CN105288730A - 一种仿基底膜管结构的神经缺损修复材料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种仿神经基底膜管结构的神经缺损修复材料的制备方法，属于组织工程技术和生物材料领域。本发明依照周围神经胶原纤维排列和神经纤维基底膜结构特征，选用高分子材料和天然物质为主要原料，结合电纺丝技术和成孔技术，制备具有仿神经纤维基底膜管结构的周围神经缺损修复材料。与其它神经导管不同，该材料横截面呈多孔微小管状结构，管壁纤维排列高度取向，方向与微管走行方向一致。材料管壁比表面积显著增加，微管结构与神经纤维基底膜管类似，能够添加多种促神经生长物质，具有良好的生物相容性，便于神经纤维沿修复材料长轴方向生长，是一种有应用前景的组织工程外周神经缺损修复材料。

Description

一种仿基底膜管结构的神经缺损修复材料的制备方法

技术领域

本发明涉及外周神经缺损修复材料仿生制备技术领域，特别涉及仿基底膜管结构的神经缺损修复材料的制备方法。

背景技术

神经(Nerve)是由聚集成束的神经纤维所构成，而神经纤维本身是由神经元的轴突外被雪旺细胞形成的髓鞘包覆而成。其中许多神经纤维聚集成束，外面再由结缔组织填充，最终构成外周神经。Sunderland根据神经损伤的程度将其分为五度，当损伤达四度以上，即神经束遭到严重破坏或完全离断时，很少能自行恢复，必须依靠神经移植或人工修补材料进行治疗。周围神经缺损的修复与重建是当前治疗周围神经损伤领域的一大难题。

目前在解决治疗周围神经缺损手段，主要以自体神经移植为主。自体神经移植是一种“拆东墙补西墙”的方法，必然造成供体供区神经部位感觉功能缺失，遗留切口瘢痕，来源有限，难以修复长节段和特殊部位的周围神经缺损。因此，科学家一直在探索可以替代自体神经移植的周围神经缺损修复材料。

这些材料多构成中空的管状结构，成为引导再生管，原材料包括天然材料和人工合成材料两大类。天然材料有自体静脉、自体骨骼肌、异体或异种神经、藻酸盐、壳聚糖、胶原等；人工合成材料主要有硅胶、PLA、PGA等。由于静脉、骨骼肌等天然生物活性材料存在管壁塌陷、再生不良、疤痕组织增生及粘连等问题，且来源均比较有限，不适于大批量生产。人工合成材料主要是制备成中空管状结构的引导再生管，但这种管缺点主要是渗透性差，无取向性，不利于近端轴突的生长。

为此，许多研究对神经引导再生管的结构进行了改良。包括采用成孔技术制备管取向的多孔状神经修复材料，但这些改进并不能真正模拟神经基底膜管的纤维排列，通过前期实验，我们发现，基底膜管的纤维结构也是沿着神经长轴方向取向排列的。而接种在取向性薄膜的背根神经节，轴突生长更具方向性。

为了更好地模拟天然神经结构，顾晓松等将PLGA(poly(lactic-co-glycolicacid，聚乳酸-羟基乙酸共聚物)丝添加到神经引导再生管内，试图通过取向排列的PLGA丝引导神经纤维再生。取得了一定效果。但这种结构的修复材料并没有真正模拟出神经基底膜管结构，如同再生的细胞在钢丝上爬行，理想的周围神经缺损替代材料应具有与正常神经相似的物理和生化特性，包括(1)在材料组成方面，要有最佳的生物相容性，利于细胞粘附、增殖和分化，同时要求在人体内可降解；(2)在空间结构方面，和神经基底膜管一致，引导雪旺细胞的迁移和取向排列，进而引导轴突沿修复材料长轴取向生长至神经的远侧断端，从而提高神经再生效能。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种仿神经基底膜管结构的神经缺损修复材料的制备方法。通过选用高分子材料和天然来源性材料基质为主要原料，采用电纺丝技术和成孔技术，制备具有仿纤维基底膜管结构的神经缺损修复材料。该修复材料具有高比表面积，与天然神经纤维基底膜管类似，能够添加多种促神经生长物质，具有良好的生物相容性，便于再生神经纤维沿修复材料长轴方向生长，应用前景广泛。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：

