图5为双层脱细胞基质导管HE染色图。
图6为大鼠坐骨神经修复实验手术过程图，A为PLCL导管组，B为脱细胞导管组，C为双层导管组，D为自体移植。
图7为术后12周大鼠墨汁行为轨迹实验过程图。
图8为术后12周三组大鼠墨汁脚印图。
图9为术后12周大鼠电生理实验手术过程图，其中A为双层导管组，B为脱细胞导管组，C为PLCL导管组。
图10为三组导管电生理波形图,其中A为双层导管组，B为脱细胞导管组，C为PLCL导管组。
图11为术后12周修复后坐骨神经远端甲苯胺蓝染色图，其中A为双层导管组，B为脱细胞导管组，C为PLCL导管组。
具体实施方式
一种新型双层神经导管的制备方法，具体步骤如下：
(1)取新鲜猪神经，剥离附属脂肪等，用剪刀将其剪成3cm的小段。
(2)用去离子水振荡漂洗神经3次(每次15min)。
(3)反复冻融三次，分别在-80℃冷冻30min，再37℃水浴30min。
(4)猪神经进行脱细胞处理(质量浓度为4％的Triton X-100浸泡神经12h；去离子水清洗3次，每次15min；质量分数为3％的脱氧胆酸钠浸泡神经24h；去离子水清洗3次，每次15min；重复以上步骤两次)。
(5)将得到的脱细胞神经放在模具中，并放在-80℃冰箱用去离子水包埋固定神经，将固定后的神经用冰冻切片机以一微米厚度将神经切碎。
(6)将切碎后的神经颗粒在冷冻干燥机中去除因包埋所多余的去离子水，干燥时间为12h-24h，得神经细胞外基质。
(7)称量干燥后的神经细胞外基质和PLCL的质量。
(8)用冰醋酸将已称量的神经细胞外基质和PLCL溶解，分别配成质量体积为10％-20％的脱细胞基质纺丝液和质量体积为10％PLCL纺丝液，在磁力搅拌机中搅拌直至脱细胞基质溶液呈均一，粘稠的乳白色；PLCL纺丝液为清澈，粘稠的透明色，搅拌时间分别为12h-48h和4h-12h。
(9)将已经配成的脱细胞基质纺丝液，利用静电纺丝技术，喷丝成具有类似于天然细胞外基质结构的神经导管的内层(电纺时间6h-12h)，再在脱细胞基质导管上喷涂一层PLCL高分子聚合物(电纺时间4h-6h)。
(10)将得到的双层神经导管层用碱溶液(0.1mol/L的NaOH)中和掉导管中残余的冰醋酸成分，然后用去离子水冲洗浸泡导管，直至PH成中性，最后放在冷冻干燥机中干燥过夜去除导管中残余的去离子水。干燥后即可得到双层神经导管。
本发明所列举双层神经导管的直径为1.5mm长度为1cm。
实施例1
1.双层脱细胞基质导管的具体步骤如下。
(1)取新鲜猪神经，剥离附属脂肪等，用剪刀将其剪成3cm的小段。
(2)用去离子水振荡漂洗神经3次(每次15min)。
(3)反复冻融三次，分别在-80℃冷冻30min，再37℃水浴30min。
(4)猪神经进行脱细胞处理(质量浓度为4％的Triton X-100浸泡神经12h；去离子水清洗3次，每次15min；质量分数为3％的脱氧胆酸钠浸泡神经24h；去离子水清洗3次，每次15min；重复两次)。
(5)将得到的脱细胞神经放在模具中，并放在-80℃冰箱用去离子水包埋固定神经，将固定后的神经用冰冻切片机以一微米厚度将神经切碎。
(6)将切碎后的神经颗粒在冷冻干燥机中去除因包埋所多余的去离子水，干燥时间为12h-24h。
(7)称量干燥后的神经细胞外基质和PLCL的质量。
(8)用冰醋酸将已称量的神经细胞外基质和PLCL溶解，分别配成质量体积为10％-20％的脱细胞基质纺丝液和质量体积为10％的PLCL纺丝液，在磁力搅拌机中搅拌直至脱细胞基质溶液呈均一，粘稠的乳白色；PLCL纺丝液为清澈，粘稠的透明色，搅拌时间分别为12h-48h和4h-12h。
(9)将已经配成的脱细胞基质纺丝液，利用静电纺丝技术，喷丝成具有类似于天然细胞外基质结构的神经导管的内层(电纺时间6h-12h)，再在脱细胞基质导管上喷涂一层PLCL高分子聚合物(电纺时间2h-6h)。
(10)将得到的双层神经导管用碱溶液(0.1mol/L的NaOH)中和掉导管中残余的冰醋酸成分，然后用去离子水冲洗浸泡导管，直至PH成中性，最后放在冷冻干燥机中干燥过夜去除导管中残余的去离子水。干燥后即可得到双层神经导管。
2.双层脱细胞基质导管的扫描电镜。
制备好的双层神经导管用梯度酒精脱水，风干，置于干燥器中，进行扫描电镜拍照。结果如图2所示，电镜结果显示，两层贴合紧密，内层和外层没有明显分离。
3.细胞毒性研究。
浸提液cck8比色法:先将材料置于95％乙醇的EP管中(3次，每次1h)，在细胞铺板前一晚进行紫外线消毒。用去离子水彻底清理材料中残余的乙醇(3次，每次1h)。根据国标(表面积每6cm2,可制备1ml的浸提液)中要求，将表面积为18cm2的材料置于含有DMEM的孔板中，于5％二氧化碳培养箱，37℃培养24h，过滤碎片，收集3ml浸提液。用含有10％胎牛血清和1％双抗的DMEM培养液中培养雪旺细胞(RSC96)，然后以2×103细胞/孔的密度均匀接种在96孔板上，细胞贴板后，弃掉培养基，用不同浓度(25％，50％，75％，100％)浸提液继续培养雪旺细胞(RSC96)，转移至37℃，湿度95％，5％二氧化碳培养箱，培养1、3、5天后，每孔再加入cck-8 10μl，继续培养37℃孵育2h后，使用酶标仪在450nm处测量吸光度(OD值)。每个样本中设置6个平行实验组来评估材料的细胞毒性。结果显示随着浸提液浓度增加，细胞存活率越大，且100％浸提液组OD值大于阴性对照组，说明双层神经导管不仅没有毒性且具有促进细胞增长的能力。