一种仿基底膜管结构的神经缺损修复材料的制备方法，包括以下步骤：

1)室温(22-28℃均可)条件下，将高分子材料与天然来源性材料加入有机溶剂，配制成电纺丝原液。

2)制备微管模型。

3)将制备好的电纺丝原液分层喷涂至微管模型的底层和表层，制备具有微管结构的薄膜，室温干燥后，将具有微管结构的薄膜，垂直于取向排列方向(即垂直于微管模型方向)，采取滚动卷曲方式，形成管状结构。

4)去除管状结构中的微管模型。

5)三蒸水漂洗并冷冻干燥，获得最终成型的神经缺损修复材料。

进一步地，步骤1)配制成的电纺丝原液的质量百分浓度为4％～16％，即高分子材料与天然来源性材料的总重量占电纺丝原液总重量的百分数。高分子材料与天然来源性材料的摩尔比例可以从9:1到2:1，根据不同材料，选择上也会有差异。

进一步地，步骤1)中，所述高分子材料选自聚己内酯、聚己内酯/左旋聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、左旋聚乳酸、聚乙烯醇、蚕丝蛋白/聚环氧乙烷、聚乳酸、聚内消旋乳酸等中的一种或多种，以获取不同的力学强度与材料特性。

所述天然来源性材料包括细胞外基质干粉、胶原、明胶、NGF、壳聚糖、甲壳素等。

所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、六氟异丙醇、四氟乙烯、碳酸二甲酯、丙酮、乙酸、二甲基亚砜、四氢呋喃、二甲基甲酰胺等中的一种或多种，以获取单根纤维表面不同的孔隙。

进一步地，步骤2)中，所述微管模型包括可溶型微管模型和不可溶型微管模型。

其中：

可溶型微管模型：原料选取可溶于水的有机材料，如PVA、蚕丝蛋白/聚环氧乙烷、聚乙二醇、聚内消旋乳酸等。依材料熔点不同选取特定温度，熔融状态下，选取不同直径的针头，铸造平行排列的微管模型，依照需求不同决定微管直径与排列间距。

不可溶型微管模型：采用市场上的丝线类，如尼龙丝、金属丝如(铜丝、钨丝等)、聚合纤维丝等。决定微管排列间距后，固定成型。

进一步地，步骤3)中，薄膜的厚度可依照最终神经修补导管的直径调整。微管模型也可以附加多层(例如在采用收集滚轴制备具有微管结构的薄膜时，可先喷涂一层电纺丝原液后，附加上微管模型，再喷涂上电纺丝原液，可以得到一层包含微管模型的薄膜，此时，如果再附加一层微管模型，再喷涂电纺丝原液，新的薄膜中，就包含两层微管模型。)。微管模型可复合1～3层薄膜，薄膜总厚度达0.05mm～1mm。

进一步地，步骤3)中，可采用收集滚轴或带电金属梳等电纺丝常见收集装置将制备好的电纺丝原液分层喷涂至微管模型的底层和表层，采用收集滚轴制备具有微管结构的薄膜的步骤包括：

将收集滚轴调速至低转速，调整电压，针头前方形成泰勒锥，使电纺丝均匀喷出，形成无规则的底膜，膜厚度约0.1mm。之后再将收集滚轴调整成高转速，收集厚度约为0.1mm的高取向薄膜。固定微管模型，再次喷涂电纺丝，厚度约0.1mm，连带铝箔，小心取下。所述收集滚轴定速可调速至0.5～9m/min(线速度)，5～15kV正电压加于针头(粗细)，-2～-12kV电压加于收集器，推注速度：10～40μL/min，喷射针头到收集器之间的距离为5～20cm，温度：-20～40℃(低温可造成当根纤维表面多孔结构)，湿度：40％以下。

进一步地，步骤5)中，所述微管模型为可溶型微管模型时，将管状结构放入水中，温和震荡3～12小时，去除可溶于水的微管模型；所述微管模型为不可溶型微管模型时，在显微镜下，直接抽除微管模型。

进一步地，上述方法还包括：将步骤5)获得的神经缺损修复材料真空包装，40～250万拉德γ射线辐照灭菌，4℃保存。

进一步地，步骤3)中优选室温干燥4～24小时，步骤5)中优选冷冻干燥12～48小时。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