4.体内坐骨神经修复实验。
21只雄性wister大鼠(n＝180±30g)随机分组为3组(每组6只)分别为单层脱细胞基质导管、双层神经导管、单层PLCL导管组、和自体移植组(n＝6)进行神经修复的体内实验。采用2％戊巴比妥钠(25mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。剥离出坐骨神经。对于导管组，使用一个10毫米的神经导管连接两个神经断端；另外，自体移植作为对照，切断一根10毫米长的神经，反向缝合到近端和远端神经断端。8-0缝合线缝合神经近端和远端，5-0缝合线缝合肌肉和皮肤。术后12周进行墨汁轨迹行为学实验和电生理实验。具体手术过程如图6所示。结果显示双层脱细胞基质导管的电生理和墨汁行为学实验数据与自体移植组无明显差距，神经修复效果良好。
5.静电纺丝溶剂导管扫描电镜对比实验
将分别用冰醋酸溶剂，三氟乙醇溶剂，和六氟异丙醇制备的的双层神经导管用梯度酒精脱水，风干，置于干燥器中，进行扫描电镜拍照。扫描电镜结果显示，溶剂为冰醋酸的双层导管的内外两层贴合紧密，没有明显分离。溶剂为其他试剂时，导管内外层存在明显分离。
6.脱细胞神经粉碎粒度实验
将经脱细胞处理后的猪神经分别用粉粹机和冰冻切片机进行粉碎处理。然后用等体积的冰醋酸溶解不同方法粉粹的等质量猪神经颗粒，用磁力搅拌机搅拌过夜。结果显示，用冰冻切片机对猪神经粉粹更加彻底，不存在明显不溶解猪神经颗粒存在；粉碎机对猪神经粉碎效果不佳，脱细胞基质溶液中仍然存在明显猪神经颗粒存在，溶液不均一。

Claims (10)

1.一种新型双层神经导管，其特征在于，由电纺脱细胞猪神经基质导管层，和设置在电纺脱细胞猪神经基质导管外层的PLCL层组成。
2.一种新型双层神经导管的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）猪神经预处理
（2）猪神经脱细胞处理
（3）脱细胞神经粉碎干燥处理
脱细胞神经粉碎至1-20μm，然后干燥，得神经细胞外基质；
（4）静电纺丝双层神经导管层
将神经细胞外基质和PLCL分别溶于冰醋酸，经磁力搅拌机搅拌得到质量体积为10%-20%的脱细胞基质纺丝液和质量体积为10% PLCL的纺丝液；然后通过静电纺丝技术制备脱细胞猪神经基质导管层，再在脱细胞猪神经基质导管层喷涂PLCL层，得双层神经导管层；
（5）双层神经导管层后处理
双层神经导管层经碱中和、洗涤和冷冻干燥，即得双层神经导管。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述猪神经预处理，包括以下步骤：将新鲜猪神经，剥离附属脂肪后碎制1-10cm；然后用水洗涤，经反复冻融后，备用。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述冻融为，在-80℃冷冻30min-1h，再37℃水浴30min-1h；所述冻融过程需进行两次到三次。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述猪神经脱细胞处理，包括以下步骤：（1）预处理的猪神经用Triton X-100浸泡、洗涤；（2）然后再用脱氧胆酸钠浸泡、洗涤；所述猪神经脱细胞处理中的步骤（1）和（2）重复两次到三次。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述脱细胞神经粉碎干燥处理，可以将脱细胞神经置于模具中，经-80℃用水包埋固定，然后将其切碎为1-20μm厚度；所述脱细胞神经粉碎干燥处理，其使用的切碎设备可以为冰冻切片机；
所述脱细胞神经粉碎干燥处理，干燥时间为12h-24h；干燥设备可以为冷冻干燥机。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝双层神经导管层，将所述神经细胞外基质溶于冰醋酸，经搅拌直至溶液呈均一，粘稠的乳白色；搅拌时间为12h-48h。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝双层神经导管层，将所述PLCL溶于冰醋酸，经搅拌直至溶液呈清澈，粘稠的透明色；搅拌时间为4h-12h。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝双层神经导管层中，静电纺丝喷丝脱细胞猪神经基质导管层的电纺时间为6h-12h；脱细胞猪神经基质导管层喷涂PLCL层的电纺时间为2h-6h。
10.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述双层神经导管层后处理中，碱溶液为0.1mol/L的NaOH；然后用水洗涤直至pH成中性；置于冷冻干燥机中干燥除水。
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