本发明设计了一种新的制备方法，可以使取向性的静电纺丝沿着神经导管内壁平行排列，制备成取向性神经缺损修补材料，与其它神经导管不同，该材料横截面呈多孔微小管状结构，管壁纤维排列高度取向，方向与微管走行方向一致，并使其具有高比表面积，同时该支架具有高渗透性，电纺丝原料可以方便添加不同促神经生长物质。

这种3D结构的修补材料，能够通过其内部的纤维通道和有取向性的纤维通道壁引导轴突定向生长。本材料最大的好处取向性结构引导细胞生长并且没有抑制细胞的渗透。这项新技术使神经导管管壁厚减小，为组织生长提供更大的空间。这种方法制备的修补材料密切模仿了脱细胞神经的结构，但其较大直径的微通道可以更好地促进了神经轴突的定向生长和神经细胞的黏附和生长。

附图说明

图1为单层微管道模型建立与电纺丝薄膜的附加方式，其中(a)为平面结构示意图；(b)为立体结构示意图。

图2为多层微管道模型建立与电纺丝薄膜的附加方式，其中(a)为平面结构示意图；(b)为立体结构示意图。

图3为外周神经修复材料45°斜切面示意图

图4为外周神经修复材料成品扫描电镜图。(a)为整体横切面图；(b)为管道内壁纵切面图。

具体实施方式

实施例1制备8％(w/v)PLGA电纺丝原液

称取0.4gPLGA(85:25)与0.1g细胞外基质干粉，放入容器内，加入5ml三氯甲烷溶液，配制成PLGA8％(w/v)的电纺丝原液，磁力搅拌12小时后，封口4℃保存备用。

其中，细胞外基质干粉制备：本实验组已有相关专利申请，详情见神经组织源性组织工程支架材料的制备及应用。国家发明专利：ZL201010107529.8。

实施例2制备10％(w/v)PLGA电纺丝原液

称取0.5gPLGA(85:25)与0.2g细胞外基质干粉，放入容器内，加入5ml三氯甲烷溶液，配制成PLGA10％(w/v)的电纺丝原液，磁力搅拌12小时后，封口4℃保存备用。

实施例3制备12％(w/v)PLGA电纺丝原液

称取0.6gPLGA(85:25)与0.3g细胞外基质干粉，放入容器内，加入5ml三氯甲烷溶液，配制成PLGA12％(w/v)的电纺丝原液，磁力搅拌12小时后，封口4℃保存备用。

实施例4制备10％(w/v)PLA电纺丝原液

称取0.5gPLA与0.2g细胞外基质干粉，放入容器内，加入5ml二氯甲烷溶液，配制成PLA10％(w/v)的电纺丝原液，磁力搅拌12小时后，封口4℃保存备用。

实施例5制备10％(w/v)PCL电纺丝原液

称取0.5gPCL与0.1g细胞外基质干粉，放入容器内，加入5ml六氟异丙醇溶液，配制成PCL10％(w/v)的电纺丝原液，磁力搅拌12小时后，封口4℃保存备用。

实施例6静电纺丝

收集滚轴(直径10cm宽5cm)定速可调速至140～2800rpm/min，6～8Kv正电压加于针头，-8～-12Kv电压加于收集滚轴，喷射针头到收集器之间的距离为14～15cm。

1.先将收集器调速至140rpm/min，7Kv正电压加于针头，-10Kv电压加于收集滚轴，推注速度：20μL/min，喷射0.15ml实施例3制备的12％(w/v)PLGA电纺丝原液，形成无规则的底膜。

2.之后将收集滚轴上调至2800rpm/min，收集0.1ml的12％(w/v)PLGA电纺丝，之后缠绕直径130μm的微管模型，如图1所示，缠绕密度为每厘米7～8根。

3.之后继续喷射0.25ml的12％(w/v)PLGA电纺丝原液，再次捆绑一层微管道模型，如图2所示，两层微管道模型之间存在电纺丝薄膜。

4.继续喷射0.25ml的12％(w/v)PLGA电纺丝原液。

实施例7制备多孔道外周神经支架

1.干燥45～60min后，小心接下电纺丝形成的薄膜，之后在光滑的玻璃台面上，以二操作(1)形成的无规则底膜为外侧，沿垂直于管道模型方向滚动薄膜，形成管状结构。

2.室温干燥24小时，去除管道模型，形成多孔道三维结构，成品如图3所示。三蒸水漂洗15～30分钟，冷冻干燥48小时，获得最终成型的高取向、多孔道蜂窝状外周神经支架，真空包装，Co60灭菌，4℃保存备用。

扫描电镜检测

经扫描电镜得到图4，(a)中可以看到外周神经修复材料的横截面存在多孔管道样结构。(b)为内部管道纵切面电镜图，可清楚观察到，内部纤维的排列成高取向性，与神经再生长轴方向一致。

Claims (10)

1.一种仿基底膜管结构的神经缺损修复材料的制备方法，包括以下步骤：

1)室温条件下，将高分子材料与天然源性材料加入有机溶剂，配制成电纺丝原液；

2)制备微管模型；

3)将制备好的电纺丝原液分层喷涂至微管模型的底层和表层，制备具有微管结构的薄膜，室温干燥后，将具有微管结构的薄膜，垂直于取向排列方向，采取滚动卷曲方式，形成管状结构；

4)去除管状结构中的微管模型；

5)三蒸水漂洗并冷冻干燥，获得最终成型的神经缺损修复材料。

2.如权利要求1所述的仿基底膜管结构的神经缺损修复材料的制备方法，其特征在于，步骤1)中配制成的电纺丝原液的质量百分浓度为4％～16％。

3.如权利要求1所述的仿基底膜管结构的神经缺损修复材料的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述高分子材料选自聚已内酯、聚己内酯/左旋聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、左旋聚乳酸、聚乙烯醇、蚕丝蛋白/聚环氧乙烷、聚乳酸、聚内消旋乳酸中的一种或多种，所述天然源性材料包括细胞外基质干粉、胶原、明胶、NGF、壳聚糖、甲壳素；所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、六氟异丙醇、四氟乙烯、碳酸二甲酯、丙酮、乙酸、二甲基亚砜、四氢呋喃、二甲基甲酰胺中的一种或多种。

4.如权利要求1所述的仿基底膜管结构的神经缺损修复材料的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述微管模型包括可溶型微管模型和不可溶型微管模型。

5.如权利要求4所述的仿基底膜管结构的神经缺损修复材料的制备方法，其特征在于，所述可溶型微管模型的原料包括PVA、蚕丝蛋白/聚环氧乙烷、聚乙二醇、聚内消旋乳酸；所述不可溶型微管模型的原料包括尼龙丝、金属丝、聚合纤维丝。

6.如权利要求1所述的仿基底膜管结构的神经缺损修复材料的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述微管模型复合1～3层薄膜，所述薄膜的总厚度为0.05mm～1mm。

7.如权利要求1所述的仿基底膜管结构的神经缺损修复材料的制备方法，其特征在于，步骤3)中，采用收集滚轴或带电金属梳将制备好的电纺丝原液分层喷涂至微管模型的底层和表层。

8.如权利要求7所述的仿基底膜管结构的神经缺损修复材料的制备方法，其特征在于，采用收集滚轴制备具有微管结构的薄膜的步骤包括：

将收集滚轴调速至低转速，调整电压，针头前方形成泰勒锥，使电纺丝均匀喷出，形成无规则的底膜，膜厚度0.1mm；之后再将收集滚轴调整成高转速，收集厚度为0.1mm的高取向薄膜；固定微管模型，再次喷涂电纺丝，厚度0.1mm，连带铝箔，小心取下；所述收集滚轴定速调速至线速度0.5～9m/min，5～15kV正电压加于针头，-2～-12kV电压加于收集器，推注速度：10～40μL/min，喷射针头到收集器之间的距离为5～20cm，温度：-20～40℃，湿度：40％以下。

9.如权利要求1所述的仿基底膜管结构的神经缺损修复材料的制备方法，其特征在于，步骤5)中，所述微管模型为可溶型微管模型时，将管状结构放入水中，温和震荡3～12小时，去除可溶于水的微管模型；所述微管模型为不可溶型微管模型时，在显微镜下，直接抽除微管模型。

10.如权利要求1所述的仿基底膜管结构的神经缺损修复材料的制备方法，其特征在于，还包括：将步骤5)获得的神经缺损修复材料真空包装，40～250万拉德γ射线辐照灭菌，4℃保存。